KR20140128870A - 유해 미생물에 대해 항균 활성을 갖는 바실러스 서브틸리스 rx7 균주 및 이의 용도 - Google Patents

유해 미생물에 대해 항균 활성을 갖는 바실러스 서브틸리스 rx7 균주 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 유해 미생물에 대해 항균 활성을 갖는 바실러스 서브틸리스 RX7 균주 및 이의 용도에 관한 것으로, 바실러스 서브틸리스 RX7 균주 및 상기 균주에서 생산된 살균성 단백질인 박테리오신은 그람음성균, 그람양성균 및 진균에 대해 폭 넓은 항균활성을 갖고, 상기 박테리오신은 넓은 범위의 pH 및 온도에서 안정적인 항균 활성이 유지되므로 항균 조성물 및 식품, 사료, 의약품에 대한 보존제 및 방부제로 다양한 산업분야에서 이용될 수 있을 것으로 기대된다.

Description

유해 미생물에 대해 항균 활성을 갖는 바실러스 서브틸리스 RX7 균주 및 이의 용도 {Bacillus subtilis RX7 strain having antimicrobial activity against harmful microorganism and uses thereof}
본 발명은 유해 미생물에 대해 항균 활성을 갖는 바실러스 서브틸리스 RX7 균주 및 이의 용도에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 유해 미생물에 대해 항균 활성을 갖는 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis) RX7 균주 (기탁번호 KFCC11550P), 상기 균주 및 균주의 배양물을 유효성분으로 함유하는 유해 미생물 항균용 조성물, 바실러스 서브틸리스 균주 (기탁번호 KFCC11550P)의 배양물로부터 분리된 살균성 단백질, 상기 살균성 단백질을 유효성분으로 포함하는 유해 미생물 항균용 조성물, 상기 항균용 조성물을 포함하는 식품, 사료, 화장품 및 의약품에 대한 보존제 조성물, 상기 균주 및 균주의 배양물을 유효성분으로 포함하는 프로바이오틱 (probiotics) 조성물, 상기 균주를 이용하여 항균용 미생물 제제를 제조하는 방법 및 상기 균주를 유해 미생물에 처리하여 유해 미생물을 방제하는 방법에 관한 것이다.
식품, 화장품, 의약품 및 사료 등은 변질 및 부패를 방지하고 영양가와 신선도를 유지하기 위해 보존제나 방부제 등의 첨가물을 이용하고 있다. 보존제나 방부제는 세균, 곰팡이, 효모 등의 미생물 증식을 억제하거나 살균하여 식품 및 의약품의 변질 및 부패를 방지하는 역할을 한다. 이러한 보존제 및 방부제는 독성이 없고 미량으로도 큰 효과를 나타내는 것이 이상적이며, 기존에는 이러한 효과를 얻기 위해 화학 물질을 주로 사용해왔다.
그러나 상기 화학 물질 중에서 가장 안전한 것으로 인정되어 범용적으로 사용되는 파라벤류 방부제들조차 피부 알레르기를 일으키고 유사 환경 호르몬이라는 문제점을 가지고 있다. 또한, 식품에 주로 사용되는 보존제나 방부제들은 허용 기준 내에 사용되는 경우에도, 항균력 및 인체 안전성에 대한 불신이 계속되고 있으며, 지속적인 체내 축적으로 인한 독성 문제 가능성이 대두되고 있다. 이와 같은 우려에 따라 안전하고 효과적인 천연 보존제 또는 방부제에 대한 관심과 요구가 급증하고 있다.
천연 보존제 또는 방부제로 이용될 수 있는 항생물질에는 박테리오신 (bacteriocin) 또는 박테리오신 유사 물질 (bacteriocin-like substances; BLS)이 있다. 박테리오신은 미생물이 생산하는 항균 펩티드 (Antimicrobial peptide)로 그람양성균 및 그람음성균 등의 근연종에 대해 항균 활성을 가지는 단백질 또는 단백질 및 탄수화물의 복합체로 구성된다. 이들은 단백질 및 탄수화물로 구성되어 있어 인체 소화기관의 단백질 가수 분해 효소에 의해 분해되기 때문에 인체에 무독하고 잔류성이 없다는 점에서 식품 등에 이용할 수 있는 천연 방부제 및 살균제 (Bacteriocide)로서의 효용성이 주목받고 있다.
박테리오신 중 니신 (nisin)이 1998년 미국 FDA로부터 가공치즈 스프레드 식품에 사용되는 것이 승인된 이후로, 박테리오신은 식품산업에서 사용될 수 있는 항균제재로서 인식되고 있으며, 이에 따라 박테리오신, 특히 박테리오신의 항균제재 용도에 대한 수많은 연구들이 진행되고 있다. 특히 유산균이 생산하는 박테리오신은 유산균이 GRAS (generally regarded as safe) 미생물이고, 인간의 장내 단백질 분해효소에 의해 분해되므로 안전하다는 인식에 의해, 박테리오신 관련 연구들 중 가장 많은 연구가 유산균 유래의 박테리오신에 대하여 진행되어 왔다.
그러나 유산균 유래의 박테리오신은 항균 스펙트럼이 좁고, 특히 그람 음성균이나 효모, 곰팡이에 대해서는 거의 항균력이 없다는 단점으로 인하여 실제로 식품 보존제로 널리 활용되지 못하고 있는 실정이다. 천연 식품 보존제의 경우 식품부패나 식중독 등에 관여하는 세균, 효모 및 곰팡이 등의 미생물에 대해 총체적으로 적용 가능한 넓은 범위의 항균력이 요구되므로 이러한 요구에 부응하는 천연 보존제 또는 방부제에 대한 개발이 필요한 실정이다 (Klaenhammer, Biochimie. 70:337-349 (1988)).
바실러스 속 균주는 넓은 항균 스펙트럼 (antimicrobial spectrum)과 다양한 구조를 지니는 펩티드 항생물질 (peptide antibiotics) 즉, 박테리오신이나 박테리오신 유사 물질 (BLS)을 생산하는 특징을 지니고 있다. 그러나 그동안 바실러스 속이 생산하는 박테리오신에 대한 연구는 유산균 유래의 박테리오신보다 상대적으로 미흡하였다. 따라서 본 발명에서는 오랜 역사 동안 전통 발효식품과 함께 섭취해온 GRAS 등급의 바실러스 속 미생물이며, 유해 세균에 대해 넓은 항균 스펙트럼을 가지는 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis) RX7 균주 및 상기 균주가 생산하는 항균 물질을 제공하고자 한다.
한편, 한국공개특허 제2009-0070975호에는 '메주로부터 분리된 바실러스 서브틸리스 및 이를 포함하는 항균 조성물'이 개시되어 있고, 한국등록특허 제1249339호에는 '항균활성을 갖는 바고코커스 속 VK24 균주 및 이를 포함하는 항균물질 제제'가 개시되어 있다. 그러나 본 발명에서와 같이 그람 양성균, 그람음성균 및 진균에 대해 항균 활성을 갖는 바실러스 서브틸리스 RX7 균주 및 이의 용도에 대해서는 개시된 바가 없다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자는 유해 미생물에 대해 항균 활성을 갖는 박테리오신 (bacteriocin)을 생산하는 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis) RX7 균주 (기탁번호 KFCC11550P)를 토양에서 분리하였고, 상기 균주, 균주의 배양물 및 배양물에서 분리된 단백질이 그람음성균, 그람양성균 및 진균에 대해 살균 (bacteriocidal) 효과를 갖는 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 유해 미생물에 대해 항균 활성을 갖는 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis) RX7 균주 (기탁번호 KFCC11550P)를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 바실러스 서브틸리스 RX7 균주, 상기 균주의 배양물, 상기 배양물의 농축액 또는 상기 배양물의 건조물을 유효성분으로 함유하는 유해 미생물 항균용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 바실러스 서브틸리스 RX7 균주의 배양물로부터 분리된 살균성 단백질을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 살균성 단백질을 유효성분으로 포함하는 유해 미생물에 대한 항균용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 항균용 조성물을 포함하는 식품, 사료, 화장품 또는 의약품에 대한 보존제 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 바실러스 서브틸리스 RX7 균주, 상기 균주의 배양물, 상기 배양물의 농축액 또는 상기 배양물의 건조물을 유효성분으로 포함하는 프로바이오틱 (probiotics) 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 바실러스 서브틸리스 RX7 균주를 배양하는 단계를 포함하는 유해 미생물에 대한 항균용 미생물 제제를 제조하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 바실러스 서브틸리스 RX7 균주, 상기 균주의 배양물, 상기 배양물의 농축액 또는 상기 배양물의 건조물을 유해 미생물에 처리하여 유해 미생물을 방제하는 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 바실러스 서브틸리스 RX7 균주 및 상기 균주에서 생산된 살균성 단백질인 박테리오신은 그람음성균, 그람양성균 및 진균에 대해 폭 넓은 항균활성을 갖고, 상기 박테리오신은 넓은 범위의 pH 및 온도에서 안정적인 항균 활성이 유지되므로 항균 조성물 및 식품, 사료, 의약품에 대한 보존제 및 방부제로 다양한 산업분야에서 이용될 수 있을 것으로 기대된다.
도 1은 바실러스 서브틸리스 RX7 균주가 분비하는 항균 물질이 살모넬라 엔테리티디스 (Salmonella enteritidis) 균주 (KCCM 12021)의 성장에 미치는 영향을 나타낸다. 세포 생존도는 대조구 세포 (삼각형) 및 최종 농도 80 AU/㎖의 항균 물질을 처리한 세포 (사각형)에서 관찰하였다.
도 2는 바실러스 서브틸리스 RX7 균주 배양액을 침전시켜 얻은 조항균 물질이 살모넬라 엔테리티디스 균주 (KCCM 12021)의 성장 억제에 미치는 영향을 한천 확산법 (Agar Well Diffusion)으로 확인한 결과를 나타낸다.
도 3은 바실러스 서브틸리스 RX7 균주 배양액에서 얻은 조항균 물질을 음이온 교환 수지인 Q-sepharose를 이용하여 다양한 농도의 NaCl (0.1, 0.3, 0.5, 0.8 및 1 M NaCl)로 용출시킨 결과를 나타낸다.
도 4는 바실러스 서브틸리스 RX7 균주 배양액에서 정제한 항균 물질의 트리신 (tricine) SDS-PAGE 분석 결과 및 트리신 SDS-PAGE에 지시균을 중층하여 항균 활성을 확인한 결과를 나타낸다. 레인 M: 단백질 마커 (Bio-Rad), 레인 A: 트리신 SDS-PAGE의 CBB (Coomassie Brilliant Blue) G250 염색 결과, 레인 B: 항균 물질의 활성 확인 결과.
도 5는 바실러스 서브틸리스 RX7 균주 배양액에서 정제한 항균 물질의 아미노-말단 아미노산 서열과 유사한 항균 펩티드와의 서열 비교 결과이다.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 유해 미생물에 대해 항균 활성을 갖는 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis) RX7 균주 (기탁번호 KFCC11550P)를 제공한다. 상기 바실러스 서브틸리스 RX7 균주를 한국미생물보존센터에 2013년 2월 28일자로 기탁하였다 (기탁번호: KFCC11550P).
또한, 본 발명은 상기 바실러스 서브틸리스 RX7 균주, 상기 균주의 배양물, 상기 배양물의 농축액 및 상기 배양물의 건조물로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상을 유효성분으로 함유하는 유해 미생물에 대한 항균용 조성물을 제공한다.
본 발명에서 배양물은 특정 미생물을 배양 배지 또는 배양액에서 배양한 것을 의미하며, 상기 배양물은 특정 미생물을 포함하거나 포함하지 않을 수 있다. 상기 배양물은 그 제형이 액체 또는 고체일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 "항균 (antimicrobial)"의 의미는 특정 농도에서 미생물의 성장 또는 생존을 감소, 방지, 억제, 또는 제거하는 능력을 의미한다. 항균용 조성물이란 항미생물제를 총칭하는 의미인 항생제와 같은 의미일 수 있고, 항균제, 살균제, 방부제, 보존제 또는 제균제와 같은 의미일 수 있으며, 바람직하게는 그람양성균, 그람음성균, 진균 (효모 및 곰팡이)으로 이루어진 군에서 선택된 1 종 이상의 미생물의 발육과 생활 기능을 저지 또는 억제할 수 있는 물질 즉, 항세균 및 항진균 효력이 있는 물질을 의미한다.
본 발명의 항균용 조성물은 유해 미생물에 감염된 부분에 직접 투여하거나 적절한 형태의 조성물로 제조하여 투여할 수 있다. 본 발명의 항균용 조성물의 투여량은 투여 대상에서 유해 미생물을 사멸시키는 효과를 발휘하기 위해 요구되는 정도의 양을 의미하는데, 제형의 종류 및 투여 대상의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 경로, 투여 시간 및 기간을 비롯한 다양한 인자에 따라 조절될 수 있다. 가축 또는 어류에 사용하는 경우는 수의학에서 허용하는 범위 내에서 제제화하고 그에 따라 투여경로를 정할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 유해 미생물은 그람음성균, 그람양성균 또는 진균일 수 있으며, 바람직하게는 바실러스 속 (Bacillus sp.), 엔테로코커스 속 (Enterococcus sp.), 리스테리아 속 (Listeria sp.), 스트렙토코커스 속 (Streptococcus sp.), 스타필로코커스 속 (Staphylococcus sp.), 에스케리키아 속 (Escherichia sp.), 클렙시엘라 속 (Klebsiella sp.), 슈도모나스 속 (Pseudomonas sp.), 쉬겔라 속 (Shigella sp.), 살모넬라 속 (Salmonella sp.) 또는 칸디다 속 (Candida sp.) 미생물일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 바실러스 세레우스 (Bacillus cereus), 바실러스 리케니포르미스 (Bacillus licheniformis), 엔테로코커스 패칼리스 (Enterococcus faecalis), 리스테리아 모노사이토게네스 (Listeria monocytogenes), 스트렙토코커스 아갈락티애 (Streptococcus agalactiae), 스트렙토코커스 뮤탄스 (Streptococcus mutans), 스타필로코커스 아우레우스 (Staphylococcus aureus), 에스케리키아 콜라이 (Escherichia coli), 클렙시엘라 뉴모니애 (Klebsiella pneumoniae), 슈도모나스 애루지노사 (Pseudomonas aeruginosa), 쉬겔라 플렉스네리 (Shigella flexneri), 살모넬라 엔테리티디스 (Salmonella enteritidis), 살모넬라 갈리나룸 (Salmonella gallinarum), 살모넬라 풀로룸 (Salmonella pullorum), 살모넬라 티피무리움 (Salmonella typhimurium) 또는 칸디다 알비칸스 (Candida albicans)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 항균용 조성물에서, 상기 조성물은 바람직하게는 식품, 식품 첨가제, 사료 첨가제 또는 의약품 형태일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 식품은 유제품 (우유, 두유, 가공우유), 발효유 (액상 요구르트, 호상 요구르트), 드링크제, 육류, 소시지, 빵, 초콜릿, 캔디류, 스낵류, 과자류, 피자, 라면, 껌류, 아이스크림류, 스프, 음료수, 알코올 음료 및 비타민 복합제로 구성되는 군으로부터 선택될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 본 발명의 식품은 기능성 식품을 포함할 수 있는데, 본 발명의 기능성 식품에는 상기 유효성분 외에도 필요에 따라 다양한 보조성분을 추가로 함유할 수 있다. 본 발명의 기능성 식품의 경우, 비타민 A, 비타민 B1, 비타민 B2, 비타민 B3, 비타민 B6, 비타민 B12, 엽산 (folic acid), 비타민 C, 비타민 D3, 비타민 E 등의 비타민류 및 구리, 칼슘, 철, 마그네슘, 칼륨, 아연 등의 미네랄을 추가로 포함할 수 있다. 또한 본 발명의 기능성 식품 중, 건강 음료는 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 포함할 수 있다. 향미제로는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제나, 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 들 수 있다. 천연 탄수화물로는 포도당, 과당 등의 단당류, 말토스, 수크로오스 등의 이당류, 덱스트린, 사이클로덱스트린 등의 다당류, 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알코올류 등을 들 수 있다.
본 발명의 균주를 배양하는 단계에서 얻어지는 상기 균주 또는 이의 배양액을 식품 첨가제로 사용할 경우, 상기 균주 또는 이의 배양액을 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용할 수 있으며, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효 성분의 혼합양은 그 사용 목적 (예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 사료 첨가제는 기초 사료에 일정 비율로 첨가될 수 있다. 상기 기초사료는 주성분이 옥수수, 대두박, 유청, 어분, 당밀, 소금, 비타민 프리믹스 및 미네랄 프리믹스 등으로 이루어질 수 있다. 비타민 프리믹스는 비타민 A, 비타민 D, 비타민 E, 리보프라빈 및 나이아신으로 구성될 수 있으며, 미네랄 프리믹스는 망간, 철, 아연, 칼슘, 구리, 코발트 및 셀레늄 등으로 구성될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 의약품 형태의 항균용 조성물은 투여를 위해서 유효성분인 상기 바실러스 서브틸리스 RX7 균주 및 이의 배양물 이외에 추가로 약제학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 포함하여 약학적 조성물로 바람직하게 제제화할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 항균 조성물은 비경구의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있는데, 제제화할 경우에는 일반적으로 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함되며, 비수성용제나 현탁용제로는 프로필렌 글리콜 (Propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔 (witepsol), 마크로골, 트윈 (tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다. 또한 생리식염수 또는 유기용매와 같이 약제로 허용된 여러 전달체 (carrier)와 혼합하여 사용될 수 있고, 안정성이나 흡수성을 증가시키기 위하여 글루코오스, 수크로오스 또는 덱스트란과 같은 카보하이드레이트, 아스코르브산 (ascorbic acid) 또는 글루타치온과 같은 항산화제 (antioxidants), 킬레이팅 물질 (chelating agents), 저분자 단백질 또는 다른 안정화제 (stabilizers)들이 동시에 사용될 수 있다. 더 나아가 해당분야의 적절한 방법으로 [Remington's Pharmaceutical Science, Mack Publishing Company, Easton PA]에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다.
또한, 본 발명은 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis) RX7 균주 (기탁번호 KFCC11550P)의 배양물로부터 분리된 살균성 단백질을 제공한다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 살균성 단백질에 있어서, 상기 살균성 단백질은 아미노 말단의 15개의 아미노산이 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 살균성 단백질에 있어서, 상기 단백질은 pH 3.0~8.0 및 4~50℃에서 안정성을 가질 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis) RX7 균주 (기탁번호 KFCC11550P)의 배양물로부터 분리된 살균성 단백질을 유효성분으로 포함하는 유해 미생물에 대한 항균용 조성물을 제공한다. 상기 유해 미생물 및 항균용 조성물의 형태는 전술한 바와 같다.
또한, 본 발명은 상기 바실러스 서브틸리스 RX7 균주, 상기 균주의 배양물, 상기 배양물의 농축액 또는 상기 배양물의 건조물을 유효성분으로 함유하는 항균용 조성물 또는 상기 바실러스 서브틸리스 RX7 균주의 배양물로부터 분리된 살균성 단백질을 유효성분으로 함유하는 항균용 조성물을 포함하는 식품, 사료, 화장품 및 의약품으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상에 대한 보존제 조성물을 제공한다.
본 발명에 있어서, 보존제란 식품, 사료, 화장품 및 의약품으로 이루어진 군 중에서 선택된 1 종 이상에 사용될 수 있는 것으로, 그람음성균, 그람양성균 및 진균으로 이루어지는 군에서 선택된 1 종 이상의 유해 미생물의 증식을 억제하거나 살균하여 식품, 사료 의약품을 보존하는 첨가물로서 유해 미생물의 발육을 저지하거나 살균할 수 있는 물질을 의미한다.
또한, 본 발명은 상기 바실러스 서브틸리스 RX7 균주, 상기 균주의 배양물, 상기 배양물의 농축액 및 상기 배양물의 건조물로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상을 유효성분으로 포함하는 프로바이오틱 (probiotics) 조성물을 제공한다.
본 발명의 조성물은 상기 유효성분 외에 통상적인 약학적 담체 및 부형제를 추가로 포함할 수 있으며, 이러한 조성물은 통상적인 프로바이오틱 조성물 제조방법에 따라 열건조 또는 동결건조하여 생균제 형태로 제조하여 이용할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 바실러스 서브틸리스 RX7 균주를 배양하는 단계를 포함하는 유해 미생물에 대한 항균용 미생물 제제를 제조하는 방법을 제공한다.
본 발명의 균주를 배양하는 방법은 당업계에 통상적으로 이용되는 방법에 따라 배양할 수 있다.
본 발명의 유해세균에 대한 항균용 미생물 제제는 유효성분으로서 바실러스 서브틸리스 RX7 균주를 이용하여 제조될 수 있다. 본 발명에 따른 항균용 미생물 제제는 용액, 분말, 현탁액, 분산액, 에멀젼, 유성 분산액, 페이스트, 분진, 분사제 또는 과립제로 제조할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 상기 바실러스 서브틸리스 RX7 균주, 상기 균주의 배양물, 상기 배양물의 농축액 및 상기 배양물의 건조물로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상을 유해 미생물에 처리하여 유해 미생물을 방제하는 방법을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 유해 미생물의 방제는 상기 바실러스 서브틸리스 RX7 균주, 상기 균주의 배양물, 상기 배양물의 농축액 또는 상기 배양물의 건조물의 유효량을 처리하여 이루어질 수 있으며, '유효량'은 유익한 또는 원하는 결과를 일으키기에 충분한 양으로 다양한 인자에 따라 조절될 수 있다. 상기 유해 미생물은 전술한 바와 같다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
재료 및 방법
1. 균주 분리 및 선발
토양에서 시료를 채취한 후에 멸균된 생리식염수 (0.85% NaCl)에 현탁시켰으며, 희석액 1 ㎖를 취해 102, 103, 104, 105 및 106 배율로 단계별로 희석하였다. 각 희석액을 0.2 ㎖씩 취하여 TSA 배지 [트립톤 (tryptone) 17 g/L, 소이톤 (soytone) 3 g/L, 글루코스 (glucose) 2.5 g/L, 염화나트륨 (NaCl) 5 g/L, 인산칼륨 (K2HPO4) 2.5 g/L, 한천 (Agar) 15 g/L]에 접종하여 도말한 후 30℃에 배양하면서 배지 상에 콜로니 (colony)를 형성시켰다. 단일 콜로니를 선발한 후 2~3회 계대 배양하여 콜로니를 순수분리하였다.
분리한 균주의 유해 미생물에 대한 억제능을 확인하기 위해 대치 배양을 수행했다. 유해 미생물은 한국미생물보존센터 (KCCM)에서 살모넬라 엔테리티디스 (KCCM 12021)을 분양받아 사용하였다.
2. 분리 균주의 동정
선별한 균주의 동정을 위해 형태적, 생리적, 생화학적 특성을 조사하였으며, 16S rRNA 유전자 염기서열을 분석함으로써 균주를 최종적으로 동정하였다. 형태학적인 특성은 전자현미경 (Scanning Electron Microscopy)으로 관찰하였으며, Sohn 등 (Sohn et al., 2004. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 54: 675-680)의 방법에 준하였다. 생화학적 특성 조사는 API 50 CHB 키트 (biomerieux Vitek, Inc.)를 이용하여 37℃에서 48시간 배양 후 실시하였다.
3. 배양 시간에 따른 균주의 생장과 항균 물질 생산
선발된 균주의 생장 정도는 분광광도계를 사용하여 600 nm에서 배양액의 흡광도를 측정함으로써 결정하였으며, 균주를 액체 배양하면서 샘플링한 상등액을 사용하여 균주에서 생산된 항균 물질의 활성을 측정하였다.
4. 항균 물질의 특성 분석
바실러스 균주가 생산하는 항균 물질의 구성 성분 및 온도와 pH에 대한 안정성을 조사하기 위한 실험을 수행했다. 항균 물질의 구성 성분을 확인하기 위해서는 배양 상등액에 6종류의 가수분해효소 (α-아밀라아제, α-키모트립신, 리파아제, 프로테이나제-K, 펩신 및 트립신)를 2 mg/ml 수준으로 첨가하여 37℃에서 2시간 동안 반응시켰다. 항균 물질의 pH 안정성은 배양 상등액을 각 pH 별 완충용액에 넣고 반응시킨 후 비교하였다. pH 1.0~4.0은 50 mM 글리신-HCl 완충용액, pH 5.0~6.0은 50 mM 아세트산나트륨 완충용액, pH 7.0~8.0은 50 mM 인산칼륨 완충용액, pH 9.0~10.0은 50 mM Tris-HCl 완충용액을 각각 사용하였다. 항균 물질의 온도 안정성은 4, 37, 50, 80 100 및 121℃에서 30분간 반응시킨 후 분석하였다. 항균 물질의 잔존 활성은 한천 확산법 (Agar Well Diffusion)으로 확인하였다.
5. 항균 물질의 정제 및 확인
바실러스 서브틸리스 RX7 균주의 항균 물질을 정제하기 위해, 24시간 동안 배양한 배양 상등액에 60% 황산 암모늄을 첨가하고 단백질을 침전시켜 조항균 물질을 얻었다. 조항균 물질의 항균 활성을 확인한 후, 10 mM 인산 완충용액 (pH 8.0)에서 투석하였다. 투석한 시료는 음이온 교환 수지인 Q-Sepharose (GE Healthcare, Sweden)를 이용하여 양이온 단백질을 제거한 후, 다양한 농도의 NaCl 용액을 이용해서 이온교환체에 결합한 음이온 단백질들을 용출하였다. 단백질의 이온 결합력에 따라 용출되는 NaCl의 농도가 달라지는데, 한천 확산법으로 염 농도에 따라 용출된 각 시료의 활성을 확인하였다.
황산 암모늄 침전과 음이온 교환 컬럼 정제과정을 거친 항균물질의 크기를 조사하기 위하여, 작은 크기의 단백질을 분리하는데 일반적으로 널리 이용되는 트리신 (Tricine) SDS-PAGE를 수행하였다. 정제 후 전기 영동으로 분리된 항균 물질의 활성은 전기 영동한 겔을 증류수로 세척한 후 지시균을 중층하여 측정하였다.
6. 항균 물질의 아미노-말단 아미노산 서열 분석
트리신 SDS-PAGE를 수행한 후에, 겔 상의 단백질을 PVDF (polyvinylidene difluoride) 멤브레인 (Bio-Rad, USA)에 20 V로 30분 동안 트랜스퍼하였다. 단백질이 흡착된 PVDF 멤브레인을 쿠마시 브릴리언트 블루 (Coomassie brilliant blue R-250, Sigma, USA)로 염색한 후에 메탄올로 탈색하였다. PVDF 멤브레인으로부터 RX7 항균 물질 밴드를 회수한 후, 에드만 분해법 (Edman & Begg. 1967. European J. Biochem. 1:80-91)에 따라 펩티드 시퀀서 (Model 494, Applied Biosystems Inc, USA)를 사용하여 분석함으로써 아미노-말단 아미노산 서열을 결정하였다.
실시예 1. 분리 균주 동정 및 항균 물질의 특성 분석
분리 균주의 형태적, 생리적, 생화학적 및 유전적 특성을 조사한 결과 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis)에 속하는 것으로 나타났고, 본 발명에서는 바실러스 서브틸리스 RX7 균주로 명명하였다.
바실러스 서브틸리스 RX7 균주가 분비하는 항균 물질이 단백질성인지의 여부를 확인하기 위해, 배양 상등액에 가수분해효소를 첨가하여 반응시킨 결과는 표 1에 나타내었다. α-키모트립신, 프로테이나제-K 및 트립신 등의 단백질 가수분해효소에 의해 항균 활성이 모두 소실되는 것으로 보아 바실러스 서브틸리스 RX7 균주가 분비하는 항균물질은 기본적으로 단백질성 물질일 것으로 판단되었다. 그러나 α-아밀라아제와 리파아제에 의해서도 일부 항균 활성이 소실되는 것으로 미루어 보아 항균 활성의 일부는 탄수화물 및 지질 복합체와도 관련이 있을 것으로 예상된다. 따라서, 바실러스 서브틸리스 RX7 균주가 분비하는 항균 물질은 단백질에 탄수화물과 지질이 일부 결합된 단백질 화합물인 것으로 추정된다.
효소 처리에 따른 바실러스 서브틸리스 RX7 균주 유래 항균 물질의 잔존 활성
처리 잔존 활성 (%)
무처리 (대조구) 100
α-아밀라아제 81
α-키모트립신 0
리파아제 91
프로테이나제-K 0
펩신 76
트립신 0
실시예 2. 항균 물질의 안정성 분석
pH가 항균 물질의 활성에 미치는 영향을 알아보기 위해, 배양 상등액을 다양한 pH의 완충용액에서 반응시킨 후 잔존 활성을 측정한 결과, pH 3.0~8.0 범위에서 가장 안정한 것으로 나타났으며, pH 3.0 이하 또는 pH 8.0 이상에서도 어느 정도의 활성이 유지되는 것으로 나타났다 (표 2).
항균 물질의 pH에 대한 영향
pH 잔존 활성 (%)
무처리 (대조구) 100
1 85
2 88
3 100
4 100
5 100
6 100
7 100
8 100
9 85
10 80
항균물질의 온도에 대한 안정성을 조사한 결과, 4~50℃까지는 매우 안정하였으나 80℃ 이상의 고온에서는 항균활성이 점차 소실되는 것으로 나타났다 (표 3).
항균 물질의 온도에 대한 영향
처리 잔존 활성 (%)
무처리 (대조구) 100
4℃/30분 100
37℃/30분 100
50℃/30분 100
80℃/30분 83
100℃/30분 80
121℃/15분 20
실시예 3. 항균 물질의 억제 기전 조사
바실러스 서브틸리스 RX7 균주가 분비하는 항균 물질의 항균 기작이 정균 작용 (bacteriostasis)인지 살균 작용 (bacteriocidal)인지 확인하기 위하여 항균 물질 (80 AU/㎖)을 살모넬라 엔테리티디스 KCCM 12021 (2×108 CFU/㎖)와 함께 배양시킨 결과는 도 1과 같다. 살모넬라 엔테리티디스 KCCM 12021의 생균수가 배양 시작 시점부터 급격히 떨어지는 것으로 보아 바실러스 서브틸리스 RX7 균주가 분비하는 항균 물질의 항균 기작은 살균 작용 (bacteriocidal)인 것으로 확인되며, 병원성 균주 억제에 효과적인 것으로 판단되었다.
실시예 4. 항균 물질의 항균 스펙트럼 조사
바실러스 서브틸리스 RX7 균주의 배양 상등액을 이용하고, 그람양성균 13종, 그람음성균 10종과 1종의 곰팡이를 지시균으로 사용하여 항균 스펙트럼을 조사하였다. 표 4에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 바실러스 서브틸리스 RX7 균주의 배양액은 살모넬라 엔테리티디스 KCCM 12021, 살모넬라 엔테리티디스 KVCC-BA0700654, 살모넬라 갈리나룸 KVCC-BA0700722, 살모넬라 풀로룸 KVCC-BA0702509, 살모넬라 티피무리움 KCCM 40253 등 모든 살모넬라균에 대해 억제능이 있음을 확인하였다. 그람음성균 중 살모넬라 이외에 에스케리키아 콜라이 K88도 억제하며, 리스테리아 모노사이토게네스 ATCC 19114 및 최근 들어 항생제 내성 문제로 이슈가 되고 있는 슈퍼박테리아 중의 하나인 MRSA (스타필로코커스 아우레우스 아종 아우레우스 KCCM 40510)도 억제하는 것으로 나타났다. 또한, 곰팡이 균주인 칸디다 알비칸스 KCTC 7122도 억제하는 것으로 나타나 바실러스 서브틸리스 RX7 균주가 분비하는 항균 물질은 광범위한 항균 스펙트럼을 갖는 것으로 사료되었다.
Figure pat00001
실시예 5. 항균 물질의 정제
바실러스 서브틸리스 RX7 균주 유래 항균 물질은 NaCl 0.5 M 이상에서 이온교환체로부터 용출되기 시작하는 것으로 나타났으며, NaCl 0.8 M에서 효과적으로 용출되는 것으로 나타났다. 황산 암모늄 침전과 음이온 교환 컬럼 정제과정을 거친 항균물질의 크기를 조사하기 위해 트리신 SDS-PAGE를 수행한 결과는 도 4에 나타내었다. 트리신 SDS-PAGE 결과, 항균물질 이외의 단백질들은 대부분 제거된 것을 확인할 수 있었으며, 분자량 표준 시료와 비교했을 때 바실러스 서브틸리스 RX7 균주 유래의 항균 물질은 약 5 kDa의 분자량을 가지는 것으로 추정되었다.
전기 영동한 겔을 증류수로 세척한 후 지시균을 중층하여 항균 물질의 활성을 조사한 결과, 염색된 겔 상의 밴드와 일치하는 곳에 억제환이 생기는 것을 확인할 수 있었다. 박테리오신 분류상 클래스 IIa에 속하는 사카신 P (sakacin P), 류코신 A (leucocin A), 페디오신 AcH (pediocin AcH) 및 엔테로신 A (enterocin A) 등의 박테리오신은 평균 분자량이 3.4~4.9 kDa인 것으로 알려져 있는데 (Ennahar at el ., FEMS Microbiol . Rev . 24:85-106 (2000)), 본 발명에서 확보한 항균 물질도 클래스 IIa에 속하는 박테리오신인 것으로 추정된다.
실시예 6. 항균 물질의 아미노-말단 아미노산 서열 분석
에드만 분해법을 이용하여 RX7 항균 물질의 아미노-말단 아미노산 15개를 순서대로 분석한 결과, C(시스테인)-A(알라닌)-W(트립토판)-Y(타이로신)-D(아스파르트산)-I(이소루신)-S(세린)-R(아르기닌)-K(리신)-L(루신)-G(글리신)-N(아스파라긴)-K(리신)-G(글리신)-A(알라닌) (서열번호 1)의 순으로 구성되어 있었다. 16번째 아미노산부터는 블로킹되어 분석할 수 없었다. Blast (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) 프로그램을 이용하여 상기 15개의 아미노산 서열과 유사한 항균 펩타이드와 비교하였으며, 그 결과는 도 5와 같다. RX7 항균 물질과 가장 유사한 항균 물질은 바실러스 할로두란스 (Bacillus halodurans) C-125에서 분리된 항균 물질로서, 아미노-말단 아미노산 15개 중에서 12개가 서로 일치하였다. 일치하지 않는 나머지 3개의 아미노산 (왼쪽부터 순서대로 D(아스파르트산), R(아르기닌) 및 K(리신)) 때문에, 본 발명에서 분리한 RX7 항균 물질은 신규한 항균 물질인 것을 알 수 있다.
한국미생물보존센터(국내) KFCC11550P 20130228
<110> Industry-Academic Cooperation Foundation, Dankook University UNIBIOTECH CO.,LTD. <120> Bacillus subtilis RX7 strain having antimicrobial activity against harmful microorganism and uses thereof <130> PN14115 <160> 1 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 15 <212> PRT <213> Bacillus subtilis RX7 <400> 1 Cys Ala Trp Tyr Asp Ile Ser Arg Lys Leu Gly Asn Lys Gly Ala 1 5 10 15

Claims (13)

  1. 유해 미생물에 대해 항균 활성을 갖는 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis) RX7 균주 (기탁번호 KFCC11550P).
  2. 제1항의 균주, 상기 균주의 배양물, 상기 배양물의 농축액 및 상기 배양물의 건조물로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상을 유효성분으로 함유하는 유해 미생물에 대한 항균용 조성물.
  3. 제2항에 있어서, 상기 유해 미생물은 바실러스 속 (Bacillus sp.), 엔테로코커스 속 (Enterococcus sp.), 리스테리아 속 (Listeria sp.), 스트렙토코커스 속 (Streptococcus sp.), 스타필로코커스 속 (Staphylococcus sp.), 에스케리키아 속 (Escherichia sp.), 클렙시엘라 속 (Klebsiella sp.), 슈도모나스 속 (Pseudomonas sp.), 쉬겔라 속 (Shigella sp.), 살모넬라 속 (Salmonella sp.) 또는 칸디다 속 (Candida sp.)인 것을 특징으로 하는 항균용 조성물.
  4. 제3항에 있어서, 상기 유해 미생물은 바실러스 세레우스 (Bacillus cereus), 바실러스 리케니포르미스 (Bacillus licheniformis), 엔테로코커스 패칼리스 (Enterococcus faecalis), 리스테리아 모노사이토게네스 (Listeria monocytogenes), 스트렙토코커스 아갈락티애 (Streptococcus agalactiae), 스트렙토코커스 뮤탄스 (Streptococcus mutans), 스타필로코커스 아우레우스 (Staphylococcus aureus), 에스케리키아 콜라이 (Escherichia coli), 클렙시엘라 뉴모니애 (Klebsiella pneumoniae), 슈도모나스 애루지노사 (Pseudomonas aeruginosa), 쉬겔라 플렉스네리 (Shigella flexneri), 살모넬라 엔테리티디스 (Salmonella enteritidis), 살모넬라 갈리나룸 (Salmonella gallinarum), 살모넬라 풀로룸 (Salmonella pullorum), 살모넬라 티피무리움 (Salmonella typhimurium) 또는 칸디다 알비칸스 (Candida albicans)인 것을 특징으로 하는 항균용 조성물.
  5. 제2항에 있어서, 상기 조성물은 식품, 식품 첨가제, 사료 첨가제 또는 의약품 형태인 것을 특징으로 하는 항균용 조성물.
  6. 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis) RX7 균주 (기탁번호 KFCC11550P)의 배양물으로부터 분리된 살균성 단백질.
  7. 제6항에 있어서, 상기 살균성 단백질은 이의 아미노 말단이 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 박테리오신인 것을 특징으로 하는 살균성 단백질.
  8. 제6항에 있어서, 상기 단백질은 pH 3.0~8.0 및 4~50℃에서 안정성을 갖는 것을 특징으로 하는 살균성 단백질.
  9. 제6항의 살균성 단백질을 유효성분으로 포함하는 유해 미생물에 대한 항균용 조성물.
  10. 제2항의 항균용 조성물 또는 제9항의 항균용 조성물을 포함하는 식품, 사료, 화장품 및 의약품으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상에 대한 보존제 조성물.
  11. 제1항의 균주, 상기 균주의 배양물, 상기 배양물의 농축액 및 상기 배양물의 건조물로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상을 유효성분으로 포함하는 프로바이오틱 (probiotics) 조성물.
  12. 제1항의 균주를 배양하는 단계를 포함하는 유해 미생물에 대한 항균용 미생물 제제를 제조하는 방법.
  13. 제1항의 균주, 상기 균주의 배양물, 상기 배양물의 농축액 및 상기 배양물의 건조물로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상을 유해 미생물에 처리하여 유해 미생물을 방제하는 방법.
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