CN101401827B - 古尼拟青霉菌丝体多糖提取物的制药用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了古尼拟青霉菌丝体及其提取物的镇静药物用途，具体地说，古尼拟青霉菌丝体及其提取物具有镇静作用，可以作为镇静类药物。属于医药用途发明。
Description
技术领域
本发明涉及古尼拟青霉菌丝体及其提取物的新医药用途，具体的说，涉及古尼拟青霉菌丝体及其提取物的镇静药物用途。
背景技术
随着对虫草研究的不断深入，古尼虫草逐渐成为继冬虫夏草后又一种重要的虫草资源。自1983年古尼虫草在我国首次报道后，梁宗琦等对其菌种分离、无性型确定、营养成分、药理实验及液体发酵等多方面作了大量的研究工作，表明古尼虫草在提高机体免疫力、促进睡眠和增强记忆力、镇痛等方面有十分重要的作用。随着实验技术的不断提高，古尼虫草仍然具有很大的应用研究潜力。
1985年，梁宗琦在国内首先报道并确认古尼虫草无性型古尼拟青霉(Paecilomyces gunnii liang)是拟青霉的新种。古尼拟青霉(Paecilomyces gunnii Z.Q.Liang)(RCEF0864)在提高机体免疫力、增强记忆力、镇痛等方面有十分重要的作用。它的毒性研究表明，古尼拟青霉属无毒性药物，特殊毒理研究表明，它没有致畸、致突变、致瘤作用。
中国专利申请公开CN101002592A公开了古尼拟青霉菌丝体及其发酵产物作为饲料添加剂，用于改善禽肉风味、营养和口感。
现有技术尚无古尼拟青霉在镇静方面医药用途的相关报道和应用。
发明内容
本发明提供了古尼拟青霉菌丝体及其提取物的一种新医药用途，具体的，是其用于制备镇静药物的用途。
其中，上述所述的用途，所述的药物是以治疗有效量的古尼拟青霉菌丝体或其提取物为活性成分与药学上可接受的辅料而制成的。其中，所述的治疗有效量，古尼拟青霉菌丝体一般为0.30-0.60g/kg，或其提取物一般为0.6-2.4g/kg。所述的辅料，没有特别限制，可以是制药工业上常规的药剂辅料或赋形剂。可以通过本领域常规的制药工艺，将所述的药物活性成分古尼拟青霉菌丝体或其提取物与药物辅料通过本领域合适药剂工艺制成所需要的制剂。
其中，上述所述的用途，其所述的药物可以为口服制剂，也可以为注射制剂，没有特别限制。也可以为固体制剂，例如胶囊、片剂等，也可以为液体制剂，例如口服液、混悬剂、注射液等。
本发明所述的上述用途，其中所述的古尼拟青霉菌丝体，是由古尼拟青霉菌经发酵工艺产生的菌丝体。其发酵工艺可以是现有技术已知工艺，例如中国专利申请公开CN101002592A披露的古尼拟青霉菌丝体及其发酵工艺，其全文引入本申请作为参考。
进一步地，所述的用途，其特征在于所述的古尼拟青霉菌丝体由古尼拟青霉菌(Paecilomyces gunnii Z.Q.Liang)经斜面菌种培养、液体摇瓶培养、种子罐培养、发酵罐发酵培养等步骤而得到的菌丝体，其中古尼拟青霉菌(Paecilomyces gunnii Z.Q.Liang)保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，编号为CGMCC No.2682。
优选地，上述所述的用途，其所述的斜面菌种培养的培养基为SDAY培养基，原料重量配比为：葡萄糖40g、蛋白胨10g、酵母浸出粉10g、琼脂20g，加水至1L，pH6.5。
优选地，上述所述的用途，其所述的液体摇瓶培养、种子罐培养、发酵罐发酵培养的培养基相同，均为蚕蛹粉培养基，原料重量配比为：蔗糖30g，蚕蛹粉25g，酵母粉5g，加水至1L，pH7-8。
本发明中所用到的古尼青霉菌丝体可以自制也可以购买。其制备方法包括菌株的分离和菌种的发酵，具体步骤如下：
菌株的分离方法是：在超净工作台上，在无菌条件下，将采来的已有明显成熟子囊的新鲜虫草用无菌水冲洗干净，置于已灭菌的直径为15cm的培养皿中，虫草的内菌核部分用打湿的脱脂棉包裹，以保湿。虫草的可孕部分下放置一灭菌的载玻片，虫草菌核部分用小玻片垫起，以使可孕部分不要直接接触载玻片，其距离约0.5cm左右。然后将培养皿放置于20℃±0.5℃的光照培养箱培养，待子囊孢子弹射于载玻片上时，在孢子周围滴加刚溶化的PDA培养基少许，移出玻片，置于另一灭菌的培养皿中保湿培养，待长出菌丝后用接种针挑取少量菌丝转另一平皿(SDAY培养基)培养(同上)，直至长出单一的纯化的菌落为至。经分子生物学方法验证，该菌株为古尼虫草(Cordyceps gunnii)无性型。
菌种的发酵工艺是由斜面菌种培养、液体摇瓶培养、种子罐培养、发酵罐发酵培养等四步完成的。
一级斜面菌种培养：
斜面培养基为SDAY培养基，即斜面试管菌种培养基的原料重量配比为：葡萄糖40g、蛋白胨10g、酵母浸出粉10g、琼脂20g，加水至1L，pH6.5。
液体摇瓶培养：
液体摇瓶培养基为：蚕蛹粉培养基：蔗糖30g，蚕蛹粉25g，酵母粉5g，水1000ml，pH7-8；500ml三角瓶装液量1/3，取生长良好的古尼拟青霉(Paecilomyces gunnii)(RCEF0864)菌株种子，匀浆化，按2％的接种量接种于摇瓶中，在恒温水浴摇床上25℃、140r/min培养4天。每100ml培养液可产菌丝量达1.27g干重；
种子罐培养：
培养基同液体种子，在70L气升式发酵罐中装入50L液体培养基，培养基温度大于95℃、pH值为6.0～7.0，并加入食用消泡剂，加入量为0.03％，在14.7×104Pa压力下，通入蒸汽加热到121℃，并保压30～45分钟；灭菌后，冷却至20℃时将6瓶上述培养好的500ml摇瓶种子接入培养，培养温度为25～26℃，通气量为1:0.5V/V.min，保压4.903～7.0845×104Pa，经20-48h通气培养，达到对数生长期后即可，最终培养体积为50L；
种子罐中1-18h为延滞期，18-36h为快速生长期，36-42h为快速生长后期。培养时间以36h为宜。
发酵罐发酵培养：
培养基同上，在1T发酵罐中装入700L液体培养基，pH值为6.0～7.0，并加入食用消泡剂，加入量为0.03％，通蒸汽和原位加热到 121℃，在14.7×104Pa压力下，保压30～45分钟；灭菌后，冷却至26℃时，将一级种子罐的50L液体种子全部接入二级种子罐培养，培养温度25～26℃，通气量为1:0.5V/V·min，保压4.903～7.0845×104Pa，经过36-48h通气培养，达到对数生长期后即可，最终培养体积为700L；
发酵罐中0-12h为延滞期，12-36h为快速生长期，36h后为生长稳定期、衰退期，42h达高峰。以42h收获最宜。干菌丝收量为15.4g/L。
本发明所述的用途，其中所述的提取物，是由菌丝体经本领域常规中药提取分离技术步骤而得到的提取物，例如可以为水提取、乙醇沉淀而得到的多糖提取物。进一步地，所述的提取物为菌丝体经热水提、乙醇沉淀、水洗得粗多糖，为淡黄褐色，得率约为3％-5％，多糖含量为70％-75％。菌株胞内多糖主峰GPp主要含有甘露糖、葡萄糖和半乳糖，红外光谱显示菌株胞内多糖GPp具有多糖峰的特征吸收，其特征吸收峰为：3422，2938，1677，1523，1430，1039，823cm。
本发明发现，古尼拟青霉菌丝体及其提取物对小鼠自发活动有一定的抑制作用，因此，古尼拟青霉菌丝体及其提取物具有镇静作用，可以将其用于制成镇静类药物，用于预防或者治疗需要治疗的个体。
附图说明
图1为实施例1所用的古尼拟青霉菌丝体及其提取物制备方法的流程图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步的说明。
实施例1
所用的小鼠为昆明种小鼠，雌雄各半，体重18-22g，购自安徽医科大学实验动物中心(皖医实动准第01号)。
所用的古尼拟青霉菌丝体粉，为自制，实验时用蒸馏水配成所需浓度；安神补脑液，吉林敖东延边药业股份有限公司生产。
古尼拟青霉菌丝体制备方法如下，流程图参见附图1。
菌株的分离方法是：在超净工作台上，在无菌条件下，将采来的已有明显成熟子囊的新鲜虫草用无菌水冲洗干净，置于已灭菌的直径为15cm的培养皿中，虫草的内菌核部分用打湿的脱脂棉包裹，以保湿。虫草的可孕部分下放置一灭菌的载玻片，虫草菌核部分用小玻片垫起，以使可孕部分不要直接接触载玻片，其距离约0.5cm左右。然后将培养皿放置于20℃±0.5℃的光照培养箱培养，待子囊孢子弹射于载玻片上时，在孢子周围滴加刚溶化的PDA培养基少许，移出玻片，置于另一灭菌的培养皿中保湿培养，待长出菌丝后用接种针挑取少量菌丝转另一平皿(SDAY培养基)培养(同上)，直至长出单一的纯化的菌落为至。该菌株为古尼拟青霉(Paecilomyces gunniiZ.Q.Liang)(RCEF0864)，古尼虫草(Cordyceps gunnii)无性型。
菌种的发酵工艺是由斜面菌种培养、液体摇瓶培养、种子罐培养、发酵罐发酵培养等四步完成的。
一级斜面菌种培养：
斜面培养基为SDAY培养基，即斜面试管菌种培养基的原料重量 配比为：葡萄糖40g、蛋白胨10g、酵母浸出粉10g、琼脂20g，加水至1L，pH6.5。
液体摇瓶培养：
液体摇瓶培养基为：蚕蛹粉培养基：蔗糖30g，蚕蛹粉25g，酵母粉5g，水1000ml，pH7-8；500ml三角瓶装液量1/3，取生长良好的古尼拟青霉(Paecilomyces gunnii)(RCEF0864)菌株种子，匀浆化，按2％的接种量接种于摇瓶中，在恒温水浴摇床上25℃、140r/min培养4天。每100ml培养液可产菌丝量达1.27g干重；
种子罐培养：
培养基同液体种子，在70L气升式发酵罐中装入50L液体培养基，培养基温度大于95℃、pH值为6.0～7.0，并加入食用消泡剂，加入量为0.03％，在14.7×104Pa压力下，通入蒸汽加热到121℃，并保压30～45分钟；灭菌后，冷却至20℃时将6瓶上述培养好的500ml摇瓶种子接入培养，培养温度为25～26℃，通气量为1:0.5V/V·min，保压4.903～7.0845×104Pa，经36h通气培养，达到对数生长期后即可，最终培养体积为50L；
种子罐中1-18h为延滞期，18-36h为快速生长期，36-42h为快速生长后期。培养时间以36h为宜。
发酵罐发酵培养：
培养基同上，在1T发酵罐中装入700L液体培养基，pH值为6.0～7.0，并加入食用消泡剂，加入量为0.03wt％，通蒸汽和原位加热到121℃，在14.7×104Pa压力下，保压40分钟；灭菌后，冷却至26℃ 时，将一级种子罐的50L液体种子全部接入二级种子罐培养，培养温度25～26℃，通气量为1:0.5V/V·min，保压4.903～7.0845×104Pa，经过42h通气培养，达到对数生长期后即可，最终培养体积为700L；
发酵罐中0-12h为延滞期，12-36h为快速生长期，36h后为生长稳定期、衰退期，42h达高峰。以42h收获最宜。
将得到的发酵醪离心后，于40℃下干燥，得到干菌丝，其收量为15.4g/L。
实验分组和给药方法
实验动物随机分为5组：对照组、阳性药(安神补脑液5ml/kg)组、古尼拟青霉菌丝体粉(0.15、0.30、0.60g/kg)三个剂量组，ig给药，连续5天，末次给药后1h进行实验。
小鼠自发活动实验
自发活动仪记录法末次给药后1h，将小鼠投入箱中适应5分钟后，记录5分钟的自发活动次数。
小鼠走动时间和举双肢法末次给药后1h，将小鼠投入底部垫有木屑的箱中适应5分钟后，记录2分钟内小鼠走动时间及双前肢向上抬举次数。
统计方法
资料多组间采用方差分析，两组间采用t检验。
实验结果
1.古尼拟青霉菌丝体粉对小鼠自发活动的影响
自发活动仪记录法的实验结果见表1。从表1种可以看出，与对 照组比较，古尼拟青霉菌丝体粉(0.60g/kg)可明显减少小鼠自发活动次数。
小鼠走动时间和举双肢法的实验结果见表2。从表2中可以看出，与对照组比较，古尼拟青霉菌丝体粉(0.60g/kg)可明显减少小鼠走动时间，古尼拟青霉菌丝体粉(0.30、0.60g/kg)可明显使前肢向上抬举次数减少。
上述试验均说明古尼拟青霉菌丝体对小鼠的自发活动有很好的抑制作用。古尼拟青霉菌丝体具有很好镇静作用，可以作为镇静类药物。
表1 古尼拟青霉菌丝体粉对小鼠自发活动的影响(χ±s，n＝8)
注：与对照组比较，*P<0.05
表2 古尼拟青霉菌丝体粉对小鼠走动时间和前肢向上抬举的影响(χ±s，n＝8)
注：与对照组比较，*P<0.05
实施例2
按照实施例1方法制得古尼拟青霉菌丝体。将得到的古尼拟青霉菌干菌丝体进行如下提取过程得到提取物(见图1)。
将得到的提取物按照实施例1中的条件进行实验，自发活动仪记录法的实验结果见表3；小鼠走动时间和举双肢法的实验结果见表4。
表3 古尼拟青霉菌干菌丝体提取物对小鼠自发性活动的影响(自发活动仪记录法，χ±s，n＝8)
与对照组比较，＊P<0.05，＊＊P<0.01
表4 古尼拟青霉菌干菌丝体提取物对小鼠走动时间及前肢向上抬举次数的影响(χ±s，n＝8)
与对照组比较，＊P<0.05，＊＊P<0.01
从上述实验可以看出，古尼拟青霉菌丝体及其提取物均具有一定的镇定作用，可以用作镇定类药物的用途。
已经根据优选实施例对本发明作了描述。应当理解的是前面的描述和实施例仅仅为了举例说明本发明而已。在不偏离本发明的精神和范围的前提下，本领域技术人员可以设计出本发明的多种替换方案和改进方案，其均应被理解为在本发明的保护范围之内。
Claims (6)
1.古尼拟青霉菌丝体提取物在制备用于镇静药物中的用途，其中所述的提取物是由菌丝体经水提取、乙醇沉淀而得到的多糖提取物。
2.如权利要求1所述的用途，其特征在于所述的药物是以治疗有效量的古尼拟青霉菌丝体提取物为活性成分与药学上可接受的辅料而制成的。
3.如权利要求1或2所述的用途，其特征在于所述的药物为口服制剂或注射制剂。
4.如权利要求1或2所述的用途，其特征在于所述的古尼拟青霉菌丝体由古尼拟青霉菌(Paecilomyces gunnii Z.Q.Liang)经斜面菌种培养、液体摇瓶培养、种子罐培养、发酵罐发酵培养步骤而得到的菌丝体，其中古尼拟青霉菌(Paecilomyces gunniiZ.Q.Liang)保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，编号为CGMCC No.2682。
5.根据权利要求4所述的用途，其特征在于所述的斜面菌种培养的培养基为SDAY培养基，原料重量配比为：葡萄糖40g、蛋白胨10g、酵母浸出粉10g、琼脂20g，加水至1L，pH6.5。
6.根据权利要求4所述的用途，其特征在于所述的液体摇瓶培养、种子罐培养、发酵罐发酵培养的培养基相同，均为蚕蛹粉培养基，原料重量配比为：蔗糖30g，蚕蛹粉25g，酵母粉5g，加水至1L，pH7-8。
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