CN109265528A - 一种贻贝粘蛋白的制备方法 - Google Patents
一种贻贝粘蛋白的制备方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN109265528A CN109265528A CN201811092999.1A CN201811092999A CN109265528A CN 109265528 A CN109265528 A CN 109265528A CN 201811092999 A CN201811092999 A CN 201811092999A CN 109265528 A CN109265528 A CN 109265528A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- frequency
- filtrate
- parameter
- mussel
- filter residue
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/43504—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Toxicology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
本发明涉及一种蛋白质的制备方法，尤其涉及一种贻贝粘蛋白的制备方法。本方法通过采用采用冷冻压缩释放破碎法以及高压高频、低压高频反复处理并且选择合适的电场参数，最终使提取得到的贻贝粘蛋白收得率在0.0572‑0.0683mg/(g贻贝)。本发明通过特定的电压频率控制，使贻贝足组织的细胞膜尽可能破碎，蛋白质得到最大程度的释放，经过纯化后最终得到的贻贝粘蛋白的提取率大大提升，并且全部提取过程未采用任何有毒有害试剂，提取的粘蛋白能直接用于伤口处理。
Description
技术领域
本发明涉及一种蛋白质的制备方法，尤其涉及一种贻贝粘蛋白的制备方法。
背景技术
在外科手术当中，或者是受到外伤时，对于伤口的缝合，一般都要用到手术缝合线来缝合伤口，按照材料的性质可以分为可吸收线和不可吸收线。不可吸收线缝合伤口一段时间后需要拆线，容易引发伤口的感染发炎，而且容易留下疤痕，不美观且操作耗费精力耗费时间。同时可吸收线可引起无菌性积液，材料在体内降解的时候产生的代谢物容易引起急性炎症反应，部分张力大的伤口可引起线结松动裂开，在外科手术中,易造成出血和新的损伤，给病人带来更多的痛苦。
贻贝粘蛋白(MAP)医用胶对人体有着较高的相容性且能被人体降解，代谢产物不会引起炎症，在伤口表面形成的蛋白交联凝胶膜可在数天或数周内被吸收，不易留下疤痕，伤口美观。主要几十个重复的十肽的高分子量蛋白片段组成MAP，其中赖氨酸含量约20％。赖氨酸使得MAP的pH在7.4时带有很强的正电荷。而人体中细胞多带有负电荷，当使用MAP生物医用胶之后通过正负电荷相互吸引作用与伤口处细胞结合来粘合伤口，并且MAP生物胶有促进细胞的生长增殖的作用，从而促进伤口与手术切口愈合，是一种具有很大优势和未来发展的生物医用胶。
尽管MAP生物胶对伤口愈合有着其他医用胶难以企及的优势，但MAP的实际应用由于极其有限的生产而受到很大限制，提取成本高，提取率低的现状，致使贻贝粘蛋白目前在临床上的大量使用仍然难以推广，因此研发得到一种具有高提取率的贻贝粘蛋白的制备方法对于目前的外科伤口愈合而言是非要迫切的。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种具有安全性高、高提取率的贻贝粘蛋白的制备方法，将高压高频脉冲、冷压均质等技术应用到贻贝粘蛋白的制备中，以期达到降低制备成本、提高收得率以及使产品安全无毒的效果。
为实现上述目的，本发明提供的一种贻贝粘蛋白的制备方法，包括如下步骤：
1、切取贻贝足，使用生理盐水清洗贻贝组织，用剪成适宜大小小块，加入预冷的有机酸溶液，在冰水浴中施加高频脉冲处理30-45min，过滤得到第一滤渣和第一滤液；
2、用去离子水清洗第一滤渣后向其中加入有机酸调节pH至4.5-6.5，采用冷冻压缩释放破碎法在-40℃～-25℃和80-100MPa的条件下进行破碎处理，过滤得到第二滤渣和第二滤液；
3、向第二滤渣中添加弱碱溶液将pH值调节至8-9，然后按照一次高压高频--一次低压高频--二次低压高频--二次高压高频的脉冲电场对溶液进行处理并重复3-5次，过滤得到第三滤渣和第三滤液，所述一次高压高频的参数为15-20kV、100-120kHz、一次低压高频的参数为700-800V、100-120kHz、二次高压高频的参数为8-10kV、100-120kHz、二次低压高频的参数为500-700V、100-120kHz，各次处理时间保持在15-30min；
4、将第一滤液、第二滤液、第三滤液混合并调节pH至7-8，然后离心分析，取上清液过滤纯化得到贻贝粘蛋白。
优选的，所述有机酸选自甲酸、乙酸、草酸中的一种以上。
优选的，所述有机酸的浓度为5-7％。
优选的，所述弱碱为氨水。
优选的，所述过滤纯化采用阳离子交换柱层析法进行纯化。
优选的，所述阳离子交换柱层析法的具体步骤为：将上清液加入到已平衡好的CMC-50分搅拌吸附后静置使其沉淀，用缓冲液冲洗树脂，缓慢搅拌使未被树脂吸附的蛋白溶于缓冲液而除去，将树脂装入层析柱内，用含0.05-0.1mol/L NaCl的缓冲液洗涤树脂，除去与树脂结合不紧密的杂蛋白，同时以缓冲液为对照，用紫外分光光度计于280nm处测流出液体的吸光度，洗至吸光系数接近0为止，冲洗时确保流速为2-3ml/min。
采用本发明的提取方法所得贻贝粘蛋白的提取率为0.0572-0.0683mg/g。
现有技术对于贻贝粘蛋白的提取率低的主要原因在于贻贝足细胞的破碎效果不够理想导致蛋白质释放效果差，研究表明，贻贝足细胞膜的破裂效果与其施加在裂纹处的力的方向有关，如果施加的力正好沿着细胞膜裂纹方向，则在相关力的作用下会加速细胞膜破裂，最终使蛋白质得以释放。本发明尝试对电压和频率进行调控以期能使电场力的方向与细胞膜裂纹方向更为贴近，由于设备问题，在对第三滤液进行高压高频脉冲电场处理时，最终的电压呈现出16kV-800V-9kV-700V的波动，最终的提取结果却意外地表明相较于原有的稳定高压高频处理，提取率有了较为明显的上升，基于此，本发明根据该变化趋势对各次电压进行了宽范围尝试，并对处理方式进行多次重复，最终确定出当采用一次高压高频的参数为15-20kV、100-120kHz、一次低压高频的参数为700-800V、100-120kHz、二次高压高频的参数为8-10kV、100-120kHz、二次低压高频的参数为500-700V、100-120kHz并重复3-5次时，贻贝粘蛋白的提取率达到最佳水平，为0.0572-0.0683mg/(g贻贝)。
由此可见，本发明通过特定的电压频率控制，使贻贝足组织的细胞膜尽可能破碎，蛋白质得到最大程度的释放，经过纯化后最终得到的贻贝粘蛋白的提取率大大提升，并且全部提取过程未采用任何有毒有害试剂，提取的粘蛋白能直接用于伤口处理。
附图说明
图1贻贝粘蛋白吸光度对BSA浓度的关系标准曲线图
具体实施方式
实施例1
一种贻贝粘蛋白的制备方法，包括如下步骤：
1、切取贻贝足24g，使用生理盐水清洗贻贝组织，用剪成适宜大小小块，加入50mL预冷的乙酸溶液，在冰水浴中施加高频脉冲处理30min，过滤得到第一滤渣和第一滤液；
2、用去离子水清洗第一滤渣后向其中中加入乙酸调节pH至5，采用冷冻压缩释放破碎法在-25℃和80MPa的条件下进行破碎处理，过滤得到第二滤渣和第二滤液；
3、向第二滤渣中添加氨水溶液将pH值调节至8，然后按照一次高压高频--一次低压高频--二次低压高频--二次高压高频的脉冲电场对溶液进行处理并重复3次，过滤得到第三滤渣和第三滤液，所述一次高压高频的参数为15kV、100kHz、一次低压高频的参数为700V、100kHz、二次高压高频的参数为8kV、100kHz、二次低压高频的参数为500V、100kHz，各次处理时间分别保持在15min；
4、将第一滤液、第二滤液、第三滤液混合并调节pH至7，然后离心分析，取上清液，将上清液加入到已平衡好的CMC-50分搅拌吸附后静置使其沉淀，用缓冲液冲洗树脂，缓慢搅拌使未被树脂吸附的蛋白溶于缓冲液而除去，将树脂装入层析柱内，用含0.05mol/LNaCl的缓冲液洗涤树脂，除去与树脂结合不紧密的杂蛋白，同时以缓冲液为对照，用紫外分光光度计于280nm处测流出液体的吸光度，洗至吸光系数接近0为止，冲洗时确保流速为2ml/min。
实施例2
一种贻贝粘蛋白的制备方法，包括如下步骤：
1、切取贻贝足24g，使用生理盐水清洗贻贝组织，用剪成适宜大小小块，加入50mL预冷的草酸溶液，在冰水浴中施加高频脉冲处理45min，过滤得到第一滤渣和第一滤液；
2、用去离子水清洗第一滤渣后向其中加入草酸调节pH至6.5，采用冷冻压缩释放破碎法在-40℃和100MPa的条件下进行破碎处理，过滤得到第二滤渣和第二滤液；
3、向第二滤渣中添加氨水溶液将pH值调节至8，然后按照一次高压高频--一次低压高频--二次低压高频--二次高压高频的脉冲电场对溶液进行处理并重复4次，过滤得到第三滤渣和第三滤液，所述一次高压高频的参数为20kV、120kHz、一次低压高频的参数为800V、120kHz、二次高压高频的参数为10kV、120kHz、二次低压高频的参数为700V、120kHz，各次处理时间保持在30min；
4、将第一滤液、第二滤液、第三滤液混合并调节pH至7，然后离心分析，取上清液，将上清液加入到已平衡好的CMC-50分搅拌吸附后静置使其沉淀，用缓冲液冲洗树脂，缓慢搅拌使未被树脂吸附的蛋白溶于缓冲液而除去，将树脂装入层析柱内，用含0.05mol/LNaCl的缓冲液洗涤树脂，除去与树脂结合不紧密的杂蛋白，同时以缓冲液为对照，用紫外分光光度计于280nm处测流出液体的吸光度，洗至吸光系数接近0为止，冲洗时确保流速为2ml/min。
实施例3
一种贻贝粘蛋白的制备方法，包括如下步骤：
1、切取贻贝足24g，使用生理盐水清洗贻贝组织，用剪成适宜大小小块，加入50mL预冷的有机酸溶液，在冰水浴中施加高频脉冲处理45min，过滤得到第一滤渣和第一滤液；
2、用去离子水清洗第一滤渣后向其中加入草酸调节pH至4.5，采用冷冻压缩释放破碎法在-30℃和100MPa的条件下进行破碎处理，过滤得到第二滤渣和第二滤液；
3、向第二滤渣中添加氨水溶液将pH值调节至9，然后按照一次高压高频--一次低压高频--二次低压高频--二次高压高频的脉冲电场对溶液进行处理并重复4次，过滤得到第三滤渣和第三滤液，所述一次高压高频的参数为16kV、100kHz、一次低压高频的参数为800V、100kHz、二次高压高频的参数为9kV、100kHz、二次低压高频的参数为700V、100kHz，各次处理时间保持在30min；
4、将第一滤液、第二滤液、第三滤液混合并调节pH至7，然后离心分析，取上清液，将上清液加入到已平衡好的CMC-50分搅拌吸附后静置使其沉淀，用缓冲液冲洗树脂，缓慢搅拌使未被树脂吸附的蛋白溶于缓冲液而除去，将树脂装入层析柱内，用含0.05mol/LNaCl的缓冲液洗涤树脂，除去与树脂结合不紧密的杂蛋白，同时以缓冲液为对照，用紫外分光光度计于280nm处测流出液体的吸光度，洗至吸光系数接近0为止，冲洗时确保流速为2ml/min。
实施例4
一种贻贝粘蛋白的制备方法，包括如下步骤：
1、切取贻贝足24g，使用生理盐水清洗贻贝组织，用剪成适宜大小小块，加入50mL预冷的草酸溶液，在冰水浴中施加高频脉冲处理40min，过滤得到第一滤渣和第一滤液；
2、用去离子水清洗第一滤渣后向其中加入草酸调节pH至6.5，采用冷冻压缩释放破碎法在-38℃，90MPa的条件下进行破碎处理，过滤得到第二滤渣和第二滤液；
3、向第二滤渣中添加氨水溶液将pH值调节至8.5，然后按照一次高压高频--一次低压高频--二次低压高频--二次高压高频的脉冲电场对溶液进行处理并重复5次，过滤得到第三滤渣和第三滤液，所述一次高压高频的参数为16kV、120kHz、一次低压高频的参数为800V、120kHz、二次高压高频的参数为9kV、120kHz、二次低压高频的参数为700V、120kHz，各次处理时间保持在30min；
4、将第一滤液、第二滤液、第三滤液混合并调节pH至7，然后离心分析，取上清液，将上清液加入到已平衡好的CMC-50分搅拌吸附后静置使其沉淀，用缓冲液冲洗树脂，缓慢搅拌使未被树脂吸附的蛋白溶于缓冲液而除去，将树脂装入层析柱内，用含0.05mol/LNaCl的缓冲液洗涤树脂，除去与树脂结合不紧密的杂蛋白，同时以缓冲液为对照，用紫外分光光度计于280nm处测流出液体的吸光度，洗至吸光系数接近0为止，冲洗时确保流速为2ml/min。
实施例5
一种贻贝粘蛋白的制备方法，包括如下步骤：
1、切取贻贝足24g，使用生理盐水清洗贻贝组织，用剪成适宜大小小块，加入50mL预冷的甲酸溶液，在冰水浴中施加高频脉冲处理45min，过滤得到第一滤渣和第一滤液；
2、用去离子水清洗第一滤渣后向其中加入甲酸调节pH至5，采用冷冻压缩释放破碎法在-30℃和100MPa的条件下进行破碎处理，过滤得到第二滤渣和第二滤液；
3、向第二滤渣中添加氨水溶液将pH值调节至9，然后按照一次高压高频--一次低压高频--二次低压高频--二次高压高频的脉冲电场对溶液进行处理并重复4次，过滤得到第三滤渣和第三滤液，所述一次高压高频的参数为18kV、110kHz、一次低压高频的参数为750V、110kHz、二次高压高频的参数为9kV、110kHz、二次低压高频的参数为600V、110kHz，各次处理时间保持在20min；
4、将第一滤液、第二滤液、第三滤液混合并调节pH至7，然后离心分析，取上清液，将上清液加入到已平衡好的CMC-50分搅拌吸附后静置使其沉淀，用缓冲液冲洗树脂，缓慢搅拌使未被树脂吸附的蛋白溶于缓冲液而除去，将树脂装入层析柱内，用含0.05mol/LNaCl的缓冲液洗涤树脂，除去与树脂结合不紧密的杂蛋白，同时以缓冲液为对照，用紫外分光光度计于280nm处测流出液体的吸光度，洗至吸光系数接近0为止，冲洗时确保流速为2ml/min。
实施例6
一种贻贝粘蛋白的制备方法，包括如下步骤：
1、切取贻贝足24g，使用生理盐水清洗贻贝组织，用剪成适宜大小小块，加入50mL预冷的甲酸溶液，在冰水浴中施加高频脉冲处理35min，过滤得到第一滤渣和第一滤液；
2、用去离子水清洗第一滤渣后向其中加入甲酸调节pH至5，采用冷冻压缩释放破碎法在-35℃和70MPa的条件下进行破碎处理，过滤得到第二滤渣和第二滤液；
3、向第二滤渣中添加氨水溶液将pH值调节至9，然后按照一次高压高频--一次低压高频--二次低压高频--二次高压高频的脉冲电场对溶液进行处理并重复5次，过滤得到第三滤渣和第三滤液，所述一次高压高频的参数为18kV、110kHz、一次低压高频的参数为750V、110kHz、二次高压高频的参数为9kV、110kHz、二次低压高频的参数为600V、110kHz，各次处理时间保持在30min；
4、将第一滤液、第二滤液、第三滤液混合并调节pH至7，然后离心分析，取上清液，将上清液加入到已平衡好的CMC-50分搅拌吸附后静置使其沉淀，用缓冲液冲洗树脂，缓慢搅拌使未被树脂吸附的蛋白溶于缓冲液而除去，将树脂装入层析柱内，用含0.05mol/LNaCl的缓冲液洗涤树脂，除去与树脂结合不紧密的杂蛋白，同时以缓冲液为对照，用紫外分光光度计于280nm处测流出液体的吸光度，洗至吸光系数接近0为止，冲洗时确保流速为2ml/min。
对比例1
一种贻贝粘蛋白的制备方法，包括如下步骤：
1、切取贻贝足24g，使用生理盐水清洗贻贝组织，用剪成适宜大小小块，加入50mL预冷的乙酸溶液，在冰水浴中施加高频脉冲处理30min，过滤得到第一滤渣和第一滤液；
2、用去离子水清洗第一滤渣后向其中加入乙酸调节pH至5，采用冷冻压缩释放破碎法在-25℃和80MPa的条件下进行破碎处理，过滤得到第二滤渣和第二滤液；
3、向第二滤渣中添加氨水溶液将pH值调节至8，然后按照一次高压高频--一次低压高频--二次低压高频--二次高压高频的脉冲电场对溶液进行处理并重复3次，过滤得到第三滤渣和第三滤液，所述一次高压高频的参数为10kV、100kHz、一次低压高频的参数为500V、100kHz、二次高压高频的参数为7kV、100kHz、二次低压高频的参数为400V、100kHz，各次处理时间分别保持在15min；
4、将第一滤液、第二滤液、第三滤液混合并调节pH至7，然后离心分析，取上清液，将上清液加入到已平衡好的CMC-50分搅拌吸附后静置使其沉淀，用缓冲液冲洗树脂，缓慢搅拌使未被树脂吸附的蛋白溶于缓冲液而除去，将树脂装入层析柱内，用含0.05mol/LNaCl的缓冲液洗涤树脂，除去与树脂结合不紧密的杂蛋白，同时以缓冲液为对照，用紫外分光光度计于280nm处测流出液体的吸光度，洗至吸光系数接近0为止，冲洗时确保流速为2ml/min。
对比例2
一种贻贝粘蛋白的制备方法，包括如下步骤：
1、切取贻贝足24g，使用生理盐水清洗贻贝组织，用剪成适宜大小小块，加入50mL预冷的乙酸溶液，在冰水浴中施加高频脉冲处理30min，过滤得到第一滤渣和第一滤液；
2、用去离子水清洗第一滤渣后向其中加入乙酸调节pH至5，采用冷冻压缩释放破碎法在-25℃和80MPa的条件下进行破碎处理，过滤得到第二滤渣和第二滤液；
3、向第二滤渣中添加氨水溶液将pH值调节至8，然后按照一次高压高频--一次低压高频--二次低压高频--二次高压高频的脉冲电场对溶液进行处理并重复3次，过滤得到第三滤渣和第三滤液，所述一次高压高频的参数为10kV、100kHz、一次低压高频的参数为700V、100kHz、二次高压高频的参数为7kV、100kHz、二次低压高频的参数为500V、100kHz，各次处理时间分别保持在15min；
4、将第一滤液、第二滤液、第三滤液混合并调节pH至7，然后离心分析，取上清液，将上清液加入到已平衡好的CMC-50分搅拌吸附后静置使其沉淀，用缓冲液冲洗树脂，缓慢搅拌使未被树脂吸附的蛋白溶于缓冲液而除去，将树脂装入层析柱内，用含0.05mol/LNaCl的缓冲液洗涤树脂，除去与树脂结合不紧密的杂蛋白，同时以缓冲液为对照，用紫外分光光度计于280nm处测流出液体的吸光度，洗至吸光系数接近0为止，冲洗时确保流速为2ml/min。
对比例3
一种贻贝粘蛋白的制备方法，包括如下步骤：
1、切取贻贝足24g，使用生理盐水清洗贻贝组织，用剪成适宜大小小块，加入50mL预冷的乙酸溶液，在冰水浴中施加高频脉冲处理30min，过滤得到第一滤渣和第一滤液；
2、用去离子水清洗第一滤渣后向其中加入乙酸调节pH至5，采用冷冻压缩释放破碎法在-25℃和80MPa的条件下进行破碎处理，如此反复进行6次，过滤得到第二滤渣和第二滤液；
3、向第二滤渣中添加氨水溶液将pH值调节至8，然后按照一次高压高频--一次低压高频--二次低压高频--二次高压高频的脉冲电场对溶液进行处理并重复3次，过滤得到第三滤渣和第三滤液，所述一次高压高频的参数为15kV、100kHz、一次低压高频的参数为500V、100kHz、二次高压高频的参数为8kV、100kHz、二次低压高频的参数为300V、100kHz，各次处理时间分别保持在15min；
4、将第一滤液、第二滤液、第三滤液混合并调节pH至7，然后离心分析，取上清液，将上清液加入到已平衡好的CMC-50分搅拌吸附后静置使其沉淀，用缓冲液冲洗树脂，缓慢搅拌使未被树脂吸附的蛋白溶于缓冲液而除去，将树脂装入层析柱内，用含0.05mol/LNaCl的缓冲液洗涤树脂，除去与树脂结合不紧密的杂蛋白，同时以缓冲液为对照，用紫外分光光度计于280nm处测流出液体的吸光度，洗至吸光系数接近0为止，冲洗时确保流速为2ml/min。
对比例4
一种贻贝粘蛋白的制备方法，包括如下步骤：
1、切取贻贝足24g，使用生理盐水清洗贻贝组织，用剪成适宜大小小块，加入50mL预冷的乙酸溶液，在冰水浴中施加高频脉冲处理30min，过滤得到第一滤渣和第一滤液；
2、用去离子水清洗第一滤渣后向其中加入乙酸调节pH至5，采用冷冻压缩释放破碎法在-25℃和80MPa的条件下进行破碎处理，如此反复进行6次，过滤得到第二滤渣和第二滤液；
3、向第二滤渣中添加氨水溶液将pH值调节至8，然后按照一次高压高频--一次低压高频--二次低压高频--二次高压高频的脉冲电场对溶液进行处理并重复3次，过滤得到第三滤渣和第三滤液，所述一次高压高频的参数为25kV、100kHz、一次低压高频的参数为850V、100kHz、二次高压高频的参数为11kV、100kHz、二次低压高频的参数为800V、100kHz，各次处理时间分别保持在15min；
4、将第一滤液、第二滤液、第三滤液混合并调节pH至7，然后离心分析，取上清液，将上清液加入到已平衡好的CMC-50分搅拌吸附后静置使其沉淀，用缓冲液冲洗树脂，缓慢搅拌使未被树脂吸附的蛋白溶于缓冲液而除去，将树脂装入层析柱内，用含0.05mol/LNaCl的缓冲液洗涤树脂，除去与树脂结合不紧密的杂蛋白，同时以缓冲液为对照，用紫外分光光度计于280nm处测流出液体的吸光度，洗至吸光系数接近0为止，冲洗时确保流速为2ml/min。
对比例5
一种贻贝粘蛋白的制备方法，包括如下步骤：
1、切取贻贝足24g，使用生理盐水清洗贻贝组织，用剪成适宜大小小块，加入50mL预冷的乙酸溶液，在冰水浴中施加高频脉冲处理30min，过滤得到第一滤渣和第一滤液；
2、用去离子水清洗第一滤渣后向其中加入乙酸调节pH至5，采用冷冻压缩释放破碎法在-25℃和80MPa的条件下进行破碎处理，如此反复进行6次，过滤得到第二滤渣和第二滤液；
3、向第二滤渣中添加氨水溶液将pH值调节至8，然后按照一次高压高频--一次低压高频--二次低压高频--二次高压高频的脉冲电场对溶液进行处理并重复3次，过滤得到第三滤渣和第三滤液，所述一次高压高频的参数为25kV、100kHz、一次低压高频的参数为700V、100kHz、二次高压高频的参数为11kV、100kHz、二次低压高频的参数为500V、100kHz，各次处理时间分别保持在15min；
4、将第一滤液、第二滤液、第三滤液混合并调节pH至7，然后离心分析，取上清液，将上清液加入到已平衡好的CMC-50分搅拌吸附后静置使其沉淀，用缓冲液冲洗树脂，缓慢搅拌使未被树脂吸附的蛋白溶于缓冲液而除去，将树脂装入层析柱内，用含0.05mol/LNaCl的缓冲液洗涤树脂，除去与树脂结合不紧密的杂蛋白，同时以缓冲液为对照，用紫外分光光度计于280nm处测流出液体的吸光度，洗至吸光系数接近0为止，冲洗时确保流速为2ml/min。
对比例6
一种贻贝粘蛋白的制备方法，包括如下步骤：
1、切取贻贝足24g，使用生理盐水清洗贻贝组织，用剪成适宜大小小块，加入50mL预冷的乙酸溶液，在冰水浴中施加高频脉冲处理30min，过滤得到第一滤渣和第一滤液；
2、用去离子水清洗第一滤渣后向其中添加氨水溶液将pH值调节至8，然后按照一次高压高频--一次低压高频--二次低压高频--二次高压高频的脉冲电场对溶液进行处理并重复3次，过滤得到第二滤渣和第二滤液，所述一次高压高频的参数为15kV、100kHz、一次低压高频的参数为700V、100kHz、二次高压高频的参数为8kV、100kHz、二次低压高频的参数为500V、100kHz，各次处理时间分别保持在15min；
4、将第一滤液、第二滤液混合并调节pH至7，然后离心分析，取上清液，将上清液加入到已平衡好的CMC-50分搅拌吸附后静置使其沉淀，用缓冲液冲洗树脂，缓慢搅拌使未被树脂吸附的蛋白溶于缓冲液而除去，将树脂装入层析柱内，用含0.05mol/L NaCl的缓冲液洗涤树脂，除去与树脂结合不紧密的杂蛋白，同时以缓冲液为对照，用紫外分光光度计于280nm处测流出液体的吸光度，洗至吸光系数接近0为止，冲洗时确保流速为2ml/min。
贻贝粘蛋白浓度测定
1、分别取不同体积的牛血清蛋白(BSA)标准溶液、0.1molPBS缓冲液与相同剂量体积的考马斯亮兰G250混合摇匀，在595nm处比色，测吸光度来制定蛋白质浓度标准曲线如附图1所示。得到的吸光度对BSA的关系曲线R2值大于0.99，说明数据很好，可以作为比对参考。
利用本发明的方法能从24g贻贝蛋白中提取10mL的贻贝粘蛋白溶液，取0.1ml前述提取的贻贝粘蛋白溶液与2.9ml考马斯亮兰G-250试剂混匀，在标准曲线测定相同条件下进行测定实验，根据在595nm处测得的贻贝粘蛋白吸光度计算贻贝粘蛋白浓度如下表所示：
表1贻贝粘蛋白含量测定
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (7)
1.一种贻贝粘蛋白的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)切取贻贝足，使用生理盐水清洗贻贝组织，用剪成适宜大小小块，加入预冷的有机酸溶液，在冰水浴中施加高频脉冲处理30-45min，过滤得到第一滤渣和第一滤液；
2)用去离子水清洗第一滤渣后向其中加入有机酸调节pH至4.5-6.5，采用冷冻压缩释放破碎法在-40℃～-25℃和80-100MPa的条件下进行破碎处理，过滤得到第二滤渣和第二滤液；
3)向第二滤渣中添加弱碱溶液将pH值调节至8-9，然后按照一次高压高频--一次低压高频--二次低压高频--二次高压高频的脉冲电场对溶液进行处理并重复3-5次，过滤得到第三滤渣和第三滤液，所述一次高压高频的参数为15-20kV、100-120kHz、一次低压高频的参数为700-800V、100-120kHz、二次高压高频的参数为8-10kV、100-120kHz、二次低压高频的参数为500-700V、100-120kHz，各次处理时间保持在15-30min；
4)将第一滤液、第二滤液、第三滤液混合并调节pH至7-8，然后离心分析，取上清液过滤纯化得到贻贝粘蛋白。
2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述一次高压高频的参数为16kV、120kHz、一次低压高频的参数为800V、120kHz、二次高压高频的参数为9kV、120kHz、二次低压高频的参数为700V、120kHz。
3.如权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于：所述有机酸选自甲酸、乙酸、草酸中的一种以上。
4.如权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于：所述有机酸的浓度为5-7％。
5.如权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于：所述弱碱为氨水。
6.如权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于：所述过滤纯化采用阳离子交换柱层析法进行纯化。
7.如权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于：所述阳离子交换柱层析法的具体步骤为：将上清液加入到已平衡好的CMC-50分搅拌吸附后静置使其沉淀，用缓冲液冲洗树脂，缓慢搅拌使未被树脂吸附的蛋白溶于缓冲液而除去，将树脂装入层析柱内，用含0.05-0.1mol/L NaCl的缓冲液洗涤树脂，除去与树脂结合不紧密的杂蛋白，同时以缓冲液为对照，用紫外分光光度计于280nm处测流出液体的吸光度，洗至吸光系数接近0为止，冲洗时确保流速为2-3ml/min。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201811092999.1A CN109265528A (zh) | 2018-09-19 | 2018-09-19 | 一种贻贝粘蛋白的制备方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201811092999.1A CN109265528A (zh) | 2018-09-19 | 2018-09-19 | 一种贻贝粘蛋白的制备方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN109265528A true CN109265528A (zh) | 2019-01-25 |
Family
ID=65197420
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201811092999.1A Pending CN109265528A (zh) | 2018-09-19 | 2018-09-19 | 一种贻贝粘蛋白的制备方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN109265528A (zh) |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101348518A (zh) * | 2007-12-14 | 2009-01-21 | 北京康铭优盛生化技术有限公司 | 一种使用羧甲基离子交换色谱纯化贻贝粘蛋白的方法 |
| CN101965897A (zh) * | 2010-10-19 | 2011-02-09 | 浙江大学 | 贻贝分离蛋白的加工方法 |
| CN104946715A (zh) * | 2015-07-15 | 2015-09-30 | 吉林大学 | 高压脉冲电场辅助酶解提取河蚌蛋白质工艺 |
-
2018
- 2018-09-19 CN CN201811092999.1A patent/CN109265528A/zh active Pending
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101348518A (zh) * | 2007-12-14 | 2009-01-21 | 北京康铭优盛生化技术有限公司 | 一种使用羧甲基离子交换色谱纯化贻贝粘蛋白的方法 |
| CN101965897A (zh) * | 2010-10-19 | 2011-02-09 | 浙江大学 | 贻贝分离蛋白的加工方法 |
| CN104946715A (zh) * | 2015-07-15 | 2015-09-30 | 吉林大学 | 高压脉冲电场辅助酶解提取河蚌蛋白质工艺 |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| YAJUN ZHOU: "OPTIMIZATION EXTRACTION OF PROTEIN FROM MUSSEL", 《JOURNAL OF FOOD PROCESSING AND PRESERVATION》 * |
| 李从军: "《生物产品分离纯化技术》", 31 August 2009, 华中师范大学出版社 * |
| 高敏: "贻贝粘蛋白综述", 《安徽农业科学》 * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN102010460B (zh) | 一种油茶籽多肽及其制备方法 | |
| CN103667226A (zh) | 一种亲和层析分段洗脱纯化糜蛋白酶的方法 | |
| CN113244458B (zh) | 一种用于修复关节软骨损伤的复合材料及其制备方法 | |
| CN102500005B (zh) | 一种自体血液回收过滤净化输血系统 | |
| CN110863026A (zh) | 一种牛或羊脊骨骨髓肽的制备方法以及组合物 | |
| CN109265528A (zh) | 一种贻贝粘蛋白的制备方法 | |
| WO2014178438A1 (ja) | 毛髪再生用の細胞製剤 | |
| CN112933285A (zh) | 一种促进修复的医用明胶敷料的制备方法 | |
| CN101439047B (zh) | 提高人凝血酶原复合物稳定性fvii得率的工艺方法 | |
| CN202236538U (zh) | 一种自体血液回收过滤净化输血系统 | |
| CN113907176A (zh) | 一种人参皂甙大豆蛋白粉的制备方法 | |
| CN101700244B (zh) | 一种由纯天然材料吸水垫构建的创可贴 | |
| CN103667227B (zh) | 一种分级沉淀提取糜蛋白酶原和胰蛋白酶原的方法 | |
| CN109646719B (zh) | 含再生组织基质微粒的关节软骨修复组合物 | |
| CN203647432U (zh) | 全封闭式无菌水分离器 | |
| CN113088549A (zh) | 一种从人胎盘血中提取抗氧化多肽的方法 | |
| CN104436177B (zh) | 修复伤口用医药组合物及其制备方法 | |
| CN113116970A (zh) | 一种含黄栀子提取物的干细胞皮肤修复液及制备方法 | |
| CN103142718B (zh) | 一种治疗冻伤的药液 | |
| RU2805215C2 (ru) | Способ получения мелкодисперсного липографта с волюмизирующим и регенераторным эффектом | |
| CN104531650A (zh) | 一种亲和层析分段洗脱纯化糜蛋白酶的方法及含有糜蛋白酶的药物组合物 | |
| CN213528724U (zh) | 一种一体化自体富血小板凝胶制备用套装 | |
| CN109452446A (zh) | 一种葵花籽抗氧化多肽饮料的制备方法 | |
| CN107266409A (zh) | 一种高效能的花青素提取方法 | |
| TW201509425A (zh) | 以血液製備修復傷口用醫藥組合物之方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20190125 |