CN105250987A

CN105250987A - 一种用于增强免疫力的蚕蛹生物活性小肽组合物

Info

Publication number: CN105250987A
Application number: CN201510743772.9A
Authority: CN
Inventors: 刘国飞; 柏道鸣
Original assignee: Anhui Biological Peptide Industry Research Institute
Current assignee: Bao Lei
Priority date: 2015-11-05
Filing date: 2015-11-05
Publication date: 2016-01-20

Abstract

本发明公开了一种增强免疫力的蚕蛹小肽有效部位组合物，属于中药领域。该组合物是由从蚕蛹中提取的蚕蛹小肽、从黄芪、茯苓、枸杞子中提取的黄芪茯苓枸杞子总多糖、从淫羊藿中提取淫羊藿总黄酮和从人参甘草中提取的人参甘草总皂苷按一定配比组成，加入药剂学常规辅料，制成各种机型，临床可用于增强免疫力，抗疲劳，抗衰老。

Description

一种用于增强免疫力的蚕蛹生物活性小肽组合物

技术领域

本发明涉及一种具有增强免疫力作用的中药有效部位组合物及其制备方法，具体地说从蚕蛹、黄芪、茯苓、枸杞子、淫羊藿、人参、甘草中提取的中药有效部位组合物及其制备方法，属于中药领域。

背景技术

人们通常把人体对外来侵袭、识别和排除异物的抵抗力称为“免疫力”，现代免疫学认为，在正常情况下，机体保持平衡状态，并依靠免疫功能，抵抗各种感染，清除体内有害物质，当免疫功能异常时，自身平衡被打破，导致多种自身免疫性疾病，因此，免疫力是人体识别和排除“异己”的生理反应，主要通过免疫监视，免疫稳定和免疫防御来保持机体免受致病物质的侵害，维持机体内环境的稳定。随着人们生活节奏及人口老龄化进程的不断加快，工作繁忙，家庭不和谐，工业污染及等原因使的现代人的免疫力越来越弱，长此以往，出现了很多亚健康问题，如：营养不良、体质虚弱、精神萎靡、身倦无力等等，这些症状在几乎所有成年人身上都有不同程度的表现，尤以中老年人最为突出。因此增强免疫力，提高人体对病原的抵抗能力已成为当今人们日益重视的一个重大问题，随着科学技术的进步及公众健康意识的增强，免疫增强剂的医疗、保健作用越来越受到重视，各种保健品应运而生。

中医气血津液理论和现代免疫学基本理论存在着广泛联系。中医虚证可见于多种疾病过程中，其病因或由先天禀赋不足，或由后天失养，或由久病耗伤，或由劳倦过度等。中医理论指出：“正气存内，邪不可干”“邪之所腠，正气必虚”，人体正气强盛，可以控制邪气，使其不能发病；如果正气虚衰，则邪气易侵入机体而引起疾病，因此，中医提出了“扶正祛邪”的基本治疗法则。扶正是指扶助机体正气，增强体质，提高机体抗邪、抗病能力的一种治疗原则，通过增强正气的方法，驱邪外出，恢复健康状况。意在用“扶正”的中草药解决气血两虚、肝肾不足、脉络不通等常见中医虚证用，这与现代医学增强机体免疫力的方法是一致的。

免疫增强剂是近些年来出现的新药物，目前临床上应用的免疫增强剂种类繁多，效果各异，有些属于治标不治本，有些价格昂贵，且多为化学合成药物，存在毒副残留等弊端。因此寻找特性确定、高效、稳定、无毒的理想免疫增强剂将是未来抗御疾病的主要物质。中草药作为天然药物，其资源丰富、成本低廉，并且具有毒副作用小、无残留、作用广泛、不易产生抗药性、多靶点等特点，成为免疫增强剂的首选。而许多研究发现，大多数扶正天然物中草药及少数祛邪类天然物中草药具有促进免疫的作用，并具有毒副作用小，多功能作用、双相（向）调节作用。

发明内容

本发明的一个目的在于提供一种具有增强免疫力作用的中药有效部位组合物；

本发明的另一个目的在于提供上述中药组合物的制备方法和用途。

本发明的第一目的：以蚕蛹小肽、黄芪茯苓枸杞子总多糖、淫羊藿总黄酮和人参甘草总皂苷为原料，加入适当药用辅料，制成相关的剂型。

本发明药物的组合物的原料药的组成及配比为：蚕蛹小肽6～12重量份、黄芪茯苓枸杞子总多糖3～9重量份、淫羊藿总黄酮2～4重量份、人参甘草总皂苷2～4重量份。

本发明中药药物组合物优选的组成及配比为：蚕蛹小肽9重量份；黄芪茯苓枸杞子总多糖6重量份；淫羊藿总黄酮3重量份；甘草总皂苷3重量份。

上述小肽有效部位中小肽的含量为50%～90%，总多糖有效部位中黄芪多糖的含量为5%～10%，枸杞多糖的含量为1%～5%；总黄酮有效部位中淫羊藿苷的含量为5%～10%；总皂苷有效部位中人参皂苷Rg1和人参皂苷Re的总量为0.5%～1%，人参皂苷Rb1的含量为0.5%～2%，甘草苷的含量为1%～5%；

该药物组合物可以加入相应辅料，制成丸剂、片剂、颗粒剂、硬胶囊剂、软胶囊剂中的任一种。然后可以再加入其他具有增强免疫力的有效部位、有效成分、化学合成品或者半合成品，然后再加入相应辅料，制成丸剂、片剂、颗粒剂、硬胶囊剂、软胶囊剂中的任一种。

本发明中药组合物的制备方法包括以下步骤：

①蚕蛹小肽的制备：取蚕蛹，适当粉碎，加10倍量水匀浆5～15min，加热煮沸15min，放冷至室温，采用盐酸调pH至2.0±0.1，然后加入底物量1%的胃蛋白酶，在40℃条件下酶解2h，然后采用氢氧化钠溶液调节pH至8±0.1，加入底物量1%的胰蛋白酶，在40℃条件下酶解4h，时时搅拌并调节pH在8±0.1范围内，酶解完毕后继续升温煮沸15min，放冷，离心，收集上清液，调节pH6.5～7.0，加入2%的活性炭，搅拌均匀，滤过，滤液用截留相对分子质量为3kD的中空纤维膜进行超滤，收集透过液，再以截留相对分子质量为150D～300D的陶瓷膜进行纳滤，收集未透过液，减压浓缩，干燥，得蚕蛹小肽；其中蚕蛹小肽的含量为50%～90%。

②黄芪茯苓枸杞子总多糖的制备：取黄芪3重量份、茯苓2重量份和枸杞子1重量份，加14倍量水提取2次，每次2h，滤过，滤液合并，减压浓缩至每ml含1g生药，加乙醇至含醇量40%，冷藏静置12h，滤过，滤液继续加乙醇至含醇量80%，收集沉淀，反复纯化沉淀，加5～20倍量水使充分溶解，加入0.5%～5%鞣酸，混匀，静置12h，离心，取上清液加入0.5%～5%活性炭，于80℃保温脱色3次，每次0.5h，滤过，滤液减压浓缩，干燥，得黄芪茯苓枸杞子总多糖；其中黄芪多糖的含量为5%～10%，枸杞多糖的含量为1%～5%。

③淫羊藿总黄酮的制备：取淫羊藿，加10倍量70%乙醇回流提取2次，每次1.5h，滤过，滤液合并，减压回收乙醇，加水稀释浓缩液，按照树脂量：药材量为1:1通过大孔树脂柱，先以5～10倍量去离子水洗脱，再以5～10倍量70%乙醇以2BV/h的速度进行洗脱，收集4BV洗脱液，减压回收乙醇并浓缩，干燥，得淫羊藿总黄酮；最后采用50～60℃热碱液和95%乙醇再生树脂，进行下一轮纯化；其中淫羊藿苷的含量为5%～10%。

④人参甘草总皂苷的制备：取人参2重量份和甘草1重量份，适当粉碎，加12倍量水提取2次，每次2h，滤过，滤液合并，减压浓缩至每1ml含1g生药，按照树脂量：药材量为1:1通过大孔树脂柱，先以5～10倍量去离子水洗脱，再用5～10倍量pH为8～9的50%乙醇以2BV/h的速度进行洗脱，收集4BV洗脱液，减压回收乙醇并浓缩，干燥，得人参甘草总皂苷；最后采用50～60℃碱液和95%乙醇进行再生树脂，进行下一轮纯化；其中人参皂苷Rg1和人参皂苷Re的含量为0.5%～1%，人参皂苷Rb1的含量为0.5%～2%，甘草苷的含量为1%～5%。

⑤按照比例取上述蚕蛹小肽、黄芪茯苓枸杞子总多糖、淫羊藿总黄酮、人参甘草总皂苷，不加辅料或加入辅料，制成药学上可以接受的剂型。

本发明中采用的大孔吸附树脂可以使丙烯酸类、苯乙烯类、甲基丙烯酸酯类等常用树脂，如D101、D201、AB-8等；采用的水洗脱均为去离子水。

蚕蛹小肽采用比色法测定多肽的含量。测定方法如下：（1）对照品溶液的制备：称取10mg，精密称定，置50ml容量瓶中，加水适量溶解至刻度，摇匀，即得对照品溶液。（2）供试品溶液的制备：取本发明组合物0.2g，精密称定，置50ml容量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，备用。（3）测定法：精密量取对照品溶液0.0ml，0.2ml，0.4ml，0.6ml，0.8ml，1.0ml。分别置具塞试管中，各加水至1.0ml，再分别加碱性铜试液1.0ml，摇匀，各加入福林酚试液4.0ml，立即混匀，置55℃水浴中反应5min，取出，置冷水浴中冷却10min，照紫外-可见分光光度法，以0号管为空白，在650nm的波长处测定吸光度A，绘制标准曲线，计算回归方程。取上述供试品溶液1ml，置具塞试管中，照标准曲线的制备项下的方法，自“分别加碱性铜试液1.0ml”起，依法测定吸光度A，将吸光度A代入标准曲线计算样品含量。（4）结果以多肽含量计，比色法测定蚕蛹小肽中总肽的含量不低于50%。

黄芪茯苓枸杞子总多糖的含量测定方法为以无水葡萄糖作对照比色法测定总糖的含量。测定方法如下：（1）对照品溶液的制备：精密称取无水葡萄糖对照品25mg，置250ml量瓶中，加水适量溶解，稀释至刻度，摇匀，即得(每1ml中含无水葡萄糖0.1mg)。（2）供试品溶液的制备：取本发明组合物0.2g，精密称定，加乙醚100ml。加热回流1小时，静置，放冷，小心弃去乙醚液，残渣置水浴上挥尽乙醚。加入80％乙醇100ml，加热回流l小时，趁热滤过，滤渣与滤器用热80％乙醇30ml分次洗涤，滤渣连同滤纸置烧瓶中，加水150ml，加热回流2小时。趁热滤过，用少量热水洗涤滤器，合并滤液与洗液，放冷，移至250ml量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，即得。（3）测定法：精密量取对照品溶液0.2ml、0.4ml、0.6ml、0.8ml、1.0ml，分别置具塞试管中，分别加水补至2.0ml，各精密加入5％苯酚溶液1ml，摇匀，迅速精密加入硫酸5ml，摇匀，放置10分钟，置40℃水浴中保温15分钟，取出，迅速冷却至室温，以相应的试剂为空白，照紫外-可见分光光度法，在490nm的波长处测定吸光度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线。精密量取上述供试品溶液1ml，置具塞试管中，加水1.0ml，照标准曲线的制备项下的方法，自“各精密加入5％苯酚溶液1ml”起，依法测定吸光度A，将吸光度A代入标准曲线计算样品含量。（4）结果以无水葡萄糖计，比色法测定黄芪茯苓枸杞子总多糖中多糖的含量不低于50%。

淫羊藿总黄酮的含量测定方法为以淫羊藿苷为对照分光光度法法测定，含总黄酮以淫羊藿苷计。测定方法如下：（1）对照品溶液的制备：取淫羊藿苷对照品2.5mg，精密称定，置25ml容量瓶中，加70%乙醇至刻度，即得对照品溶液。（2）供试品溶液的制备：取本发明组合物0.5g，精密称定置具塞锥形瓶中，精密加入稀乙醇20ml，称定重量，超声处理1小时，再称定重量，用70%乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液。（3）测定法：精密量取对照品溶液0.5ml、1.0ml、1.5ml、2.0ml、2.5ml，分别置10ml具塞试管中，分别加70%乙醇至刻度，以70%乙醇为空白，采用紫外-可见分光光度法，在270nm波长处测定吸光度,以对照品溶液浓度为横坐标，以吸光值为纵坐标，绘制标准曲线，得直线回归方程，计算总黄酮的含量。（4）结果以淫羊藿苷计，分光光度法测定淫羊藿总黄酮中总黄酮的含量不低于50%。

比色法测定人参甘草总皂苷中人参皂苷的含量。测定方法如下：（1）对照品溶液的制备：称取10mg人参皂苷Re对照品适量，精密称定，置10ml容量瓶中，加甲醇制成每1ml含1mg的溶液，即得。（2）供试品溶液的制备：取本发明组合物50mg，精密称定，置25ml量瓶中，加甲醇适量使溶解并稀释至刻度，摇匀，备用。（3）测定法：精密吸取对照品溶液20μl、40μl、80μl、120μl、160μl、200μl，分别置于具塞试管中，低温挥去溶剂，加入1％香草醛高氯酸试液0.5ml，置60℃恒温水浴上充分混匀后加热15分钟，立即用冰水冷却2分钟，加入77％硫酸溶液5ml，摇匀；以试剂作空白。消除气泡后照紫外-可见分光光度法，在540nm的波长处测定吸光度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标绘制标准曲线。精密吸取供试品溶液50ul，照标准曲线的制备项下的方法，自“置于具塞试管中”起依法操作，测定吸光度，从标准曲线上读出供试品溶液中人参皂苷Re的量，计算结果乘以0.84，即得。（4）结果以人参皂苷Re计，比色法测定人参甘草总皂苷中人参皂苷的含量不低于60%。

经过发明人的对比优选后，确定了上述有效部位的最佳重量配比为：蚕蛹小肽9重量份、黄芪茯苓枸杞子总多糖6重量份、淫羊藿总黄酮3重量份、人参甘草总皂苷3重量份。按照比例取上述蚕蛹小肽、黄芪茯苓枸杞子总多糖、淫羊藿总黄酮、人参甘草总皂苷，不加辅料或加入药剂学常规辅料，制成药学上可以接受的剂型。

本发明药物组合物可制成的剂型为丸剂、片剂、颗粒剂、硬胶囊剂、软胶囊剂。

以上所说的药剂学常规辅料包括但不限于润滑剂，如滑石粉、硬脂酸镁、微粉硅胶和聚乙二醇；崩解剂，如羧甲淀粉钠、低取代羟丙甲纤维素、交联羧甲基纤维素；吸收促进剂，如季铵化合物；表面活性剂，如十六烷醉、十二烷基硫酸钠；粘合剂，如纤维素衍生物、藻酸盐、明胶和聚乙烯吡咯烷酮；赋形剂，如乳糖、淀粉、蔗糖、糊精、碳酸钙、硫酸铝、氧化镁、硬脂酸镁、碳酸氢钠、甘油、丙二醇、聚乙二醇、山梨糖醇、羊毛脂、凡士林、微晶纤维素、蜂腊、木腊、液体石蜡、树脂、高级蜡、压敏胶、半合成脂肪酸脂等。

本发明有效部位组合物用于增强免疫力，抗疲劳，抗衰老。

有益效果

本发明中药组合物，是按传统中医药理论同时结合现代医学研究成果组方而成，具备中医学特色，同时符合现代医学的治疗原则。

免疫识别是诱导和触发机体产生免疫应答反应或者决定免疫系统处于耐受状态的重要免疫过程,是免疫学研究中的一个关键科学问题。以往人们对于获得性免疫(T细胞与B细胞)的免疫识别的细胞与分子机制研究很多,研究了抗原结构包括蛋白抗原结构、多肽抗原、表位抗原结构对免疫识别的影响。对抗原结构的研究目前多集中于研究抗原表位的结构特点,根据其识别特征的不同,抗原表位包括B细胞表位、Th细胞表位、CTL细胞表位、MHC限制表位等；根据其免疫效应的差异,抗原表位包括免疫保护性表位以及毒性或抑

制性、优势非中和性、病理与自身抗原交叉反应性等不利于保护性免疫的表位结构。近年来对中药的研究结果显示,多种中药中含有的有机酸类、多糖类、苷类

、生物碱类和挥发油类等物质,能够使机体自身的适应力和免疫功能得到充分发挥和全面调整进而达到预防疾病的目的。多糖在对机体的免疫力的调节上发挥一定的作用,可使免疫细胞得到激活对补体系统也有重要的影响沮能诱发产生细胞因子。

本发明以传统中医理论为指导思想，同时结合国内外的相关研究成果，在增强免疫力方面效果显著。方中以蚕蛹为君，蚕蛹味甘，性平，功能祛风、健脾、止消渴、镇惊安神、益精助阳，为增强免疫力常用药，可以生津止渴、消食理气，发挥提高免疫力、延缓衰老之用，故为君，对增强免疫力起主要作用；研究表明蚕蛹含有丰富的蛋白质和氨基酸，对机体糖、脂肪代谢能起到一定的调整作用，蚕蛹中含有一种广谱免疫物质；现代药理研究亦证明，蚕蛹具有抑制金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和绿脓杆菌的作用，具有较好的消炎和抗感染作用。人参味甘，性温，归脾、肺、心、肾经，自古誉为“百草之王”“滋阴补生，扶正固本”之极品，具有大补元气，复脉固脱，补脾益肺，生津养血，安神益智之功效；药理研究表明人参对中枢神经系统、心血管系统、内分泌系统鱼哦明显的平衡作用。黄芪味甘，性温，功能补气升阳，固表止汗，利水消肿，生津养血，行滞通痹，托毒排脓，敛疮生肌；现代医学研究表明，黄芪有增强机体免疫功能、保肝、利尿、抗衰老、抗应激、降压和较广泛的抗菌作用。淫羊藿味辛甘，性温，具有补肾阳，强筋骨，祛风湿之效，用于肾阳虚衰，阳痿遗精，筋骨痿软，风湿痹痛，麻木拘挛。人参、黄芪均属补气良药，人参偏重于大补元气，黄芪则以补虚为主，与淫羊藿三者合用旺气生血壮阳，共为臣药，起到协调配合君药的疗效。茯苓味甘，性平，有利水渗湿，健脾，宁心之效。枸杞子性平，味甘，具有滋补肝肾，益精明目之功效；大量的实验药理学研究表明，具有免疫调节、抗肿瘤、抗衰老等多种生物学作用。两者共为佐药，阴阳调和，温而不燥。甘草味甘，性平，主五脏六腑寒热邪气，可以补脾益气，清热解毒，祛痰止咳，缓急止痛，调和诸药，同时对疾病引起的胃部不适具有调理和治疗作用。本复方可以缓和因人体衰老、生活工作压力过大等原因产生的免疫力下降等一系列身体状况，达到肝肾阴阳同补、固本扶元、祛邪调理的作用。

本发明产品成分明确，疗效稳定，服用量小，安全性高，不仅符合传统中医药增强免疫力的组方原则，而且符合中药现代化的发展要求，对推动医药产业从仿制向自主创新转变以及对推动我国中药国际化具有重要意义。经查阅相关文献和专利，未检索到以蚕蛹、黄芪、茯苓、枸杞子、淫羊藿、人参、甘草的有效部位做为原料，生产加工并制成适宜药物制剂用于增强免疫力的保健或辅助治疗的报道。

为进一步验证本发明的药理作用，用本发明片剂进行动物药效学实验。

试验内容：

对免疫抑制小鼠免疫器官重量的影响、ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞转化实验。

1试剂、样品和动物

1.1试剂

玉屏风颗粒广东环球制药公司批号：20144572

环磷酰胺山东齐鲁制药公司批号：20150219

Hank’s试液上海抚生实业有限公司

MTT上海谱振生物科技有限公司

ConA液上海抚生实业有限公司

酸性异丙醇济南世纪通达化工有限公司

1.2供试样品

样品1：（本发明片剂）

取蚕蛹5kg，适当粉碎，加10倍量水匀浆15min，加热煮沸15min，放冷至室温，采用盐酸调pH至2.0±0.1，然后加入底物量1%的胃蛋白酶，在40℃条件下酶解2h，然后采用氢氧化钠溶液调节pH至8±0.1，加入底物量1%的胰蛋白酶，在40℃条件下酶解4h，时时搅拌并调节pH在8±0.1范围内，酶解完毕后继续升温煮沸15min，放冷，离心，收集上清液，调节pH7.0，加入2%的活性炭，搅拌均匀，滤过，滤液用截留相对分子质量为3kD的中空纤维膜进行超滤，收集透过液，再以截留相对分子质量为150D～300D的瓷膜进行纳滤，收集未透过液，减压浓缩，干燥，得蚕蛹小肽（含量为60%）；取黄芪3kg、茯苓2kg、枸杞子1kg，加14倍量水提取2次，每次2h，滤过，滤液合并，减压浓缩至每ml含1g生药，加乙醇至含醇量40%，冷藏静置12h，滤过，滤液继续加乙醇至含醇量80%，收集沉淀，反复纯化沉淀，加10倍量水使充分溶解，加入2%鞣酸，混匀，静置12h，离心，取上清液加入2%活性炭，于80℃保温脱色3次，每次0.5h，滤过，滤液减压浓缩，干燥，得黄芪茯苓枸杞子总多糖（含量为60%）；取淫羊藿3kg，加10倍量70%乙醇回流提取2次，每次1.5h，滤过，滤液合并，减压回收乙醇，加水稀释浓缩液，按照树脂量：药材量为1:1通过大孔树脂柱，先以6倍量去离子水洗脱，再以6倍量70%乙醇以2BV/h的速度进行洗脱，收集6BV洗脱液，减压回收乙醇并浓缩，干燥，得淫羊藿总黄酮（含量为55%）；最后采用50～60℃热碱液和95%乙醇再生树脂，进行下一轮纯化；取人参2kg，甘草1kg，适当粉碎，加12倍量水提取2次，每次2h，滤过，滤液合并，减压浓缩至每1ml含1g生药，按照树脂量：药材量为1:1通过大孔树脂柱，先以6倍量去离子水洗脱，再用6倍量pH为8.5的50%乙醇以2BV/h的速度进行洗脱，收集6BV洗脱液，减压回收乙醇并浓缩，干燥，得人参甘草总皂苷（含量为70%）；最后采用50～60℃碱液和95%乙醇进行再生树脂，进行下一轮纯化得。

取蚕蛹小肽180g、黄芪茯苓枸杞子多糖120g、淫羊藿总黄酮60g、人参甘草总皂苷60g，加入85g的淀粉和12g的硬脂酸镁，用90%乙醇为润湿剂制颗粒，压片，包衣，即得片剂，每片0.3g。

样品2：（本发明胶囊剂）

采用样品1制备的有效部位原料。

取蚕蛹小肽90g、黄芪茯苓枸杞子总多糖60g、淫羊藿总黄酮30g、人参甘草总皂苷30g，加入95g的微晶纤维素和3g的硬脂酸镁，用90%乙醇为润湿剂制软材，过筛，60℃干燥，整粒，填装胶囊，即得胶囊剂，制成1000粒。

样品3：

采用样品1制备的有效部位原料。

取蚕蛹小肽30g、黄芪茯苓枸杞子总多糖100g、淫羊藿总黄酮60g、人参甘草总皂苷30g，加入100g的微晶纤维素和3.3g硬脂酸镁，用90%乙醇为润湿剂制颗粒，60℃干燥，填装胶囊，即得胶囊剂，制成1000粒，每粒0.3g%。

样品4：

采用样品1制备的有效部位原料。

取蚕蛹小肽45g、黄芪茯苓枸杞子总多糖30g，淫羊藿总黄酮15g，金银花提取物15g，加入80g糊精、26g淀粉、105g乳糖，用90%乙醇为润湿剂制软材，经挤压过12目筛，成湿颗粒，干燥，整粒，即得颗粒剂。

给药前，取上述相应制剂，研细，采用纯水配制成所需要的药物浓度。

1.3实验动物

健康雄性ICR小鼠130只，由山东中医药大学试验动物中心提供。

2实验方法

2.1对免疫抑制小鼠免疫器官重量的影响

健康雄性ICR小鼠70只随机分为7组:正常对照组、环磷酰胺致免疫力低下小鼠模型对照组、阳性药物组、样品1组、样品2组、样品3组、样品4组。参考造模方法，实验第1天，动物按体重灌胃给药，连续7天，每天1次，正常对照组、模型对照组灌胃蒸馏水；实验第4天，除正常对照组外，各组分别以50mg/kg体重腹腔注射环磷酰胺，连续3天，造成动物免疫抑制模型。于末次给药后1h处死动物，称量体重，并解剖取胸腺和脾脏称重，计算脏器指数。

脏器指数=脏器重量（mg）/体重（g）×100%

结果显示本发明组对于由于环磷酰胺所致小鼠免疫器官抑制具有良好的缓解作用。与正常对照组比较，模型对照组脾脏指数和胸腺指数都明显小于正常对照组；与模型对照组比较，各样品组均能显著增加脾脏指数和胸腺指数；各样品组相比较，样品1组、2组效果更好，与阳性药组相当，与正常对照组（p<0.05）和模型对照组组（p<0.05）相比都具有显著差异性。结果见表1。

表1对免疫器官重量的影响

组别	剂量（mg/kg）	脾脏指数（mg/10g）	胸腺指数（mg/10g）
				正常对照组	-	3.35±0.75	4.54±0.32
模型对照组	-	1.48±0.26	1.40±0.54
				阳性药对照组	10	1.92±0.31	2.15±0.35
样品1组	10	2.06±0.19	2.38±0.41
				样品2组	10	1.96±0.22	2.35±0.22
样品3组	10	1.69±0.18	1.89±0.14
				样品4组	10	1.57±0.41	1.45±0.34

注：与正常组比较P＜0.001；与模型组比较P＜0.05，P＜0.01。

说明本发明组对由于环磷酰胺所致小鼠免疫器官抑制具有治疗作用。

2.2ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞转化实验

健康雄性ICR小鼠60只随机分为6组:空白对照组、阳性药物组、样品1组、样品2组、样品3组、样品4组。参考造模方法，每组每只灌胃药液均为0.5mL，每日一次。连续灌胃30d后，颈椎脱臼处死小鼠，无菌取脾脏，用镊子轻轻将脾磨碎，制成单个细胞悬液。经200目筛网过滤，用Hank's液洗涤，1000r/min离心10min，共洗涤两次。然后调整细胞浓度为3×10⁶个/mL。将每份脾细胞悬液加入24孔培养板中，1mL/孔，2孔/样品，一孔加75μLConA液（相当于7.5ug/mL），mL），另一孔作为对照，置5%CO₂，37℃CO₂孵箱中培养72h。培养结束前4h，每孔轻轻吸去上清液0.7mL，加入0.7mL不含小牛血清的RPMI1640培养液，同时加入MTT（5mg/mL）50μL/孔，继续培养4h。培养结束后，每孔加入1mL酸性异丙醇，吹打混匀，使紫色结晶完全溶解。然后分装到96孔培养板中，每孔作3个平行样，用酶标仪，以570nm波长测定光密度值。

结果显示：样品组可显著提高光密度差值，在淋巴细胞增殖力上较空白对照组和阳性药物组均有显著提高；各样品组相比较，样品1组效果最好。与空白对照组（p<0.05）相比具有显著差异性，结果见表2。

表2ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞转化实验

组别	光密度差值
		空白对照组	0.072±0.016
阳性药物组	0.098±0.021
		样品1组	0.120±0.019
样品2组	0.114±0.021
		样品3组	0.101±0.027
样品4组	0.085±0.015

注：与空白对照组比较P＜0.001

具体实施方式

以下通过具体实施例来进一步阐明本发明的技术方案，但是本发明申请所要保护的内容不仅仅如此。实际生产中的用量不仅限于实例中的药物用量，可以用吨、千克、克等计量单位，但是各原料药物的用量配比仍依据本方明的技术方案。

实施例1：

处方：蚕蛹小肽90g黄芪茯苓枸杞子总多糖60g淫羊藿总黄酮30g

人参甘草总皂苷30g

制法：蚕蛹小肽的制备：取蚕蛹，适当粉碎，加10倍量水匀浆15min，加热煮沸15min，放冷至室温，采用盐酸调pH至2.0±0.1，然后加入底物量1%的胃蛋白酶，在40℃条件下酶解2h，然后采用氢氧化钠溶液调节pH至8±0.1，加入底物量1%的胰蛋白酶，在40℃条件下酶解4h，时时搅拌并调节pH在8±0.1范围内，酶解完毕后继续升温煮沸15min，放冷，离心，收集上清液，调节pH7.0，加入2%的活性炭，搅拌均匀，滤过，滤液用截留相对分子质量为3kD的中空纤维膜进行超滤，收集透过液，再以截留相对分子质量为150D～300D的瓷膜进行纳滤，收集未透过液，减压浓缩，干燥，得蚕蛹小肽其中水蛭小肽的含量为60%；

黄芪茯苓枸杞子总多糖的制备：取黄芪、茯苓、枸杞子，加14倍量水提取2次，每次2h，滤过，滤液合并，减压浓缩至每ml含1g生药，加乙醇至含醇量40%，冷藏静置12h，滤过，滤液继续加乙醇至含醇量80%，收集沉淀，反复纯化沉淀，加10倍量水使充分溶解，加入2%鞣酸，混匀，静置12h，离心，取上清液加入2%活性炭，于80℃保温脱色3次，每次0.5h，滤过，滤液减压浓缩，干燥，得黄芪茯苓枸杞子总多糖（含量为70%）；其中黄芪多糖的含量为7%，枸杞多糖的含量为4%；

淫羊藿总黄酮的制备：取淫羊藿，加10倍量70%乙醇回流提取2次，每次1.5h，滤过，滤液合并，减压回收乙醇，加水稀释浓缩液，按照树脂量：药材量为1:1通过大孔树脂柱，先以6倍量去离子水洗脱，再以6倍量70%乙醇以2BV/h的速度进行洗脱，收集6BV洗脱液，减压回收乙醇并浓缩，干燥，得淫羊藿总黄酮；最后采用50～60℃热碱液和95%乙醇再生树脂，进行下一轮纯化；其中淫羊藿苷的含量为8%；

人参甘草总皂苷的制备：取人参2kg，甘草1kg，适当粉碎，加12倍量水提取2次，每次2h，滤过，滤液合并，减压浓缩至每1ml含1g生药，按照树脂量：药材量为1:1通过大孔树脂柱，先以6倍量去离子水洗脱，再用6倍量pH为8.5的50%乙醇以2BV/h的速度进行洗脱，收集6BV洗脱液，减压回收乙醇并浓缩，干燥，得人参甘草总皂苷；最后采用50～60℃碱液和95%乙醇进行再生树脂，进行下一轮纯化得；其中人参皂苷Rg1和人参皂苷Re的含量为1%，人参皂苷Rb1的含量为1.2%，甘草苷的含量为4%；

取上述各有效部位，粉碎，混合，加入95g的微晶纤维素和3g硬脂酸镁，用150ml90%乙醇为润湿剂制软材，过筛，60℃干燥，整粒，装0号胶囊，制成1000粒，即得。

实施例2：

处方：蚕蛹小肽180g黄芪茯苓枸杞子总多糖120g淫羊藿总黄酮60g

人参甘草总皂苷60g

取上述各有效部位，粉碎，混合，加入315g大豆油、30g蜂蜡和10g卵磷脂，混匀，压制成软胶囊，制成1500粒，即得。

实施例3：

处方：蚕蛹小肽900g黄芪茯苓枸杞子总多糖600g淫羊藿总黄酮300g

人参甘草总皂苷300g

制法：取蚕蛹小肽、黄芪茯苓枸杞子多糖、淫羊藿总黄酮、人参甘草总皂苷，混匀，加入425g淀粉和60g的硬脂酸镁，用90%乙醇为润湿剂制颗粒，压片，包衣，制成8000片，即得片剂。

实施例4：

处方：蚕蛹小肽9kg黄芪茯苓枸杞子总多糖6kg淫羊藿总黄酮3kg

人参甘草总皂苷3kg

制法：取蚕蛹小肽、黄芪茯苓枸杞子多糖、淫羊藿总黄酮、人参甘草总皂苷，混匀，加入16kg糊精、5.2kg淀粉、21kg乳糖，用90%乙醇为润湿剂制软材，经挤压过12目筛，成湿颗粒，干燥，整粒，即得颗粒剂。

实施例5：

取实施例1所制片剂治疗43例肺气虚证患者。治疗方案：口服，一次3片，一日3次，4周为一个疗程。2个疗程后进行血、尿、便常规化验和心、肺功能检查，并观察：发热、恶寒，鼻部症状，咽部症状及全身情况以及查体温，咽扁桃体，舌象脉象，指纹等变化，分别进行疗效评价。结果：治愈16例，好转23例，无效4例，总有效率为90.7%。结果如下：

总数	好转	治愈	有效	无效
					43	23	16	39	4
总数%	好转率%	治愈率%	有效率%	无效率%
					100	53.5	37.2	90.7	9.3

实施例6：

取实施例2所制胶囊剂治疗29例体虚感冒、气虚感冒患者。治疗方案：口服，一次4粒，一日3次，服药1周后观察治疗前后临床症状、发热、恶寒及体温等变化，进行疗效评价。结果治愈18例，好转9例，无效2例，总有效率为。治疗结果如下：

总数	好转	治愈	有效	无效
					29	9	18	27	2
总数%	好转率%	治愈率%	有效率%	无效率%
					100	31	62	93	7

上述实施例仅用于说明本发明，而对本发明没有限制。

Claims

1.一种用于增强免疫力的蚕蛹小肽有效部位组合物，其特征在于是由从蚕蛹中提取的蚕蛹小肽，从黄芪、茯苓、枸杞子中提取的黄芪茯苓枸杞子总多糖，从淫羊藿中提取的淫羊藿总黄酮和从人参、甘草中提取的人参甘草总皂苷组成；其中，所述各原料的重量配比为：

蚕蛹小肽6～12重量份

黄芪茯苓枸杞子总多糖3～9重量份

淫羊藿总黄酮2～4重量份

人参甘草总皂苷2～4重量份。

2.如权利要求1所述的蚕蛹小肽有效部位组合物，其特征在于各原料的重量配比为：蚕蛹小肽9重量份、黄芪茯苓枸杞子总多糖6总量份、淫羊藿总黄酮3重量份、人参甘草总皂苷3重量份。

3.如权利要求1或2所述的蚕蛹小肽有效部位组合物，其特征在于其制备方法包含以下步骤：

蚕蛹小肽的制备：取蚕蛹，适当粉碎，加5～20倍量水匀浆5～15分钟，加热煮沸5～30分钟，放冷至室温，采用盐酸调pH至2.0±0.1，然后加入底物量0.5%～10%的胃蛋白酶，在30℃～45℃条件下酶解1～6h，然后采用氢氧化钠溶液调节pH至7～10，加入底物量0.5%～10%的胰蛋白酶，在45℃～55℃条件下酶解1～6h，时时搅拌并调节pH在7～10范围内，酶解完毕后继续升温煮沸5～15min，放冷，离心，收集上清液，调节pH6.5～7.0，加入1%～3%的活性炭，搅拌均匀，滤过，滤液用截留相对分子质量为3kD的中空纤维膜进行超滤，收集透过液，再以截留相对分子质量为150D～300D的陶瓷膜进行纳滤，收集未透过液，减压浓缩，干燥，得蚕蛹小肽有效部位；其中蚕蛹小肽的含量为50%～90%；

黄芪茯苓枸杞子总多糖的制备：取黄芪3重量份、茯苓2重量份和枸杞子1重量份，加8～20倍量水提取1～3次，每次2h，滤过，滤液合并，减压浓缩至每ml含1g生药，加乙醇至含醇量40%，冷藏静置12h，滤过，滤液继续加乙醇至含醇量80%，收集沉淀，反复纯化沉淀，加5～20倍量水使充分溶解，加入0.5%～5%鞣酸，混匀，静置12h，离心，取上清液加入0.5%～5%活性炭，于80℃保温脱色3次，每次0.5h，滤过，滤液减压浓缩，干燥，得黄芪茯苓枸杞子总多糖有效部位；其中黄芪多糖的含量为5%～10%，枸杞多糖的含量为1%～5%；

淫羊藿总黄酮的制备：取淫羊藿，加8～20倍量40%～95%乙醇回流提取1～3次，每次1.5h，滤过，滤液合并，减压回收乙醇，加水稀释浓缩液，按照树脂量：药材量为1:1通过大孔树脂柱，先以5～10倍量去离子水洗脱，再以5～10倍量70%乙醇洗脱，收集洗脱液，减压回收乙醇并浓缩，干燥，得淫羊藿总黄酮有效部位；其中淫羊藿苷的含量为5%～10%；

人参甘草总皂苷的制备：取人参2重量份和甘草1重量份，适当粉碎，加8～20倍量水提取1～3次，每次2h，滤过，滤液合并，减压浓缩至每1ml含1g生药，按照树脂量：药材量为1:1通过大孔树脂柱，先以5～10倍量去离子水洗脱，再用5～10倍量pH为8～9的50%乙醇洗脱，收集洗脱液，减压回收乙醇并浓缩，干燥，得人参甘草总皂苷有效部位；其中人参皂苷Rg1和人参皂苷Re的总量为0.5%～1%，人参皂苷Rb1的含量为0.5%～2%，甘草苷的含量为1%～5%；

按照各有效部位的重量配比取上述四份有效部位，不加辅料或加入药剂学常规辅料，制成药学上可以接受的剂型。

4.权利要求1或2所述的蚕蛹小肽有效部位组合物用于增强免疫力，抗疲劳，抗衰老。