CN101328487A

CN101328487A - 鸡腿菇液体转化桑叶的发酵液制备方法及其用途

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Publication number: CN101328487A
Application number: CNA2008100208894A
Authority: CN
Inventors: 张志才; 陈惠�; 郑惠华; 黄达明; 崔凤杰
Original assignee: JIANGSU ALPHAY BIOTECHNOLOGY CO Ltd; Jiangsu University
Current assignee: JIANGSU ALPHAY BIOTECHNOLOGY CO Ltd; Jiangsu University
Priority date: 2008-07-30
Filing date: 2008-07-30
Publication date: 2008-12-24
Anticipated expiration: 2028-07-30
Also published as: CN101328487B

Abstract

本发明涉及生物发酵及医药领域，本发明涉及鸡腿菇液体转化桑叶的发酵液制备方法，以及由该方法获得的含有该发酵液的药物或保健品。其以鸡腿菇为出发菌株，以桑叶为转化对象，进行液体摇瓶培养、一级种子培养和发酵培养，得到转化桑叶后鸡腿菇深层发酵液。本发明所述的发酵液为黄色至褐色，发酵液多糖含量高达1.5～2.5％，多酚类化合物含量为0.6～1.3％。所述的发酵液具有多种药物功能，可用于制备预防和治疗糖尿病及糖尿病并发症的药物或保健饮品。本发明不仅为深度开发利用鸡腿菇以及中药功效的增强提供了一种新方法，而且为预防和治疗糖尿病提供安全有效、生产过程易于控制的中药制剂。

Description

鸡腿菇液体转化桑叶的发酵液制备方法及其用途

技术领域

本发明涉及生物发酵及医药领域，具体的说本发明涉及鸡腿菇液体转化桑叶的发酵液制备方法，以及由该方法获得的含有该发酵液的药物或保健品。所述的发酵液具有多种药物功能，可用于制备预防和治疗糖尿病及糖尿病并发症的药物或保健饮品。

背景技术

糖尿病是目前中老年人的常见病和多发病，由糖尿病引起的并发症严重危及人们的生命健康。现有西药类降糖药物虽作用效果好，靶点清楚，长期服用易引起副作用。而中药毒副作用小，且来源广泛，成本较低，是用于治疗糖尿病的一个主要药物来源。

桑叶是桑科植物桑Morus alba L的干燥叶。桑叶作为中药，旱已在民间广泛应用。自古以来中医就用桑叶来治疗消渴证(相当于现代医学的糖尿病)。《木草纲日》记载：桑叶“汁煎代茗，能止消渴”、“灸热煎饮，代茶止渴”。近代医家也常将桑叶配伍于中药复方中应用于临床，收效甚好。现代药理研究证明桑叶具有抑制血糖上升之功效，可预防和治疗糖尿病。近年来，各国研究人员对桑叶的组成、功能和作用机理进行了系统地研究，结果发现桑叶中含有丰富的氨基酸、纤维素、维生素、矿物质以及多种生理活性物质，具有降血糖、降血压、降血脂、延缓哀老等多种保健功效。1996年，陈福君等用桑叶总多糖(TPM)对四氧嘧啶糖尿病小鼠进行腹腔汁射给药，结果表明TPM有显著的降血糖作用。但TPM的结构尚不清楚，有待进一步研究。2002年，陈金显等曾经对一种以桑叶为主要原料的保健品功效成分进行研究，结果表明桑叶多糖和生物碱均能明显降低四氧嘧啶糖尿病小鼠的空腹血糖，并有明显预防小鼠血糖升高的作用。2005年，吴志平等对桑树不同药用部位的降血糖效果进行了比较，发现桑叶、桑白皮、桑枝、桑皮这四中中药材都有明显的降血糖作用。尽管桑叶具有这些功效，但是桑叶仍具有中药的共性：见效慢，质量不稳定有时还具有副作用。如何克服桑叶缺点提高桑叶疗效呢？无疑生物转化是一个有效的手段。用于生物转化的菌种有多种，但药食用真菌转化桑叶具有安全无毒等特点，更受到科研工作者的青睐。

鸡腿菇，(Coprinus comatus)是药用真菌的一种，学名毛头鬼伞，隶属于真菌门(Eumycota)，担子菌亚门(Basidiomycotina)，层菌纲(Hymenomycetes)，伞菌目(Agaricales)，鬼伞科(Coprinaceae)，鬼伞属(Coprinus)。鸡腿菇肉质细嫩、鲜美可口、营养丰富。目前，该品种已被定为符合联合国粮农组织(FAO)和世界卫生组织(WHO)要求的集“天然、营养、保健”三种功能为一体的16种珍稀食用菌之一。近年来国内外对鸡腿菇的研究主要集中于它的驯化栽培、营养成分分析、液体培养以及菌丝体内多糖及药效等方面。1984年，英国阿斯顿大学Bailey C.J报道鸡腿菇含有降血糖的有效成分。1993年，黄年来用鸡腿菇水提物浓缩液饲养小鼠，1.5h有明显降低血糖浓度的效果。2000年，王玉萍等利用深层发酵方法获得获得富铬鸡腿菇发酵液，进行急性毒性试验，并对四氧嘧啶诱发的小鼠糖尿病模型做了降血糖试验。2002年，韩春超等研究了鸡腿菇发酵液与钒酸钠协同抑制小鼠血糖升高的作用。目前已经公布的鸡腿菇的8项专利主要是鸡腿菇的栽培和鸡腿菇多糖的提取以及鸡腿菇菌丝的棘状小球结构及其应用。

本发明与上述文献或相关专利区别在于本发明侧重于鸡腿菇转化桑叶，通过鸡腿菇在培养过程中与桑叶相互作用提高降血糖作用，鸡腿菇转化桑叶产生的培养液中多酚类化合物的提取方法以及这种培养液和多酚类化合物在预防和治疗糖尿病方面的应用。

发明内容

本发明的一个目的是提供了一种以鸡腿菇为菌种通过液体深层培养转化桑叶的方法，由该培养方法制备的鸡腿菇转化桑叶的发酵液，该发酵液具有调节血糖，预防和治疗糖尿病及其并发症的功效。

本发明所使用的鸡腿菇菌种可选用任意一种鸡腿菇菌种，例如河南、河北、江苏或山西的野生鸡腿菇经常规组织分离得到的菌种。本发明含有鸡腿菇转化桑叶的生产工艺包括以鸡腿菇为出发菌株，以桑叶为原料，进行液体摇瓶培养、一级种子培养和发酵培养，得到鸡腿菇转化桑叶的发酵液。

更具体地，本发明涉及鸡腿菇以桑叶为原料进行深层培养的生产工艺包括以下步骤：

(1)在本发明所述的发酵工艺中，在进行发酵培养之前，首先将鸡腿菇的斜面菌种接入新配制的斜面培养基中进行活化培养，培养温度20～35℃，培养时间72～240小时；其中所述的斜面培养基是现有技术中常用的斜面培养基，例如常用的是PDA培养基，此类培养基的组成和所用可参见诸葛健，王正祥，工业微生物实验技术手册，1994：P 367；

(2)将步骤(1)的斜面菌种按5～10％(v/v)的接种量转接入装有摇瓶培养基的三角瓶中，于20～35℃进行培养，转速60～200转/分钟，培养时间72～240小时，其中所述的培养基组成为(克/升)：葡萄糖5～10，玉米粉5～25，黄豆饼粉0.5～7，KH₂PO₄1～6，MgSO₄1～4，加水至适当体积，起始pH值为5.0～7.0；

(3)将上述步骤(2)得到的液体摇瓶培养的菌种按5～10％(v/v)的接种量转接入装有一级种子培养基的种子罐中进行培养，温度20～35℃，种子罐压力0.05Mpa，搅拌速率60～200转/分钟，通风量1∶0.3～2v/v/m，培养时间72～240小时。其中所述的一级种子罐培养的培养基组成为(克/升)：葡萄糖20～70，玉米粉10～20，麸皮5～30，黄豆饼粉3～10，桑叶粉5～30，KH₂PO₄2～4，MgSO₄1～4，消泡剂0.2～0.5，加水至适当体积，起始pH值为5.0～7.0；

(4)将上述种子罐中的菌种按5～10％(v/v)的接种量转接入装有含有桑叶的发酵培养基的发酵罐中进行培养，温度20～35℃，发酵罐压力0.05Mpa，搅拌速率60～200转/分钟，通风量1∶0.3～2v/v/m，培养时间100～180小时。其中所述发酵培养的培养基组成为(单位为克/升)：葡萄糖25～70，玉米粉10～20，麸皮5～30，黄豆饼粉3～10，桑叶粉5～30，KH₂PO₄2～4，MgSO₄1～4，CaCO₃0.5～1，消泡剂0.2～0.8，加水至适当体积，起始pH值为5.0～8.0；得到深层培养液3000～10000转/分钟离心去除菌丝体后即为鸡腿菇转化桑叶的发酵液。该发酵液浅黄色至深褐色，有中药味，有一定粘度的粘稠液体，其中含有菌丝体残渣形成的沉淀，该发酵液中多糖含量高达1.5～2.5％，多酚类化合物含量为0.6～1.3％。

本发明的另一目的在于提供了鸡腿菇转化桑叶发酵液另一项用途控制糖尿病病患着血糖。其特征是发酵液直接无菌灌装成为饮料，或浓缩成膏状制成膏剂，或浓缩干燥粉碎，制成含有该粉末的胶囊或片剂。

功能的检测方法为选取空腹血糖水平在3.5～6.3mmol/L范围的正常雄性昆明小鼠，正常小鼠在禁食24小时后，给予腹腔注射四氧嘧啶180mg/Kg体重，96小时后禁食，尾部静脉取血测血糖值，并选用血糖值在10mmol/l以上者再按血糖水平随即分成1个正常组，1个阳性对照组和3个样品组(每组10只，分别以桑叶提取物、鸡腿菇、鸡腿菇发酵液与桑叶的混合组和鸡腿菇转化桑叶组，按体重10mL/kg体重的量灌胃，其中正常组和阳性对照组给以等量的生理盐水)，每天灌胃1次，连续灌胃给药7天后，禁食4小时，眼眶静脉取血测定血糖值，比较了桑叶、鸡腿菇和鸡腿菇转化桑叶的降血糖作用。

上述试验给药7d后，鸡腿菇转化桑叶组与对照组相比，治疗组血糖均极显著降低(p＜0.01)，可见鸡腿菇转化桑叶7d即能显著降低高血糖小鼠血糖。

本发明经试验研究发现应用本发明的生物转化的方法，通过鸡腿菇和桑叶相互作用，生产的培养液经口服途径给予高血糖小鼠其降低血糖和果糖胺功能与单纯的鸡腿菇发酵液，纯的桑叶以及纯发酵液和桑叶的混合液相比显著增强，因此证实了鸡腿菇转化桑叶发酵液具有用于制备具有更强降血糖功能的保健饮品和/或药品的用途。应用本发明的鸡腿菇转化桑叶深层发酵方法，可以大规模或工业化生产鸡腿菇发酵液。由于该药物组合物中所含的鸡腿菇转化桑叶发酵液来源于天然菌种的发酵，因此没有任何毒副作用，从而为糖尿病患者提供了理想的药物，并为鸡腿菇的应用开创了广阔的前景。

具体实施方式

为了进一步阐述本发明的技术方案所涉及的材料及工艺，给出了下述实施例。但这些实施例不以任何方式限制本发明的范围。

实施例1鸡腿菇菌种的制备

取河北野生鸡腿菇新鲜未开伞的子实体，削去菌柄基部和菌柄外表皮，用75％乙醇进行子实体表面消毒后，移入超净工作台，紫外灯照射20min。将解剖刀在酒精灯火焰上灼烧后放人无菌水中降温，确保解剖刀温度不会损伤子实体组织。将子实体一分为二，在菌柄内(柄中)、菌柄与菌盖交界处(交界)、菌盖和菌褶处切割表皮内组织，黄豆大小的小块，切割时不能切透子实体表面组织。用无菌镊子接人试管斜面培养基(即为PDA培养基)，每种组织各接10支，25-28℃暗培养，每天定时观测菌丝生长污染情况，当长至4-10天时，用PDA培养基试管斜面转接。

实施例2鸡腿菇发酵液的制备

1、在新配制的土豆培养基(诸葛健，王正祥，工业微生物实验技术手册，1994：P 367)中接入实施例1得到的鸡腿菇菌种，培养温度20℃，待菌丝体长满斜面后，将斜面菌种接入装有60mL摇瓶培养基的250mL三角瓶中，于20℃、80转/分钟摇床培养144小时。其中所述摇瓶培养基的配方为(单位为克/升)：葡萄糖5，玉米粉12，黄豆饼粉0.6，KH₂PO₄1，MgSO₄1，起始pH值为5.3。

2、将上述摇瓶菌种2.5L接入装有44.9L一级种子培养基的75L种子罐中，种子罐中发酵液的总体为48.5L；维持罐温20℃，罐压0.05MPa，搅拌速率80转/分钟，通风量1∶0.3v/v/m，发酵时间85小时。其中种子罐中的一级种子培养基的配方为(单位为克/升)：葡萄糖20，玉米粉10，麸皮5，黄豆饼粉3，桑叶粉5，KH₂PO₄2，MgSO₄1，消泡剂0.2，起始pH值为5.2。

4、将48.5L一级种子菌种接入装有480L发酵培养基的800L发酵罐中，发酵罐中发酵液的总体为528.5L。维持罐温20℃，罐压0.05MPa，搅拌速率80转/分钟，通风量1∶0.5v/v/m，发酵时间106小时。其中发酵培养基的配方为(单位为克/升)：葡萄糖30，玉米粉10，麸皮5，黄豆饼粉3，桑叶粉5，KH₂PO₄2，MgSO₄1，CaCO₃0.5，，消泡剂0.25，起始pH值为6.0。

经上述步骤后得到鸡腿菇发酵液3000转/分钟离心后，液体桔黄色，具有香味，胞外多糖含量为1.5g/L，多酚类化合物含量为0.6。

实施例3鸡腿菇转化桑叶的制备

此实施例所用的菌种为实施例1得到的菌种。

1、在新配制的PDA培养基(诸葛健，王正祥，工业微生物实验技术手册，1994：P 367)中接入组织分离法得到的鸡腿菇菌种，培养温度27℃，待菌丝体长满斜面后，将斜面菌种接入装有75mL摇瓶培养基的250mL三角瓶中，27℃、120转/分钟摇床培养180小时。其中所述摇瓶培养基的配方为(单位为克/升)：葡萄糖7，玉米粉12，黄豆饼粉3，KH₂PO₄3，MgSO₄3，起始pH值为6.0。

2、将此摇瓶菌种1750mL接入装有28.5L一级种子培养基的50L种子罐中，种子罐中发酵液的总体为30L；维持罐温27℃，罐压0.05MPa，搅拌速率150转/分钟，通风量1∶1v/v/m，发酵时间180小时。其中所述一级种子罐培养基的配方为(克/升)：葡萄糖40，玉米粉15，麸皮20，黄豆饼粉8，桑叶粉17，KH₂PO₄3，MgSO₄2.5，消泡剂0.35，起始pH值为6.1。

3、将30L一级种子菌种接入装有380L发酵培养基的600L发酵罐中，发酵罐中发酵液的总体为410L；维持罐温25℃，罐压0.05MPa，搅拌速率120转/分钟，通风量1∶1.4v/v/m，发酵时间140小时。其中所述的发酵培养基的配方为(单位为克/升)：葡萄糖50，玉米粉15，麸皮17，黄豆饼粉8，桑叶粉15，KH₂PO₄3，MgSO₄3，CaCO₃0.7，消泡剂0.5，起始pH值为6.0。

得到鸡腿菇发酵液6000转/分钟离心去除菌丝体后发酵液为鸡腿菇保健饮品，该发酵液浅褐色，胞外多糖含量为2.0g/L，多酚类化合物含量为0.9％

实施例4鸡腿菇转化桑叶的制备

此实施例所用的菌种为实施例1得到的菌种。

1、在新配制的PDA培养基(诸葛健，王正祥，工业微生物实验技术手册，1994：P 367)中接入组织分离法得到的鸡腿菇菌种，培养温度33℃，待菌丝体长满斜面后，将斜面菌种接入装有100mL摇瓶培养基的250mL三角瓶中，33℃、180转/分钟摇床培养240小时。其中所述的培养基的组成为(克/升)：葡萄糖10，玉米粉25，黄豆饼粉7，KH₂PO₄6，MgSO₄6，起始pH值为7.0。

2、将此摇瓶菌种3000mL接入装有30L一级种子培养基的50L种子罐中，种子罐中发酵液的总体为31.5L；维持罐温35℃，罐压0.05MPa，搅拌速率200转/分钟，通风量1∶2v/v/m，发酵时间240小时。其中所述的一级种子罐培养的培养基组成为(克/升)：葡萄糖70，玉米粉20，麸皮30，黄豆饼粉10，桑叶粉30，KH₂PO₄4，MgSO₄4，消泡剂0.5，，起始pH值为7.0；

3、将30L一级种子菌种接入装有300L发酵培养基的500L发酵罐中，发酵罐中发酵液的总体为330L；维持罐温33℃，罐压0.05MPa，搅拌速率180转/分钟，通风量1∶2v/v/m，发酵时间180小时.其中所述发酵培养的培养基组成为(克/升)：葡萄糖70，玉米粉20，麸皮30，黄豆饼粉10，桑叶粉30，KH₂PO₄4，MgSO₄4，CaCO₃1，消泡剂0.8，起始pH值为8.0；

得到鸡腿菇发酵液10000转/分钟离心去除菌丝体后发酵液为鸡腿菇保健饮品，该发酵液深褐色，胞外多糖含量为2.5g/L，多酚类化合物含量为1.3％。

实施例5鸡腿菇转化桑叶发酵液降低四氧嘧啶诱导的糖尿病小鼠血糖试验。

实验动物：昆明小白鼠，雄性，体重为21-26g，由中科院上海实验动物中心提供。糖尿病小鼠模型制备：雄性小鼠禁食24小时后，腹腔注射160-200ug/kg四氧嘧啶造模型，5天后禁食3-5小时，测血糖，血糖值＞10mmol/l为实验性糖尿病模型鼠。分成1个正常组，1个阳性对照组和3个样品组(每组10只，分别以桑叶提取物、鸡腿菇、鸡腿菇+桑叶，其中正常组和阳性对照组给以等量的生理盐水)，每天灌胃1次，连续灌胃给药7天后，禁食4小时，眼眶静脉取血测定血糖值。

三个实施例制得的发酵液降血糖试验结果(下表)显示和阳性对照组相比，桑叶提取物，纯鸡腿菇发酵液组，鸡腿菇转化桑叶组血糖值显著低于阳性对照组(p＜0.01)，说明这三种供试药物在试验剂量浓度范围内产生显著降血糖作用。同时鸡腿菇转化桑叶组血糖显著低于桑叶组和纯鸡腿菇发酵液组。

不同发酵液对四氧嘧啶高血糖小鼠调节血糖作用的比较(mmol/L)

以上已详细描述了本发明的实施方案，对本领域技术人员来说很显然可以做很多改进和变化而不会背离本发明的基本精神。所有这些变化和改进都在本发明的保护范围之内。

Claims

1、鸡腿菇液体转化桑叶的发酵液制备方法，其特征在于以鸡腿菇为出发菌株，以桑叶为转化对象，进行液体摇瓶培养、一级种子培养和发酵培养，得到转化桑叶后鸡腿菇深层发酵液，其中所述的液体摇瓶菌种培养工艺为：用接种铲将斜面菌种划成5×5mm，挑5～10块转接入装有摇瓶培养基的三角瓶中，于20～35℃，转速60～200转/分钟摇床上，培养100～180小时；其中所述的一级种子培养工艺为摇瓶菌种按5～20％v/v的接种量转接入装有一级种子培养基的种子罐中进行培养，温度20～35℃，种子罐压力0.05Mpa，搅拌速率90～200转/分钟，通风量1∶0.3～2v/v/m，培养时间24～48小时；其中所述的发酵工艺为种子罐中的菌种按5～20％的接种量转接入装有含有桑叶发酵培养基的发酵罐中，温度20～35℃，发酵罐压力0.05Mpa，搅拌速率90～200转/分钟，通风量1∶0.3～2v/v/m，培养时间100～180小时；其中所述的液体摇瓶培养基组成为，以克/升为单位：葡萄糖5～40，玉米粉5～25，黄豆饼粉0.5～7，KH₂PO₄1～6，MgSO₄1～4，起始pH值为5.0～7.0；其中所述的一级种子培养基为，以克/升为单位：葡萄糖5～10，玉米粉5～25，黄豆饼粉0.5～7，KH₂PO₄1～6，MgSO₄1～4，豆油0.2～0.5，起始pH值为5.0～7.0；其中所述发酵培养的培养基组成为，单位为克/升：葡萄糖20～70，玉米粉10～20，麸皮5～30，黄豆饼粉3～10，桑叶粉5～30，KH₂PO₄2～4，MgSO₄1～4，CaCO₃0.5～1，消泡剂0.2～0.8，起始pH值为5.0～8.0，得到此发酵液即为鸡腿菇转化桑叶的深层发酵液。

2、按照权利要求1所述的鸡腿菇液体转化桑叶的制备得到的发酵液的用途，其特征在于发酵液用于制备预防和治疗糖尿病及糖尿病并发症的药物或保健品。

3、按照权利要求1所述的鸡腿菇液体转化桑叶的制备得到的发酵液的用途，其特征在于发酵液用于制备具有血糖调节功能的适于应用的片剂、胶囊这些常规剂型，以及适于口服的净膏和饮料。