CN102618607B - 一种高f值葵花低聚肽的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种高F值葵花低聚肽的制备方法，该方法是以葵花粕蛋白为原料，采用多酶法联合水解技术酶解，将葵花浓缩蛋白水解成以芳香族氨基酸为端基的多肽，然后用第二种酶水解多肽成芳香族氨基酸、游离氨基酸和低聚肽，进而采用微滤和纳滤二级膜技术进行脱盐以及除去游离氨基酸和芳香族氨基酸，提高F值的比例，最后经脱盐、浓缩、冷冻干燥获得高F值的葵花低聚肽。本发明具有以下技术效果：（1）反应条件温和、获得的产品活性高；（2）制备方法清洁环保，无污染，符合国家清洁生产的相关政策；（3）制得的产品具有显著的生理功效，能充分适用于保健品行业。
Description
技术领域
本发明属于植物深加工技术领域，具体涉及到一种高F值葵花低聚肽的制备方法。
背景技术
葵花籽的产量在世界主要植物油料资源中占第二位。我国葵花籽产量也比较丰富，东北是我国葵花籽的主要产区。制油后的葵花粕是较好的食用蛋白质资源（蛋白质含量在40~60%），并且不具有其它植物油中典型的有毒成份，是一种很理想的植物蛋白资源。但由于葵花籽中有显色酚，限制了其在食品中的直接使用。因此，以葵花籽蛋白为资源，通过生物技术制备具有显著生理功效的低聚肽是非常有前景的，尤其是对于制备成高F值低聚肽来说是一个非常好的资源。
高F值低聚肽是指一类由3~7个氨基酸残基所组成的低聚肽，其中支链氨基酸（主要指必需氨基酸亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸）的含量与芳香族氨基酸（主要指苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸）含量的比值大于20。高F值低聚肽在改善肝功能方、抗疲劳、降血清胆固醇浓度方面具有显著的生理功效。它在抗疲劳方面主要作用机理在于，高F值低聚肽具有含量较高的支链氨基酸，通过补充高F值低聚肽，支链氨基酸进入肌肉组织中氧化脱氨，一方面生成相应的α-酮酸进入三羧酸而氧化供能，另一方面，脱下来的氨基与丙酮酸或谷氨酸偶联，促进丙氨酸和谷氨酰胺的形成，从而成为可提供能量的物质，从而减轻疲劳。
目前，国内外较多的研究人员是采用动物蛋白（如鱼蛋白、乳清蛋白）、植物蛋白（玉米黄粉、玉米醇溶蛋白、大豆分离蛋白）为原料，尚未见有报道是采用葵花粕蛋白为提取原料。在精制分离时国内外常采用活性碳色谱法和凝胶过滤法除去芳香族氨基酸来提高F值 ，然后再蒸汽加热浓缩，这些方法存在一定的产业化局限：色谱法会会消耗大量的水淋洗液，水洗液中肽类浓度较低(0.1%~0.5%)，由此需要较长时间进行浓缩，不仅浓缩成本高，而且浓缩时间过长，易破坏产品的活性。
发明内容
本发明的目的是提供一种高F值葵花低聚肽的制备方法，该方法采用新原料制备高F值低聚肽，进一步提高葵花籽蛋白的利用价值，解决目前这类产品不足的问题。
本发明是以葵花浓缩蛋白为原料，配以缓冲溶液形成酶解体系，然后采用三酶法联合水解技术水解，即将葵花浓缩蛋白水解成以芳香族氨基酸为端基的多肽，然后用第二种酶水解多肽成芳香族氨基酸肽和游离氨基酸，进而采用微滤和超滤二级膜技术进行脱盐以及除去游离氨基酸，提高F值的比例，最后经脱盐、浓缩、冷冻干燥而成。具体包括以下步骤：
（1）混和：取葵花粕蛋白，加水搅拌形成酶解体系；
（2）一酶水解：在步骤（1）中所得的酶解体系中，加入碱性蛋白酶，调节温度40~55℃，pH7.5~9，反应时间为30~240min，然后升温至85~90℃，保持15~20min，灭酶，获得以芳香族氨基酸为端基的多肽溶液；
（3）二酶水解：在步骤（2）中所得的多肽溶液中加入肌动蛋白酶，调节温度45~65℃，pH3.5~7，反应时间为30~240min，然后升温至85~90℃，保持15~20min，灭酶，获得低芳香族氨基酸肽和游离氨基酸；
（4）离心：将步骤（3）中所得的酶解液进行离心，采用高速离心机，离心速度2000~4500rpm，离心时间5~30min，获得酶解离心液；
（5）一级膜技术：将步骤（4）中所得的酶解离心液进行微滤，除去分子量较大的物质，获得澄清的多肽滤液；
（6）二级膜技术：在步骤（5）中所得的多肽滤液中进一步采用纳米过滤，将低聚肽与芳香族氨基酸、游离氨基酸、盐分离出同时起到浓缩的作用，获得高F值的葵花低聚肽。
所述步骤（1）中酶解底物体系调配至质量比为1~20%。
所述步骤（2）中采用的碱性蛋白酶是指通过枯草杆菌发酵提取或动物胰脏提取而得的碱性蛋白酶，其添加量是底物质量的0.1~1%。
所述步骤（5）中微滤采用的滤膜的孔径范围是0.1~10微米。
所述步骤（6）中纳米过滤采用的滤膜是NF-1014S、NF-1015S或NF-1016S，截留分子量300~2000，操作压差0.5~2.0MPa。
与现有的技术相比，本发明具有以下技术效果：
（1）本发明制备方法反应条件温和、获得的产品活性高；
（2）本发明制备方法清洁环保，无污染，符合国家清洁生产的相关政策；
（3）本发明制备方法制得的产品具有显著的生理功效，能充分适用于保健品行业。
具体实施方式
以下实施例仅用于阐述本发明，而本发明的保护范围并非仅仅局限于以下实施例。所述技术领域的普通技术人员依据以上本发明公开内容和各参数所取范围，均可实现本发明的目的。
实施例1
称取10克葵花粕蛋白，加入50亳升水，用氢氧化钠调节pH7.5，加入0.05克碱性蛋白酶，升温到40℃，保持40分钟，然后将酶解液继续升温到90℃，保持15分钟进行灭酶，灭酶后将酶解液冷却到45℃，用柠檬酸调节pH4，加入0.05克肌动蛋白酶，保持40分钟，然后将酶解液继续升温到90℃，保持15分钟进行灭酶，灭酶后进行离心，调整离心速度2000rpm，离心时间保持10分钟，然后倒出离心液选择膜孔径0.5微米的膜进行微滤，获得澄清的多肽溶液。将滤液进一步纳滤，选择NF-1014S膜，截留分子量300，操作压差0.6MPa，将芳香族氨基酸和游离氨基酸以及盐分分离出来，同时将葵花低聚肽溶液进行浓缩，最后进行冷冻干燥获得高F值的葵花低聚肽。
实施例2
称取50克葵花粕蛋白，加入500亳升水，用氢氧化钠调节pH7.6，加入0.1g碱性蛋白酶，升温到45℃，保持60分钟，然后将酶解液继续升温到90℃，保持15分钟进行灭酶，灭酶后将酶解液冷却到50℃，用柠檬酸调节pH4，加入0.1g肌动蛋白酶，保持120分钟，然后将酶解液继续升温到90℃，保持15分钟进行灭酶，灭酶后进行离心，调整离心速度2500rpm，离心时间保持15分钟，然后倒出离心液选择膜孔径0.3微米的膜进行微滤，获得澄清的多肽溶液。将滤液进一步纳滤，选择NF-1001T膜，截留分子量500，操作压差0.5MPa，将芳香族氨基酸和游离氨基酸以及盐分分离出来，同时将葵花低聚肽溶液进行浓缩，最后进行冷冻干燥获得高F值的葵花低聚肽。
实施例3
称取100克葵花粕蛋白，加入2000亳升水，用氢氧化钠调节pH8.5，加入0.5g碱性蛋白酶，升温到45℃，保持45分钟，然后将酶解液继续升温到90℃，保持15分钟进行灭酶，灭酶后将酶解液冷却到45℃，用柠檬酸调节pH4，加入0.5g肌动蛋白酶，保持45分钟，然后将酶解液继续升温到90℃，保持15分钟进行灭酶，灭酶后进行离心，调整离心速度3000rpm，离心时间保持15分钟，然后倒出离心液选择膜孔径8微米的膜进行微滤，获得澄清的多肽溶液。将滤液进一步纳滤，选择NF-1016S膜，截留分子量1000，操作压差0.5MPa，将芳香族氨基酸和游离氨基酸以及盐分分离出来，同时将葵花低聚肽溶液进行浓缩，最后进行冷冻干燥获得高F值的葵花低聚肽。
实施例4
称取300克葵花粕蛋白，加入5000亳升水，用氢氧化钠调节pH8，加入1g碱性蛋白酶，升温到50℃，保持55分钟，然后将酶解液继续升温到90℃，保持15分钟进行灭酶，灭酶后将酶解液冷却到50℃，用柠檬酸调节pH5，加入1g肌动蛋白酶，保持120分钟，然后将酶解液继续升温到90℃，保持15分钟进行灭酶，灭酶后进行离心，调整离心速度3500rpm，离心时间保持20分钟，然后倒出离心液选择膜孔径6微米的膜进行微滤，获得澄清的多肽溶液。将滤液进一步纳滤，选择NF-1016S膜，截留分子量500，操作压差1MPa，将芳香族氨基酸和游离氨基酸以及盐分分离出来，同时将葵花低聚肽溶液进行浓缩，最后进行冷冻干燥获得高F值的葵花低聚肽。
实施例5
称取500克葵花粕蛋白，加入6000亳升水，用氢氧化钠调节pH8.2，加入1.3g碱性蛋白酶，升温到53℃，保持100分钟，然后将酶解液继续升温到90℃，保持15分钟进行灭酶，灭酶后将酶解液冷却到50℃，用柠檬酸调节pH6，加入1.3g肌动蛋白酶，保持60分钟，然后将酶解液继续升温到90℃，保持15分钟进行灭酶，灭酶后进行离心，调整离心速度4000rpm，离心时间保持10分钟，然后倒出离心液选择膜孔径5微米的膜进行微滤，获得澄清的多肽溶液。将滤液进一步纳滤，选择NF-1015S膜，截留分子量1500，操作压差1MPa，将芳香族氨基酸和游离氨基酸以及盐分分离出来，同时将葵花低聚肽溶液进行浓缩，最后进行冷冻干燥获得高F值的葵花低聚肽。
Claims (2)
1.一种高F值葵花低聚肽的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）混和：取葵花粕蛋白，加水搅拌形成酶解体系；
（2）一酶水解：在步骤（1）中所得的酶解体系中，加入碱性蛋白酶，调节温度40~55℃，pH7.5~9，反应时间为30~240min，然后升温至85~90℃，保持15~20min，灭酶，获得以芳香族氨基酸为端基的多肽溶液，其中的碱性蛋白酶是指通过枯草杆菌发酵提取或动物胰脏提取而得的碱性蛋白酶，其添加量是底物质量的0.1~1%；
（3）二酶水解：在步骤（2）中所得的多肽溶液中加入肌动蛋白酶，调节温度45~65℃，pH3.5~7，反应时间为30~240min，然后升温至85~90℃，保持15~20min，灭酶，获得低芳香族氨基酸肽和游离氨基酸；
（4）离心：将步骤（3）中所得的酶解液进行离心，采用高速离心机，离心速度2000~4500rpm，离心时间5~30min，获得酶解离心液；
（5）一级膜技术：将步骤（4）中所得的酶解离心液进行微滤，除去分子量较大的物质，获得澄清的多肽滤液，其中微滤采用的滤膜的孔径范围是0.1~10微米；
（6）二级膜技术：在步骤（5）中所得的多肽滤液中进一步采用纳米过滤，纳米过滤采用的滤膜是NF-1014S、NF-1015S或NF-1016S，截留分子量300~2000，操作压差0.5~2.0MPa，将低聚肽与芳香族氨基酸、游离氨基酸、盐分离出同时起到浓缩的作用，获得高F值的葵花低聚肽。
2.根据权利要求1所述的高F值葵花低聚肽的制备方法，其特征在于，所述步骤（1）中酶解底物体系调配至质量比为1~20%。
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