CN105018558B - 一种苜蓿多目标联产提取分离方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及苜蓿有效成分提取领域，特别涉及一种苜蓿多目标联产提取分离方法，包括以下步骤：取苜蓿鲜草，预处理后经碾切、打浆后，得到浆液，在浆液中加入纤维素酶进行酶解；分离，得到草渣和上清液，草渣回收作为饲料，上清液进行多级串联酶解；脱色，脱色得到的叶绿素回收利用，脱色的液体进行分离，得到上清液和固体物质，其中的上清液回收，得到以叶黄素为主的产品，固体物质即为多肽。本发明提供的苜蓿多目标联产提取分离方法，利用生物酶法提取植物蛋白，得到的多肽活性高，并且将苜蓿的有效成分全部利用，不仅减少了环境污染，还增加附带产值，具有重大意义。

Description

一种苜蓿多目标联产提取分离方法

技术领域

本发明涉及苜蓿有效成分提取领域，具体而言，涉及一种苜蓿多目标联产提取分离方法。

背景技术

苜蓿叶蛋白的蛋白质含量高，营养丰富，必需氨基酸完善，消化率高，能量代谢率高，是理想的高蛋白饲料添加剂，在目前国际推行的有机食品畜牧业中国际和国内市场应用前景广阔。叶蛋白不仅可以满足大牲畜的饲料，也是水产养殖、大型肉用养禽业、养猪业和特种养殖业最好的蛋白添加型饲料。经大量试验研究证明，用苜蓿叶蛋白饲喂奶牛、肉牛、蛋鸡、肉鸡、猪、水产业等效果非常显著。主要表现在：节约精饲料，降低饲养成本，提高养殖效益，提高畜、禽、水产品等品质，增加产品产量，改善畜、禽的健康状况，增强畜禽的体质。每年每头奶牛节省精饲料350kg，每头奶牛产奶量日增6kg，总受胎率可提高到98％以上；肉牛个体产肉量增长9.52％。欧洲许多国家，在蛋鸡出栏前三个月开始饲喂苜蓿叶蛋白，提高产蛋量9.4％，产蛋率提高6.1％，叶黄素使鸡肉鲜嫩，使鸡的皮肤和蛋黄的颜色得到改善。蛋白叶黄素产品中大部分用于鸡饲料，为了给肉鸡上色，其用量相当高(达5％)，给鸡蛋壳和蛋黄上色时用量较低。一头商品猪可节约饲料70kg，利用苜蓿叶蛋白代替玉米、豆粕、鱼粉等蛋白添加剂是新型养猪业的发展方向；苜蓿叶蛋白含有天然的叶黄素、叶绿素和胡萝卜素等，叶蛋白可满足基本的营养要求，叶绿素可大大提高水产品鱼、虾的鲜美程度，β胡萝卜素可促进对虾体内虾红素的增加，使外观鲜艳，虾肉鲜美，增加附加值。总之，苜蓿深加工产品叶蛋白含量高，营养丰富，所含必须氨基酸完善，消化率高，能量代谢率高，是理想的饲料高蛋白添加剂，在目前国际普遍推行有机食品的畜牧业中具有广阔的发展前景。苜蓿叶蛋白含量与豆粕和鱼粉相当，但饲用效果高于豆粉和鱼粉，作为蛋白质饲料，以苜蓿叶蛋白替代鱼粉和豆粕潜力巨大。

苜蓿叶蛋白在食品工业中也具有很好的应用前景，从苜蓿中提取出可直接食用的叶蛋白(白蛋白)，含有18种氨基酸(8种人体必需氨基酸)，与联合国粮农组织推荐的成人氨基酸构成基本吻合。苜蓿中的赖氨酸含量高达5.6-7.4％，可弥补谷物类食品中的不足。苜蓿叶蛋白具有防病、防衰老、强身健体等生理功能，苜蓿叶蛋白提取后的草渣中，含有70％以上的总膳食纤维，是很好的天然果蔬类纤维源，可以防止便秘、降低血清胆固醇、调节血糖平衡、预防胆结石及减少人体肠道癌变，改善肠道微生物活动和抵抗乳腺癌的发生，苜蓿膳食纤维可用于多种食品添加剂(面制食品、冰淇淋、发酵乳制品和饮料等)，大大提高产品的经济效益。

苜蓿叶蛋白提取在我国科研院所及高等院校等都进行了大量的研究，但都停留在实验室研究阶段，一直未能实现工业化生产。主要存在以下原因：

1.苜蓿叶蛋白提取率低

从牧草中提取的叶蛋白主要由叶绿体蛋白质(chloroplast protein)和细胞质蛋白(cytoplasm protein)组成。其中45％左右是与类脂和叶绿素结合成的难溶性结构蛋白，只有把难溶于水的大分子量蛋白(40-56万)即结构蛋白和细胞壁蛋白的细胞壁打破才能提取出来，传统的国际上现行的生产工艺为机械打碎。鲜苜蓿草切碎后经过一次、二次甚至三次机械打碎，否则叶蛋白提取率低。

2.提取叶蛋白能量消耗大

鲜苜蓿草打浆消耗功率大，法国苜蓿公司现行的离心锤式打浆机的功率为160KW，需4台打浆二次。每小时处理鲜草50t，为了使打浆能顺利进行，还要加入20％水。生产一吨叶蛋白消耗能量768KW/T.h，电耗384元/T(按0.5元/KW.h)。单螺杆榨汁机200KW，需2台，能耗400KW/T，电耗200元/T，仅打浆榨汁二道工序耗能为580元/T，这对于能源匮乏的中国成为制约叶蛋白工业生产的瓶颈。

综上可以看出，现有苜蓿处理工艺，苜蓿有效成分得率低，能耗大，并且得到的蛋白分子量很大，不利于利用。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的在于提供一种苜蓿多目标联产提取分离方法，利用生物酶法提取植物蛋白，并使其水解成小分子蛋白不仅有利于消化吸收，提高生物效价，而且易溶于水，为结构蛋白的提取开辟一条新路，同时，苜蓿本身的成分得到了全面回收利用，节约资源，防止环境污染，并达到了节约能源的目的。

为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：

一种苜蓿多目标联产提取分离方法，包括以下步骤：

(a)、取苜蓿鲜草，预处理后经碾切、打浆后，得到浆液，在所述浆液中加入纤维素酶进行酶解；

(b)、将酶解后的浆液分离，得到草渣和上清液，所述草渣回收作为饲料，所述上清液进行多级串联酶解；

(c)、将多级串联酶解后的浆液进行脱色，脱色得到的叶绿素回收利用，脱色的液体进行分离，得到上清液和固体物质，其中的上清液回收，得到以叶黄素为主的产品，固体物质即为多肽。

20世纪中期生物酶法在我国食品行业中开始利用，主要用于果品深加工、大豆多肽蛋白生产、鲜骨胶原蛋白等的提取。本发明提供的苜蓿多目标联产提取分离方法，利用生物酶法提取植物蛋白，使其水解成小分子蛋白，不仅有利于消化吸收，提高生物效价，而且易溶于水，为结构蛋白的提取开辟一条新路，同时，达到了节约能源的目的。并且，本发明提供的苜蓿的处理方法将苜蓿的有效成分全部利用，不仅减少了环境污染，还增加附带产值，具有重大意义。

其中，苜蓿草的预处理是将苜蓿草清洗后甩干，以防止杂质对后续程序的干扰；在机械碾切中，要求达到压扁茎秆，方便打浆；通过打浆进一步捣毁细胞壁，通过加入纤维素酶进行酶解，进一步使细胞壁破坏，为提取结构蛋白打开通道。酶解后的浆液粘度下降，以利于后续的分离。

进一步地，在步骤(a)中，所述浆液在加入纤维素酶之前，还包括对所述浆液中的纤维进行研磨的步骤。通过研磨将浆液中的纤维进行均质，以利于纤维素对浆液中的大分子纤维酶解的均一性。

为了利于后续蛋白的分离，进一步地，在步骤(a)中，所述纤维素酶的添加量为所述苜蓿鲜草重量的0.5％-2％，酶解时间为45-55h。

优选地，在步骤(b)中，所述多级串联酶解具体为：

多级串联酶解的级别设置为4-6级，每一级别酶解的温度范围控制在25-55℃之间，pH控制在6-7之间，且从第一级别到下一级别的温度逐渐升高，而pH值则逐渐降低。

需要注意的地方在于，多级串联酶解的级别设置为4-6级，然后每级之间串联，具体每一级别的温度与pH选取是通过大量的实验得到的适宜的范围，而且第一级别到下一级别的温度按照逐渐升高的趋势进行设定，而pH值则呈逐渐降低的趋势，以保证酶解产物的质量。

经多次试验验证，多级串联酶解所用的酶为木瓜蛋白酶和中性蛋白酶的混合物，且木瓜蛋白酶和中性蛋白酶的添加重量比例为1∶0.8-1.5，得到的多肽平均分子量＜2000Da，不仅有利于消化吸收，提高生物效价，并且水溶性好。优选地，在步骤(b)中，所述多级串联酶解所用的酶为木瓜蛋白酶和中性蛋白酶的混合物，所述木瓜蛋白酶和中性蛋白酶的添加重量比例为1∶0.8-1.5。

为了进一步保证酶解产物的分子量大小以及得率，优选地，在步骤(b)中，所述多级串联酶解所用的酶的添加量为酶解物质重量的0.3％-0.8％；所述多级串联酶解的时间为45-50h。

生物法提取苜蓿多肽与非生物法比较其沉降速率增加，以叶蛋白和白蛋白为主的多肽分离因数降低，汁液中粘度大大降低，为多肽的分离创造了有利条件，为多肽分离设备选型提供了依据。选用连续式卧式螺旋卸料沉降离心机分离效果好，且效率高。分离因素大于3500，多肽分离均可达85％以上。优选地，在步骤(c)中，所述分离采用连续式卧式螺旋卸料沉降离心机进行。

叶黄素水溶性较好，脱色后的上清液中干物质含量为3％-4％，叶黄素约占35％，还有糖类等营养物，是理想的天然食用色素，其经济价值高，回收利用，增加了副产值，也避免了对环境的污染。进一步地，在步骤(c)中，所述其中的上清液回收通过以下方法进行：

将上清液进行浓缩后干燥，得到以叶黄素为主的产品。

为了降低能耗，且不影响其中的活性成分的活性，优选地，在步骤(c)中，所述浓缩采用高效三效真空蒸发器进行，浓缩物料出口温度50-55℃，出料浓度30-35％，得到浓缩液；

将所述浓缩液送至压力式喷粉塔进行造粒喷粉，即得。

苜蓿在生产过程中，原料草需要保持新鲜，原料草的质量和新鲜程度会直接影响到多肽以及其他成分的产量和质量。优选地，在步骤(a)中，所述苜蓿鲜草为：苜蓿从收割到加工不超过4小时。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

(1)本发明提供的苜蓿多目标联产提取分离方法，利用生物酶法提取植物蛋白，使其水解成小分子蛋白，不仅有利于消化吸收，提高生物效价，而且易溶于水，为结构蛋白的提取开辟一条新路，同时，达到了节约能源的目的；并且，本发明提供的苜蓿的处理方法将苜蓿的有效成分全部利用，不仅减少了环境污染，还增加附带产值，具有重大意义。

(2)本发明在多级串联酶解前，先加入纤维素酶进行酶解，为多肽的获得提供很好的条件。

(3)本发明通过多级串联酶解，选用特定的酶、其之间的添加比例以及添加量，并限定酶解的条件，获得的多肽平均分子量＜2000Da，具有非常高的生物活性，该多肽制成喷剂后喷施于人体皮肤，能快速的紧致皮肤，特别是对于喷施于产后的妈妈的腹部，喷施两周即可使松垮的皮肤恢复如初；该多肽还能够与纤维结合，形成纤维蛋白，对治疗癌症有很大的应用前景；另外，该多肽制成口服制剂，具有非常好的提高人体免疫力的效果，对关节病也具有非常好的效果。

(4)本发明还对多级串联酶解后的上清液进行了回收利用，得到以叶黄素为主的产品，增加了副产值，并且也避免了对环境的污染。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售获得的常规产品。

实施例1

一种苜蓿多目标联产提取分离方法，步骤如下：

1)、取苜蓿鲜草，清洗后甩干，然后进行碾切、打浆，得到浆液，对浆液中的纤维进行研磨后加入纤维素酶进行酶解，纤维素酶的添加量为苜蓿鲜草重量的0.5％，酶解时间为55h；

2)、将酶解后的浆液离心，得到草渣和上清液，草渣回收作为饲料，上清液进行多级串联酶解；

3)、多级串联酶解的级别设置为4级，每一级别酶解的温度范围控制在25-35℃之间，pH控制在6-7之间，且从第一级别到下一级别的温度逐渐升高，而pH值则逐渐降低；多级串联酶解所用的酶为木瓜蛋白酶和中性蛋白酶的混合物；木瓜蛋白酶的添加量为上清液重量的0.2％，中性蛋白酶的添加量为上清液重量的0.16％；多级串联酶解的时间为45h；

3)、将多级串联酶解后的浆液用活性炭脱色，脱色得到的叶绿素回收利用，脱色的液体采用连续式卧式螺旋卸料沉降离心机进行分离，得到上清液和固体物质；固体物质为多肽，多肽的得率为6.2％；

上清液采用高效三效真空蒸发器进行浓缩，浓缩物料出口温度50℃，出料浓度30％，得到浓缩液，将浓缩液送至压力式喷粉塔进行造粒喷粉，即得到以叶黄素为主的产品。

实施例2

一种苜蓿多目标联产提取分离方法，步骤如下：

1)、取苜蓿鲜草，清洗后甩干，然后进行碾切、打浆，得到浆液，对浆液中的纤维进行研磨后加入纤维素酶进行酶解，纤维素酶的添加量为苜蓿鲜草重量的1％，酶解时间为48h；

2)、将酶解后的浆液离心，得到草渣和上清液，草渣回收作为饲料，上清液进行多级串联酶解；

3)、多级串联酶解的级别设置为5级，每一级别酶解的温度范围控制在30-50℃之间，pH控制在6-7之间，且从第一级别到下一级别的温度逐渐升高，而pH值则逐渐降低；多级串联酶解所用的酶为木瓜蛋白酶和中性蛋白酶的混合物；木瓜蛋白酶的添加量为上清液重量的0.4％，中性蛋白酶的添加量为上清液重量的0.4％；多级串联酶解的时间为48h；

3)、将多级串联酶解后的浆液用活性炭脱色，脱色得到的叶绿素回收利用，脱色的液体采用连续式卧式螺旋卸料沉降离心机进行分离，得到上清液和固体物质；固体物质为多肽，多肽的得率为6.3％；

上清液采用高效三效真空蒸发器进行浓缩，浓缩物料出口温度52℃，出料浓度32％，得到浓缩液；将浓缩液送至压力式喷粉塔进行造粒喷粉，即得到以叶黄素为主的产品。

实施例3

一种苜蓿多目标联产提取分离方法，步骤如下：

1)、取苜蓿鲜草，清洗后甩干，然后进行碾切、打浆，得到浆液，对浆液中的纤维进行研磨后加入纤维素酶进行酶解，纤维素酶的添加量为苜蓿鲜草重量的1.5％，酶解时间为50h；

2)、将酶解后的浆液离心，得到草渣和上清液，草渣回收作为饲料，上清液进行多级串联酶解；

3)、多级串联酶解的级别设置为5级，每一级别酶解的温度范围控制在40-55℃之间，pH控制在6-7之间，且从第一级别到下一级别的温度逐渐升高，而pH值则逐渐降低；多级串联酶解所用的酶为木瓜蛋白酶和中性蛋白酶的混合物；木瓜蛋白酶的添加量为上清液重量的0.15％，中性蛋白酶的添加量为上清液重量的0.15％；多级串联酶解的时间为48h；

3)、将多级串联酶解后的浆液用活性炭脱色，脱色得到的叶绿素回收利用，脱色的液体采用连续式卧式螺旋卸料沉降离心机进行分离，得到上清液和固体物质；固体物质为多肽，多肽的得率为5.8％；

上清液采用高效三效真空蒸发器进行浓缩，浓缩物料出口温度52℃，出料浓度33％，得到浓缩液；将浓缩液送至压力式喷粉塔进行造粒喷粉，即得到以叶黄素为主的产品。

实施例4

一种苜蓿多目标联产提取分离方法，步骤如下：

1)、取苜蓿鲜草，清洗后甩干，然后进行碾切、打浆，得到浆液，对浆液中的纤维进行研磨后加入纤维素酶进行酶解，纤维素酶的添加量为苜蓿鲜草重量的2％，酶解时间为45h；

2)、将酶解后的浆液离心，得到草渣和上清液，草渣回收作为饲料，上清液进行多级串联酶解；

3)、多级串联酶解的级别设置为6级，每一级别酶解的温度范围控制在25-55℃之间，pH控制在6-7之间，且从第一级别到下一级别的温度逐渐升高，而pH值则逐渐降低；多级串联酶解所用的酶为木瓜蛋白酶和中性蛋白酶的混合物；木瓜蛋白酶的添加量为上清液重量的0.2％，中性蛋白酶的添加量为上清液重量的0.3％；多级串联酶解的时间为50h。

3)、将多级串联酶解后的浆液用活性炭脱色，脱色得到的叶绿素回收利用，脱色的液体采用连续式卧式螺旋卸料沉降离心机进行分离，得到上清液和固体物质；固体物质为多肽，多肽的得率为6％；

上清液采用高效三效真空蒸发器进行浓缩，浓缩物料出口温度55℃，出料浓度35％，得到浓缩液；将浓缩液送至压力式喷粉塔进行造粒喷粉，即得到以叶黄素为主的产品。

试验例1

将实施例1-4制得的以叶黄素为主的产品进行成分检测，得到的结果如表1所示。

表1以叶黄素为主的产品成分检测结果

从表1可以看出，得到的以叶黄素为主的产品各营养物质含量丰富，品质高。

试验例2

将实施例1得到的多肽，进行检测，其多肽大小均小于2000Da，大多在1000-2000Da之间。取该多肽250g进行氨基酸含量检测，得到的结果如表2所示。

表2多肽中氨基酸的含量

项目	含量％	项目	含量％
				天门冬氨酸	2.82	亮氨酸	1.67
苏氨酸	0.93	酪氨酸	0.50
				丝氨酸	0.72	苯丙氨酸	1.14
谷氨酸	2.87	赖氨酸	0.94
				甘氨酸	1.30	组氨酸	0.44
丙氨酸	1.76	精氨酸	0.63
				胱氨酸	0.40	脯氨酸	1.48
缬氨酸	1.48	蛋氨酸	0.32
				异亮氨酸	1.13	总和	20.53

另外，实施例2-4制得的多肽的各种氨基酸的含量与实施例1一致。

本发明得到的多肽具有非常高的生物活性，该多肽制成喷剂后喷施于人体皮肤，能快速的紧致皮肤，特别是对于喷施于产后的妈妈的腹部，喷施两周即可使松垮的皮肤恢复如初；该多肽还能够与纤维结合，形成纤维蛋白，对治疗癌症有很大的应用前景；另外，该多肽制成口服制剂，具有非常好的提高人体免疫力的效果，对关节病也具有非常好的效果。

尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，在不背离本发明的精神和范围的情况下可以作出许多其它的更改和修改。因此，这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有这些变化和修改。

Claims (2)

1.一种苜蓿多目标联产提取分离方法，其特征在于，包括以下步骤：

(a)、取苜蓿鲜草，预处理后经碾切、打浆后，得到浆液，研磨,在所述浆液中加入纤维素酶进行酶解,所述纤维素酶的添加量为所述苜蓿鲜草重量的0.5％-2％，酶解时间为45-55h；

(b)、将酶解后的浆液分离，得到草渣和上清液，所述草渣回收作为饲料，所述上清液进行多级串联酶解；

(c)、将多级串联酶解后的浆液进行脱色，脱色得到的叶绿素回收利用，脱色的液体采用连续式卧式螺旋卸料沉降离心机进行分离，得到上清液和固体物质，其中的上清液回收，得到以叶黄素为主的产品，固体物质即为多肽；

在步骤(b)中，所述多级串联酶解具体为：

多级串联酶解的级别设置为4-6级，每一级别酶解的温度范围控制在25-55℃之间，pH控制在6-7之间，且从第一级别到下一级别的温度逐渐升高，而pH值则逐渐降低；

在步骤(b)中，所述多级串联酶解所用的酶为木瓜蛋白酶和中性蛋白酶的混合物，所述木瓜蛋白酶和中性蛋白酶的添加重量比例为1:0.8-1.5；

在步骤(b)中，所述多级串联酶解所用的酶的添加量为酶解物质重量的0.3％-0.8％；所述多级串联酶解的时间为45-50h；

在步骤(c)中，所述其中的上清液回收通过以下方法进行：

将上清液进行浓缩后干燥，得到以叶黄素为主的产品；

所述浓缩采用高效三效真空蒸发器进行，浓缩物料出口温度50-55℃，出料浓度30-35％，得到浓缩液；

将所述浓缩液送至压力式喷粉塔进行造粒喷粉，即得。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(a)中，所述苜蓿鲜草为：苜蓿从收割到加工不超过4小时。