CN111534473A - 一株枯草芽孢杆菌、菌肥及其制备方法和应用 - Google Patents

一株枯草芽孢杆菌、菌肥及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于微生物肥料技术领域，具体涉及一株枯草芽孢杆菌、菌肥及其制备方法和应用。本发明提供了一株枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)Y2，保藏号为CGMCC NO.18752，该枯草芽孢杆菌Y2对生菜中的大肠菌群和细菌菌落总数有抑制作用。本发明提供的含有枯草芽孢杆菌的菌肥，不仅能够使生菜的增产和减病，还能够降低生菜携带的大肠菌群含量与细菌菌落总数。

Description

一株枯草芽孢杆菌、菌肥及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于微生物肥料技术领域，具体涉及一株枯草芽孢杆菌、菌肥及其制备方法和应用。
背景技术
生菜又名叶用莴苣(Lactuca sativa)，原产于欧洲，最早自东南沿海地区传入我国。随着消费者对鲜食生菜需求量增多，生菜的种植量增大，2015年叶类蔬菜总产量占蔬菜总产量的39.5％。为了增加生菜产量，过度使用化肥，造成土壤氮源过剩、肥力下降以及菌群失衡的后果。同时在农户生产过程中大肠菌群与有害微生物可以通过灌溉水(肥)、动物粪便或者人为污染附着在生菜表面，在加工过程中利用流失的生菜汁液进行繁殖，加工伤口侵入生菜内部，导致生菜污染，甚至会使整条加工线内生菜全部污染。大肠菌群与细菌菌落总数为食品卫生中评价食品卫生质量过程中的重要指标之一，其数量超标可引发食用者出现肠道外感染等疾病。
传统菌肥，例如CN201710124044.9公开了一种生菜专用微生物富硒菌肥及其制备方法，其提供的菌肥能够增加生菜的硒含量，抑制真菌性病害，并提高生菜的产量，但并不能降低生菜携带的大肠菌群含量与细菌菌落总数。
发明内容
本发明的目的在于提供一株能够抑制大肠菌群与细菌菌落总数的枯草芽孢杆菌，本发明提供的含有枯草芽孢杆菌的菌肥，不仅能够使生菜的增产和减病，还能够降低生菜携带的大肠菌群含量与细菌菌落总数。
为了实现上述目的，本发明提供了以下技术方案；
本发明提供了一株枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)Y2，保藏号为CGMCCNO.18752。
本发明提供了一种菌肥，包括解淀粉芽孢杆菌Y1和上述技术方案所述枯草芽孢杆菌Y2；
所述解淀粉芽孢杆菌Y1的保藏号为CGMCC NO.11583。
优选的，所述菌肥的活菌数为大于1×108CFU/mL；
所述枯草芽孢杆菌Y2和解淀粉芽孢杆菌Y1的体积比为0.75～1:0.75～1；所述枯草芽孢杆菌Y2的活菌数浓度为108～109CFU/mL；所述解淀粉芽孢杆菌Y1的活菌数浓度为108～109CFU/mL。
本发明提供了上述技术方案所述菌肥的制备方法，包括以下步骤：
(1)将解淀粉芽孢杆菌Y1接种于液态培养基中培养，得到解淀粉芽孢杆菌Y1液态发酵液；
(2)将枯草芽孢杆菌Y2接种于液态培养基中培养，得到枯草芽孢杆菌Y2液态发酵液；
(3)将解淀粉芽孢杆菌Y1液态发酵液和枯草芽孢杆菌Y2液态发酵液混合得到菌肥；
所述步骤(1)和(2)没有时间先后顺序。
优选的，步骤(1)所述液态培养基以水为溶剂，包括以下浓度的组分：8～12g/L淀粉、2～6g/L氯化钙、2～6g/L酵母浸出物、2～6g/L胰蛋白胨、1.5～3.5g/L尿素，pH＝6.5～7.5；
步骤(2)所述液态培养基以水为溶剂，包括以下浓度的组分：8～12g/L淀粉、2～6g/L氯化钙、2～6g/L酵母浸出物、2～6g/L胰蛋白胨、1.5～3.5g/L氯化铵，pH＝6.5～7.5。
优选的，步骤(1)和(2)中所述培养的温度独立地为37～40℃，时间独立地为52～56h，转速独立地为150～180r/min。
本发明还提供了上述技术方案所述的枯草芽孢杆菌、上述技术方案所述菌肥或上述技术方案所述制备方法制备的菌肥在抑制大肠菌群、生菜增产或减病中的应用。
优选的，所述菌肥的施用方式为滴灌。
优选的，所述菌肥的施用时间为定植后每15～18d使用一次，直至收获日。
优选的，所述一次的菌肥用量为1800～2200mL/667m2。
本发明提供了一株枯草芽孢杆菌，本发明提供的枯草芽孢杆菌Y2能够产生抑菌物质，对大肠菌群生长与菌落总数有抑制作用。
本发明提供的枯草芽孢杆菌Y2产生的细菌素具有广谱抑菌性的物质；解淀粉芽孢杆Y1的细菌素也具有广谱抑菌性的物质；由枯草芽孢杆菌Y2和解淀粉芽孢杆菌Y1制备的菌肥不仅对病原真菌有抑制作用，降低生菜病害，可以提高生菜产量，同时生菜中降低细菌菌落总数、抑制生菜大肠菌群生长。因此，本发明提供的菌肥能够有效改善设施生菜种植过程中由于化肥、农肥投入量多带来的负面影响，提高生菜品质的同时提高生菜微生物安全性，降低食源性疾病的风险。
生物保藏说明
枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)Y2菌株，保藏地点为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏时间为2019年10月28日，保藏编号为CGMCC NO.18752。
解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)Y1菌株，保藏地点为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏时间为2015年11月05日，保藏编号为CGMCCNO.11583。
具体实施方式
本发明提供了一株枯草芽孢杆菌，所述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)为枯草芽孢杆菌Y2，保藏号为CGMCC NO.18752。
枯草芽孢杆菌Y2产生的细菌素对大肠菌群生长有抑制作用，能够降低生菜细菌菌落总数。
本发明提供了一种菌肥，包括上述技术方案所述枯草芽孢杆菌Y2和解淀粉芽孢杆菌Y1；
所述解淀粉芽孢杆菌Y1的保藏号为CGMCC NO.11583。
在本发明中，所述菌肥的活菌数优选为大于1×108CFU/mL；所述枯草芽孢杆菌Y2和解淀粉芽孢杆菌Y1的体积比优选为0.75～1:0.75～1，更优选为1:1。所述枯草芽孢杆菌Y2的活菌数浓度为108～109CFU/mL；所述解淀粉芽孢杆菌Y1的活菌数浓度为108～109CFU/mL。
本发明提供了上述技术方案所述菌肥的制备方法，包括以下步骤：
(1)将解淀粉芽孢杆菌Y1接种于液态培养基中培养，得到解淀粉芽孢杆菌Y1液态发酵液；
(2)将枯草芽孢杆菌Y2接种于液态培养基中培养，得到枯草芽孢杆菌Y2液态发酵液；
(3)将解淀粉芽孢杆菌Y1液态发酵液和枯草芽孢杆菌Y2液态发酵液混合得到菌肥；
所述步骤(1)和(2)没有先后顺序。
本发明将解淀粉芽孢杆菌Y1接种于液态培养基中培养，得到解淀粉芽孢杆菌Y1液态发酵液。在本发明中，所述培养的温度优选为37～40℃，更优选为38～39℃；时间优选为52～56h，更优选为53～55h；转速优选为150～180r/min，更优选为160～170r/min。在本发明中，所述培养优选包括将解淀粉芽孢杆菌Y1接种于液态培养基中进行第一次液态培养，得到种子液；将所述种子液接种于液态培养基中进行第二次液态培养。第一次液态培养能够获得对数生长期的菌，进而利于第二次发酵扩繁。在本发明中，所述第一次液态培养的时间优选为12h；本发明对第一次液态培养的接种量没有特殊限定，优选为一环。在本发明中，所述第二次液态培养的时间优选为40～44h，更优选为41～43h；所述种子液与液态培养基的体积比为2～5:100，更优选为3～4:100。所述第二次液态培养优选在锥形瓶中进行，所述液态培养基的体积优选为锥形瓶容量的20～35％，更优选为22～33％。
所述第一次液态培养前优选还包括将解淀粉芽孢杆菌Y1接种于营养琼脂平板培养，取单菌落接种于液态培养基进行第一次液态培养；所述营养琼脂平板优选包括牛肉膏3g/L、蛋白胨5g/L和琼脂15g/L；所述营养琼脂平板培养的温度优选为37～40℃，更优选为38～39℃；营养琼脂平板培养的时间优选为10～14h，更优选为11～13h；所述接种优选为接种环划线接种，营养琼脂平板培养解淀粉芽孢杆菌Y1能够活化解淀粉芽孢杆菌Y1。
所述液态培养基优选以水为溶剂，优选包括以下浓度的组分：8～12g/L淀粉、2～6g/L氯化钙、2～6g/L酵母浸出物、2～6g/L胰蛋白胨、1.5～3.5g/L尿素，pH＝6.5～7.5；更优选包括以下浓度的组分：9～11g/L淀粉、3～5g/L氯化钙、3～5g/L酵母浸出物、3～5g/L胰蛋白胨、2～3g/L尿素，pH＝6.6～7.4。
本发明将枯草芽孢杆菌Y2接种于液态培养基中培养，得到枯草芽孢杆菌Y2液态发酵液。在本发明中，所述培养的温度优选为37～40℃，更优选为38～39℃；时间优选为52～56h，更优选为53～55h；转速优选为150～180r/min，更优选为160～170r/min。在本发明中，所述培养优选包括将枯草芽孢杆菌Y2接种于液态培养基中进行第一次液态培养，得到种子液；将所述种子液接种于液态培养基中进行第二次液态培养。第一次液态培养能够获得对数生长期的菌，利于第二次液态培养产细菌素的枯草芽孢杆菌Y2。在本发明中，所述第一次液态培养的时间优选为12h。在本发明中，所述第二次液态培养的时间优选为40～44h，更优选为41～43h；所述种子液与液态培养基的体积比为2～5:100，更优选为3～4:100。所述第二次液态培养优选在锥形瓶中进行，所述液态培养基的体积优选为锥形瓶容量的20～35％，更优选为22～33％。
所述第一次液态培养前优选还包括将枯草芽孢杆菌Y2接种于营养琼脂平板培养，取单菌落接种于液态培养基；将枯草芽孢杆菌Y2接种于营养琼脂平板培养能够活化菌株，所述营养琼脂平板培养的温度优选为37～40℃，更优选为38～39℃；营养琼脂平板培养的时间优选为10～14h，更优选为11～13h；所述接种优选为接种环划线接种。
枯草芽孢杆菌Y2培养用的液态培养基优选以水为溶剂，包括以下浓度的组分：8～12g/L淀粉、2～6g/L氯化钙、2～6g/L酵母浸出物、2～6g/L胰蛋白胨、1.5～3.5g/L氯化铵，pH＝6.5～7.5；更优选包括以下浓度的组分：9～11g/L淀粉、3～5g/L氯化钙、3～5g/L酵母浸出物、3～5g/L胰蛋白胨、2～3g/L氯化铵，pH＝6.6～7.4。
得到解淀粉芽孢杆菌Y1液态发酵液和枯草芽孢杆菌Y2液态发酵液后，本发明将解淀粉芽孢杆菌Y1液态发酵液和枯草芽孢杆菌Y2液态发酵液混合，得到菌肥。本发明对于混合的方法没有特殊限定，采用本领域技术人员常规混合方法即可。
本发明还提供了上述技术方案所述的枯草芽孢杆菌、上述技术方案所述菌肥或上述技术方案所述制备方法制备的菌肥在降低生菜大肠菌群含量或生菜增产、减病中的应用。在本发明中，所述菌肥的施用方式优选为滴灌。所述菌肥的施用时间优选为定植后每15～18d使用一次，直至收获日，更优选为定植后每16～17d使用一次，直至收获日。所述一次的菌肥用量优选为1800～2200mL/667m2，更优选为1900～2100mL/667m2。多次施肥有助于持续改善土壤微生物环境。
本发明提供的枯草芽孢杆菌Y2能够产生含有聚酮化合物等具有广谱抑菌性的物质的细菌素；解淀粉芽孢杆Y1能够产生含有抗菌蛋白、脂肽类等具有广谱抑菌性物质的细菌素；由枯草芽孢杆菌Y2和解淀粉芽孢杆菌Y1制备的菌肥不仅对病原真菌有抑制作用，降低生菜病害，可以提高生菜产量，同时降低生菜大肠菌群含量；有效改善设施生菜种植过程中由于化肥、农肥投入量多带来的负面影响，提高生菜品质的同时提高生菜微生物安全性。
下面结合实施例对本发明提供的一株枯草芽孢杆菌、菌肥及其制备方法和应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
(1)将解淀粉芽孢杆菌Y1以接种环划线至营养琼脂平板培养12h后，取单菌落接入10mL(锥形瓶装液量20％)的液态培养基中，在温度为40℃、150r/min的条件下培养12h，得到种子液；将3.5mL种子液与175mL液态培养基按体积比为2:100的比例混合，在温度为40℃、150r/min的条件下培养40h，得到的解淀粉芽孢杆菌Y1液态发酵液；液态培养基为10g/L淀粉、4g/L氯化钙、4g/L酵母浸出物、4g/L胰蛋白胨、2g/L尿素，pH＝7；
(2)枯草芽孢杆菌Y2的培养方法和条件与步骤(1)中解淀粉芽孢杆菌Y1的培养方法和条件相同，区别之处在于液态培养基为10g/L淀粉、4g/L氯化钙、4g/L酵母浸出物、4g/L胰蛋白胨、2g/L氯化铵，pH＝7；
(3)将得到的解淀粉芽孢杆菌Y1液态发酵液和枯草芽孢杆菌Y2液态发酵液按体积比1:1的比例混合，得到活菌数为1.2×109CFU/mL的菌肥。
应用例1
试验设计：生菜种植的地点位于北京市昌平区农作物品种试验展示基地，设施长50m，宽8m，设施土壤类型为沙壤土。设施中每畦长6.5m，宽1.2m，生菜种植的密度为80株/畦，株距0.3m×0.3m，设置空白对照组(CK)、实施例1的菌肥组(T)，生菜品种使用北生4号，2020年1月21日播种，3月27日定植，收获日期为5月12日。
生菜混合菌肥使用采用滴灌处理，定植后每18d，在对生菜浇水的过程中向菌肥处理畦的水管中加入菌肥，直到收获日，施加菌肥体积与生菜种植面积比值为250mL:39m2。
设施内栽培的生菜进行病害的持续调查记录：于生菜收获时间调查，对患有链格孢属真菌引起叶斑类病害植株记录，3次重复，计算平均生菜病斑率。计算公式：
生菜病斑率(％)＝(病斑率植株总数/80)×100
生菜大肠菌群、细菌菌落总数的调查方法：于生菜收获时将生菜带采用GB 4789.3进行检测大肠菌群、利用GB4789.2检测细菌菌落总数。
不同处理生菜的产量和病斑率的试验结果见表1，可以看出实施例1菌肥可以提高生菜产量、降低生菜病害。
表1应用例1得到的不同处理的生菜产量与病斑率
Figure BDA0002543456760000071
注：表中同一列不同字母表示差异显著(P＜0.05)。
不同处理生菜的大肠菌群含量的试验结果见表2，可以看出本发明实施例1的菌肥可以有效降低生菜携带大肠菌群的含量。
表2应用例1得到的生菜大肠菌群含量
Figure BDA0002543456760000072
不同处理生菜的菌落总数的试验结果见表3，可以看出本发明实施例1的菌肥可以有效降低生菜的细菌菌落总数。
表3应用例1得到的生菜细菌菌落总数
Figure BDA0002543456760000081
实施例2
(1)将解淀粉芽孢杆菌Y1以接种环划线至营养琼脂平板培养12h后，取单菌落接入10mL(锥形瓶装液量20％)的液态培养基中，在温度为40℃、150r/min的条件下培养10h，得到种子液；将3.5mL种子液与175mL液态培养基按体积比为2:100的比例混合，在温度为40℃、150r/min的条件下培养40h，得到的解淀粉芽孢杆菌Y1液态发酵液；液态培养基为8g/L淀粉、2g/L氯化钙、2g/L酵母浸出物、2g/L胰蛋白胨、1.5g/L尿素，pH＝6.5；
(2)枯草芽孢杆菌Y2的培养方法和条件与步骤(1)中解淀粉芽孢杆菌Y1的培养方法和条件相同，区别之处在于液态培养基为8g/L淀粉、2g/L氯化钙、2g/L酵母浸出物、2g/L胰蛋白胨、1.5g/L氯化铵，pH＝6.5；
(3)将解淀粉芽孢杆菌Y1液态发酵液和枯草芽孢杆菌Y2液态发酵液按体积比1:1的比例混合，得到活菌数1.3×109CFU/mL的菌肥。
应用例2
生菜种植的地点位于北京市昌平区农作物品种试验展示基地，设施长50m，宽8m，设施土壤类型为沙壤土。设施中每畦长6.5m，宽1.2m，生菜种植的密度为80株/畦，株距0.3m×0.3m，设置空白对照组(CK)、实施例2菌肥处理组(T2)，2020年1月21日播种，3月27日定植，收获日期为5月12日。
设施种植生菜品种选择北生4号、北生2号、射手101。
设施内栽培的生菜进行病害调查记录：于2020年5月12日时间调查，对患有链格孢属真菌引起叶斑类病害植株记录，3次重复，计算平均生菜病斑率。计算公式：
生菜病斑率(％)＝(病斑率植株总数/80)×100
生菜使用实施例2菌肥采用滴灌处理，定植后每15d，在对生菜浇水的过程中向菌肥处理畦的水管中加入菌肥，直至收获日，施加菌肥体积与生菜种植面积比值为2100mL:667m2。
生菜收获后对生菜进行大肠菌群含量、细菌菌落总数检测。
不同品种的生菜产量与总体病斑率试验结果见表4，不同品种生菜大肠菌群含量结果见表5，细菌菌落总数结果见表6。通过上述试验，可以看出实施例2菌肥(T2)可以提高北生4号、北生2号、射手101的生菜产量、降低生菜总体病斑率，并且可以降低生菜大肠菌群含量，降低生菜细菌菌落总数，能够有效的提高生菜品质与微生物安全。
表4应用例2得到的不同品种生菜的产量与总体病斑率
Figure BDA0002543456760000091
注：表中同一列不同字母表示差异显著(P＜0.05)。
表5应用例2得到的不同生菜品种大肠菌群含量
Figure BDA0002543456760000092
表6应用例2得到的不同生菜品种细菌菌落总数
Figure BDA0002543456760000093
实施例3
(1)将解淀粉芽孢杆菌Y1以接种环划线至营养琼脂平板培养12h后，取单菌落接入10mL(锥形瓶装液量20％)的液态培养基中，在温度为40℃、150r/min的条件下培养12h，得到种子液；将3.5mL种子液与175mL液态培养基按体积比为2:100的比例混合，在温度为40℃、150r/min的条件下培养40h，得到的解淀粉芽孢杆菌Y1液态发酵液；液态培养基为12g/L淀粉、6g/L氯化钙、6g/L酵母浸出物、6g/L胰蛋白胨、3.5g/L尿素，pH＝7.5；
(2)枯草芽孢杆菌Y2的培养方法和条件与步骤(1)中解淀粉芽孢杆菌Y1的培养方法和条件相同，区别之处在于液态培养基为12g/L淀粉、6g/L氯化钙、6g/L酵母浸出物、6g/L胰蛋白胨、3.5g/L氯化铵，pH＝7.5；
(3)将解淀粉芽孢杆菌Y1液态发酵液和枯草芽孢杆菌Y2液态发酵液按体积比0.75:1的比例混合，得到活菌数1.3×109CFU/mL的菌肥。
应用例3
生菜种植的地点位于北京市昌平区农作物品种试验展示基地，设施长50m，宽8m，设施土壤类型为沙壤土。设施中每畦长6.5m，宽1.2m，生菜种植的密度为80株/畦，株距0.3m×0.3m，设置空白对照组(CK)、实施例3菌肥处理组(T2)、解淀粉芽孢杆菌Y1液态发酵液处理组(Y1)、枯草芽孢杆菌Y2液态发酵液处理组(Y2)，生菜品种使用北生1号，2019年8月5日播种，9月1日定植，收获日期为11月22日。菌肥的使用方法和用量同应用例1。
试验结果：不同菌剂处理下生菜产量和病斑率试验结果如表7所示，不同菌剂处理下生菜大肠菌群含量与菌落总数如表8所示，实施例3菌剂相比与解淀粉芽孢杆菌Y1或枯草芽孢杆菌Y2单独施用具有更强的增产、减病效果，同时对生菜携带大肠菌群含量抑制更为明显，对菌落总数的减少也更明显。
表7应用例3得到的不同菌剂处理下生菜产量和病斑率
Figure BDA0002543456760000101
Figure BDA0002543456760000111
注：表中同一列不同字母表示差异显著(P＜0.05)。
表8应用例3得到的不同菌剂处理下生菜大肠菌群含量与细菌菌落总数
Figure BDA0002543456760000112
实施例4
(1)将解淀粉芽孢杆菌Y1以接种环划线至营养琼脂平板培养12h后，取单菌落接入10mL(锥形瓶装液量20％)的液态培养基中，在温度为37℃、180r/min的条件下培养14h，得到种子液；将8.75mL种子液与175mL液态培养基按体积比为5:100的比例混合，在温度为37℃、180r/min的条件下培养44h，得到的解淀粉芽孢杆菌Y1液态发酵液；液态培养基为11g/L淀粉、5g/L氯化钙、5g/L酵母浸出物、5g/L胰蛋白胨、2.5g/L尿素，pH＝7；
(2)枯草芽孢杆菌Y2的培养方法和条件与步骤(1)中解淀粉芽孢杆菌Y1的培养方法和条件相同，区别之处在于液态培养基为11g/L淀粉、5g/L氯化钙、5g/L酵母浸出物、5g/L胰蛋白胨、2.5g/L氯化铵，pH＝7；
(3)将解淀粉芽孢杆菌Y1液态发酵液和枯草芽孢杆菌Y2液态发酵液按体积比1:1的比例混合，得到活菌数1.4×109CFU/mL的菌肥。
对比例1
制备方法与实施例4相同，区别之处在于液态培养基为混合菌肥营养肉汤培养基。
应用例4
生菜种植的地点位于北京市昌平区农作物品种试验展示基地，设施长50m，宽8m，设施土壤类型为沙壤土。设施中每畦长6.5m，宽1.2m，生菜种植的密度为80株/畦，株距0.3m×0.3m，设置空白对照组(CK)、混合菌肥营养肉汤处理组(对比例1)、实施例4菌肥处理组，生菜品种使用北生1号，2019年8月5日播种，9月1日定植，收获日期为11月22日。菌肥的使用方法和用量同应用例1。
试验结果：不同菌剂处理下生菜产量与病斑率试验结果如表9所示，不同菌剂处理下生菜大肠菌群含量与菌落总数试验结果如表10所示，实施例4与对比例1制备的菌肥对设施生菜均有增产减病的效果，同时也能够降低生菜携带大肠菌群的含量，但是对比例1的增产减病和降低生菜携带大肠菌群的含量的效果不如实施例4。本发明的液态培养基能够促进本发明制备的菌肥的增产减病和降低生菜携带大肠菌群与细菌菌落总数的效果。
表9实施例4和对比例1的菌剂处理下生菜产量与病斑率
Figure BDA0002543456760000121
注：表中同一列不同字母表示差异显著(P＜0.05)。
表10实施例4和对比例1的菌剂处理下生菜大肠菌群含量与细菌菌落总数
Figure BDA0002543456760000122
实施例5
(1)将解淀粉芽孢杆菌Y1以接种环划线至营养琼脂平板培养12h后，取单菌落接入10mL(锥形瓶装液量20％)的液态培养基中，在温度为40℃、180r/min的条件下培养10h，得到种子液；将3.5mL种子液与175mL液态培养基按体积比为2:100的比例混合，在温度为40℃、150r/min的条件下培养40h，得到的解淀粉芽孢杆菌Y1液态发酵液；液态培养基为9g/L淀粉、3g/L氯化钙、3g/L酵母浸出物、3g/L胰蛋白胨、2.0g/L尿素，pH＝6.5；
(2)枯草芽孢杆菌Y2的培养方法和条件与步骤(1)中解淀粉芽孢杆菌Y1的培养方法和条件相同，区别之处在于液态培养基为9g/L淀粉、2g/L氯化钙、3g/L酵母浸出物3g/L胰蛋白胨、2.0g/L氯化铵，pH＝6.5；
(3)将解淀粉芽孢杆菌Y1液态发酵液和枯草芽孢杆菌Y2液态发酵液按体积比1:0.75的比例混合，得到活菌数1.1×109CFU/mL的菌肥。
实施例6
制备方法与实施例5相同，区别之处在于步骤(3)将解淀粉芽孢杆菌Y1液态发酵液和枯草芽孢杆菌Y2液态发酵液按体积比0.75:1的比例混合。
实施例7
制备方法与实施例5相同，区别之处在于步骤(3)将解淀粉芽孢杆菌Y1液态发酵液和枯草芽孢杆菌Y2液态发酵液按体积比1:1的比例混合。
应用例5
生菜种植的地点位于北京市昌平区农作物品种试验展示基地，设施长50m，宽8m，设施土壤类型为沙壤土。设施中每畦长6.5m，宽1.2m，生菜种植的密度为80株/畦，株距0.3m×0.3m，设置空白对照组(CK)、实施例5菌肥组、实施例6菌肥组、实施例7菌肥组，生菜品种使用北生1号，2019年8月5日播种，9月1日定植，收获日期为11月22日。菌肥的使用方法和用量同应用例1。
试验结果：试验结果如表11、12所示，在Y1、Y2不同比例的混合条件下(0.75:1,1:1,1:0.75)均可以对设施生菜具有增产、减病的效果，同时可以降低生菜携带大肠菌群的含量与细菌菌落总数。
表11实施例5～7菌肥处理下生菜产量和病斑率
Figure BDA0002543456760000131
注：表中同一列不同字母表示差异显著(P＜0.05)。
表12实施例5～7菌肥处理下生菜大肠菌群含量与细菌菌落总数
Figure BDA0002543456760000141
本发明提供了一株能够抑制大肠菌群的枯草芽孢杆菌，本发明提供的含有枯草芽孢杆菌的菌肥，不仅能够使生菜的增产和减病，还能够抑制生菜病原真菌以及生菜携带的大肠菌群含量。
尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。

Claims (10)

1.一株枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)Y2，保藏号为CGMCC NO.18752。
2.一种菌肥，其特征在于，包括解淀粉芽孢杆菌Y1和权利要求1所述枯草芽孢杆菌Y2；
所述解淀粉芽孢杆菌Y1的保藏号为CGMCC NO.11583。
3.根据权利要求2所述的菌肥，其特征在于，所述菌肥的活菌数为大于1×108CFU/mL；
所述枯草芽孢杆菌Y2和解淀粉芽孢杆菌Y1的体积比为0.75～1:0.75～1，所述枯草芽孢杆菌Y2的活菌数浓度为108～109CFU/mL；所述解淀粉芽孢杆菌Y1的活菌数浓度为108～109CFU/mL。
4.权利要求2或3所述菌肥的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将解淀粉芽孢杆菌Y1接种于液态培养基中培养，得到解淀粉芽孢杆菌Y1液态发酵液；
(2)将枯草芽孢杆菌Y2接种于液态培养基中培养，得到枯草芽孢杆菌Y2液态发酵液；
(3)将解淀粉芽孢杆菌Y1液态发酵液和枯草芽孢杆菌Y2液态发酵液混合得到菌肥；
所述步骤(1)和(2)没有时间先后顺序。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述液态培养基以水为溶剂，包括以下浓度的组分：8～12g/L淀粉、2～6g/L氯化钙、2～6g/L酵母浸出物、2～6g/L胰蛋白胨、1.5～3.5g/L尿素，pH＝6.5～7.5；
步骤(2)所述液态培养基以水为溶剂，包括以下浓度的组分：8～12g/L淀粉、2～6g/L氯化钙、2～6g/L酵母浸出物、2～6g/L胰蛋白胨、1.5～3.5g/L氯化铵，pH＝6.5～7.5。
6.根据权利要求4或5所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)和(2)中所述培养的温度独立地为37～40℃，时间独立地为52～56h，转速独立地为150～180r/min。
7.权利要求1所述的枯草芽孢杆菌、权利要求2～3任意一项所述菌肥或权利要求4～6任意一项所述制备方法制备的菌肥在抑制大肠菌群、减少细菌菌落总数、生菜增产或减病中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述菌肥的施用方式为滴灌。
9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述菌肥的施用频次为定植后每15～18d使用一次，直至收获日。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述一次的菌肥用量为1800～2200mL/667m2。
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