CN114711347B - 提高海水养殖鱼类抗病能力的组合制剂、其制备方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种提高海水养殖鱼类抗病能力的组合制剂、其制备方法及应用。为了应对针对鱼类易于患病而导致产量损失或提早捕捞导致产量规格不达标的缺陷，本发明提供了鱼用的配方组合及其制备方法，以β‑葡聚糖、甘露寡糖、黄芪多糖、poly(I:C)进行复配和配方优化，并以鱼油和卵磷脂等辅料进行乳化制备。所述组合制剂能够非常显著地提高鱼类如大菱鲆对感染后细菌的清除能力，缓解细菌感染导致的粘膜组织如肠道和鳃的病理损伤，增强大菱鲆的抗病能力。令人意外地，所述组合物也能极显著地减少脾脏和肾脏中细菌定植。与抗生素类药物相比，所述组合制剂环境友好、成本低廉且效果理想，为提高海水鱼类的养殖水平、提高存活率提供了新方案。
Description
技术领域
本发明属于水产养殖饲料添加剂技术领域，更具体地，本发明涉及一种提高鱼类如大菱鲆抗病能力的组合制剂、其制备方法及其应用。
背景技术
水产养殖业作为一种传统产业，在近代得到了快速发展，在人们的饮食以及工业上占据重要地位。由于水土资源的有限性，从提高养殖面积来增加产量难以持续发展，集约化、规模化、高密度养殖模式逐渐成为鱼类养殖业的发展主流。然而，随着渔业养殖的不断稳步发展，各种病害问题日益突出，影响养殖产量造成严重经济损失。病害问题已成为制约海水养殖业健康发展的重要因素。
由于病害严重，突发性强，鱼类养殖人员普遍倾向于采取提早收获的手段来规避病害风险，然而这种做法造成产品规格偏小的问题。
在以往的水产养殖过程中，饲料中常常添加抗生素类药物来促进动物生长、治疗和预防肠道疾病等。但是抗生素的滥用导致细菌耐药性增加和环境污染，水产品的药物残留等负面影响日趋严重。抗生素的残留也对人类的健康造成严重威胁，一些国家目前已全面禁止抗生素类药物在养殖饲料中的添加。目前，推广建立无公害养殖技术规范已被推出，其中一个主要技术指标就是禁止使用抗生素药物，以确保养殖水产品的食品质量安全。
大菱鲆是重要的经济鱼种之一，然而在养殖过程中，水产饲料中的植物蛋白源和细菌侵染容易造成养殖鱼类的肠炎的发生。肠道是营养物质消化和吸收的主要场所，饲喂过程中肠道炎症会引起鱼摄食和游动能力降低，身体机能下降。当病原体入侵鱼体时，肠道作为重要器官，可以作为物理屏障阻挡病原的入侵造成系统性感染；另外，肠道中的一些有益细胞、化学杀菌物质和共生菌群也可以杀灭病原菌。但是，当肠道炎症反应过于强烈时，也会引发肠道组织损伤和脱落、肠道微绒毛缩短和肠道渗透性升高等情况，甚至导致鱼类的死亡。
综上的本领域现状，开发有利于保护鱼类的抗生素替代产品是非常有价值的。
发明内容
本发明的目的在于提供一种提高鱼抗病能力的组合制剂。
本发明的目的还在于提供所述组合制剂的制备方法。
本发明的目的还在于提供所述组合制剂的应用。
在本发明的第一方面，提供一种组合物在制备提高海水养殖鱼类抗病能力的制剂中的应用，其中所述的组合物包括以下组分：β-葡聚糖、甘露寡糖、黄芪多糖、poly(I:C)、卵磷脂、鱼油；按照重量百分比，所述组合物包括：
在一种或多种实施方式中，所述组合物中，除了所述β-葡聚糖、甘露寡糖、黄芪多糖、poly(I:C)、卵磷脂、鱼油，余量为水。也即，β-葡聚糖、甘露寡糖、黄芪多糖、poly(I:C)、卵磷脂、鱼油被溶解于水中，或与水相互混合。
在一种或多种实施方式中，所述的组合物被添加到鱼饲料中，按照所述组合物占饲料重量的5±2％(w/v)，较佳地5±1％(w/v)的量添加。
在一种或多种实施方式中，所述的提高海水养殖鱼类的抗病能力为促进鱼的肠道健康(减少肠道损伤、促进组织完整性)。
在一种或多种实施方式中，所述的提高海水养殖鱼类的抗病能力为缓解鱼的鳃或肠道的炎症(减少炎性细胞浸润)。
在一种或多种实施方式中，所述的提高海水养殖鱼类的抗病能力为：减少脾脏中细菌定植。
在一种或多种实施方式中，所述的提高海水养殖鱼类的抗病能力为：减少肾脏中细菌定植。
在一种或多种实施方式中，所述的提高海水养殖鱼类的抗病能力为：减少肠中杀鱼爱德华氏菌的定植。
在一种或多种实施方式中，所述的提高海水养殖鱼类的抗病能力为：减少鳃中杀鱼爱德华氏菌的定植。
在一种或多种实施方式中，所述的提高海水养殖鱼类的抗病能力为减少鱼的白便。
在一种或多种实施方式中，所述的提高海水养殖鱼类的抗病能力为增强鱼的肠道机械屏障稳态(维持肠道渗透性、提高肠道紧密连接蛋白表达)。
所述的提高海水养殖鱼类的抗病能力为：所述的提高鱼的抗病能力为：减少脾、肾、肠或鳃中杀鱼爱德华氏菌的定植。
所述的提高海水养殖鱼类的抗病能力为：所述提高海水养殖鱼类的抗病能力的制剂包括：鱼饲料。
所述的提高海水养殖鱼类的抗病能力为：所述的海水养殖鱼类为杀鱼爱德华氏菌(Edwardsiella piscicida)易感性的鱼；较佳地，所述的鱼为大菱鲆(或与大菱鲆具有近缘关系的海水养殖鱼类)。
在本发明的另一方面，提供一种制备提高鱼的抗病能力的制剂的方法，所述方法包括制备含以下组分的组合物：β-葡聚糖、甘露寡糖、黄芪多糖、poly(I:C)、卵磷脂、鱼油；按照重量百分比，各组分为：
包括：将β-葡聚糖、甘露寡糖、黄芪多糖、poly(I:C)、卵磷脂、鱼油和水进行混合，之后进行乳化；较佳地，以7.6±1Kr/min(较佳地7.6±0.5Kr/min)进行搅拌乳化10±2min(较佳地10±1min)。
在一种或多种实施方式中，乳化时以7.6±0.5Kr/min进行搅拌乳化。
在一种或多种实施方式中，乳化时间为10±1min。
在一种或多种实施方式中，使用匀浆机进行均质乳化。
在本发明的另一方面，提供一种组合物，所述组合物可用于制备提高海水养殖鱼类的抗病能力的制剂，按照重量百分比，其包括：
在一种或多种实施方式中，按照重量百分比，所述组合物包括：
在一种或多种实施方式中，所述的组合物中还包括食品学或药学上可接受的成分。
在本发明的另一方面，提供一种海水养殖鱼类饲料，所述饲料中包括：
(a)鱼基础饲料；以及
(b)所述的组合物；
在一种或多种实施方式中，所述的海水养殖鱼类饲料中，(b)与(a)按照体积质量比3～10％(V/m)的比例混合；较佳地，(b)与(a)按照体积质量比4～8％(V/m)的比例混合。
在一种或多种实施方式中，(b)与(a)按照体积质量比4.5、5、5.5、6、6.5、7或7.5％(V/m)的比例混合。
在一种或多种实施方式中，所述“(b)与(a)按照体积质量比3～10％(V/m)的比例混合”等同于：(b)与(a)按照体积质量比3～10:100(其中若体积以mL计，那么质量以g计)。
本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
附图说明
图1、饲喂所述实验组A和实验组B的组合制剂的大菱鲆在细菌感染后肠道溶菌酶活力变化，以未添加组合制剂、仅给予基础饲料的组为对照组。
图2、饲喂所述所述实验组A和实验组B的组合制剂的大菱鲆在细菌感染后肠道细菌定植变化，以未添加组合制剂、仅给予基础饲料的组为对照组。
图3、饲喂所述实验组A和实验组B的组合制剂在细菌感染后鳃细菌定植变化，以未添加组合制剂、仅给予基础饲料的组为对照组。
图4、饲喂所述实验组A和实验组B的组合制剂的大菱鲆在细菌感染后肠道渗透性变化，以未添加组合制剂、仅给予基础饲料的组为对照组。
图5、所述实验组A和实验组B的组合制剂对于大菱鲆肠道紧密连接蛋白表达影响，以未添加组合制剂、仅给予基础饲料的组为对照组。
图6、所述实验组A和实验组B的组合制剂对于鳃病理影响，以未添加组合制剂、仅给予基础饲料的组为对照组。
图7、所述实验组A和实验组B的组合制剂对于肠道病理影响，以未添加组合制剂、仅给予基础饲料的组为对照组。
图8、所述实验组A和实验组B的组合制剂对于大菱鲆幼苗的肠道白便的影响，以未添加组合制剂、仅给予基础饲料的组为对照组。
图9、所述实验组B和实验组C的组合制剂对于大菱鲆幼苗的肠道白便的影响，以未添加组合制剂、仅给予基础饲料的组为对照组。
图10、所述实验组B和实验组C的组合制剂饲喂后，大菱鲆幼苗的肠道病理切片分析，以未添加组合制剂、仅给予基础饲料的组为对照组。
图11、所述实验组B和实验组C的组合制剂饲喂后，大菱鲆幼苗的肠道和鳃中细菌定植情况分析，以未添加组合制剂、仅给予基础饲料的组为对照组。
图12、所述实验组B和实验组C的组合制剂饲喂后，大菱鲆幼苗的脾脏和肾脏中细菌定植情况分析，以未添加组合制剂、仅给予基础饲料的组为对照组。
图13、所述实验组B和实验组C的组合制剂饲喂后，大菱鲆幼苗的肠道渗透性分析，以未添加组合制剂、仅给予基础饲料的组为对照组。
具体实施方式
为了应对针对水产易于患病而导致产量损失或提早捕捞导致产量规格不达标的缺陷，本发明提供了一种鱼用的配方组合及其制备方法，以β-葡聚糖、甘露寡糖、黄芪多糖、poly(I:C)进行复配和配方优化，并以鱼油和卵磷脂等辅料进行乳化制备。所述组合制剂能够非常显著地提高鱼类如大菱鲆对感染后细菌的清除能力，缓解细菌感染导致的粘膜组织如肠道和鳃的病理损伤，增强大菱鲆的抗病能力。令人意外地，本发明的组合物也能极显著地减少脾脏和肾脏中细菌定植。与抗生素类药物相比，本发明组合制剂环境友好、成本低廉且效果理想，为提高海水鱼类的养殖水平、提高存活率提供了新的方案。
术语
如本发明中所用，“约”、“大约”、“大概”或“基本上”一般应指一特定数值或范围如20％以内、较佳10％以内、更佳地5％以内的上下浮动。在此所使用的数值为近似值，代表若未明示地陈述，“约”、“大约”、“大概”或“基本上”等词可以被推断适用。
如本发明中所用，所述的“含有”，“具有”或“包括”包括了“包含”、“主要由……构成”、“基本上由……构成”、和“由……构成”；“主要由……构成”、“基本上由……构成”和“由……构成”属于“含有”、“具有”或“包括”的下位概念。
如本发明中所用，所述的“主要成分”或“主要活性成分”或“活性成分”是指在提高鱼抗病能力中起作用的必要成分，本发明中主要由β-葡聚糖、甘露寡糖、黄芪多糖、poly(I:C)、卵磷脂、鱼油组成。
如本发明中所用，术语“本发明的组合物”通常是食物组合物、饲料组合物或药物组合物，其含有本发明的组合制剂作为提高鱼抗病能力的主要成分；以及药学上可接受的载体或赋形剂。
如本发明中所用，“食品学或药学上可接受的”成分是适用于动物而无过度不良副反应(如毒性、刺激和变态反应)即有合理的效益/风险比的物质。
如本发明中所用，所述的“鱼”包括海洋/海水鱼类，或为易于被杀鱼爱德华氏菌(Edwardsiella piscicida)感染的鱼，例如大菱鲆。
如本发明中所用，“食品学或药学上可接受的载体”是用于将本发明的组合制剂传送给动物的药学上或食品上可接受的溶剂、悬浮剂或赋形剂。载体可以是液体或固体。适用于本发明的药学上可接受的载体包括(但并不限于)：BSA、盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇等，或它们的组合。
提高鱼的抗病能力的组合物/制剂
如前所述，海洋病原菌杀鱼爱德华氏菌(Edwardsiella piscicida)能够感染鱼类，导致鱼发生疾病。
现有技术中，如何有效保护水产、避免其患病而导致产量损失，一直是亟待解决的难题。本发明人致力于水产养殖技术的改进、促进鱼类健康生长，使用β-葡聚糖、甘露寡糖、黄芪多糖、poly(I:C)、卵磷脂、鱼油进行复配，并且采用乳化均质方法制备液体制剂，使其能够和饲料更好的结合，提高饲喂效果。本发明人的研究结果意外地发现，用低剂量(甚至可认为“极低剂量”)的β-葡聚糖、甘露寡糖、黄芪多糖、poly(I:C)来与卵磷脂和鱼油进行复配，比之普通剂量/高剂量，效果更为突出，使鱼类如大菱鲆具有更强的抗病能力。
基于本发明人的上述新发现，本发明提供了一种新型的用于增强鱼类(尤其为大菱鲆)的抗病能力的组合物，包括：低剂量的β-葡聚糖、低剂量的甘露寡糖、低剂量的黄芪多糖、低剂量的poly(I:C)、卵磷脂和鱼油。
在本发明的优选方式中，按重量百分比，所述的增强鱼的抗病能力的组合物所包括的组分的用量如表1所示。
表1
作为本发明实施例中的一个优选的具体实例，本发明的提高鱼的抗病能力的组合物包括：β-葡聚糖0.4％，甘露寡糖0.4％，黄芪多糖0.4％，poly(I:C)0.025％，卵磷脂3％，鱼油10％。
本发明的提高鱼的抗病能力的组合物中各个组分以合适的量相互配伍，协同作用，达到显著的抗病能力的促进作用。
本发明的提高鱼的抗病能力的组合物的剂型可以是多种多样的，包括但不限于：乳液，水溶液，可乳化浓缩物，可湿粉剂，冻干剂，可喷洒溶液，油性或水性分散系，悬浮剂，粉剂，颗粒剂，或微胶囊。应理解，只要能够将本发明所述的组合物在保持全部或部分活性的前提递下送到所需处理的对象的剂型都是可取的。优选地其为适于口服的剂型。优选地为那些易于与饲料混合的剂型，如乳化液(乳剂)，其为均质乳化后形成的，能够与饲料良好地相混合。
浓缩型的组合物中活性成分的含量较高，如20～90wt％，而稀释型组合物和实际使用的组合物中活性成分含量较低，通常为0.00005～0.5wt％。此外，还可以包含其他合适的化学剂、增效剂、微量元素、稳定剂、粘合剂、润湿剂、分散剂、乳化剂、渗透剂、溶剂、充填剂等常用组分。本发明组合物中还可以含有其它活性成分，如促消化剂等。
在本发明的优选实施例中，提供了一种口服型的组合制剂的制备方法，包括以下步骤：在纯净水中加入上述质量浓度的各组分，用高剪切乳化机以7.6Kr/min进行搅拌乳化10min制成均质乳浊液。
本发明的提高鱼的抗病能力的组合物中，各个活性组分的需要量低、成本可控且原料易得，制备方法简单，但是却能由海水鱼类、尤其是大菱鲆有效且高效地利用，使得鱼类的抗病能力大大增强，且可长期维持这种抗病能力，非常适用于作为海水鱼类、尤其是大菱鲆的饲料添加剂。
应用
本发明中，令人意外地发现，低或极低剂量的β-葡聚糖、甘露寡糖、黄芪多糖、poly(I:C)，进一步与卵磷脂、鱼油配伍，形成的组合物，可极为显著地改善鱼类健康，使得鱼类的抗病能力大大增强，且可长期维持这种抗病能力。
在本发明人的上述发现的基础上，本发明提供了所述提高鱼的抗病能力的组合物的应用，应用于制备鱼类饲料(如鱼类幼苗饲料)。较佳地，可将所述提高鱼的抗病能力的组合物(优选地先进行乳化，形成液体)按照体积质量比3～10％(V/m)添加于大菱鲆幼苗基础饲料中。
饲料
本发明还提供了一种鱼类饲料，所述饲料中包括：鱼基础饲料；以及本发明所述的提高鱼的抗病能力的组合物。
作为本发明的优选实施方式，将上述成分均质乳化后制成所述提高鱼的抗病能力的组合物，将该组合物按照5％(V/m)的比例添加于大菱鲆幼苗基础饲料中，通过仅需2周的短期饲喂即可显著增强大菱鲆幼苗的抗病能力，有效保护期很长。
本发明也提供了一种用于提高海洋鱼类、尤其是大菱鲆的抗病能力的试剂盒/包装盒/食盒，其中包括上述的提高鱼的抗病能力的组合物，或含有所述组合物的饲料。
所述试剂盒/包装盒/食盒通常包括包装或容器，所述提高鱼的抗病能力的组合物或含有其的饲料被置于所述包装或容器中。
所述的试剂盒/包装盒/食盒中，通常还包括使用说明书，其上可记载使用所述提高鱼的抗病能力的组合物或含有其的饲料的方法，也可记载例如本发明的提高鱼的抗病能力的组合物或含有其的饲料的制备方法等，以利于本领域技术人员方便地进行配制和施用。
仅需通过2周的短期饲喂后即可增强大菱鲆幼苗的抗病能力，有效保护期达8周或8周以上。该所述组合制剂提高大菱鲆幼苗对感染后细菌的清除能力，缓解细菌感染导致的粘膜组织如肠道和鳃的病理损伤。本发明制备简单，使用方便，效果显著，无害环保，不影响饲料适口性。
与现有技术相比，本发明的有益效果如下：
1、本发明的提高鱼抗病能力的组合物为组合制剂，在促进鱼类抗病方面作用方面效果显著。本发明采用的β-葡聚糖、甘露寡糖、黄芪多糖、poly(I:C)、卵磷脂、鱼油相互组合、协同作用，仅需要非常低的用量就能够明显提高大菱鲆幼鱼的抗病能力。
2、本发明所述的组合制剂能够有效改善大菱鲆抗病能力，包括降低肠道和鳃的细菌载量，提高肠道紧密连接蛋白的转录表达水平，降低肠道渗透性，缓解肠道白便现象和肠道炎性细胞浸润，改善肠道和鳃形态及其结构完整性。
3、本发明所述组合制剂优选的为经乳化的制剂，其剂型优选地为乳浊液，在和饲料拌喂的过程中能够增加摄入效率，同时增加饲料的适口性，促进鱼类的有效食用。
4、本发明的口服所述组合制剂使用周期短，通过2周的饲喂即可达到8周以上的抗病保护作用，节约养殖成本。
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见的。本申请说明书和实施例仅是示例性的。
材料和方法
1、试验试剂
苏木素伊红(HE)染色试剂盒，无水乙醇，二甲苯，FITC-dextran(4000Da),MonAmpSYBR Green qPCR Mix(Low ROX)，溶壁微球藻菌。
2、试验器材
石蜡切片机，光学显微镜，Nanodrop2000核酸定量仪，多功能酶标仪，电子称，高效组织细胞样品处理仪，高剪切乳化机，荧光定量PCR仪。
3、试验饲料
实验组A：向基础饲料中添加5％(w/v)组合制剂1饲喂大菱鲆。
实验组B：向基础饲料中添加5％(w/v)组合制剂2饲喂大菱鲆。
对照组：基础饲料饲喂大菱鲆。
4、试验大菱鲆
选取健康，外表无损伤，大小均一和规格为3-5g/尾大菱鲆幼苗。
5、饲喂试验
在养殖基地选取3-5g大菱鲆进行2周的所述组合制剂饲喂，在所述组合制剂饲喂结束后8周(该8周中饲喂基础饲料)，对大菱鲆进行细菌攻毒，考察粘膜系统对于细菌的抵抗能力的变化情况。
6、攻毒试验
使用杀鱼爱德华氏菌EIB202(以下简称EIB202，或简称“细菌”)对所述组合制剂饲喂后8周(该8周中饲喂基础饲料)的大菱鲆幼苗进行攻毒试验。将EIB202菌液按1％的接种量接种到含有50μg/ml多粘菌素的TYB培养基中，28℃，200rpm培养12h。将一级同样以1％的接种量接种到含有50μg/ml多粘菌素的TYB培养基中，28℃，200rpm过夜培养。用NanoDrop2000测定菌浓，待OD增长至3时，8000rpm离心10min收集细菌。每组随机选取40条大菱鲆进行浸泡攻毒，浸泡体积为6L，菌浓为2×108CFU/ml，浸泡时间为1h。浸泡结束后用海水洗涤并放置在培养缸中进行后续观察。
7、样本采集与检测
在对大菱鲆攻毒后第3天进行采样，用于肠道紧密连接蛋白转录水平检测，采样具体步骤如下：每一组随机取9条鱼，分成三份，取后肠置于1.5ml EP管中，加入200μl RNAStore溶液，置于-80℃冰箱中，用于后续的RNA提取和q-PCR。
在攻毒后第3天进行采样，用于肠道溶菌酶活力检测，采样具体步骤如下：每一组随机取9条鱼，分成三份，取后肠置于1.5ml EP管中，加入200μl RIPA裂解液进行裂解，裂解后加入1％蛋白酶抑制剂并置于-80℃冰箱中，用于后续的溶菌酶酶活力的检测。
在攻毒后第3天进行采样，用于细菌定植，采样步骤具体如下：每一组随机取9条鱼，分成三份，取鳃和后肠置于研磨管中，加入1ml PBS浸没，用高效组织细胞处理仪进行研磨，研磨液用PBS进行梯度稀释后取10μl进行滴板计数。
在攻毒后第7天进行肠道渗透性检测，每组取3条鱼，称量体重后以50mg FITC-D/kg体重的剂量给大菱鲆进行口服，并在5h后进行取血，血液静置1h后4000rpm，15min离心取血清，取100μl血清置于黑边底透的96孔板中，并用多功能酶标仪进行读数，激发波为490nm，发射波长为520nm。
在攻毒后第7天进行采样，用于病理切片制备和观察。每组取3条鱼，剖取鱼的鳃和后肠部位于组织固定液中浸没，用于后续的石蜡切片样本制备，HE染色和组织形态观察。
实施例1、所述组合制剂的制备及饲料制备
1、组合制剂1
制备一种提高大菱鲆黏膜抵抗力的制剂(实验组A)，包括以下质量浓度组分：poly(I:C)0.1％(w/v)，卵磷脂3％(w/v)，鱼油10％(v/v)。
上述制剂的制备方法，包括以下步骤：用电子称称取poly(I:C)和卵磷脂，用量筒量取鱼油和纯净水，混合后用高剪切乳化机以7.6Kr/min进行搅拌乳化10min，混合均匀，得到制剂。
2、组合制剂2：普通剂量组
普通剂量组(实验组B)中，制备一种提高大菱鲆黏膜抵抗力的制剂，包括以下质量浓度组分：β-葡聚糖2％(w/v)，甘露寡糖2％(w/v)，黄芪多糖2％(w/v)，poly(I:C)0.1％(w/v)，卵磷脂3％(w/v)，鱼油10％(v/v)。
上述制剂的制备方法，包括以下步骤：用电子称称取β-葡聚糖，甘露寡糖，黄芪多糖，poly(I:C)和卵磷脂，用量筒量取鱼油和纯净水，混合后用高剪切乳化机以7.6Kr/min进行搅拌乳化10min。
3、组合制剂3：低剂量组
低剂量组(实验组C)中，制备一种提高大菱鲆黏膜抵抗力的制剂，包括以下质量浓度组分：β-葡聚糖0.4％(w/v)，甘露寡糖0.4％(w/v)，黄芪多糖0.4％(w/v)，poly(I:C)0.025％(w/v)，卵磷脂3％(w/v)，鱼油10％(v/v)。
上述制剂的制备方法，包括以下步骤：用电子称称取β-葡聚糖，甘露寡糖，黄芪多糖，poly(I:C)和卵磷脂，用量筒量取鱼油和纯净水，混合后用高剪切乳化机以7.6Kr/min进行搅拌乳化10min。
4、饲料
将上述1～3项制备的组合制剂添加到水产动物养殖用的基础饲料中，制备成实验饲料。以5％(v/m)比例与颗粒饲料进行拌料饲喂，即1kg饲料加50ml所述组合制剂。
普通剂量组(实验组B)：多糖组分的拌料后比例为0.1％，poly(I:C)拌料后比例为0.005％。
低剂量组(实验组C)：多糖组分的拌料后比例为0.02％，poly(I:C)拌料后比例为0.00125％。
以下具体以在大菱鲆养殖上的应用进行具体的说明。
实施例1、所述组合制剂饲喂显著增加大菱鲆粘膜多个器官的细菌清除能力
1、肠道溶菌酶活力
对所述组合制剂饲喂后8周的大菱鲆幼苗进行攻毒试验。在细菌攻毒后3天，对不同饲喂组大菱鲆幼苗肠道中的溶菌酶活力进行检测，测定给予所述组合制剂与对照相比的效果。
结果如图1所示，相对于对照组，实验组B的肠道溶菌酶活力明显提升。实验组A则没有显著的肠道溶菌酶活力提升。
2、细菌定植情况
对所述组合制剂饲喂后8周的大菱鲆幼苗进行攻毒试验。在细菌攻毒后3天，测定不同饲喂组大菱鲆幼苗肠道和鳃中的细菌定植情况。
肠道中细菌定植情况如图2所示。相对于对照组，实验组B的肠道中的细菌定植发生极为显著的减少。实验组A则与对照组相比略有减少但缺乏显著性。
鳃中细菌定植情况如图3所示。相对于对照组，实验组A和B中大菱鲆幼苗鳃和肠道定植有明显降低。并且，实验组B中大菱鲆幼苗的细菌定植降低更为明显。
上述实验结果表明，本发明如实验组B的所述组合制剂可以显著提高大菱鲆幼苗的粘膜清除细菌感染的能力。
实施例2、所述组合制剂饲喂缓解大菱鲆幼苗细菌感染后的肠道机械屏障损伤
1、肠道的渗透性
对所述组合制剂饲喂后8周的大菱鲆幼苗进行攻毒试验。在细菌攻毒后7天，通过FITC标记的葡聚糖对实验组和对照组大菱鲆幼苗进行灌喂处理，一段时间后检测血清中FITC荧光强度，评价细菌感染后大菱鲆幼苗肠道的渗透性。
结果如图4所示，可以看出，相对于对照组，实验组B的大菱鲆幼苗血清中FITC荧光强度均显著降低。实验组A的大菱鲆幼苗血清中FITC荧光强度的没有明显降低。
2、肠道紧密连接蛋白的表达
肠道紧密连接蛋白的功能是维持肠道机械屏障的功能。本发明人进一步地检测肠道紧密连接蛋白相关基因的表达。
结果如图5所示，可以看出，相对于对照组，实验组A和B的紧密连接蛋白转录水平均有明显提高。并且，实验组B的紧密连接蛋白转录水平的提高更为明显。
上述结果表明，饲喂本发明所述的所述组合制剂(实验组B)能够有效促进大菱鲆幼苗肠道组织完整性，减少细菌感染导致的肠道损伤。
实施例3、所述组合制剂饲喂显著改善大菱鲆幼苗的鳃和肠道的组织炎症和病理
对所述组合制剂饲喂后8周的大菱鲆幼苗进行攻毒试验。在细菌攻毒后7天，对不同饲喂组的大菱鲆幼苗的鳃和肠道进行组织病理切片制备观察。
如图6所示，相对于对照组，实验组A和B中的大菱鲆幼苗鳃小片增生融合得到了明显缓解。而且，实验组B的缓解效果更为理想，其鳃小片排列规律，结构清晰完整，而且鳃丝基质处未出现明显增生。
如图7所示，相对于对照组，实验组大菱鲆幼苗的肠道炎性细胞浸润和杯状细胞减少现象明显缓解，环形皱襞更深。实验组B相对更为理想。
上述结果表明，本发明所述的所述组合制剂(实验组B)饲喂后，能够降低细菌感染导致的大菱鲆幼苗鳃和肠道的病理损伤和炎症，并且poly(I:C)和其它的多组分配伍的所述组合制剂具有更好的效果。
实施例4、所述组合制剂饲喂显著改善细菌感染导致的大菱鲆幼苗肠道白便
对所述组合制剂饲喂后8周的大菱鲆幼苗进行攻毒试验。在细菌攻毒后7天，对不同饲喂组大菱鲆幼苗肠道白便的病理表型进行观察。
结果如图8和表2所示。相对于对照组，实验组A和B中大菱鲆幼苗肠道白便现象发生比例显著降低，并且白便的严重程度明显缓解，实验组B中大菱鲆幼苗的肠道白便缓解更为显著。
表2
上述结果表明，使用本发明所述的所述组合制剂(实验组B)饲喂可显著改善大菱鲆幼苗细菌感染导致的肠道白便，并且本发明中经由多组分联合配伍的组合具有更好的效果。
实施例5、普通剂量所述组合制剂(实验组B)与低剂量所述组合制剂(实验组C)的测试
1、肠道白便情况
所述组合制剂饲喂结束8周后，使用杀鱼爱德华氏菌感染。在细菌攻毒后7天，对不同饲喂组大菱鲆幼苗肠道白便的病理表型进行观察。
肠道白便情况如图9和表3。
表3
上述结果表明，使用本发明所述的低剂量所述组合制剂(实验组C)饲喂可显著改善大菱鲆幼苗细菌感染导致的肠道白便，其改善效果大大优于普通剂量所述组合制剂(实验组B)。
2.肠道病理切片
所述组合制剂饲喂结束8周后，使用杀鱼爱德华氏菌感染。在细菌攻毒后7天，对不同饲喂组大菱鲆幼苗肠道白便的病理表型进行观察。
如图10所示，相对于对照组，低剂量所述组合制剂(实验组C)饲喂可显著改善肠道炎性细胞浸润和杯状细胞减少现象，环形皱襞更深；且低剂量所述组合制剂(实验组C)的改善效果显著优于普通剂量所述组合制剂(实验组B)。
3、细菌定植情况
所述组合制剂饲喂结束8周后，使用杀鱼爱德华氏菌感染。在细菌攻毒后7天，测定不同饲喂组大菱鲆幼苗不同器官中的细菌定植情况。
(1)肠道和鳃中细菌定植
肠道和鳃中细菌定植情况如图11所示。在肠中，相对于对照组，实验组B(普通剂量组)的细菌定植显著减少，实验组C(低剂量组)则发生非常显著的减少。
在鳃中，相对于对照组，实验组B(普通剂量组)的细菌定植显著减少，实验组C(低剂量组)则发生非常显著的减少。
(2)脾脏和肾脏中细菌定植
脾脏和肾脏中细菌定植情况如图12所示。在脾脏中，相对于对照组，实验组B(普通剂量组)的细菌定植显著减少，实验组C(低剂量组)则发生非常显著的减少。
在肾脏中，相对于对照组，实验组B(普通剂量组)的细菌定植显著减少，实验组C(低剂量组)则发生非常显著的减少。
4.肠道渗透性
在细菌攻毒后7天，通过FITC标记的葡聚糖对实验组和对照组大菱鲆幼苗进行灌胃处理，一段时间后检测血清中FITC荧光强度，评价细菌感染后大菱鲆幼苗肠道的渗透性。
结果如图13所示，可以看出，相对于对照组，实验组B和C的大菱鲆幼苗血清中FITC荧光强度均显著降低。并且，实验组C的大菱鲆幼苗血清中FITC荧光强度的降低更为明显。
5、保护周期
低剂量的所述组合制剂在饲喂结束后，具有较长时间的保护效果，经过2周的饲喂，在饲喂结束后8周甚至更长的时间仍有明显的保护效果。
综上所述，这是令人意外地，低剂量下的各组分配伍即能达到理想的使用效果，高剂量时些情况下反而不利于细菌清除或者炎症应答。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。同时，在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。
Claims (12)
1.组合物在制备提高海水养殖鱼抗病能力的制剂中的应用，其中所述的组合物由以下组分以及余量的水组成：β-葡聚糖、甘露寡糖、黄芪多糖、polyI:C、卵磷脂和鱼油；按照重量百分比，各组分为：
，
所述的海水养殖鱼为杀鱼爱德华氏菌(Edwardsiella piscicida)易感性的鱼；所述的提高海水养殖鱼的抗病能力为减少脾脏和/或肾脏中杀鱼爱德华氏菌定植，减少肠和/或鳃中杀鱼爱德华氏菌的定植。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的组合物被添加到鱼饲料中，按照所述组合物占饲料重量的5±2%w/v的量添加。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，按照所述组合物占饲料重量的5±1%w/v的量添加。
4.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述提高海水养殖鱼的抗病能力的制剂包括：鱼饲料。
5.如权利要求1-4任一所述的应用，其特征在于，所述海水养殖鱼为大菱鲆。
6.一种制备提高海水养殖鱼的抗病能力的制剂的方法，其特征在于，所述方法包括制备由以下组分以及余量的水组成的组合物：β-葡聚糖、甘露寡糖、黄芪多糖、polyI:C、卵磷脂和鱼油；按照重量百分比，各组分为：
，
将β-葡聚糖、甘露寡糖、黄芪多糖、polyI:C、卵磷脂、鱼油和水进行混合，之后进行乳化；
所述的海水养殖鱼为杀鱼爱德华氏菌易感性的鱼；所述的提高海水养殖鱼的抗病能力为减少脾脏和/或肾脏中杀鱼爱德华氏菌定植，减少肠和/或鳃中杀鱼爱德华氏菌的定植。
7. 如权利要求6所述的方法，其特征在于，以7.6±1 Kr/min进行搅拌乳化10±2 min。
8.一种组合物，所述组合物用于制备提高海水养殖鱼的抗病能力的制剂，其特征在于，按照重量百分比，其由以下活性成分以及余量的水组成：
，
所述的海水养殖鱼为杀鱼爱德华氏菌易感性的鱼；所述的提高海水养殖鱼的抗病能力为减少脾脏和/或肾脏中杀鱼爱德华氏菌定植，减少肠和/或鳃中杀鱼爱德华氏菌的定植。
9. 一种提高海水养殖鱼的抗病能力的海水养殖鱼饲料，其特征在于，所述饲料中包括：
(a)鱼基础饲料；以及
(b)权利要求8所述的组合物；
所述的海水养殖鱼为杀鱼爱德华氏菌易感性的鱼；所述的提高海水养殖鱼的抗病能力为减少脾脏和/或肾脏中杀鱼爱德华氏菌定植，减少肠和/或鳃中杀鱼爱德华氏菌的定植。
10.如权利要求9所述的海水养殖鱼饲料，其特征在于，(b)与(a)按照体积质量比3～10%V/m的比例混合。
11.如权利要求10所述的海水养殖鱼饲料，其特征在于，(b)与(a)按照体积质量比4～8%V/m的比例混合。
12.如权利要求10所述的海水养殖鱼饲料，其特征在于，(b)与(a)按照体积质量比4.5%、5%、5.5%、6%、6.5%、7%或7.5%V/m的比例混合。
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