CN110613832B - 一种海参多肽在医疗器械的应用和制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明研究了酶解法制取有效抗氧化活性海参多肽，本发明为推动海参活性物质的医疗器械的开发奠定了基础。

Description

一种海参多肽在医疗器械的应用和制备方法
技术领域
本发明涉及医疗器械领域，具体涉及一种海参多肽在医疗器械应用，涉及海参多肽的制备方法。
背景技术
海参为刺参科动物刺参或其他种海参的全体，我国古代谢肇的《五杂俎》云“海参，在辽东海滨有之，其性温补，足敌人参，故名海参”。《本草从新》、《本草纲目拾遗》等称海参为补益药物；在《不药良方》、《食物宜忌》和《随息居饮食谱》等称海参为养生佳品。
全世界约有1100种海参，我国有100多种；全世界可供食用海参有40多种，我国有20多种。海参富含蛋白质，脂肪和糖分含量低，含有多种氨基酸和多种维生素及丰富的微量元素，是膳食营养佳品。除了营养物质之外，海参还含有多种生物活性成分，如海参多糖、海参皂苷、海参多肽、海参神经节苷酯、海参不饱和脂肪酸。传统中医药认为海参的功能主治为：补肾益精，养血淘燥。治精血亏损，虚弱劳怯，阳痿，梦遗，小便频数，肠燥便艰。
海参体壁的多糖主要分为两类：一类为海参糖胺聚糖或黏多糖，另一类为海参岩藻多糖。海多糖具有抗肿瘤、提高免疫力、抗真菌、降血糖、抗凝血、降血脂、降低血液黏稠度、抗炎、抑制艾滋病病毒HIV、乙肝病毒HBV等生物活性。
海参皂苷是海参的主要次生代谢产物,是其进行化学防御的物质基础，海参皂苷，被证明具有抗真菌、抗肿瘤、抗病毒、细胞毒、溶血、抑制新生血管、降血压等活性，海参皂苷能与生物膜上甾醇分子结合形成复合物,在膜上形成单一离子通道和大的水孔导致生物膜溶解。
海参中的脂质以磷脂为主(占总脂质的90％)，胆固醇含量非常低(仅占1％)。海参内脏中的脂肪含量比较高，有的高达16％以上，海参脂类化合物能够抗肿瘤、抗HIV病毒和肝保护。
海参体内还含有多种活性多肽，如神经肽、糖肽以及抗菌活性肽等。海参多肽能够抗衰老、提高免疫力、清除氧自由基、提高红细胞SOD活性、抗疲劳。
国内海参深加工产业处于原始阶段，海参的利用效率低，大量营养物质和生物活性成分在加工和运输过程中流失，活性成分结构复杂导致纯化步骤长而且得率低。因此，有待从海参产品的活性因子的原料筛选、到生产工艺进行深入研究，突出海参同其他产品的优势。
近年来海参多肽的抗氧化活性功能已有报道，多种海参多肽产品已经上市，目前国内外已有许多活性肽的分子量与其生物活性之间的关系的报道。由于海参多肽具有溶解性好、低黏度、热稳定性强等优良的理化性质，同时具有抗氧化、抗衰老、抗疲劳等保健功能，因此，开发海参多肽的产品具有很广阔的前景。
本发明以海参多肽与抗氧化活性的关系进行了研究，为酶解法制取有效抗氧化活性海参多肽、为推动海参活性物质的医疗器械、生物制品、食品、保健品、美容化妆品的开发奠定了基础。
技术方案
本发明的目的在于提供一种海参多肽在医疗器械的应用和制备方法。
本发明的海参多肽所制备的组合物具有保健皮肤的活性，具有组织修复的活性。
本发明的海参多肽组合物，包含海参多肽提取物。
本发明涉及海参多肽组合物，包括：洗剂、乳剂、凝胶、膏、霜、液、面膜、乳膏、喷雾剂、贴剂、精华霜、冻干粉。
本发明涉及海参多肽组合物：采用本领域的辅料制备得到医疗器械、药物、化妆品、保健品。
本发明涉及一种海参多肽提取物，其特征在于：分子量范围是800-2000Da，水溶性好，稳定性好。
本发明涉及一种海参多肽提取物，工艺步骤是：新鲜海参，去除嘴、内脏和内壁膜，洗净、粉碎，加入超纯水，调PH，加入中性蛋白酶，酶解，加热水解液，灭酶，冷却至常温，得到海参酶解液；向海参酶解液中加入乙醇，静置，离心，回收上清液的乙醇，用层析处理海参多肽的混合物，脱色脱腥，得到海参多肽提取液，冻干海参多肽提取液，得到海参多肽提取物。
本发明涉及一种海参多肽提取物，工艺步骤是：新鲜海参，去除嘴、内脏和内壁膜，洗净、粉碎，加入6倍量的超纯水，调PH为7.0，加入1％中性蛋白酶，控制在27℃酶解8 小时，100℃加热水解液40分钟，灭酶，冷却至常温，得到海参酶解液；向海参酶解液中加入95％乙醇，至乙醇体积分数为80％，静置12h，离心10000rpm，30分钟，回收上清液的乙醇，海参多肽的混合物通过阴离子树脂，使用去离子水脱色脱腥，得到海参多肽提取液，冻干海参多肽提取液，得到海参多肽提取物。
本发明涉及一种海参多肽提取物，其特征在于：最低熔点为-8.4℃
本发明涉及一种海参多肽提取物，其特征在于：冷冻干燥条件：-45℃，预冻5小时，-30℃减压真空干燥(＜10Pa)14小时，再经10小时将温度升至30℃，继续减压干燥4小时。
实验例1：各材料预处理
各材料预处理
活性炭预处理：采用三氯甲烷浸泡数小时，后使用甲醇清洗至流出的液体无色，超纯水清洗至无醇味，备用。
预处理：以0.5BV的乙醇浸泡树脂24h(1BV为1个树脂床体积)，用2BV的乙醇以2BV/h流速通过树脂柱,并浸泡4-5h；用乙醇2BV/h的流速洗涤树脂至流出液的加水不呈白色混浊为止再用水以同样流速洗净。用2BV的5％HCL溶液以4-6BV/h的流速通过树脂层。并浸泡树脂2-4h。而后用水以同样流速洗至出水pH中性。用2BV的2％NaOH溶液以4- 6BV/h的流速通过树脂层，并浸泡树脂2-4h。而后用水以同样流速洗至出水pH中性。
阳离子交换树脂预处理：首先使饱和食盐水，取其量约等于被处理树脂体积的3倍，将树脂置于食盐溶液中浸泡18-20小时，然后放净食盐水，用清水漂洗，使排出水不带黄色。其次再用2％-4％NaOH溶液适量，浸泡2-4小时，放尽碱液，冲洗树脂直至排出水接近中性为止。最后用5％HCl溶液适量，浸泡4-8小时，放尽酸液，用清水漂洗至中性为止。最后用5％HCl溶液适量，浸泡4-8小时，放尽酸液，用清水漂洗至中性。
阴离子交换树脂预处理：其处理方法中第一步与阳树脂预处理的第一步相同，后用 5％HCl浸泡4-8小时，然后放尽酸液，用水清洗至中性；最后使用2％-4％NaoH溶液浸泡4- 8小时后，放尽碱液，用清水洗至中性。
实验例2：本发明的脱腥脱色流程
采用具有色素吸附功能的活性炭、大孔树脂、717阴离子交换树脂、732阳离子交换树脂，采用以下几种方案对海参酶解液进行脱色脱腥处理。
填料类型 颜色变化
活性炭 无明显变化
大孔树脂 颜色变浅明显
大孔树脂+活性炭 变成无色
阴离子：阳离子＝1:1 颜色变浅
阴离子 变成无色
总结，先经过大孔树脂再经过活性炭与经过阴离子交换树脂之后，样品颜色均变浅，考虑实用性，故选择阴离子交换树脂作为海参脱色脱腥的材料
阴离子交换树脂优选为：717型阴离子交换树脂。
试验例2：多肽的HPLC分析：
采用北京创新通恒高效液相色谱仪、CXTH-3000色谱工作站进行分析；
渗透凝胶色谱：Sephadex G-25凝胶层析(20×400mm)；
进样样品：海参多肽提取物的去离子水溶解液(100μg/ml)，进样量为3ml；
流动相：0.01mol/L的氢氧化钠和磷酸二氢钾水溶液，等度洗脱，
分别称取1.60g氢氧化钠和5.44g磷酸二氢钾置4L水中，作为流动相；
流速：8mL/min，检测波长为220nm，室温；
得到3个色谱峰(HST-1、HST-2、HST-3)；
出峰时间分别为：8.774、13.081、19.087min。结果如图36所示。
试验例3：多肽提取物的质谱分析
采用基质辅助激光解析电离-飞行时间串联质谱仪MALDI-TOF/TOF(AB Sciex,America)进行分析，扫描范围为600-20000Da。
质谱的进样样品是：使用1％的甲酸溶液溶解海参多肽提取物作为样品(1μg/ml)，进样量为5μl。
在LC-MS/MS分析中，通过120分钟梯度洗脱以0.300μl/min的流速分离消化产物，该洗脱系统与质谱仪直接连接。
分析柱是Acclaim PepMap RSLC column(75μm ID,250mm length,C18)。
流动相A为0.1％甲酸-水组成，流动相B由80％乙腈和0.1％甲酸组成。
梯度洗脱条件：
0-5min，3％B；
5-80min，22％B；
80-92min，35％B；
92-103min，90％B；
103-109min，90％B；
109-110min，3％B。
采用轨道离子阱质谱仪(Thermo，America)进行分析。
使用xcalibur 4.1.50软件在数据相关采集模式下操作Fusion Lumos质谱仪，在轨道上有一个单一的全扫描(600-10000m/z，60000分辨率)，随后是20个数据相关的MS/MS扫描。
使用软件byonic(3.2.0版)根据所选数据库搜索MS/MS光谱。
确定分子量范围为600-2500Da。结果如图33-35所示。
图33和34是图35的放大，目的是为了更清楚的明确混合多肽分子量的范围。
实验例4：冻干工艺的确定
(1)最低溶点的测定
仪器：SWCⅡ数字贝克曼温度计，凝固点测定仪
方法：将海参多肽提取物水溶液，置凝固点测定仪内管中，插入测温热电偶，置-25℃冰箱中使冻结。将冻结的样品置凝固点测定仪外管中，测定不同时间下样品温度，绘制样品温度—时间曲线。从曲线上读出最低熔点为-8.4℃。
(2)冷冻干燥条件的确定
冷冻干燥过程按之程度进行：①预冻结过程；②升华干燥；③解析干燥。
建立六种冷冻干燥条件，以外观成型性、复溶性、含水量作考察的指标，优化冷冻干燥的工艺。
优化冷冻干燥的工艺
Figure BDA0002254751250000041
Figure BDA0002254751250000051
以上试验结果表明：6号样品的冻干条件最好，故确定冷冻干燥条件：-45℃，预冻5小时，-30℃减压真空干燥(＜10Pa)14小时，再经10小时将温度升至30℃，继续减压干燥4小时。
实验例5
实验药品
海参多肽：由北京大学天然药物及仿生药物国家重点实验室制备，维生素E：北京双鹤药业股份有限公司，甘露醇：湖南聚硕生物科技有限公司.二甲基亚砜：沧州东丽精细化工有限公司，1，1，3，3一四乙氧基丙烷(TEP)：为上海笛柏化学品技术有限公司，三氯乙酸：上海宏瑞化工有限公司,硫代巴比妥酸(TBA):Sigma公司，以上均为分析纯试剂。
实验仪器：UV-240型紫外分光光度计(日本岛津)；离心机：JIDI-18D台式多用途高速离心机(广州吉迪仪器有限公司；匀浆机：JJ-2组织捣碎匀浆机(常州国华电器有限公司)恒温震荡水浴：FWS-30多功能水浴摇床；皮肤斑试器：IQ Ultra斑试器(北京元康医学有限责任公司)
实验动物
昆明种小白鼠：雌雄各半，20士2g；大耳白兔：2.00士0.20kg,由中国医科大学实验动物部提供。
实验方法
体外实验：按照文献[3，4]的方法进行试验，将小鼠及兔处死，然后，立即取其脑、肝及肾组织，用pH7.4的PBS制备成50g/L的匀浆液，取匀浆液2.0ml，加入不同浓度的海参肽溶液，在37℃温度条件下振荡温育1.5h，用200g/L三氯乙酸沉淀，然后离心，取上清液2m1，加6.5g/L的硫代巴比妥酸(TBA)1m1，于96℃温度下加热10min，用UV-240型紫外分光光度计测定，以TEP为标准品，分别测定其在532nm处的A值，按公式10×A测定值/A标准值，计算LPO的浓度。
体内实验：大白兔经液氮冷冻制成脑水肿模型后(参照文献3)，每天按海参多肽(200、40、8mg/kg)、维生素E和甘露醇(5mg/kg)静脉注射；以生理盐水作为对照组。每组动物8只，手术前、手术后分别于1、3、5、7天静脉取血，测其SOD活性及LPO 含量，每组每天处死2只大白兔，取脑组织测其SOD活性及LPO含量。
人体斑贴试验依据《化妆品安全技术规范》(2015版)筛选符合标准的受试者40名,单次选用40μL(2g/L)的FETSS-3加入斑试器小室内,敷于背部24h；设置空白组,试验完撤去斑试器30min后观察一次(排除因压迫等造成的非特异性刺激反应),48和96h 分别再次观察,记录数据并划分为5个等级。
1.NIR:无任何反应；
2.+可疑反应,仅有轻度红斑；
3.+:红斑、浸润、少量丘疹；
4.++:红斑、浸润、丘疹、水痘；
5.+++:红斑、浸润明显、出现大、红疱和过敏现象。
实验结果
海参多肽对小鼠肝、肾及兔脑组织LPO含量的影响
小鼠肝、肾及兔脑组织匀浆在37℃温育一段时间后，脂质过氧化产物LPO明显升高，而使用海参肽后，其LPO含量明显降低，且有剂量效应关系。说明海参肽能明显清除体外动物组织中的脂质过氧化产物的作用。
兔血中SOD活性及LPO含量变化
实验大白兔形成脑水肿后，其体内血中的SOD活性明显降低，LPO含量明显升高。经用海参肽、维生素E和甘露醇治疗后，其血中SOD活性明显升高，LPO含量显著下降，且有明显的剂量效应关系。
可以看出，动物术后经海参多肽治疗后，随着用药剂量的增加及用药时间的延长，其 SOD活性可从26.8U/ml增至43.6U/m1，其最大增效率可达65.4％。
可以看到，实验动物经海参肽治疗后，其血中LPO含量明显降低，最大清除率可达48.0％，呈现剂量效应关系。
各组动物血及脑组织中SOD活性及LPO含量
海参肽三个不同剂量组均可明显增强动物血中SOD的活性和降低血中LPO的含量，其作用效果随剂量增加而增强，与维生索E和甘露醇效果相当。对脑组织中的作用效果与血中同。
人体斑贴试验结果
人体斑贴试验是药物刺激性和可能致敏性的有效试验手段,实验结果显示:受实验40 名人中，38人为NIR级,意味着无任何反应；1名受试者呈现轻度瘙痒反应,1名受试者轻度红斑；空白对照组40名受试者均无任何反应。这表明海参肽的作为化妆品活性成分用于人皮肤的安全性较高，可以作为皮肤化妆品活性成分使用。
讨论及结论：
动物生物膜上不饱和脂肪酸的脂质过氧化反应是通过自由基的链而进行的。动物颅脑损伤后，可使自由基产生增多，由于脑组织中富含较多不饱和脂肪酸，自由基可攻击膜上不饱和脂肪酸，形成自由基反应中心，以致破坏细胞膜的脂质，从而导致膜上许多酶的功能受到损伤，关于抗自由基药物或自由基消除剂，已有大量的实验研究报道，这类制剂不仅使自由基的产生减少，亦可使自由基的清除速度加快，因而起到保护脑的作用。
本研究结果表明，海参多肽在体外小鼠肝、肾及兔脑组织匀浆中能有效清除温育引起的LPO升高，其抑制率分别达76.8、82.2和85.1％，与对照组比较，有显著差异 (P<0.01)，并具有剂量效应关系。
动物体内实验表明，海参多肽能有效地阻止动物脑组织及血清中脂质过氧化反应的发生与发展，并提高动物体内SOD活性，其作用效果与甘露醇及维生素E相似。说明海参肽对动物脑组织具有较好的保护效果。
人体斑贴实验表明海参多肽用于人皮肤上具有良好的安全性，可以用于制备医疗器械、护肤品和美容化妆品。
海参多肽対小鼠肝、肾及兔脑组织中LPO((μmol/L，x±s)含量的影响
Figure BDA0002254751250000071
兔血清中SOD活性动态变化(U/ml，x±s)
Figure BDA0002254751250000072
兔血清中LPO含量动态变化(μmol//ml，x±s)
术后 术后 术后 术后
组别 术前 1d 3d 5d 7d
海参多肽200mg/kg 1.27±0.32 1.21±0.38 1.05±0,15 0.72±0.12 0.66±0.14
海参多肽40mg/kg 1.28±0.26 1.24±0.23 1.21±0.17 1.13±0.14 0.90±0.24
海参多肽8mg/kg 1.27±0.32 1.22±0.29 1.18±0.17 1.08±0.16 0.97±0.2b
VE 1.29±0.24 1.23±0.24 1.02±0,18 0.84±0.13 0.68±0.08
甘露醇 1.28±0.27 1.22±0.22 1.06±0.12 0.86±0.18 0.70±0.16
对照组 1.28+0.38 1.29±0.28 1.27±0.34 1.28±0.33 1.27±0.13
试验例5：组织修复实验过程
动物
年龄为8-10周的雄性C57BL/6小鼠，将小鼠维持在标准实验室条件下，25±2℃相对湿度50±15％和正常光照期(12小时黑暗/12小时光照)。动物随意喂食正常饮食和水。
大鼠切除伤口模型和药物治疗
使用4％的水合氯醛(0.1ml/10g)经腹膜注射麻醉小鼠。将背部皮肤剃毛，使用医用酒精进行消毒。使用5mm活组织检查器在背部制造一对圆形全厚度伤口，通过用无菌纱布均匀压缩来实现止血。
将伤口随机分成四组，每组五只，进行每日两次局部治疗，使用康复新液(四川好医生攀西药业有限责任公司)20μl(10mg/ml)，海参多肽100μl(用生理盐水溶解；100，200和400μg/ml)或生理盐水100μl，持续一段时间。取伤口造成后第3、5、7和11天的组织进行以下实验。
组织学检查
固定后，将每个伤口包埋在石蜡中。切割5μm的连续切片并用苏木精和曙红染色，用于组织学评估成纤维细胞增殖，新血管形成和上皮再生。
免疫组化
中性粒细胞在组织损伤后的最初48小时占主导地位，用于清除伤口的微生物和细胞碎片；巨噬细胞在接下来的几天中起主要作用，除了清创伤口外，还能分泌生长因子，以促进新组织的形成。为了衡量中性粒细胞、巨噬细胞和分裂的细胞核在伤口恢复期间的变化，使用MPO、F4/80、Ki67进行免疫组化。简言之，组织切片置于盛满柠檬酸抗原修复缓冲液(PH6.0)的修复盒中于微波炉内进行抗原修复，自然冷却后将玻片置于PBS (PH7.4)中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。切片放入3％双氧水溶液，室温避光孵育25min，将玻片置于PBS(PH7.4)中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。在组化圈内滴加3％BSA均匀覆盖组织，室温封闭30min。(一抗是山羊来源的用兔血清封闭，其他来源的用BSA封闭)。轻轻甩掉封闭液，在切片上滴加PBS按一定比例配好的一抗，切片平放于湿盒内4℃孵育过夜。(湿盒内加少量水防止抗体蒸发)。加二抗：玻片置于 PBS(PH7.4)中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。切片稍甩干后在圈内滴加与一抗相应种属的二抗(HRP标记)覆盖组织，室温孵育50min。玻片置于PBS(PH7.4)中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。切片稍甩干后在圈内滴加新鲜配制的DAB显色液，显微镜下控制显色时间，阳性为棕黄色，自来水冲洗切片终止显色。苏木素复染3min左右，自来水洗，苏木素分化液分化数秒，自来水冲洗，苏木素返蓝液返蓝，流水冲洗。显微镜镜检，图像采集分析。
Masson
组织固定在10％中性福尔马林缓冲液中，常规处理，并嵌入石蜡中。用Masson三色染色法测定胶原蛋白。依次将切片放入二甲苯Ⅰ20min-二甲苯Ⅱ20min-无水乙醇Ⅰ5min-无水乙醇Ⅱ5min-75％酒精5min，自来水洗。切片入重铬酸钾浸泡过夜，自来水洗。铁苏木素A液与B液等比混合成铁苏木素染液，切片入铁苏木素3min，自来水洗，分化液分化，自来水洗，返蓝液返蓝，流水冲洗。：切片入丽春红酸性品红浸染5-10min，自来水漂洗。磷钼酸水溶液浸染1-3min。磷钼酸之后不用水洗，直接入苯胺蓝染液染3-6min。切片用1％冰醋酸分化，两缸无水乙醇脱水。切片放入第三缸无水乙醇5min，二甲苯5min透明，中性树胶封片。显微镜镜检，图像采集分析。
武汉赛维尔生物科技有限公司组织切片的分析报告
组织切片扫描及分析方法：组织切片扫描仪型号Pannoramic MIDI，厂家：3DHISTECH.将组织切片上机后切片会在扫描仪的镜头下逐步移动，边移动边成像进而将组织切片上所有的组织信息都扫描成像出来形成一个文件，该文件包含了组织切片上所有的组织信息。该文件用Pannoramic viewer软件打开后可以1-400倍任意倍数放大后进行观察，并可以任意部位截取图片。
Quant center是与Pannoramic viewer配套的分析软件。图片扫描完成后进入Quantcenter中的densito quant软件自动识别并设置组织切片上所有的深棕色为强阳性，棕黄色为中度阳性，浅黄色为弱阳性，蓝色细胞核为阴性。进而对每个组织进行识别分析出强阳性，中度阳性，弱阳性及阴性的面积(单位：像素)，阳性的百分比，及最后进行H-score的评分。
H-SCORE即histochemistry score(组织化学评分)的缩写，是处理免疫组化结果的一种组织学评分方法，将每张切片内阳性的细胞数量及其染色强度转化为相应的数值，达到对组织染色半定量的目的。
H-SCORE＝∑(PI×I)＝(percentage of cells of weak intensity× 1)+(percentage of cells of moderate intensity×2)+percentage of cells of strongintensity×3),
式中pi表示阳性细胞数量占切片中所有细胞数量的百分数；
i代表着色强度(Phase I/II study of temsirolimus for patients withunresectable Hepatocellular Carcinoma(HCC)-a correlative study to explorepotential biomarkers for response；Winnie Yeo,Stephen L Chan,Frankie KF Mo andetc；BMC Cancer.2015；15:395.RANK-ligand(RANKL)expression in young breastcancer patients and during pregnancy；Hatem A Azim,Jr,Fedro A Peccatori,Sylvain Brohée and etc；Breast Cancer Res.2015；17(1):24.)
在伤口愈合初期，低剂量的海参多肽可以促进细胞核的分裂，巨噬细胞数量的增值，加速细胞生成；皮肤增殖过程中，在初期的基础上，中性粒细胞的数量也明显增加，防止伤口感染。整个愈合过程中，海参多肽组胶原纤维生成并排列整齐，可见毛囊皮脂腺等附属器官。因此，海参多肽在伤口愈合中有一定的促进作用。
Figure BDA0002254751250000101
Figure BDA0002254751250000111
Figure BDA0002254751250000121
Figure BDA0002254751250000131
Figure BDA0002254751250000141
Figure BDA0002254751250000151
Figure BDA0002254751250000161
注：Total pixels:总像素点数
Negative pixels:阴性像素点数
Weak-Positive pixels:弱阳性像素点数
Moderate-Positive pixels:中阳性像素点数
Strong-Positive pixels:强阳性像素点数
Mean Density of all pixels:所有像素的平均密度
Mean Density of Negative pixels:阴性像素的平均密度
Mean Density of Weak-Positive pixels:弱阳性像素的平均密度
Mean Density of Moderate-Positive pixels:中阳性像素的平均密度
Mean Density of Strong-Positive pixels:强阳性像素的平均密度
Ratio of Negative pixels to total pixels(％):阴性像素与总像素的比例
Ratio of Strong-Positive pixels to total pixels(％):强阳性像素与总像素的比例
Ratio of Moderate-Positive pixels to total pixels(％):中阳性像素与总像素的比例
Ratio of Weak-Positive pixels to total pixels(％):弱阳性像素与总像素的比例
Ratio of all positive pixels to total pixels(％):阳性像素与总像素的比例
H-Score:组织化学评分
Annotation area(mm2)：测量区
Mask area(mm2):标记区
Total count(pcs):总像素点数
Relative mask area(％):标记区/测量区
Positive mask area(％):阳性标记区面积
Negative(pcs):阴性像素点数
Weak positive(pcs):弱阳性像素点数
Medium positive(pcs):中阳性像素点数
Strong positive(pcs):强阳性像素点数
Negative(％):阴性比例
Weak positive(％):弱阳性比例
Medium positive(％):中阳性比例
Strong positive(％):强阳性比例
H-Score:组织化学评分
试验例5：组织修复实验过程的图例的详细解释
图1：S1皮肤1_2.0x S1皮肤1_20.0x
组织中可见大面积表皮层脱落(黑色箭头)，真皮层缺失，未被结缔组织修复，皮下脂肪层可见较多炎性细胞浸润(红色箭头)。
图2：S2皮肤1_2.0x S2皮肤1_20.0x
可见大片坏死组织。
图3：S3皮肤1_2.0x S3皮肤1_20.0x
可见大片坏死组织。
图4：空白皮肤1_2.0x 空白皮肤1_20.0x
局部可见大面积表皮层坏死，核固缩深染，胞质嗜酸性增强(黑色箭头)，真皮层缺失。
图5：阳性皮肤1_2.0x 阳性皮肤1_20.0x
局部可见大面积表皮层坏死，核固缩深染，胞质嗜酸性增强(黑色箭头)，周围真皮层细胞大面积坏死，可见大量嗜伊红物质(黄色箭头)；皮下脂肪层可见较多炎性细胞浸润(红色箭头)。
图6：S1皮肤masson 2_2.0x S1皮肤masson 2_20.0x
未见明显胶原增生。
图7：S2皮肤masson 2_2.0x S2皮肤masson 2_20.0x
可见大片坏死组织。
图8：S3皮肤masson 2_2.0x S3皮肤masson 2_20.0x
可见大片坏死组织。
图9：空白皮肤masson 2_2.0x 空白皮肤masson 2_20.0x
未见明显胶原增生。
图10：阳性皮肤masson 2_2.0x 阳性皮肤masson 2_20.0x
未见明显胶原增生。
图11：S1皮肤_5.0x S1皮肤_20.0x
可见大片坏死组织。
图12：S 2皮肤_5.0x S2皮肤_20.0x
可见大面积表皮层脱落(黑色箭头)，局部可见表皮层增厚，鳞状上皮细胞增生(黄色箭头)；局部可见大面积结缔组织增生，伴有少量炎性细胞浸润(红色箭头)
图13：S3皮肤_5.0x S3皮肤_20.0x
可见大片坏死组织，皮肤结构消失。
图14：空白皮肤_5.0x 空白皮肤_20.0x
可见大片坏死组织，皮肤结构消失。
图15：阳性皮肤_5.0x 阳性皮肤_20.0x
未见真皮层，表皮层可见增厚，鳞状上皮细胞增生，少量鳞状上皮细胞胞质空泡化(黑色箭头)；局部可见角质层增生(黄色箭头)。
图16：S1皮肤masson_5.0x S1皮肤masson_20.0x
可见大片坏死组织，未见明显胶原增生。
图17：S2皮肤masson_5.0x S2皮肤masson_20.0x
可见大片坏死组织，未见明显胶原增生。
图18：S3皮肤masson_5.0x S3皮肤masson_20.0x
可见大片坏死组织，未见明显胶原增生。
图19：空白皮肤masson_5.0x 空白皮肤masson_20.0x
可见大片坏死组织，未见明显胶原增生。
图20：阳性皮肤masson_5.0x 阳性皮肤masson_20.0x
可见大片坏死组织，未见明显胶原增生。
图21：S1-皮肤_19.9x1 S1-皮肤_19.9x2
局部可见较大面积表皮层缺失(黑色箭头)；真皮层胶原纤维排列整齐，可见毛囊、皮脂腺等附属器官，未见明显炎症。
图22：S2-皮肤_20.0x1 S2-皮肤_20.0x2
表皮层结构完整，上皮细胞形态结构正常；真皮层胶原纤维排列较疏松，可见毛囊、皮脂腺等附属器官，未见明显炎症。
图23：S3-皮肤_20.0x1 S3-皮肤_20.0x2
局部可见表皮层增厚，棘层细胞增生，并可见部分棘层细胞胞质空泡化(黑色箭头)，同时伴有角质层增生(黄色箭头)，表皮层与真皮层之间可见较大空隙；真皮层局部可见较多成纤维细胞与纤维细胞(红色箭头)，毛囊、皮脂腺等附属器官消失，并伴有少量淋巴细胞浸润(蓝色箭头)。
图24：空白-皮肤_20.0x1 空白-皮肤_20.0x2
表皮层结构完整，上皮细胞形态结构正常；真皮层胶原纤维排列较疏松，可见毛囊、皮脂腺等附属器官，未见明显炎症。
图25：阳性-皮肤_20.0x1 阳性-皮肤_20.0x2
表皮层可见轻度增厚(黑色箭头)；真皮层胶原纤维排列较规则，可见毛囊、皮脂腺等附属器官，未见明显炎症
图26：正常-皮肤_20.0x1 正常-皮肤_20.0x2
表皮层结构完整，上皮细胞形态结构正常；真皮层胶原纤维排列较疏松，可见毛囊、皮脂腺等附属器官，未见明显炎症。
图27：S1-皮肤masson_20.0x1 S1-皮肤masson_20.0x2
真皮层可见大量胶原纤维(黑色箭头)，胶原纤维排列规则。
图28：S2-皮肤masson_20.0x1 S2-皮肤masson_20.0x2
真皮层可见大量胶原纤维(黑色箭头)，胶原纤维排列疏松。
图29：S3-皮肤masson_20.0x1 S3-皮肤masson_20.0x2
真皮层局部胶原含量较低(黑色箭头)，胶原纤维排列规则。
图30：空白-皮肤masson_20.0x1 空白-皮肤masson_20.0x2
真皮层可见大量胶原纤维(黑色箭头)，胶原纤维排列较规则。
图31：阳性-皮肤masson_20.0x1 阳性-皮肤masson_20.0x2
真皮层可见大量胶原纤维(黑色箭头)，胶原纤维排列规则。
图32：正常-皮肤masson_20.0x1 正常-皮肤masson_20.0x2
真皮层可见大量胶原纤维(黑色箭头)。
试验例6：多肽HPLC分析洗脱条件的确定(结合图例予以详细解释)：
1.1甲醇水体系
A：水，B：甲醇
图38：色谱条件为0-20min，0.5％B的海参多肽HPLC分析图
图39：色谱条件为0-30min，0.5％B-5％B的海参多肽HPLC分析图
图40：色谱条件为0-12min，0.5％B-3％B；12-20min，3％B-5％B的海参多肽HPLC分析图
1.2缓冲盐-水体系
A：0.01mol/L的氢氧化钠和磷酸二氢钾水溶液，B：水
图41：色谱条件为0-15min，0.5％B-15％B；15-20min，15％B-24.5％B的海参多肽HPLC 分析图
图42：色谱条件为0-20min，5％B-15％B；20-30min，15％B-24.5％B；30-50min，24.5％B-29％B；50-60min，29％B-95％B的海参多肽HPLC分析图
1.3纯水系统
去离子水
图43：色谱条件为0-25min，100％去离子水的海参多肽HPLC分析图
1.4缓冲液系统
0.01mol/L的氢氧化钠和磷酸二氢钾水溶液
图44：色谱条件为0-25min，100％缓冲液的海参多肽HPLC分析图
通过以上几种流动相体系考察，结果显示缓冲液体系具有更好的分离效果。
本发明的工艺的优点是：
本发明向酶解液中加入体积分数95％的乙醇至乙醇体积分数为80％，静置24小时，使得海参多糖发生充分沉淀，使得海参多肽溶解在上清液中，该处理工艺使得海参多肽从酶解液中进一步分离出来，海参肽损失率减少，而且提高了后续效率。海参酶解液中多肽浓度不是很高，其中含有大量的海参多糖，直接浓缩，溶液会变得黏稠，将会降低阴离子树脂的洗脱效率。
附图的分组归类：
图1-5：伤口造成后第三天组织学分析图
图6-10：伤口造成后第三天MASSON分析图
图11-15：伤口造成后第七天组织学分析图
图16-20：伤口造成后第七天MASSON分析图
图21-26：伤口造成后第十一天组织学分析图
图27-32：伤口造成后第十一MASSON分析图
图33-35：海参多肽基质辅助激光解析电离-飞行时间串联质谱仪分析图
附图说明：
图1：S1皮肤1_2.0x，S1皮肤1_20.0x
图2：S2皮肤1_2.0x，S2皮肤1_20.0x
图3：S3皮肤1_2.0x，S3皮肤1_20.0x
图4：空白皮肤1_2.0x，空白皮肤1_20.0x
图5：阳性皮肤1_2.0x，阳性皮肤1_20.0x
图6：S1皮肤masson 2_2.0x，S1皮肤masson 2_20.0x
图7：S2皮肤masson 2_2.0x，S2皮肤masson 2_20.0x
图8：S3皮肤masson 2_2.0x，S3皮肤masson 2_20.0x
图9：空白皮肤masson 2_2.0x，空白皮肤masson 2_20.0x
图10：阳性皮肤masson 2_2.0x，阳性皮肤masson 2_20.0x
图11：S1皮肤_5.0x，S1皮肤_20.0x
图12：S 2皮肤_5.0x，S2皮肤_20.0x
图13：S3皮肤_5.0x，S3皮肤_20.0x
图14：空白皮肤_5.0x，空白皮肤_20.0x
图15：阳性皮肤_5.0x，阳性皮肤_20.0x
图16：S1皮肤masson_5.0x，S1皮肤masson_20.0x
图17：S2皮肤masson_5.0x，S2皮肤masson_20.0x
图18：S3皮肤masson_5.0x，S3皮肤masson_20.0x
图19：空白皮肤masson_5.0x，空白皮肤masson_20.0x
图20：阳性皮肤masson_5.0x，阳性皮肤masson_20.0x
图21：S1-皮肤_19.9x1，S1-皮肤_19.9x2
图22：S2-皮肤_20.0x1，S2-皮肤_20.0x2
图23：S3-皮肤_20.0x1，S3-皮肤_20.0x2
图24：空白-皮肤_20.0x1，空白-皮肤_20.0x2
图25：阳性-皮肤_20.0x1，阳性-皮肤_20.0x2
图26：正常-皮肤_20.0x1，正常-皮肤_20.0x2
图27：S1-皮肤masson_20.0x1，S1-皮肤masson_20.0x2
图28：S2-皮肤masson_20.0x1，S2-皮肤masson_20.0x2
图29：S3-皮肤masson_20.0x1，S3-皮肤masson_20.0x2
图30：空白-皮肤masson_20.0x1，空白-皮肤masson_20.0x2
图31：阳性-皮肤masson_20.0x1，阳性-皮肤masson_20.0x2
图32：正常-皮肤masson_20.0x1，正常-皮肤masson_20.0x2
图33：海参多肽质谱图
图34：海参多肽质谱图
图35：海参多肽质谱图
图36：海参多肽液相分析图
图37：脱色脱腥处理的产物
图38：色谱条件为0-20min，0.5％B的海参多肽HPLC分析图
图39：色谱条件为0-30min，0.5％B-5％B的海参多肽HPLC分析图
图40：色谱条件为0-12min，0.5％B-3％B；12-20min，3％B-5％B的海参多肽HPLC分析图
图41：色谱条件为0-15min，0.5％B-15％B；15-20min，15％B-24.5％B的海参多肽HPLC分析图
图42：色谱条件为0-20min，5％B-15％B；20-30min，15％B-24.5％B；30-50min，24.5％B- 29％B；50-60min，29％B-95％B的海参多肽HPLC分析图
图43：色谱条件为0-25min，100％去离子水的海参多肽HPLC分析图
图44：色谱条件为0-25min，100％缓冲液的海参多肽HPLC分析图。
实施例1：冻干粉的制备
海参多肽提取物100mg；加入5.0g精氨酸，加入10.0g甘露醇，加入注射用水，加热溶解，稀释至2000ml，过滤、滤液超滤，分装、冷冻干燥，完毕后压盖。
冷冻干燥条件：-45℃，预冻5小时，-30℃减压真空干燥(＜10Pa)14小时，再经10小时将温度升至30℃，继续减压干燥4小时。
实施例2：精华液的制备
一种精华液的制备方法，取海参多肽提取物2mg，丙二醇30g，甘油20g，去离子水950ml；搅拌。
实施例3：一种保湿面膜的制备方法，由无纺布面膜纸和实施例3的精华液制成。
实施例4：日霜：
海参多肽提取物100mg，甘油2g，芝麻油4.0g，棕榈酸异辛酯2.0g，单甘酯2.0g，二甲基硅油2.0g，维生素E醋酸酯1g，烟酰胺0.1g，尿囊素0.1g，尼伯金甲酯0.1g，去离子水加至100g。
实施例5：气雾剂：
海参多肽提取物100mg，用氮酮2g，丙二醇10g，冰片0.3g，加入50ml75％乙醇研磨溶解，补足乙醇至100ml，充分搅拌30分钟，灌装，即得。
实施例6：凝胶：
海参多肽提取物100mg，尼泊金甲酯2g，羟丙基乙基纤维素50g，75％乙醇100ml；取海参多肽提取物，加入尼泊金甲酯，用75％乙醇溶解；另取羟丙基乙基纤维素，加水溶胀，混匀，加水至1000g，搅匀，得到透明状凝胶。
实施例7：
一种海参多肽提取物，工艺步骤是：新鲜海参，去除嘴、内脏和内壁膜，洗净、粉碎，加入6倍量的超纯水，调PH为7.0，加入1％中性蛋白酶，控制在27℃酶解8小时， 100℃加热水解液40分钟，灭酶，冷却至常温，得到海参酶解液；向海参酶解液中加入 95％乙醇，至乙醇体积分数为80％，静置12h，离心10000rpm，30分钟，回收上清液的乙醇，海参多肽的混合物通过阴离子树脂，使用去离子水脱色脱腥，得到海参多肽提取液，冻干海参多肽提取液，得到海参多肽提取物。
一种海参多肽提取物，冷冻干燥条件：-45℃，预冻5小时，-30℃减压真空干燥(＜10Pa)14小时，再经10小时将温度升至30℃，继续减压干燥4小时。
一种海参多肽提取物，最低熔点为-8.4℃
实施例8：
一种海参多肽提取物，通过HPLC分析，有3个色谱峰
采用北京创新通恒高效液相色谱仪、CXTH-3000色谱工作站进行分析；
渗透凝胶色谱：Sephadex G-25凝胶层析(20×400mm)；
进样样品：海参多肽提取物的去离子水溶解液(100μg/ml)，进样量为3ml；
流动相：0.01mol/L的氢氧化钠和磷酸二氢钾水溶液，等度洗脱，
分别称取1.60g氢氧化钠和5.44g磷酸二氢钾置4L水中，作为流动相；
流速：8mL/min，检测波长为220nm，室温；
得到3个色谱峰(HST-1、HST-2、HST-3)；
出峰时间分别为：8.774、13.081、19.087min。结果如图36所示。
实施例9：多肽提取物的质谱分析
采用基质辅助激光解析电离-飞行时间串联质谱仪MALDI-TOF/TOF(AB Sciex,America)进行分析，扫描范围为600-20000Da。
质谱的进样样品是：使用1％的甲酸溶液溶解海参多肽提取物作为样品(1μg/ml)，进样量为5μl。
在LC-MS/MS分析中，通过120分钟梯度洗脱以0.300μl/min的流速分离消化产物，该洗脱系统与质谱仪直接连接。
分析柱是Acclaim PepMap RSLC column(75μm ID,250mm length,C18)。
流动相A为0.1％甲酸-水组成，流动相B由80％乙腈和0.1％甲酸组成。
梯度洗脱条件：
0-5min，3％B；
5-80min，22％B；
80-92min，35％B；
92-103min，90％B；
103-109min，90％B；
109-110min，3％B。
采用轨道离子阱质谱仪(Thermo，America)进行分析。
使用xcalibur 4.1.50软件在数据相关采集模式下操作Fusion Lumos质谱仪，在轨道上有一个单一的全扫描(600-10000m/z，60000分辨率)，随后是20个数据相关的MS/MS扫描。
使用软件byonic(3.2.0版)根据所选数据库搜索MS/MS光谱。
确定分子量范围为600-2500Da。结果如图33-35所示。
参考文献：
1.马同汇,周清凯,蔡云见.海参的药理作用及应用[J].海洋药物,1982,(2):9-14
2.陈卉卉,于平,励建荣.东海海参胶原蛋白多肽的制备及清除自由基功能研究[J].中国食品学报,2010,10(1):19-25
3.句海松，忻文娟，李小洁等.甘草类黄酮对脂质过氧化和活性氧自由基的作用.药学学报，1989.24(11)：807
4.张光成，方思鸣，同光云等.解烟毒保健营养液抗氧化作用实验研究.中草药，1996，27(4)：227
5.Reulen M D，KontosH A.Elearance ofedema fluide intocerebrosplnalfluid.J Neurosurg，l978，48：754

Claims (8)

1.一种海参多肽提取物作为唯一活性成分在制备促进伤口愈合的组合物的应用，其特征在于：
一种海参多肽提取物，工艺步骤是：新鲜海参，去除嘴、内脏和内壁膜，洗净、粉碎，加入6倍量的超纯水，调PH为7.0，加入1%中性蛋白酶，控制在27℃酶解8小时，100℃加热水解液40分钟，灭酶，冷却至常温，得到海参酶解液；向海参酶解液中加入95%乙醇，至乙醇体积分数为80%，静置12h，离心10000rpm，30分钟，回收上清液的乙醇，海参多肽的混合物通过阴离子树脂，使用去离子水脱色脱腥，得到海参多肽提取液，冻干海参多肽提取液，得到海参多肽提取物；
海参多肽提取物的最低熔点为-8.4℃；
海参多肽提取物的冷冻干燥条件：-45℃，预冻5小时，-30℃减压真空干燥14小时，＜10Pa，再经10小时将温度升至30℃，继续减压干燥4小时；
采用北京创新通恒高效液相色谱仪、CXTH-3000色谱工作站分析海参多肽提取物；
渗透凝胶色谱： Sephadex G-25凝胶层析，20×400mm；
进样样品：海参多肽提取物的去离子水溶解液，100μg/ml，进样量为3ml；
流动相：0.01mol/L 的氢氧化钠和磷酸二氢钾水溶液，等度洗脱，
分别称取1.60g氢氧化钠和5.44g磷酸二氢钾置4L水中，作为流动相；
流速：8mL/min，检测波长为220nm，室温；
得到3个色谱峰：HST-1、HST-2、HST-3；
出峰时间分别为：8.774、13.081、19.087min。
2.如权利要求1所述的一种海参多肽提取物作为唯一活性成分在制备促进伤口愈合的组合物的应用，其特征在于：
组合物的剂型为乳剂、凝胶、膏、霜、液、面膜、喷雾剂、贴剂、冻干粉。
3.如权利要求1所述的一种海参多肽提取物作为唯一活性成分在制备促进伤口愈合的组合物的应用，其特征在于：
组合物的剂型为乳膏、精华霜。
4.一种海参多肽提取物作为唯一活性成分在制备促进伤口愈合的医疗器械的应用，其特征在于：
海参多肽提取物的制备方法如权利要求1所述；
剂型如权利要求2所述。
5.一种海参多肽提取物作为唯一活性成分在制备组织修复的组合物的应用，其特征在于：
海参多肽提取物如权利要求1所述；
剂型如权利要求2所述。
6.一种海参多肽提取物作为唯一活性成分在制备皮肤修复的组合物的应用，其特征在于：
海参多肽提取物如权利要求1所述；
剂型如权利要求2所述。
7.一种海参多肽提取物作为唯一活性成分在制备保健皮肤的组合物的应用，其特征在于：
海参多肽提取物如权利要求1所述；
剂型如权利要求2所述。
8.一种海参多肽提取物作为唯一活性成分在制备治疗脑水肿的组合物的应用，其特征在于：
海参多肽提取物如权利要求1所述；
剂型是冻干粉。
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