CN110283866B - 鲫鱼抗疲劳活性肽的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了鲫鱼抗疲劳活性肽的制备方法，包括：初步酶解、再次酶解、纯化，取鲫鱼鱼鳞，经胃蛋白酶酶解为胶原蛋白，在胶原蛋白溶液中加入木瓜蛋白酶、茴香丙酮酶解得到抗疲劳活性肽溶液，在一定条件下经超滤后获得含量达44.9%的鲫鱼抗疲劳活性肽。有益效果为：本发明方法使用鲫鱼鱼鳞经过二次水解获得鲫鱼抗疲劳活性肽，鲫鱼抗疲劳活性肽得率高、活性大，不仅制备成本低廉，安全环保，而且制备过程简单易控，适合规模化生产。

Description

鲫鱼抗疲劳活性肽的制备方法
技术领域
本发明涉及鲫鱼活性肽领域，尤其是涉及鲫鱼抗疲劳活性肽的制备方法。
技术背景
鲫鱼简称鲫，俗名鲫瓜子、月鲫仔、土鲫、细头、鲋鱼、寒鲋、喜头、鲫壳、河鲫。常见于欧亚地区，为常见淡水鱼，属于辐鳍鱼亚纲鲤形目鲤科鲫属。鲫鱼经过人工养殖和选育，可以产生许多新品种，例如金鱼就是由此产生的一种观赏鱼类，和食用的野生鲫鱼学名同为Carassiusauratus。鲫鱼是主要以植物为食的杂食性鱼类，喜群集而行，择食而居。肉质细嫩，营养价值很高，每百克肉含蛋白质13克、脂肪11克，并含有大量的钙、磷、铁等矿物质。鲫鱼药用价值极高，其性平味甘，入胃、肾，具有和中补虚、除羸、温胃进食、补中生气之功效。鲫鱼分布广泛，全国各地水域常年均有生产，以2-4月份和8-12月份的鲫鱼最为肥美，为我国重要食用鱼类之一。最大体长约30厘米，栖息深度为0-20米，无毒，经济型食用鱼类，物美价廉。多产于黄河流域、长江流域、珠江流域一带，其中洱海鲫鱼较为出名。
鱼鳞是鱼外表保护自身，防止水流失的扇片状外壳。鱼鳞含有丰富的蛋白质、脂肪和多种维生素，还有铁、锌、钙和多种人体必需的微量元素以及胶质。鱼鳞通常作为废弃物丢弃，不仅污染环境，而且造成了浪费。
发明内容
本发明的目的在于提供鲫鱼抗疲劳活性肽的制备方法，本制备方法简单易行，使用鲫鱼鱼鳞制备抗疲劳活性肽，环保价廉，制备抗疲劳活性肽效率较高，活性肽活性较好。
本发明针对背景技术中提到的问题，采取的技术方案为：鲫鱼抗疲劳活性肽的制备方法，包括：初步酶解、再次酶解、纯化，具体包括以下步骤：
初步酶解：取鲫鱼鱼鳞，捣碎成肉糜，加入12-15倍量的蒸馏水，再加入鱼鳞用量5-6%的胃蛋白酶，间隔超声辅助酶解，在温度为34-38℃、pH为1.3-1.8的条件下酶解2-3小时得酶解液；鲫鱼鱼鳞中富含胶原蛋白，经过胃蛋白酶的水解后，胶原蛋白析出并可被进一步水解为多肽；
再次酶解：调节酶解液pH为6.5-7.0，加入鱼鳞用量6-8%的木瓜蛋白酶，再加入木瓜蛋白酶重量5.0-7.0%的茴香丙酮，以微波辅助加热使体系温度维持在50-55℃，微波功率为60-100W，酶解1-2小时得酶解液，将酶解液冷却后置于2-4℃、5000-6000r/min条件下离心30-45分钟，取上清液即肽液；茴香丙酮可以作用于木瓜蛋白酶的活性中心半胱氨酸的巯基，提高木瓜蛋白酶的活性，进而加快酶解反应的进行，提高酶解效率，降低反应时间，获得分子量均匀、活性较高的鲫鱼鱼鳞抗疲劳肽；
纯化：在安装好的超滤杯中加入肽液，超滤膜截取分子量为10kDa，将超滤杯放在磁力搅拌器上，打开磁力搅拌器使搅拌子120-160r/min的转速转动，通入氮气调整操作压力为0.13-0.14MPa，超滤45-60分钟即收集滤出液；经纯化后，鲫鱼抗疲劳活性肽的含量可达44.9%，纯化效率较高；鲫鱼抗疲劳活性肽富含支链氨基酸，对机体运动后恢复有促进的作用，还可加速肌肉的合成，减少肌肉组织的损伤，有助于肌肉增大，运动能力增强，机体抗疲劳和耐缺氧的能力均有明显提高。
作为优选，间隔超声的方式为超声2-4秒、暂停4-8秒，超声频率为42-45kHz，超声密度为0.35-0.45W/cm2，超声总用时10-30分钟；超声波的空化效应可以增大酶与底物的接触频率，从而可以提高酶解效率。
与现有技术相比，本发明的优点在于：
1）茴香丙酮可以作用于木瓜蛋白酶的活性中心半胱氨酸的巯基，提高木瓜蛋白酶的活性，进而加快酶解反应的进行，提高酶解效率，降低反应时间，获得分子量均匀、活性较高的鲫鱼鱼鳞抗疲劳肽；
2）鲫鱼抗疲劳活性肽富含支链氨基酸，对机体运动后恢复有促进的作用，还可加速肌肉的合成，减少肌肉组织的损伤，有助于肌肉增大，运动能力增强，机体抗疲劳和耐缺氧的能力均有明显提高；
3）本发明方法使用鲫鱼鱼鳞经过二次水解获得鲫鱼抗疲劳活性肽，鲫鱼抗疲劳活性肽得率高、活性大，不仅制备成本低廉，安全环保，而且制备过程简单易控，适合规模化生产。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明方案作进一步说明：
实施例1：
鲫鱼抗疲劳活性肽的制备方法，包括以下步骤：
1）取鲫鱼鱼鳞，捣碎成肉糜，加入12倍量的蒸馏水，再加入鱼鳞用量5%的胃蛋白酶，间隔超声辅助酶解，间隔超声的方式为超声2秒、暂停4秒，超声频率为42kHz，超声密度为0.35W/cm2，超声总用时10分钟，在温度为34℃、pH为1.3的条件下酶解2小时得酶解液；2）调节酶解液pH为6.5，加入鱼鳞用量6%的木瓜蛋白酶，再加入木瓜蛋白酶重量5.0%的茴香丙酮，以微波辅助加热使体系温度维持在50℃，微波功率为60W，酶解1小时得酶解液，将酶解液冷却后置于2℃、5000r/min条件下离心30分钟，取上清液即肽液；3）在安装好的超滤杯中加入肽液，超滤膜截取分子量为10kDa，将超滤杯放在磁力搅拌器上，打开磁力搅拌器使搅拌子120r/min的转速转动，通入氮气调整操作压力为0.13MPa，超滤45分钟即收集滤出液；经纯化后，鲫鱼抗疲劳活性肽的含量可达44.9%，纯化效率较高；鲫鱼抗疲劳活性肽富含支链氨基酸，对机体运动后恢复有促进的作用，还可加速肌肉的合成，减少肌肉组织的损伤，有助于肌肉增大，运动能力增强，机体抗疲劳和耐缺氧的能力均有明显提高。
实施例2：
鲫鱼抗疲劳活性肽的制备方法，包括以下步骤：
1）初步酶解：取鲫鱼鱼鳞，捣碎成肉糜，加入15倍量的蒸馏水，再加入鱼鳞用量6%的胃蛋白酶，间隔超声辅助酶解，间隔超声的方式为超声4秒、暂停8秒，超声频率为45kHz，超声密度为0.45W/cm2，超声总用时30分钟，在温度为38℃、pH为1.8的条件下酶解3小时得酶解液；鲫鱼鱼鳞中富含胶原蛋白，经过胃蛋白酶的水解后，胶原蛋白析出并可被进一步水解为多肽；
2）再次酶解：调节酶解液pH为7.0，加入鱼鳞用量8%的木瓜蛋白酶，再加入木瓜蛋白酶重量7.0%的茴香丙酮，以微波辅助加热使体系温度维持在55℃，微波功率为100W，酶解2小时得酶解液，将酶解液冷却后置于4℃、6000r/min条件下离心45分钟，取上清液即肽液；茴香丙酮可以作用于木瓜蛋白酶的活性中心半胱氨酸的巯基，提高木瓜蛋白酶的活性，进而加快酶解反应的进行，提高酶解效率，降低反应时间，获得分子量均匀、活性较高的鲫鱼鱼鳞抗疲劳肽；
3）纯化：在安装好的超滤杯中加入肽液，超滤膜截取分子量为10kDa，将超滤杯放在磁力搅拌器上，打开磁力搅拌器使搅拌子160r/min的转速转动，通入氮气调整操作压力为0.14MPa，超滤60分钟即收集滤出液；经纯化后，鲫鱼抗疲劳活性肽的含量可达44.9%，纯化效率较高；鲫鱼抗疲劳活性肽富含支链氨基酸，对机体运动后恢复有促进的作用，还可加速肌肉的合成，减少肌肉组织的损伤，有助于肌肉增大，运动能力增强，机体抗疲劳和耐缺氧的能力均有明显提高。
实施例3：
鲫鱼抗疲劳活性肽的制备方法，包括：初步酶解、再次酶解、纯化，具体包括以下步骤：
初步酶解：取鲫鱼鱼鳞，捣碎成肉糜，加入14倍量的蒸馏水，再加入鱼鳞用量5.5%的胃蛋白酶，间隔超声辅助酶解，间隔超声的方式为超声3秒、暂停6秒，超声频率为44kHz，超声密度为0.40W/cm2，超声总用时25分钟，在温度为37℃、pH为1.5的条件下酶解2.5小时得酶解液；鲫鱼鱼鳞中富含胶原蛋白，经过胃蛋白酶的水解后，胶原蛋白析出并可被进一步水解为多肽；
再次酶解：调节酶解液pH为6.8，加入鱼鳞用量7%的木瓜蛋白酶，再加入木瓜蛋白酶重量6.0%的茴香丙酮，以微波辅助加热使体系温度维持在52℃，微波功率为85W，酶解1.5小时得酶解液，将酶解液冷却后置于3℃、5500r/min条件下离心38分钟，取上清液即肽液；茴香丙酮可以作用于木瓜蛋白酶的活性中心半胱氨酸的巯基，提高木瓜蛋白酶的活性，进而加快酶解反应的进行，提高酶解效率，降低反应时间，获得分子量均匀、活性较高的鲫鱼鱼鳞抗疲劳肽；
纯化：在安装好的超滤杯中加入肽液，超滤膜截取分子量为10kDa，将超滤杯放在磁力搅拌器上，打开磁力搅拌器使搅拌子140r/min的转速转动，通入氮气调整操作压力为0.13MPa，超滤50分钟即收集滤出液；经纯化后，鲫鱼抗疲劳活性肽的含量可达44.9%，纯化效率较高；鲫鱼抗疲劳活性肽富含支链氨基酸，对机体运动后恢复有促进的作用，还可加速肌肉的合成，减少肌肉组织的损伤，有助于肌肉增大，运动能力增强，机体抗疲劳和耐缺氧的能力均有明显提高。
本发明操作步骤中的常规操作为本领域技术人员所熟知，在此不进行赘述。
以上所述的实施例对本发明的技术方案进行了详细说明，应理解的是以上所述仅为本发明的具体实施例，并不用于限制本发明，凡在本发明的原则范围内所做的任何修改、补充或类似方式替代等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (1)

1.鲫鱼抗疲劳活性肽的制备方法，包括：
初步酶解：取鲫鱼鱼鳞，捣碎成肉糜，加入12-15倍量的蒸馏水，再加入鱼鳞重量的5-6%的胃蛋白酶，间隔超声辅助酶解，间隔超声的方式为超声2-4秒、暂停4-8秒，超声频率为42-45kHz，超声密度为0.35-0.45W/cm2，超声总用时10-30分钟，在温度为34-38℃、pH为1.3-1.8的条件下酶解2-3小时得酶解液；
再次酶解：调节酶解液pH为6.5-7.0，加入木瓜蛋白酶、茴香丙酮酶解，木瓜蛋白酶的添加量为鱼鳞用量的6-8%，茴香丙酮的添加量为木瓜蛋白酶重量的5.0-7.0%，以微波辅助加热维持体系温度为50-55℃，微波功率为60-100W，酶解1-2小时得酶解液，将酶解液冷却后置于2-4℃、5000-6000r/min条件下离心30-45分钟，取上清液即肽液；
在安装好的超滤杯中加入肽液，超滤膜截取分子量为10kDa，将超滤杯放在磁力搅拌器上，打开磁力搅拌器使搅拌子120-160r/min的转速转动，通入氮气调整操作压力为0.13-0.14MPa，超滤45-60分钟即收集滤出液。
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