KR20150136001A - Ｅｒｋ 신호활성 억제제를 유효성분으로 함유하는 암 줄기세포 성장 억제용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 Erk 신호활성 억제제를 유효성분으로 함유하는 암 줄기세포 성장 억제용 조성물로서, 보다 구체적으로는 Erk 억제제로서 카지놀 E를 유효성분으로 함유하는 유방암, 폐암 줄기세포 성장 억제용 조성물 및 이를 이용한 유방암, 폐암 치료방법에 관한 것이다. 본 발명의 조성물은 인체 독성이 적은 천연물(닥나무) 유래 분리 물질인 Kazinol E를 암 줄기세포 표적 치료제로 사용하기 때문에, 암의 내성, 전이 및 재발 등을 원천적으로 치료, 예방 또는 개선할 수 있다.

Description

Ｅｒｋ 신호활성 억제제를 유효성분으로 함유하는 암 줄기세포 성장 억제용 조성물{A Composition for inhibiting Growth of Cancer Stem Cells, containing Erk signaling activation inhibitor}

본 발명은 Erk 신호활성 억제제를 유효성분으로 함유하는 암 줄기세포 성장 억제용 조성물로서, 보다 구체적으로는 Erk 억제제로서 카지놀 E(Kazinol E)를 유효성분으로 함유하는 유방암, 폐암, 뇌암 줄기세포 성장 억제용 조성물 및 이를 이용한 유방암, 폐암, 또는 뇌암 치료방법에 관한 것이다.

유방암은 여성에게 있어서 매년 40,000명 이상의 사망의 원인이 되는 가장 보편적인 악성 종양으로서 조기 진단이 매우 중요하나, 이미 알려져 있는 많은 항암치료제의 치료에도 불구하고 암이 많이 진행된 경우나 전이된 경우 생존율이 향상되지 못한 실정이다.

대표적인 항암 요법인 화학요법(chemotherapy)은, 단독으로 또는 방사능요법과 같은 다른 치료법과 조합하여 현재 암을 치료하기 위한 가장 효율적인 치료법으로 사용되고 있다. 그러나, 화학요법에서 암 치료 약물의 효능은 암 세포를 죽일 수 있는 능력에 따르나, 약물 사용시 암세포 뿐만 아니라 일반적인 세포에도 작용할 수 있다는 문제가 있다.

암 줄기세포(cancer stem cell)는 무제한 재생능력을 가진 암세포로서 줄기세포에서 종양이 기원할 것이라는 가설은, 90년대 말 급성 골수성 백혈병에서 암줄기세포가 될 수 있는 일단의 세포를 면역억제 쥐에 이식하여 사람의 백혈병이 쥐에서 재현됨이 발표되면서 확고하게 되었고, 이후 유방암에서 암줄기세포를 증명하면서 고형 암종에서도 줄기세포의 존재를 확신하게 되었다.

악성 종양이 보이는 다양한 이질성이 줄기세포의 다양한 분화성과 일치하며, 많은 표적치료에도 불구하고 끊임없이 발현되는 암세포의 약물 저항성은 줄기세포의 기본 특성과 일치하는데 이로써 종양의 발생과 줄기세포를 연관지어 생각할 수 있으며, 암 줄기세포는 새로운 표적치료 분야가 될 수 있다.

암 줄기세포 가설에 근거하여 여러 치료방법들이 고안되었는데, 그 중 많이 알려진 방법은 암 줄기세포의 자가재생 경로를 이용하는 방법이다. 이러한 치료에서 중요한 점은 정상 줄기세포의 자가재생은 유지하면서 암 줄기세포의 자가재생만을 표적으로 해야 하는 것이다. 예로서 Notch 신호는 gamma secretase라는 효소에 의해 진행되는데, 이에 대한 억제제(gamma secretase inhibitor)를 Notch1이 과발현된 유방암에 사용하면 종양 억제 효과를 달성할 수 있다. Hedgehog 신호체계를 표적으로 할 경우에도 항암효과를 보인다는 최근 보고가 있는데, Hedgehog 억제제인 cyclopamine을 종양을 이종이식(tumor xenograft)한 동물에 투여했을 때 극적으로 종양이 위축되었다는 것이다. 그 밖에도, PI3K/AKT, MAPK, JAK2/STAT3 signaling pathway와 관련 있다고 알려져 있다.

그러나, 지금까지 암 줄기세포에 대한 연구에는 제한성도 많고, 종양의 형성이나 유지에서의 역할에 대해서는 아직까지 확실하게 밝혀진 것은 없다. 정상 줄기세포에는 손상을 주지 않으면서 암 줄기세포만을 표적으로 하는 치료를 효율적으로 수행하기 위해서는 암 줄기세포의 유지와 조절에 중요한 분자생물학적인 특성이나 그 조절 경로에 대한 지식과 이해가 필요하다.

현재까지 암 줄기세포를 직접적으로 타겟팅하는 항암제나 천연물 유래 추출물의 연구는 거의 없는 실정이다. 종래의 기술은 암 줄기세포의 직접적인 타겟 유전자를 억제하는 실험으로 암줄기세포를 억제하거나 또는 암줄기세포의 상위 신호전달 단백질을 억제하여 암줄기세포를 억제하는 연구들이 진행되었다. 그러나 많은 종양 환자에 있어서 종양유전자의 변이나 단백질의 변이로 이러한 타겟팅 실험이 어려움이 많다.

따라서, 암 줄기세포에 대한 약물의 선택성을 개선하는 것은 항암 약물에 의한 화학요법의 효능을 증가시킴으로써 약물을 더 낮은 용량으로 사용하게 하는 것을 분명히 가능하게 할 것이다. 그러므로, 암 치료 및 예방을 위하여 암 줄기세포의 성장을 선택적으로 억제할 수 있는 개선된 접근법이 요구된다.

이에 본 발명자들은 닥나무에서 유래된 카지놀 E가 유방암, 폐암, 또는 뇌암에서 Erk의 신호활성을 억제함으로써 암 줄기세포 특이적 사멸이 현저하게 증가함을 확인하고, Erk 신호전달체계와 관련한 분자적 메카니즘을 규명하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 Erk 신호활성 억제제를 유효성분으로 함유하는, 암 줄기세포 성장 억제용 약학/식품 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다. 즉, Erk 신호활성 억제제로서 카지놀 E를 이용하여 암 줄기세포를 표적치료하는 방법을 제공하는 데 있다.

상기와 같은 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은, Erk 신호활성 억제제를 유효성분으로 함유하는, 암 줄기세포 성장 억제용 약학 및/또는 식품 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은, Erk 신호활성 억제제를 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 암 줄기세포 성장 억제방법을 제공한다.

또한, 본 발명은, Erk 신호활성 억제제를 암 줄기세포 성장 억제에 이용하는 용도를 제공한다.

본 발명의 일 구현예로, 상기 Erk 신호활성 억제제는 카지놀 E 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염인 것을 특징으로 한다.

본 발명의 다른 구현예로, 상기 카지놀 E는 닥나무에서 추출된 것임을 특징으로 한다.

본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 암은 유방암인 것을 특징으로 한다.

본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 암은 폐암 또는 뇌암인 것을 특징으로 한다.

본 발명의 Erk 신호활성 억제제를 유효성분으로 함유하는 약학 및/또는 식품 조성물은, 인체 독성이 적은 천연물(닥나무) 유래 분리 물질인 카지놀 E에 대하여 암의 내성, 전이 및 재발 등에 중요한 암줄기 세포의 표적 치료 활성을 발견하고, 암줄기세포의 생장에 매우 중요한 ERK 효소의 활성을 직접적으로 저해함으로써 유방암, 폐암, 뇌암 등의 암을 원천적으로 치료, 예방 또는 개선할 수 있다.

도 1은 종래의 암세포 표적 치료법과 암 줄기세포 표적 치료법을 비교한 모식도이다.
도 2의 (a)는 일반 유방암세포 배양 조건에서 카지놀 E에 의한 세포독성 평가를 실시한 결과이고, (b) 및 (c)는 유방암 줄기세포 특이적 배양 조건에서 sphere 크기와 개수를 측정하여 카지놀 E에 의한 암줄기세포 특이적 항암 활성을 확인한 결과이다.
도 3은 유방암 줄기세포 특이적 표면 항원(CD44 high/CD24 low)을 이용하여 카지놀 E에 의한 암줄기세포 특이적 항암 활성을 확인한 결과이다.
도 4는 유방암 줄기세포 특이적 마커 효소(ALDH)를 이용하여 카지놀 E에 의한 암줄기세포 특이적 항암 활성을 확인한 결과이다.
도 5는 유방암 줄기세포에서 카지놀 E에 의한 세포 신호 활성 변화를 검정하여 Erk/P90RSK pathway의 저해를 확인한 결과이다.
도 6은 폐암 줄기세포에서 Erk/P90RSK pathway 저해 효과에 대한 카지놀 E와 카지놀 C의 비교 결과이다.
도 7은 카지놀 E에 의해 Erk 효소활성이 직접적으로 저해됨을 보여주는 in vitro kinase assay 결과이다.
도 8은 유방암 줄기세포에서 카지놀 E에 의한 세포 신호 활성 변화를 검정하여 Wnt/β-catenin pathway의 저해를 확인한 결과이다.

본 발명은 Erk 신호활성 억제제를 유효성분으로 함유하는, 암 줄기세포 성장 억제용 약학 및 식품 조성물에 관한 것이다.

암 줄기세포는 종양의 성장 및 전이에 중요한 소수의 세포로 종양의 자가증식에 의해 집락을 형성해 전이를 일으킨다. 암 줄기세포는 암의 내성과 재발, 발생에 중요한 역할을 하는 소수 그룹의 암조직 내의 세포 그룹이며, 이를 선별적으로 표적 치료하면 암의 내성 극복 및 치료에 크게 도움이 될 수 있다.

따라서, 본 발명자들은 암 줄기세표 표적 치료를 통한 유방암, 폐암, 뇌암 등의 치료를 위하여, 카지놀 E를 처리하여 암 줄기세포에 대한 특이적 항암 활성 및 그 기전을 확인하였다. 즉, 본 발명에서는 천연물질인 닥나무에서 추출한 카지놀 계열로 항산화효과를 가지는 카지놀 E를 이용해 암줄기세포에서의 효과와 메커니즘을 연구하였다.

그 결과, 카지놀 E 처리에 의하여 일반 암세포의 세포 생존율의 변화가 없었던 반면, 암 줄기세포의 Colony크기와 수의 감소를 통해 암 줄기세포 특이적 항암 활성을 확인하였다. 특히, 유방암 줄기세포 특이적 표면 항원(CD44high/24low) 및 마커 효소(ALDH:aldehyde dehydrogenase)의 감소를 통해 유방암 줄기세포의 억제효과를 검증하였다.

또한, western blot을 통해 암 줄기세포와 관련 있는 단백질의 발현 변화를 관찰하여 항암 활성의 기전(Erk/P90RSK pathway, Wnt/β-catenin pathway)을 확인한 결과, 이들의 신호활성 저해 메커니즘을 확인하였다.

따라서, 본 발명에 의하면, 암세포에 독성이 없는 농도에서 암 줄기세포에 영향을 주는 pathway 변화를 통해 카지놀 E라는 천연물을 항암제로 사용한다면 부작용이 적으면서 전이를 막을 수 있는 유용한 항암치료법이 될 수 있을 것이다.

본 발명에서 '닥나무(Broussonetia kazinoki)'란, 쐐기풀목 뽕나무과의 낙엽활엽 관목을 말한다. 한방에서 닥나무 열매는 양기부족·수종의 치료제로 사용하고, 어린 잎은 식용한다.

본 발명에서 '유방암의 치료 또는 예방'이란, 유방암의 경감, 완화 및 증상의 개선을 포함하며, 또한 유방암이 걸릴 가능성을 낮추는 것을 포함하는 의미이다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 유방암의 치료 또는 예방용 조성물은 약학적 조성물로 제조될 수 있다. 치료 및 예방에 사용하기 위해 본 발명의 카지놀 E 자체를 투여하는 것이 가능하나, 약학적 조성물의 활성 성분으로서 상기 카지놀 E가 포함되는 것이 바람직하다.

본 발명의 약학적 조성물은 카지놀 E 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하며, 상기 카지놀 E는 하기 화학식 1의 구조를 갖는다.

[화학식 1]

본 발명의 카지놀 E는 닥나무의 비극성용매 추출물로부터 수득될 수 있으며, 구체적으로는 하기와 같은 과정을 통하여 수득될 수 있다.

우선, 닥나무 껍질을 건조하여, 시료 무게(g)의 약 1배 내지 20배, 바람직하게는 약 3배 내지 10배의 C1 내지 C4의 저급 알콜 또는 이들의 혼합용매, 바람직하게는 에탄올로, 20℃ 내지 100℃, 바람직하게는 50℃ 내지 70℃의 추출온도에서 약 1시간 내지 10일, 바람직하게는 약 2시간 내지 5시간 동안 냉침, 열수추출, 초음파 추출, 환류 냉각 추출, 더욱 바람직하게는 환류 냉각 추출방법을 이용하여 상층액을 회수한 다음, 상기의 과정을 2 내지 7회 반복 수행하여 상층액을 모으고 감압 농축하여 극성용매 가용추출물을 수득할 수 있다.

이어서, 상기 극성용매 가용추출물을 증류수에 현탁한 후, 이 현탁액에 약 1 내지 100배, 바람직하게는 약 1 내지 5배 부피의 헥산, 에틸아세테이트, 메틸렌클로라이드, 클로로포름과 같은 비극성 용매를 가하여 1회 내지 10회, 바람직하게는 2회 내지 5회 비극성용매 가용층을 추출, 분리하여 비극성용매 가용 분획물을 수득할 수 있다. 또한, 추가로 통상의 분획 공정을 수행할 수도 있다.

본 발명에서 약학적으로 허용 가능한 염으로는 유리산(free acid)에 의해 형성된 산부가염이 유용하다. 산부가염은 통상의 방법, 예를 들면 화합물을 과량의 산 수용액에 용해시키고, 이 염을 메탄올, 에탄올, 아세톤 또는 아세토니트릴과 같은 수혼화성 유기용매를 사용하여 침전시켜서 제조한다. 동 몰량의 화합물 및 물 중의 산 또는 알코올(예, 글리콜 모노메틸에테르)을 가열하고 이어서 상기 혼합물을 증발시켜서 건조시키거나, 또는 석출된 염을 흡인 여과시킬 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 유효성분 이외에 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있다. 이때, 약학적으로 허용 가능한 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 사이클로덱스트린, 덱스트로즈 용액, 말토덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올, 리포좀 등을 포함하지만 이에 한정되지 않으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액 등 다른 통상의 첨가제를 더 포함할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제, 윤활제 등을 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다. 적합한 약학적으로 허용되는 담체 및 제제화에 관해서는 레밍턴의 문헌 (Remington's Pharmaceutical Science, Mack Publishing Company, Easton PA)에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 제형에 특별한 제한은 없으나 주사제, 흡입제, 피부 외용제 등으로 제제화할 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물의 투여방법은 특별히 제한되는 것은 아니나, 목적하는 방법에 따라 정맥 내, 피하, 복강 내, 흡입, 피부도포 또는 국소적용과 같이 비경구 투여하거나 경구 투여할 수 있다.

투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하다. 일일 투여량은 치료를 필요로 하는 개체에 투여됨으로써 경감된 질병 상태에 대한 치료에 충분한 본 발명의 치료용 물질의 양을 의미한다. 치료용 물질의 효과적인 양은 특정 화합물, 질병 상태 및 그의 심각도, 치료를 필요로 하는 개체에 따라 달라지며, 이는 당업자에 의해 통상적으로 결정될 수 있다. 비제한적 예로서, 본 발명에 의한 조성물의 인체에 대한 투여량은 환자의 나이, 몸무게, 성별, 투여 형태, 건강 상태 및 질환 정도에 따라 달라질 수 있으며, 몸무게가 70 ㎏인 성인 환자를 기준으로 할 때, 일반적으로는 0.01∼1000 ㎎/일, 바람직하게는 1∼500 ㎎/일이며, 일정시간 간격으로 1일 1회 내지 수회에 분할 투여할 수도 있다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 유방암의 예방 또는 개선용 조성물은 식품 조성물로 제조될 수 있다. 본 발명의 조성물이 식품 조성물로 제조되는 경우, 유효성분으로서 상기 카지놀 E를 함유할 뿐만 아니라, 식품 제조시에 통상적으로 첨가되는 성분을 포함하며, 예를 들어, 단백질, 탄수화물, 지방, 영양소, 조미제 및 향미제를 포함할 수 있다. 예컨대, 본 발명의 식품 조성물이 드링크제로 제조되는 경우에는 본 발명의 카지놀 E 이외에 구연산, 액상과당, 설탕, 포도당, 초산, 사과산, 과즙 등을 추가로 포함시킬 수 있다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 닥나무 유래의 카지놀 E 준비

1-1. 닥나무 뿌리 추출물로부터 카지놀 E의 단리

닥나무 뿌리(600 g)를 80% 에탄올로 환류냉각하면서 3회 추출한 후, 감압 농축하여 알콜 추출물(31 g)을 얻고, 이를 에틸아세테이트에 분산 추출하여 에틸아세테이트 가용분획을 얻었다.

에틸아세테이트 분획물을 n-헥산/아세톤 기울기 용출시스템(20:1 → 1:10)으로 11개 분획물을 얻고 이중 7번째 분획물을 수집하였다. 이어서, 상기 7번째 분획물에 대하여 클로로포름:메탄올(100:1→10:1)을 이용한 실리카겔 컬럼크로마토그래피를 수행하여 6개 서브분획층으로 분리한 후 3번째 서브분획층을 수집하였다. 또한, 상기 3번째 서브분획물에 대하여 n-헥산/에틸아세테이트(20:1→1:1)를 이용한 실리카겔 컬럼크로마토그래피 기울기 용출을 더욱 수행하였다.

1-2. 카지놀 E의 구조동정

상기 실시예 1-1에서 수득한 화합물이 카지놀 E인지 구조확인하기 위하여, NMR, Mass 분석 등의 분광학적 방법을 이용하여 동정하였고, 그 결과를 하기에 나타내었다:

HREIMS m/z 462.2771 (calculated for C₃₀H₃₈O₄, 462.2770); EIMS (70 eV) m/z 462 ([M]⁺, 33.1%), 406 (4.2), 363 (10.0), 284 (4.8), 272 (26.2), 257 (15.2), 229 (10.7), 215 (49.9), 201 (21.6), 191(100), 173 (34.9), 161 (13.2); ¹H NMR(CDCl₃, 400MHz): δ 1.43 (3H 2, s, 19-Me), 1.68 (3H, s, H-18), 1.70 (3H, s, H-17), 1.73 (3H, s, H-13), 1.80 (3H, s, H-12), 1.90 - 2.20 (2H, m, H-3), 2.74, 2.91 (each 1H, m, H-4), 3.31 (4H, dd, J=14.8, 6.4 Hz, H-9 and H-14), 5.00 (1H, br t, J=6.2 Hz, H-15), 5.09 (1H, dd, J=10.6, 2 Hz, H-2), 5.14 (1H, br t, J=6.4 Hz, H-10), 5.28 (1H, d, J=10.8 Hz, H-23Z), 5.34 (1H, d, J=17.6 Hz, H-23E), 6.19 (1H, dd, J=17.6, 10.8 Hz, H-22), 6.40 (1H, s, H-8), 6.91 (1H, s, H-2'), 6.95 (1H, s, H-5); ¹³C NMR(CDCl₃,100MHz):δ 17.9 (C-12), 18.0 (C-17), 25.5 (C-18), 25.6 (C-14), 25.7 (C-4), 25.8 (C-13), 27.1 (C-9, 21), 27.2 (C-20), 29.9 (C-3), 39.7 (C-19), 74.8 (C-2), 105.5 (C-8), 111.0 (C-2'), 113.2 (C-23), 113.7 (C-4a), 122.4 (C-10), 123.8 (C-15), 124.8 (C-6), 126.6 (C-6'), 126.9(C-5), 129.8 (C-5'), 131.1 (C-16), 131.7 (C-1'), 133.3 (C-11), 141.9 (C-4'), 142.2 (C-3'), 148.2 (C-22), 153.6 (C-7), 155.2 (C-8a).

실시예 2: 유방암 줄기세포 배양

유방암 세포주인 MCF-7(Korean Cell Line Bank)를 10% FBS 및 페니실린(100units/ml) 함유 DMEM 배지로 37 ℃, 5% CO₂에서 배양하여 일반적인 종양세포를 확보하였다.

유방암 줄기세포를 얻기 위하여, 상기 종양세포를 'sphere forming conditioned media'에 더욱 배양시켰다. 즉, 4 mg/mL heparin, 0.5 ug/ml hydrocortison 및 mammo supplement 함유 Mammocult^® medium(Stem Cell Technologies)에서 mammosphere 배양하였다.

실시예 3: 암 줄기세포 특이적 성장저해

3-1. 일반 암세포 생존성 분석(cell viability assay)

일반적인 종양세포에 미치는 카지놀 E의 세포독성을 평가하기 위하여, 실시예 2에서 얻어진 일반적인 종양세포에 카지놀 E를 0∼5 uM의 농도로 처리한 후 공지의 MTT 분석법으로 세포 생존 분석(cell viability assay)을 수행하였다.

그 결과, 도 2의 (a)에 나타난 바와 같이, 카지놀 E 농도별 처리에 따른 세포 생존성에 큰 차이가 없음을 확인하였다.

3-2. 암줄기세포 생존성 분석(sphere forming assay)

상기 실시예 3-1에서 카지놀 E이 일반적인 종양세포에는 세포 독성이 없음을 확인하였기 때문에, 암 줄기세포에만 특이적으로 작용하는지 더욱 확인하기 위하여 sphere forming assay를 수행하였다. 유방암 줄기세포는 플레이트 표면에 부착하지 않고 부유하여 sphere 형태의 콜로니 덩어리를 형성하기 때문에, 이 덩어리의 크기 및 개수를 관찰하여 암 줄기세포 특이적 효과를 확인할 수 있다.

구체적으로, 실시예 2에서 얻어진 유방암 줄기세포(spheres) 배양액에 카지놀 E를 0∼5 uM의 농도로 처리한 후, 100 um 이상의 직경을 갖는 spheres의 수를 현미경(40X)으로 카운팅하였다.

그 결과, 도 2의 (b) 및 (c)에 나타난 바와 같이, 유방암 줄기세포(spheres)의 크기 및 개수가 카지놀 E 농도 의존적으로 감소(2 uM에서는 60%, 5 uM에서는 70% 감소)함을 확인하였다.

이러한 결과는, 카지놀 E가 일반적인 종양세포보다 암줄기세포에 선택적으로 작용하여 암줄기세포 특이적인 성장저해를 일으킨다는 것을 의미하는 것이다.

실시예 4: 유방암 줄기세포 마커

4-1. CD44high / CD24low

카지놀 E에 의한 암줄기세포 특이적인 성장저해 효과를 더욱 입증하기 위하여, Flow cytometry법을 이용하여 유방암 줄기세포 표면항원 마커인 CD44high/CD24low population이 감소되었는지 확인하였다.

구체적으로, 유방암 세포주인 MCF-7(Korean Cell Line Bank)를 mammocult media에 씨딩한지 24시간 후에, 카지놀 E를 3일 동안 처리하였다. 이후, 세포를 accutase 처리하여 detaching한 후, 항-Human CD24 FITC( Cat. #11-0247-42)(eBiosciences) 및 항-Human CD44 PE(Cat. #12-0441-82)(eBiosciences) 단일클론 항체로 20분간 처리하였다. PBS 버퍼로 세정한 후 FACS Calibur (BD Biosciences)로 분석하였다.

그 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이, CD44high/CD24low population이, 카지놀 E를 처리하지 않은 대조군(control)은 38.3%인 반면, 2 uM의 카지놀 E를 처리한 군에서는 32.7%, 5 uM의 카지놀 E를 처리한 군에서는 30.0%로 감소하였다.

4-2. ALDH ( aldehyde dehydrogenase )

카지놀 E에 의한 암줄기세포 특이적인 성장저해 효과를 더욱 입증하기 위하여, Aldefluor assay를 이용하여 유방암 줄기세포 마커 효소인 ALDH+(양성) population이 감소되었는지 확인하였다.

구체적으로, 유방암 세포주인 MCF-7(Korean Cell Line Bank)를 mammocult media에 씨딩한지 24시간 후에, 카지놀 E를 2일 동안 처리하였다. 이후, 세포를 accutase 처리하여 detaching한 후, ALDEFLUOR™ 키트를 이용하여 Aldefluor assay를 수행하였다. 이때, Aldefluor 기질은 37℃에서 30분간 배양하고, 5분간 원심분리하여(250 x g) 세포 펠렛을 얻고, 이 세포 펠렛을 Aldefluor detection buffer에 재현탁하였다. ALDH1 inhibitor인 DEAB(diethylaminobenzaldehyde)를 대조군으로 사용하였으며, ALDH1 발현은 flow cytometry법(FACSCalibur™, BD Bioscience)으로 평가하였다.

그 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이, ALDH+ population이, 카지놀 E를 처리하지 않은 대조군(control)은 6.47%인 반면, 2 uM의 카지놀 E를 처리한 군에서는 2.02%, 5 uM의 카지놀 E를 처리한 군에서는 1.29%로 감소하였다.

실시예 5: Erk / P90RSK pathway 저해

5-1. 암 줄기세포( CSC )와 일반 암세포(Cancer cell)의 비교

Erk(Extracellular signal-Regulated Kinase) 신호활성(signal activation)은 암줄기세포 성장 및 발암 촉진에 중요한 인자이기 때문에, 카지놀 E에 의해 Erk 경로가 저해되는지 확인하고자 웨스턴 블랏팅(western blotting)을 수행하였다.

이때, 유방암 세포주인 MCF-7(Korean Cell Line Bank)를 sphere forming conditioned media에서 1시간 동안 배양한 후, 1 uM, 2 uM, 5 uM의 카지놀 E를 48시간동안 처리한 후 공지의 방법으로 웨스턴 블랏팅하였다. 대조군으로는 housekeeping gene인 GAPDH와 β-actin을 이용하였다.

그 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이, 카지놀 E가 암줄기세포(CSC)에서 인산화된 Erk(p-Erk)의 발현은 증가시키는 한편, Erk의 downstream에서 인산화된 P90RSK(p-P90RSK)의 발현, 즉 활성화된 P90RSK의 발현을 감소시켜 결국 Erk 신호활성을 억제함을 알 수 있었다. 이러한 결과는, p-P90RSK 감소가 negative feedback으로 작용하여 p-Erk를 증가시키는 것으로 예상된다.

또한, CSC와 달리 일반 암세포(Cancer cell)에서는, 카지놀 E에 의해 인산화된 Erk(p-Erk)의 발현은 오히려 감소하는 것이 관찰되었다. 따라서, 카지놀 E는 일반 암세포에는 작용하지 않고 암줄기세포(CSC)만을 특이적으로 표적화하여 저해한다는 것을 알 수 있다.

5- 2. 카지놀 E와 카지놀 C의 비교

카지놀계 화합물중 카지놀 E 이외에 카지놀 C도 Erk/P90RSK pathway 저해효과가 있는지 확인하고자 웨스턴 블랏팅(western blotting)을 수행하였다.

이때, 폐암 세포주인 H226B를 sphere forming conditioned media에서 1시간 동안 배양한 후, 2 uM, 10 uM, 50 uM의 카지놀 E 및 카지놀 C를 48시간동안 처리한 후 공지의 방법으로 웨스턴 블랏팅하였다. 대조군으로는 housekeeping gene인 α-tubulin을 이용하였다.

그 결과, 도 6에 나타낸 바와 같이, 카지놀 E로 처리한 경우에는 Erk의 downstream에 있는 인산화된 P90RSK(p-P90RSK)의 발현, 즉 활성화된 P90RSK의 발현을 감소시키는 반면, 카지놀 C로 처리한 경우에는 감소 효과가 관찰되지 않았다.

따라서, 카지놀계 화합물중 카지놀 E가 특이적으로 Erk/P90RSK pathway에 작용한다는 것을 알 수 있다.

5-3. 카지놀 E에 의한 Erk 효소활성 직접 저해 효과

카지놀 E가 Erk 효소의 활성을 직접적으로 저해하는지 더욱 확인하기 위하여, in vitro kinase assay를 수행하였다.

우선, 50ng의 활성형 Erk와 0.4, 2, 10 및 50 uM의 카지놀 E를 각각 상온에서 10분간 preincubating시킨 후, 각각의 반응혼합물에 His-RSK2 328-740(400 ng) 및 cold ATP(100 uM)를 가하였다. RSK에 대한 Erk의 Kinase 반응은 30℃에서 30분간 진행한 후, 6× SDS 샘플버퍼를 가하여 95℃에서 5분간 가열함으로써 반응을 종료시켰다.

이후, 이 반응혼합물에 대하여 SDS-PAGE를 수행한 후 웨스턴 블랏팅에 의해 얻어진 밴드 강도는 NIH Image J computer program (ver 2.0)으로 측정하였다. 그 결과, 도 7에 나타낸 바와 같이, 카지놀 E가 10 uM 이상에서 인산화된 p90 RSK의 발현을 현저히 저해시킴을 확인하였는 바, 이러한 결과는 직접적인 Erk 효소 활성 저해제로서의 카지놀 E의 효능을 증명하는 것이다.

실시예 6: Wnt /β- catenin pathway 저해

Wnt 신호활성(signal activation)은 암줄기세포 성장 및 발암 촉진에 중요한 인자이기 때문에, 카지놀 E에 의해 Wnt 경로가 저해되는지 확인하고자 웨스턴 블랏팅(western blotting)을 수행하였다.

이때, 유방암 세포주인 MCF-7(Korean Cell Line Bank)를 sphere forming conditioned media에서 1시간 동안 배양한 후, 1 uM, 2 uM, 5 uM의 카지놀 E를 48시간동안 처리한 후 공지의 방법으로 웨스턴 블랏팅하였다. 대조군으로는 housekeeping gene인 GAPDH을 이용하였다.

그 결과, 도 8에 나타낸 바와 같이, 카지놀 E가 암줄기세포(CSC)에서 Wnt의 downstream에서 β-catenin의 발현을 감소시켜 결국 Wnt 신호활성을 억제함을 알 수 있었다.

또한, CSC와 달리 일반 암세포(Cancer cell)에서는, 카지놀 E에 의한 β-catenin의 발현 변화는 관찰되지 않았다. 따라서, 카지놀 E는 일반 암세포에는 작용하지 않고 암줄기세포(CSC)만을 특이적으로 표적화하여 저해한다는 것을 알 수 있다.

상기에서는 본 발명의 바람직한 실시예를 참조하여 설명하였지만, 해당 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 하기의 특허 청구의 범위에 기재된 본 발명의 사상 및 영역으로부터 벗어나지 않는 범위 내에서 본 발명을 다양하게 수정 및 변경시킬 수 있음을 이해할 수 있을 것이다.

Claims (10)

1. Erk 신호활성 억제제를 유효성분으로 함유하는, 암 줄기세포 성장 억제용 약학 조성물.
2. 제 1 항에 있어서, 상기 Erk 신호활성 억제제는 카지놀 E(Kazinol E) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염인 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
3. 제 2 항에 있어서, 상기 카지놀 E(Kazinol E)는 닥나무에서 추출된 것임을 특징으로 하는 약학 조성물.
4. 제 1 항에 있어서, 상기 암은 유방암인 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
5. 제 1 항에 있어서, 상기 암은 폐암 또는 뇌암인 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
6. Erk 신호활성 억제제를 유효성분으로 함유하는, 암 줄기세포 성장 억제용 식품 조성물.
7. 제 6 항에 있어서, 상기 Erk 신호활성 억제제는 카지놀 E(Kazinol E) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염인 것을 특징으로 하는 식품 조성물.
8. 제 6 항에 있어서, 상기 카지놀 E(Kazinol E)는 닥나무에서 추출된 것임을 특징으로 하는 식품 조성물.
9. 제 6 항에 있어서, 상기 암은 유방암인 것을 특징으로 하는 식품 조성물.
10. 제 6 항에 있어서, 상기 암은 폐암 또는 뇌암인 것을 특징으로 하는 식품 조성물.

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