WO2001036591A1

WO2001036591A1 - Souche yunnan sl-001

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Publication number: WO2001036591A1
Application number: PCT/JP1999/006380
Authority: WO
Inventors: Hiroyuki Sumi
Original assignee: Honda Trading Corporation
Priority date: 1999-11-16
Filing date: 1999-11-16
Publication date: 2001-05-25
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Description

明細書雲南 SL-001菌技術分野

本発明は、新規な枯草菌（Bacillus subtilis)に関するものである。詳しく述べると、本発明は、効率よくビタミン Kまたはその誘導体を産生する能力を有する枯草菌（Bacillus subtilis)に関するものである。背景技術

ビタミン Kは、従来、血液が凝固する際に必要な因子として知られており、このビ夕ミン Kの欠乏は血液凝固能の低下をもたらすので抗出血性ビタミンとも呼ばれる脂溶性ビタミンの一種である。このビタミン K の欠乏が血液凝固能の低下をもたらす原因としては、近年、プロトロンビンを含む数種の血液凝固因子の生合成にビ夕ミン Kが不可欠であることが示唆された。しかしながら、血液凝固能の低下を防止するために必要とされるビタミン Kの量は〃 gオーダーと極めて微量であり、一般的には、成人では腸内細菌から供給されるので、ビタミン K欠乏症になることはまれであり、また、ビタミン K欠乏性出血症の治療には合成ビ夕ミン K tや K ₂が医薬品として用いられ、これまではこの予防を目的として天然ビタミン K i濃縮物が食品として利用されているため、ビタミン Kはこれまであまり注目されることはなかった。

しかしながら、近年、ビタミン κには骨形成促進作用及び骨吸収抑制作用があり、ビタミン Kの投与で骨密度が増加することが明らかにされた。一方、骨粗鬆症は、老化や疾病などの原因によって起こる、骨がもろくなる病態で、骨折したり、激しい痛みなどを伴い、老人医療の面から大きな社会問題となりつつある病気であり、骨粗鬆症患者におけるビ夕ミン Kの血中濃度を調べてみると健常人に比べて約 1 / 2 と少ないことが報告された。このため、合成ビタミン Kが骨粗鬆症用治療薬として臨床試験が行われているが、出血症の治療 ' 予防の場合と異なり、骨粗鬆症の治療 ' 予防では、一日に 4 5 m g以上という多量のビタミンの投与で骨量を増す改善効果があることが臨床試験により証明されている < また、骨粗鬆症は発病してからの治療より予防が重要であり、このためには食品から日常的にビタミン Kを摂取することが望まれるが、健常者の場合、一日にどのくらいのビタミン Kを摂取すれば骨量が増し、骨粗鬆症の予防に役立つかは明らかではない上、既存の食品で上記したような量を摂取することは難しいと思われる。

上述したように、ビタミン Kの摂取は日常の食品を通じて行われるのが望ましく、実際、ビタミン K iは緑黄色野菜や海草類などから、ビ夕ミン K ₂は納豆などの発酵食品から摂取することができる。しかしながら、市販の食品から骨粗鬆症の改善に有効な量であるとの報告のある 4 5 m gのビタミン Kを摂取しょうとする場合、例えば、ビタミン Kを 1 p p m含有する食品では、一日に 4 5 k gという多量の食品を食する必要があるが、このようなことは実際には非常に困難である。また、食品のうちでビ夕ミン Kの含量が十数 p p mと最も多いのは納豆である力たとえ、このような納豆を食しても一日に数百 gから数 k gの量を食さなくてはならず、嗜好上、これだけの量を毎日食することは困難である上、摂取されたビタミン Kの半減期は短く、単発で経口摂取したのでは効果が不十分であったり、また逆に一時に大量摂取すると副作用の問題も残されていた。このため、ビタミン Kが濃縮されたものを摂取することが望ましいが、出血症予防のために調製粉乳に添加している市販の天然ビタミン K濃縮物は高価であり、医薬品の合成ビタミン Kは、食品添加物として認められておらず、このため食品に添加できないという問題があった。

ところで、ビタミン K類の中で、自然界に存在するのはビタミン K i およびビタミン K ₂群のみである。ビタミン K tは、食品中では、特に緑色野菜、植物油、海藻等に多く含まれており、例えば、海藻 · 海苔 - 茶葉などに数十 p p m、大豆油、ほうれん草やブロッコリ一などに数 p p m含まれており、また、 2—メチル一 1 ， 4—ナフトキノンとフイチルアセテートを縮合することよって合成される。また、ビタミン K ₂群は、側鎖長の違いによりメナキノン— 1〜 1 4 (ΜΚ— 1〜 1 4 ) の同族体が知られている。これらのうち、特にメナキノン一 7 (本明細書では、単に「ΜΚ— 7」ともいう）は、ビタミン Κ ₂の代表的な物質であり、主に納豆菌によって合成される力、自然界では納豆でも数〜十数 ρ p mと比較的微量にしか存在しない上半減期が短いため、単離が非常に困難であり、これまで、 MK— 7高含量の脂質を調製した例は、特開平 8 - 7 3 3 9 6号公報一例くらいしか知られていない。

このため、ビ夕ミン K ₂を納豆菌等の微生物を用いて大量に生産することが試みられ、天然ビ夕ミ >K ₂を得る方法としては多くの研究が知られており、例えば、フラボパクテリゥム属に属する微生物の培養液からビタミン Κ ₂を採取する方法（特公平 7— 2 8 7 4 8号及び特公平 7 一 5 1 0 7 0号公報）、グリセリンを添加した大豆煮汁や豆腐粕等に納豆菌を接種して発酵させることによりビタミン Κを生産する方法（特開平 1 0— 2 9 5 3 9 3号公報）、特定の培養温度及び時間で納豆菌による発酵させることによりビタミン Κを生産する方法（特開平 8— 9 9 1 6号及び特開平 8— 1 9 3 7 8号公報）が挙げられる。これらの方法に加えて、納豆菌の発酵物をアルコール、ェ一テル、エステルゃケトン等の有機溶媒による溶媒抽出などを行うことによって天然ビタミン Κ ₂、特に天然 MK— 7を多量に含む濃縮脂質を得る方法（特開平 8 - 7 3 3 9 6号公報）が提案されている。

しかしながら、特公平 7— 2 8 7 4 8号及び特公平 7— 5 1 0 7 0号公報に開示されるようなフラボパクテリゥムなどのビタミン K生産菌を使用する方法は、フラボパクテリゥムが食品としての安全性が証明されていないので、フラボパクテリゥムによる培養物や培養液などを直ちに食品添加物、その他の食用に供することはできないという問題がある。また、特開平 1 0— 2 9 5 3 9 3号公報に開示されるようなグリセリンを添加した大豆煮汁や豆腐粕等で納豆菌を培養する方法では、確かに最大約 4 O m g/リットル培養液という比較的ビタミン K含有量の高い培養物が得られたものの、培地中に 3〜 1 0質量％程度のグリセリンが含まれているため、培養物には当然グリセリンが残存する。このため、大豆煮汁、豆腐粕等の培地や納豆菌等の培養前の原料はそのまま食用に供せるものの、培養後の培養物や培養液などは、グリセリンの存在により、直ちに食品添加物、その他の食用に供することはできないという問題がある。さらに、特開平 8 - 9 9 1 6号及び特開平 8 - 1 9 3 7 8号公報に開示されるような特定の培養温度及び時間で納豆菌による発酵させる方法では、目的とするビタミン K含有量が、それぞれ、最大で約 5 3 m g/k g大豆及び約 1 1 7 mg/リツトル培養液というビタミン K含有量の非常に高い培養物が得られる。しかしながら、上記方法のうち、特開平 8— 9 9 1 6号公報では、明細書中にも記載されているが、得られた培養物はアンモニア臭がするため、食品素材としては不適切である。また、特開平 8 - 1 9 3 7 8号公報に開示される方法では、確かに培養液では高いビタミン K含有量が得られるが、ここで産生されるビタミン Kの大部分は水溶性ではなく脂溶性のビタミン Kであるため、その使用できる用途は非常に限定されたものとなる。さらに、特開平 8— 7 3 3 9 6号公報に開示されるような納豆菌の発酵物を有機溶媒で抽出することによって調製される天然メナキノン一 7 高含量脂質は、大豆等の食用に供することができるものを原料として調製されてはいるものの、抽出工程に有機溶媒を使用しているため、得られた天然メナキノン— 7高含量脂質を食品中にあるいは食品として使用する際にはこの有機溶媒を完全に除去しなければならずこのための設備や時間がさらに必要である上、上記と同様、得られるメナキノン一 7含有脂質はその名称からも明らかなように脂溶性であるためその使用できる用途が限定される。

上述したように、納豆、納豆の製造過程で発生する粕、煮汁等の副産物の発酵物から納豆菌等の微生物を用いてビ夕ミン Kやメナキノン一 7 を生産する方法は多数報告されてきたが、食用に供せるビタミン Kやその水溶性の誘導体を高産生量で生産できる微生物自体に関する報告は従来ほとんどなかった。

したがって、本発明は、ビタミン Kまたはその誘導体を効率良く産生できる微生物を提供することを目的どするものである。発明の開示

本発明の目的は、枯草菌（Bacillus subtilis)に属する雲南 SL-001菌 F E R M B P— 6 7 1 3によって達成される。図面の簡単な説明

第 1図は、雲南 SL-001菌、宮城野菌、弥生菌、高橋菌及び成瀬菌の R A P D法による D N Aパターンを示す図である。

第 2図は、実施例 1 において 4 日間培養した後の各種納豆菌の培養物の水及びイソプロパノール抽出物中の M K— 7量を示す図である。第 3図は、実施例 4において培養時間に対する宮城野菌及び雲南 SL- 001菌の培養物のイソプロパノール抽出物中の M K— 7量を示す図であ第 4図は、実施例 5において 4 日間培養した後の各種納豆菌の培養物の水抽出物中の M K— 7誘導体の量を示す図である。

第 5図は、実施例 6において水溶性ビ夕ミン K誘導体及びオカラ培養物のィソプロパノール抽出試料の H P L C分析結果示すグラフである。発明を実施するための最良の形態

本発明による雲南 SL-001菌は、バチルス属（Bacillus), 詳しくは枯草菌（Bacillus subtilis)に属し、ビタミン Kまたはその誘導体を高い収率で産生することができることを特徴とする新規な微生物である。

以下、本発明を詳細に説明する。

中国雲南省の毘明巿内で製造 · 販売される納豆（ビヮの葉を容器として使用し、その容器の中で大豆を発酵及び熟成させたもの）を滅菌水で希釈し、この希釈液について、納豆試験法（ 6 5〜 6 6頁、株式会社光琳発行、納豆試験法研究会編、 1 9 9 0 ) に記載の希釈分離法に従って、普通寒天培地（ 1 0 m 1 ) 上で 3 0 °Cで 4 8時間培養し、所定時間培養後に形成されたコロニーを釣菌し、当該操作を繰り返すことによって、単一の菌株を単離した。

このようにして単離された菌株の菌学的性質を以下に示す。

( a ) 形態的性質

1 ) 細胞の形および大きさ：桿菌で、肉汁中で 3 0 °Cで 2 4時間培養した後の細胞を顕微鏡により直接観察したところ、幅 1 〃m x長さ 3 〜 4 mの両端の丸い桿となる。

2 ) 細胞の多形性の有無：無し 3 ) 運動性の有無：有り

より詳しくは、半流動培地（ 0. 3 %寒天を添加したブイヨン培地を高層に固めたもの）の 2 / 3の深さまで穿刺接種し、 3 5。(：で培養し、穿刺線から全面に生育が広がったことから、また、顕微鏡により直接観察したところ、運動性が有ると判断した。

4 ) 胞子の有無：有り（耐熱性の胞子を産生）

胞子は、直径約 1 〃mの大きさであり、細胞の中央に楕円形の胞子を生じる。また、胞子 ¾は形成されない。

上記 4 ) において、胞子の確認方法を簡潔にいうと、 Moeller法（Moe ller, H.， 1891， Ueber eine neue Methoae der Spore nfarbung., Zent bl. Bakt. Parasitkde Abt. I, 10， 273)で芽胞を染色した。より詳しくは、火炎固定した菌体を石炭酸フクシン液で染色、水洗した後、ェタノールで脱色し、 Lofflerメチレンブル一液で後染色、水洗したところ、菌体が青色に、および芽胞が赤色に染色された。また、培養菌体を 8 0 °Cで 1 0分間加熱し、菌の生残により芽胞が耐熱性芽胞か否かを判定したところ、耐熱性芽胞であることが分かった。

( b ) 培養的性質

1 ) 肉汁寒天平板培養（ 3 0 ° ( 、 4 8時間）：コロニーは、白色円形で、表面はしわ状を呈し、乾燥しているように見える。また、コロニ一の大きさは、 3 0 °Cで 4 8時間培養した際、直径約 2 mmである。

2 ) 肉汁液体培養（ 3 0 °C) ： 1 0 m lの培地に一白金耳を接種したところ、 3 6時間の培養で白濁し、その培養液の吸光度（ O D _{6 6}。）は 0 . 8 5であった。

3 ) 肉汁ゼラチン穿刺培養： +

ゼラチン加寒天培地に菌を接種し、培養した後、 Frazier試薬（Frazie r, W.C., 1926, A method ior the detection of changes m gelatin d ue to bacteria., J. Infect. Dis.， 37, 302)を培地表面に注ぎ、菌の発育周囲に明瞭な透明帯が形成されるか否かを観察し、透明帯が形成されたものを陽性（+ ) とした。

( c ) 生理学的性質

1 ) グラム染色： +

2 ) 硝酸塩の還元： ―

3 ) V Pテスト： +

4 ) インドールの生成： ―

5 ) 硫化水素の生成：一

6 ) クェン酸の利用：一

7 ) ゥレア一ゼ：一

8 ) ォキシダーゼ： +

9 ) 酸素に対する態度：好気性

1 0 ) アルギニンの分解（アルギニンジヒドロラ一ゼ活性）： ― 1 1 ) リジンの脱炭酸反応（リジン脱炭酸酵素活性）：一

1 2 ) オル二チンの脱炭酸反応（オル二チン脱炭酸酵素活性）：一

1 3 ) トリブトファンの脱ァミノ反応：一

1 4 ) O N P Gテスト（ ?一ガラクトシダ一ゼ活性）：一

1 5 ) ピオチンの要求性：一

1 6 ) 粘着物の生成： +

なお、上記生理学的性質の一部について、その判定方法を以下に簡潔に説明する。

1 ) グラム染色

Huckerの変法によって、判定した。より詳しくは、火炎固定した菌体をまず Huckerクリスタルバイオレット液で染色し、ヨウ素処理を行つた後、脱色、 Pfeifferフクシン液で後染色を行ったところ、菌体は紫色に染色された。この際、グラム陽性菌は紫色に、およびグラム陰性菌は赤色に、それぞれ染色される。

2 ) 硝酸塩の還元

硝酸塩ブイヨン培地に菌を接種し、培養した後、培養液に 0 . 8 %スルファニル酸溶液（ 5 N酢酸溶液における）及び 0 . 5 %ひ一ナフチルァミン溶液（ 5 N酢酸溶液における）を添加し、この際、赤色または赤褐色に発色したものを陽性と判定した。

3 ) V Pテスト（ァセトインの生成）

Voges-Proskauerテス卜でピンクから赤色に発色させた菌を陽性と判定した。より詳しくは、 MR-VP ブイヨン培地に菌を接種し、 3 0 °Cで 2 4時間培養した後、 6 %ひ一ナフ卜一ル（エタノールにおける）溶液及び 4 0 %水酸化ナトリウム溶液を添加して、激しく混和した後、静置して、培養液がピンクから赤色に変色した菌を陽性と判定した（Eddy, B.P. , 1961 , The Voges-Proskauer reaction and its signincance : a r eview, J. Appl. Bact., 24, 27)。

4 ) インドールの生成

インドールテスト用ペプトン水に菌を接種し、 3 5 °Cで 1 0〜 1 5分間放置した後、コバック試薬を添加し、赤色に発色したものを陽性と判定した (Kovacs, N.， 1928, Eine vereinfachte ethoae zum Nachwei s der Indolbildung durch Bakterien, Z. ImmunForsch. exp . Ther. , 55, 311) o

5 ) 硫化水素の生成

プリセラブイヨン培地に菌を接種し、キヤップと試験管との間に酢酸鉛紙をはさみ、培地に触れないようにして試験管内に垂らす。培養後、濾紙の先端が褐色あるいは黒色になったものを陽性と判定した（ Z 0 B e 11 , C.E . & Feltham, C.B. , 1934, A comparison of lead, bismuth, and iron as detectors of hydrogen sulphide produced by bacteria, J. Bact. , 28, 169) o

6 ) クェン酸の利用

シモンズクェン酸寒天培地（Simmonsの培地）に菌を接種した後、 3 5 °Cで 4 日間、培養し、明らかな生育が見られ、培地が青変したものを陽性と判定した。

7 ) ゥレアーゼ

クリステンセン尿素寒天培地に菌を濃厚に接種し、 3 5 °Cで一晩培養し、培地全体が赤変したものを陽性と判定した（Christensen, W. B., 19 46, Urea decomposition as a means of differentiating Proteus and paracolon cultures from each other and from Salmonella and Shi gella, J. Bact. , 52, 461)。

8 ) ォキシダーゼ

菌体の塊にコバック試薬を滴下し、暗紫色に変色した菌を陽性と判定した (Kovacs, Ν·， 1956, Identiiication of Pseudomonas pyocyanea b y the oxidase reaction, Nature, 178， 703)。

9 ) 酸素に対する態度

平板培地 2枚に菌を接種し、これらのうち、 1枚は好気培養し、他方は嫌気培養する。この際、嫌気培養には、 B B L社製ガスパックパゥチを使用する。この結果、好気培養した平板にのみ菌が生育したものを好気性と判定した。

1 0〜 1 2 ) アルギニンの分解（アルギニンジヒドロラーゼ活性）、リジンの脱炭酸反応（リジン脱炭酸酵素活性）及びオル二チンの脱炭酸反応（オル二チン脱炭酸酵素活性）

メーラデカルボキシラーゼ培地に、アルギニン、リジンまたはオル二チン（いずれも塩酸塩）をそれぞれ 1 %添加し、高圧滅菌する。この培地に、菌をそれぞれ接種し、滅菌流動パラフィンを重層して培養し、培養液が紫色に変色したものを陽性を判定した。

1 3 ) トリプトファンの脱ァミノ反応

トリブトファン寒天培地に菌を濃厚に接種し、 3 5 °Cで 2 4時間培養した後、 3. 4 %塩化第二鉄溶液を斜面に沿って加え、試薬に触れた斜面部が赤褐色に変色したものを陽性を判定した。

1 4 ) O N P Gテスト（ ?—ガラクトシダーゼ活性）

O N P G ( o—ニトロフエ二ルー/?一 D—ガラクトビラノシド）テス卜で黄変したものを陽性と判定した。言い換えると、 O N P Gプイヨン培地に菌を接種し、 3 5 °Cで 2 4時間培養した後、黄変したものを陽性と判定した。

1 5 ) ピオチンの要求性

喜田節子らの合成培地（喜田節子、橋田度、寺本四郎、 1 9 5 6、納豆及び納豆菌に関する栄養学的研究、発酵工学雑誌、 3 4、 5 4 2 ) を使用し、ピオチン添加及び無添加合成培地に菌を接種し、 3 5 °Cで 6曰間培養して、菌が生育して培養液が濁ったものを陽性と判定した。

1 6 ) 粘着物の生成

粘着物生産用平板培地（村松芳多子ら、 1 9 9 5、日本農芸化学会 1 9 9 5年度大会講演要旨集、 3 1 5頁）に菌を接種し、培養した後、形成されたコロニーを観察して粘着物を産生したものを陽性と判定した。

(d ) 糖類からの酸の生成

以下に各種糖類からの酸の生成の有無を記載する。

なお、以下の糖（炭水化物）からの酸の産生は、最終 1 %濃度となるように炭水化物を添加した糖加アンモニゥム寒天培地に菌を接種し、 3 5 °Cで 4日間培養し、黄変したものを陽性と判定した。

1 ) グリセロール：土 2 ) L—ァラビノース：一

3 ) リボース：一

4 ) D—グルコース： +

5 ) D—フラク卜一ス：土

6 ) D—マンノース： +

7 ) イノシトール：一

8 ) D—マンニトール：一

9 ) D—ソルビトール：一

1 0 ) ひ一メチル一 D—グルコシド：土

1 1 ) エスクリン： +

1 2 ) マルトース：一

1 3 ) サッカロース： +

1 4 ) トレノヽロース： +

1 5 ) ィヌリン： +

1 6 ) グリコーゲン： +

本菌について、バージーズマニュアルォブシステマティックノ、'クテリオロン一 Bergey s Manual of Systematic Bacteriology 8 th) などを参考にして分類、同定したところ、枯草菌（Bacillus subtili s)に近似していることが分かった。

次に、（ a) 〜（ d ) の諸性質について、上記中国雲南省の毘明巿内で製造 · 販売される納豆から単離された菌株と、枯草菌（Bacillus subti lis)の代表的な基準菌株であるマールブルグ（Marburg)ならびに市販の納豆菌である宮城野菌（有限会社宮城野納豆製造所製、仙台）、弥生菌 (株式会社鈴与工業製、東京）、高橋菌（高橋祐蔵研究所製、山形）及び成瀬菌（株式会社成瀬醜酵化学研究所製、東京）との比較を行い、この結果を下記第 1〜 3表に示す。第 1表

第 2表

市販の納豆菌

諸特性 Marburg 単離菌

W K Mr、土 t HSa 向困

リジンの脱炭酸反応

オル二チンの脱炭酸反応

トリプトフアンの脱ァミノ反応

0 N P Gテスト + 4- 4- ピオチンの要求性 4- 4- 4- 4- 粘着物の生成 4- 4- + 酸の生成の有無グリセ口一ル + + + + + +

Lーァラピノ一ス + + + + +

リポース + + + + +

D一グルコース + + + + + +

D—フラクト一ス + + + + + 土

D—マンノース + + + + + + イノシトール + + + + +

D—マンニトール + + + + +

第 3表市販の納豆菌

諸特性 Marburg 単離菌宫城野菌弥生菌成瀬菌酸の生成の有無 D—ソルビトール + + + + +

α -メチル -D-ク 'ルコシ + + + + + + エスクリン + + + + + + マルトース + + + + +

サッカロ一ス + + + + + + トレハロース + + + + + + ィヌリン + + + + + グリコーゲン +

上記第 1〜 3表から、クェン酸の利用、 O N P Gテスト（ ?—ガラクトシダーゼ活性）及びピオチンの要求性について、中国雲南省の毘明巿内で製造 · 販売される納豆から単離された菌株は、他の枯草菌（Bacillu s subtilis), 特に市販菌に比して、有意な差が認められ、また、糖からの酸の生成については、 Lーァラビノース、リボース、イノシトール、 D —マンニトール、 D —ソルビトール、マル卜一ス及びグリコーゲンについて、中国雲南省の毘明巿内で製造 · 販売される納豆から単離された菌株が他の枯草菌（Bacillus subtilis)、特に市販菌に比べて有意な差が認められることが示される。

また、中国雲南省の毘明巿内で製造 · 販売される納豆から単離された菌株、ならびに市販の納豆菌である宮城野菌（有限会社宮城野納豆製造所製、仙台）、弥生菌（株式会社鈴与工業製、東京）、高橋菌（高橋祐蔵研究所製、山形）及び成瀬菌（株式会社成瀬醜酵化学研究所製、東京）の D N Aパターンを、 R A P D法（西本佳津子、川口洋、横手珠美、岸本憲明、田野達男、 1 9 9 9、 R A P D (random amplified polymor phic DNA)を西本佳津子、用いた簡便な納豆菌分類法、日本農芸化学会 1 9 9 9年度大会講演要旨集、 7 5頁；川口洋、西本佳津子、横手珠美、森下日出旗、岸本憲明、田野達男、 1 9 9 9、 R A P D法を用いた食品微生物の「株」レベルでの分類、日本食品科学工学大会大 4 6回大会講演要旨集、 9 8頁）に従って、比較した。結果を第 1図に示す。

第 1図から示されるように、中国雲南省の毘明巿内で製造 · 販売される納豆から単離された菌株（第 1図における雲南 SL-001菌）は、他の

4種の市販される納豆菌株とは明らかにその D N Aパターンに相違が見られた。

上記したような相違に加えて、下記実施例において詳細に記載するせ、中国雲南省の毘明巿内で製造 · 販売される納豆から単離された菌株、及び様々な市販される納豆菌について、培養細胞中の及び培養液中のビ夕ミン Kの一種であるメナキノンー 7 ( M K - 7 ) 及びその誘導体の量を測定したところ、これらの産生量に有意な差が認められた。

これらの結果から、本菌株は、公知の枯草菌（Bacillus subtilis)とは異なる性質を有するものであるため、本菌株を枯草菌（Bacillus subtili s)に属する新規な微生物であると判断し、本菌株を雲南 SL-001菌と命名した。また、雲南 SL-001菌は、平成 1 1年 5月 7 日付で、日本国茨城県つくば巿東 1丁目 1 番 3号に所在の通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に、受託番号 F E R M B P— 6 7 1 3号で国際寄託された。

なお、本発明者は、雲南 SL-001菌の培養物を濾過や遠心分離等の既知の方法により集菌した後、これを凍結乾燥、風乾、真空熱乾燥等の公知の方法により乾燥し、この乾燥菌体を水に溶解したところ溶解したことを発見した。このため、下記実施例で詳細に述べるが、培養物を水及びイソプロパノールで抽出したものを H P L Cで調べたところ、両者にビタミン（特に M K— 7 ) が含まれていることが分かった。この点から、本発明の雲南 SL-001菌が産生するビタミン K (特に M K— 7 ) は菌体内では何らかの変化を受けて水溶性となっていると考えられ、このような水溶性が付与された形態のビタミン K及びメナキノン一 7 ( M K 一 7 ) を、本願明細書において、それそれ、「水溶性ビタミン K誘導体」（または、単に「ビタミン K誘導体」）及び「水溶性メナキノン一 7誘導体（または、単に「M K— 7誘導体）」 ) と称する。この際、水溶性メナキノン— 7誘導体は、やはり下記実施例でより詳細に説明する、 S D S—ポリアクリルアミド電気泳動で測定される際に約 1 0万の分子量の単一のバンドを示す点、ゲル瀘過で測定される際には 1 0万以上の分子量を示す点、およびメナキノンー 7の分子量が約 6 4 9である点を考慮することにより、 M K— 7に何らかの物質（例えば、糖タンパク質）が結合して安定化されて水に可溶性のビタミン K誘導体（ビタミ > K ₂誘導体及びメナキノン— 7誘導体を含む；以下、省略）が菌体内で形成されるのではないかと推定される。しかしながら、上記仮説によつて本発明の概念が限定されるものではないことはいうまでもない。本発明において、雲南 SL-001菌の培養は、枯草菌（Bacillus subtili s)を一般的に培養するのと同様の培地及び培養条件が使用され、例えば、本発明による培養に使用される培地は、当業者には公知の成分からなる培地が使用でき特に制限されず、各種培養成分を適宜混合することにより調製してもあるいは市販の培地をそのまま使用してもあるいは市販の培地に上記公知の成分を補助成分として添加した培地を使用してもよい, この際、培地は、固体または液体培地のいずれを使用してもよく使用目的によって適宜選択され、また、使用する微生物が資化しうる炭素源、適量の窒素源、無機塩及びその他の栄養素を含有する培地であれば、合成培地または天然培地のいずれであってもよい。

本発明の雲南 SL-001菌の培養において使用できる炭素源は、雲南 S L-001菌が資化できるものであれば特に制限されない。具体的には、デンプンまたはその組成画分、焙焼デキストリン、加工デンプン、デンプン誘導体、物理処理デンプン、ひ —デンプン、可溶性デンプン、アミ口ース、アミロぺクチン、マルトオリゴ糖、シクロデキストリン、プルラン、トウモロコシデンプン、馬鈴薯デンプン、甘藷デンプン及びデキストリン、グリセリン、ガラクト一ス、ラクト一ス、麦芽汁、グルコース、フルクトース、マンノース、ひ一メチル一 D —グルコシド、エスクリン、サッカロース、トレハロース、ィヌリン及びグリコーゲン等の炭水化物が挙げられる。これらの炭素源のうち、雲南 SL-001菌の生育の観点から、サッカロ一ス、マンノース、エスクリン、グルコース、デンプン、卜レハロース、ィヌリン及びグリコーゲンが好ましく使用される。これらの炭素源は、単独あるいは 2種以上の混合物の形態で使用できる。本発明の雲南 SL-001菌の培養において使用できる窒素源もまた、資化できるものであれば特に制限されない。具体的には、肉エキス、麦芽エキス、ペプトン、大豆由来のポリペプトン（例えば、ポリペプトン一 S ) 、酵母エキス、味液（大豆タンパク酸加水分解物）、大豆粉末、ミルクカゼイン、カザミノ酸、グルタミン酸、アルギニン、ァスパラギン及びプロリン等の各種アミノ酸、コーンスティープリ力一等の有機窒素化合物；ならびにアンモニア、炭酸アンモニゥム、硝酸アンモニゥム、硫酸アンモニゥム及び塩化アンモニゥムなどのアンモニゥム塩、硝酸ナトリウム、硫酸ナトリウムなどのナトリウム塩、尿素及び尿酸等の無機窒素化合物等が挙げられる。これらの窒素源のうち、雲南 SL-001菌の生育を考慮すると、大豆由来のポリペプトン（例えば、ポリペプトン一 S ) 及び大豆粉末が好ましく使用される。これらの窒素源も、単独あるいは 2種以上の混合物の形態で使用できる。

本発明の雲南 SL-001菌の培養に使用できる無機塩もまた、雲南 SL- 001菌が良好に生育できうるものであれば特に制限されないが、具体的には、マグネシウム、マンガン、カルシウム、ナトリウム、カリウム、銅、鉄及び亜鉛などのリン酸塩、塩酸塩、硫酸塩及び酢酸塩等から選ばれた 1種または 2種以上を使用することができる。

さらに、本発明の雲南 SL-001菌の培養用の培地に、ビタミンを含ませてもよい。この際、ビタミンとしては、雲南 SL-001菌が良好に生育できうるものであれば特に制限されないが、具体的には、チアミン、リボフラビン、ビタミン B ₆類、ノントデン酸カルシウム、ニコチン酸ァミド、 p —ァミノ安息香酸及び葉酸などが挙げられる。

また、本発明の雲南 SL-001菌の培養に市販の培地を使用する場合の市販の培地としては、例えば、栄養ブイヨン（nutrient broth) (乾燥ブィヨン）（日水製薬株式会社または日本製薬株式会社製）、ポリぺプトン— S (和光純薬製）などが挙げられる。

または、本発明において、雲南 SL-001菌の培養に使用する培地として、オカラ、大豆、味噌や納豆製造時に副生する大豆煮汁、豆腐ゃ油揚げ製造時に副生する豆腐粕、大豆を原料とした製油時に副生する大豆粕. 味噌製造時の副産物である大豆の種皮など、納豆菌によつて発酵できる材料を使用してもよい。この際、必要であれば、この材料に上記したような炭素源、窒素源及び無機塩を適宜添加してもよい。

本発明において、雲南 SL-001菌の培養は、従来公知の方法と同様にして行われ、その際の培養条件は、培地の組成及び培養法によって適宜選択され、良好に生育できる条件であれば特に制限されない。培養温度は、通常、 2 0〜 4 5 °C、好ましくは 3 7〜 4 2 °Cであり、また、培養に適当な培地の p Hは、通常、 6 . 0〜 9 . 5、好ましくは 7 . 0〜 8 . 5である。

このようにして得られた本発明の雲南 SL-001菌の培養物及び培養液は、雲南 SL-001菌が食品を源とするので、高い安全性を有する。ゆえに、本発明の雲南 SL-001菌の培養物及び培養液をそのまま食品添加物としてあるいは食品として使用できる。

本発明の雲南 SL-001菌は、以下に詳細に述べるように、効率よくビ夕ミン Kまたはその誘導体を産生する能力を有するものであるが、雲南 SL-001菌からのビ夕ミン Kまたはその誘導体の分離 · 精製方法としては、培養条件等によって異なるが、例えば、目的とするビタミン Kまたはその誘導体が培養細胞中に蓄積される場合には、上記培養条件下で培養を行った後、菌体を瀘過あるいは遠心分離等によって集め、例えば、凍結融解処理、超音波処理、加圧処理、浸透圧差処理、磨砕処理等の物理的手段またはリゾチーム等の細胞壁溶解酵素処理若しくは界面活性剤との接触処理等の化学的処理を単独または組み合わせて行うことにより菌体を破砕し、破砕した菌体から目的とするビタミン Kまたはその誘導体を、分別結晶法、分別沈殿法、イオン交換クロマトグラフィー法および溶媒抽出法等の既知の方法を単独若しくは組み合わせて用いて精製する方法が挙げられる。

または、培養菌体をソックスレー抽出することによってビタミン Kまたはその誘導体を回収してもよい。具体的には、上記のようにして培養された菌体をソックスレー抽出器を用いてへキサン、ジェチルェ一テル、アセトン、エタノール及びイソプロパノール等の有機溶媒で使用する有機溶媒の沸点でソックスレー抽出し、脂溶性画分を得る。次に、この画分をへキサン、ジェチルェ一テル、アセトン、エタノール及びイソプロ

) —ル等の有機溶媒で 3 0〜 1 0 0 °Cで 0 . 1 〜 2 0時間、抽出する _c 得られた抽出物を上記と同様の有機溶媒で所定の総容量にまで希釈する _c 希釈された抽出物の一部を水及びイソプロパノールと混和し、さらに夕ツチミキサーを使用するなどにより上記と同様の有機溶媒とさらに混和する。得られた液体混合物を遠心し、上清を乾固した後、残渣をェタノ —ルに溶解することにより、ビ夕ミン Kまたはその誘導体が得られる。さらに、本発明において、雲南 SL-001菌が産生するビタミン K誘導体が水溶性である際には、以下のような操作によって、所望のビタミン κ誘導体が回収できる。簡潔にいうと、上記のようにして培養された雲南 SL-001菌体の培養液またはその培養上清の p Hを、好ましくは p H を 1 〜 3にまで下げて沈殿物を得、この沈殿物を遠心分離などによって分離することによって、水溶性ビタミン K誘導体が分取できる。

このようにして得られた本発明の雲南 SL-001菌の培養物及び培養液から得られたビタミン Kまたはそのビタミン K誘導体もまた、雲南 SL- 001菌が食品を源とし、その培養物及び培養液は安全であるので、高い安全性を有する。ゆえに、本発明の雲南 SL-001菌の培養物及び培養液から得られたビタミン Kまたはそのビタミン K誘導をそのまま食品添加物としてあるいは食品として使用するこもできる。

以下、実施例を参照しながら、本発明をより具体的に説明する。実施例 1

1 0 g (湿重量）のオカラ（旭松食品株式会社製、飯田巿）をシヤーレに入れ、 1 2 0 °Cで約 1 0分間加圧釜で蒸煮（オートクレープ滅菌）した。

別途、スラントに保存された市販の納豆に使用されている 4種の納豆菌株（宮城野菌、朝日菌、成瀬菌及び高橋菌）、薬剤として使用されている 2種の納豆菌株（日東菌及び目黒菌）、ならびに雲南 SL-001菌 ( F E R M B P— 6 7 1 3 ) の合計 7種の納豆菌を、それそれ一白金耳、 9 . 5 m lの滅菌水に懸濁し、菌体懸濁水を調製した。なお、各市販納豆菌の詳細は下記のとおりである。以下、納豆菌は菌名のみを記載する。

く使用した市販納豆菌〉

宮城野菌（有限会社宮城野納豆製造所製、仙台）

曰東菌（株式会社日東薬品工業製、京都）

目黒菌（株式会社目黒研究所製、大阪）

朝日菌（株式会社朝日工業製、東京）

成瀬菌（株式会社成瀬醜酵化学研究所製、東京）

高橋菌（高橋祐蔵研究所製、山形）

次に、上記滅菌済みのオカラに、上記で調製された菌体懸濁液 0 . 5 m lを各々植菌した後、 3 7 °Cで 4 日間、インキュベーションした。このようにして得られた各種納豆菌のオカラ培養物に、 4倍量の蒸留水またはイソプロパノールを、それぞれ、加えた。この混合液を、 2 0。( で、 3， O O O r p mで 1 0分間、遠心分離し、得られた上清 0. 5 m lを抽出試料とした。次に、抽出溶媒として蒸留水を用いた抽出試料には、蒸留水 0. 5 m 1及びイソプロパノール 1. 5 m lを混和した, また、抽出溶媒としてイソプロパノールを用いた抽出試料には、蒸留水 1. 0 m 1及びイソプロパノール 1 . 0 m 1を混和した。続いて、このようにして得られた混合液に、それぞれ、へキサンを 5. O m lずつ添カロ · 撹拌した後、 2 0°Cで 3， 0 0 0 r p mで 1 0分間、遠心分離した < 続いて、得られたへキサン層 4. 0 m 1をエバポレー夕一で濃縮 · 乾固し、 1 0 0〃 1のエタノールで溶解した。このようにして蒸留水またはイソプロパノールを抽出溶剤として使用した試料を、それぞれ、水抽出試料及びイソプロパノール抽出試料とした。このようにして調製された水抽出試料及びィソプロパノール抽出試料を用いて下記 H P L C条件によって MK— 7含量を測定した。結果を第 2図に示す。第 2図から示されるように、本発明の雲南 SL-001菌は、水抽出試料及びイソプロパノール抽出試料双方とも他の市販納豆菌に比べて、高い MK— 7量を示し、特に水抽出試料で有意な MK— 7量の差が認められた。

なお、本実施例において、高速液体クロマトグラフィー（H P L C ) による MK— 7量の測定は、ビタミン Kが白金—アルミナ触媒でハイドロキノン体に還元され、蛍光物質になることを利用するものであり、具体的には、以下の条件で測定した。

装置ポンプ： P U— 9 8 0 (日本分光製）

インジェク夕： 7 1 2 5 (日本分光製）

カラムオーブン： C 0— 9 6 5 (日本分光製）

検出器：蛍光検出器 8 2 1 — F P (日本分光製）データ処理装置： C一 R 5 A (島津製作所製）条件カラム ◦ D S— I I カラム（ 4. 6 x 2 5 0 mm)

(島津製作所製）

7S兀カフム白金一アルミナ触媒カラム（和光純薬製、一級白金—アルミナ、 P t = 5 %を約 0. 2 g 充填する； 4. 0 0 x 1 0 mm)

移動相 9 7 %エタノール（流速； 0. 7 m l /分）分離 · 還元温度 4 0 °C

測定波長励起 3 2 0 n m

蛍光 4 3 0 nm

注入量 1 μ.1

このような測定方法によって、 ΜΚ— 7、メナキノンー 4及びビ夕ミン iについて検量線を作成したところ、 MK— 7の量は、 0. 0 5〜

5 0 n gの範囲で式 [― 0. 8 9 6 6 1 + 1 . 6 9 9 3 x 1 0一 6 X

(ビタミン Kに相当する H P L Cの面積（〃 V , s e c ) ) ] によってならびにメナキノン一 4及びビタミンの量は、 0. 0 1〜 1 0 n g の範囲で、それぞれ、式 [― 0. 5 8 6 5 7 + 4. 8 0 3 0 X 1 0—⁹ X (ビタミン Kに相当する H P L Cの面積（〃 V, s e c ) ) ] 及び式

[— 0. 4 4 3 8 1 + 4. 0 6 2 6 x 1 0一 ⁷ x (ビタミン Kに相当する H P L Cの面積（〃V， s e c ) ) ] によって、測定が可能であつた, また、検量線を作成する際の MK— 7の標準品は、以下によって調製した。すなわち、 6 0 0 gの納豆に、 7 5 %イソプロパノール 1 リットル及び n—へキサン 1 リットルを加え、 1時間、ゆっくりと撹拌、静置した。分離した 2層のうち上層を取り、無水硫酸ナトリゥムで乾燥、蒸発乾固することにより、抽出物約 2 0 gを得た。これを 1 0 m lの n— へキサンと混合し、 4 0 0 m lのクロマトグラフィ一用シリカゲルに通して吸着させ、 2 リットルの n—へキサン/トルエン（ 1 ： 1 ) で溶出 ■ 分画した。 M K— 7を含む画分を減圧下で蒸発乾固し、得られたシリ力ゲル濃縮物を 5 m 1の n —へキサンで溶解し、上記と同様にして、再度シリカゲルカラムで分画し、減圧下で蒸発乾固して約 3 5 0 m gを得た。このうち 5 O m gを少量のアセトンに溶解し、ァセトニ卜リル/ メタノール（ 1 ： 1 ) で充填した 6 0 m lのクロマトグラフィー用 O D S —シリカゲルに通液し、ァセトニトリル/メタノール（ 1 ： 1 ) で展開した。溶出液を H P L Cでモニタリングしながら、 M K— 7 と考えられる物質が単独で溶出している画分を分取し、減圧乾固した。得ちれた物質について、赤外吸収スペクトラム及びマススペクトラムを得て、 M K 一 7であることを確認した。なお、この物質の純度を検定したところ、 9 9 . 8 %であった。また、フイロキノン（ビタミンば及びメナキノン一 4 ( M K - 4 ) の標準品としては、それぞれ、シグマ社（Sigma) 製の特級品を用いた。測定は、 3回抽出して分析した平均値により求めた。

実施例 2

雲南 SL-001菌の水抽出試料を、実施例 1 と同様にして調製し、標準フイブリン平板法に従って、血栓の溶解性を評価した。簡潔にいうと、この水抽出試料 3 0 〃 1 を、シャーレ内で作製した人工血栓（標準フィブリン平板） (H. Sumi et al., Experientia, 43: 1110- 111, 1987)上にのせ、 3 7 °Cで 1時間インキュベーションしたところ、血栓の溶解が観察された。この結果から、雲南 SL-001菌の水抽出試料はナットゥキナーゼ（N K ) による血栓溶解活性があることが確認された。

実施例 3

雲南 SL-001菌の水抽出試料を、実施例 1 と同様にして調製し、合成基質分解法に従って、プラスミンの基質の分解性を評価した。具体的には、この水抽出試料 1 0〃 1及び 5 X 1 0 ³ Mの S — 2 2 5 1 (ブラスミンの基質； H - D— V a l — L e u - L y s — p N A) 2 を 0. 1 M トリス緩衝液（ p H 7. 4 ) 1 7 0〃 1に添加し、これを 3 7 で 1時間インキュベーションしたところ、 4 0 5 nmでの吸光度 (A₄。 ₅) が 0. 1 6 8であり、 S— 2 2 5 1の分解が観察された。この結果からも、雲南 SL-001菌の水抽出試料にはナツトウキナーゼ（N K ) による血栓溶解活性があることが確認された。

実施例 4

1 0 g (湿重量）のオカラ（旭松食品株式会社製、飯田巿）をシヤーレに入れ、 1 2 0 °Cで約 1 0分間加圧釜で蒸煮（ォートクレーブ滅菌）した。

別途、スラントに保存された市販の納豆菌株である宮城野菌および雲南 SL-001菌（ F E RM B P— 6 7 1 3 ) 一白金耳を、それぞれ、スラントから 9. 5 m lの滅菌水に懸濁し、この菌体懸濁水 0. 5 m lを. 上記滅菌済みのオカラに各々植菌した後、 3 7 °Cで 1 0 日間、インキュベーシヨンした。

培養期間中、納豆菌によるオカラ培養物を経時的（ 1 , 2 , 4 , 6 ， 8及び 1 0 日目）に抜き取り、この培養物から、実施例 1 と同様にして、イソプロパノール抽出試料をそれそれ調製し、さらに、このイソプロパノール抽出試料中の MK— 7含量を実施例 1 と同様にして測定した。結果を第 3図に示す。

第 3図から示されるように、本発明の雲南 SL-001菌の培養物は、一般的な市販の納豆菌株である宮城野菌に比して、すべての培養時間で有意に高い MK— 7量を示す上、よい短い時間で MK— 7量のピークが観察されることから、本発明の雲南 SL-001菌は迅速にかつ効率よくビタミン Kの一種である MK— 7を産生できることが示され、大量生産に非常に適していることが分かった。実施例 5

オカラ（旭松食品株式会社、飯田巿）を— 2 5 °Cで凍結保存し、必要時に解凍して使用した。解凍したオカラを、 1 2 0 Cで 3 0分間、ォートクレーブで滅菌した後、約 1 2 O m l容のポリスチレンペーパー（P S P ) 容器に入れ、これを納豆菌の培地とした。

別途、市販の納豆に使用されている 4種の納豆菌株（高橋菌、成瀬菌、宮城野菌及び朝日菌）、薬剤として使用されている 2種の納豆菌株（日東菌及び目黒菌）、ならびに雲南 SL-001菌の合計 7種の納豆菌を、それそれ、 5 0 O m l容の三角フラスコ内で 1 5 O m lの 3 %栄養ブイョン（nutrient broth) (乾燥ブイヨン）（日水製薬株式会社製）培地中で 3 7°Cで 3 日間、振盪培養（ l O O r p m) することによって、上記 Ί 種の納豆菌の前培養液を調製した。

上記で調製されたオカラ（湿重量 5 0 g) に、これら計 7種の納豆菌の前培養液（生菌数： 2 x 1 0⁸個/ m l ) 0. 5 m lを、それぞれ、添加し、 3 7 °Cで、静置して発酵し続けた。発酵し始めてから 4曰目、納豆菌を水中に懸濁し、これを金属製の茶漉しで濾過した後、遠心分離 ( 3， O O O r p m x l O分）することによって、各菌体の培養物を調製し、この培養物から実施例 1 と同様にして水抽出試料を調製し、該試料における MK— 7誘導体の量を実施例 1に記載の方法に従って測定した。その結果を第 4図に示す。

第 4図から示されるように、 4日間培養した後の各種納豆菌の培養物における MK— 7誘導体の生産量が、平均で、雲南 SL-OOl菌で 3 6. 6〃 g/gオカラ湿重量；宫城野菌で 1. 9〃 g/gオカラ湿重量；成瀬菌で 1 4. 2〃 g/gオカラ湿重量；高橋菌で 6. 8 ju g/gオカラ湿重量；朝日菌で 1 1. 9〃 g/gオカラ湿重量；目黒菌で 1. 9〃 g /gオカラ湿重量；および日東菌で 5. 2〃 g/gオカラ湿重量であり、特に、本発明の雲南 SL-001菌は、 3 6. 6 g/ gオカラ湿重量という高い MK— 7生産量を示し、この値は、計算上、他の納豆菌の生産量に比べて 2〜 2 0倍という高い値であり、また、従来報告（山口迪夫監修、日本食品成分表、医歯薬出版、東京、 1 9 9 7年、 pp.52-53；坂野俊行ら、ビタミン、 6 2、 393-398(1988)； H. Ikeda and Y. Doi， Eur. J. Biochem., 192， 219-223 (1990)；および池田ひろ、家政誌、 4 3、 643-648(1992)) されている納豆の分析値（ 6. 2〜 8. ォカラ湿重量）の 4倍以上という高いものであった。

実施例 6

オカラは、旭松食品株式会社（飯田巿）より提供されたものを、一 2 5。( で凍結保存し、必要時に解凍して使用した。

別途、本発明の雲南 SL-001菌を、 5 0 0 m l容の三角フラスコ内で 1 5 0 m 1の 3 %栄養ブイョン（nutrient broth) (乾燥ブイヨン）（日水製薬株式会社製）培地中で 3 7°Cで 3日間、振盪培養（ 1 0 0 r p m) することによって、納豆菌の前培養液を調製した。

解凍したオカラ 1 k g (湿重量）を、 1 2 0 °Cで 3 ◦分間、オートクレーブで滅菌した後、約 1 2 0 m l容量のポリスチレンペーパー（P S P ) 容器に入れた。この容器に、上記で調製された雲南 SL-001菌の前培養液を添加し、 3 7 °Cで 4日間、発酵させた。このようにして発酵させたオカラ納豆 1 k g (湿重量）に対して、 5 リットルの水を加え、室温で 1時間撹拌し、遠心分離（ 3 , 0 0 0 r p m、 1 0分間）した。得られた上清に対して、 6 2 0 gのイオン交換樹脂（DEAE-Sepharose CL-613) を加え、撹拌した後、室温で 3 0分間、静置した。次に、これをガラスカラム（ 7. 5 c m 0 x l O O c m) に充填し、蒸留水及び 0. 0 5 Mリン酸緩衝液（ p H 7. 0 ) で洗浄した後、 0. 1〜 0. 8 M N a C lを含む 0. 0 5 Mリン酸緩衝液（ p H 7. 0 ) でグラジェント溶出した。各画分について、実施例 1 と同様の H P L C法によってビタミン K量を測定し、ビタミン Kを含む画分をメンブランフィルタ一 (Millipore製、分子量 1 0， 0 0 0 ) で濃縮し、蒸留水で透析した後、凍結乾燥し、薄黄色粉末として水溶性ビタミン K誘導体を得た。

このようにして得られた水溶性ビタミン K誘導体及び上記と同じ才力ラをイソプロパノールで抽出したものを、 H P L Cによって分析し、その結果を第 5図に示す。なお、第 5図において、 MK— 4、ビタミン ,及び M K— 7の保持時間は、それそれ、約 8. 2分、約 1 1. 3分及び約 1 7. 5分であり、矢印は MK— 7の保持時間を示す。第 8図から、オカラのイソプロパノ一ル抽出物の 6 0 %以上が水溶性分画に抽出され、また、ビタミン Kとしては、ビタミン Kい MK— 4の量は少なく、常に 9 5 %以上が MK— 7で占められることが分かった。

また、この水溶性ビタミン K誘導体について、 S D S—ポリアクリルァミドゲル電気泳動による分析を行ったところ、分子量約 1 0万の位置に幅広いながら単一のバンドを示した。この結果から、水溶性ビタミン誘¾体は他の糖夕ンパク質と分子量約 1 0万の複合体を形成しているのではないかと考察される。また、この際の納豆 1 k gからの水溶性ビ夕ミン K誘導体の収率は、 3回の操作による平均で、約 5. 3 g ( 8 3 0 U g 水溶性 MK— 7誘導体/ gを含む）であった。

実施例 7

5 0 0 m 1容の三角フラスコ 5本に、それぞれ、 3 0 0 m lの 3 %乾燥ブイョン（日水製薬株式会社製）培地を入れ、 1 2 0 °Cで 1 5分間ォ一トクレーブ滅菌した。これらの培地に、雲南 SL-001菌を一白金耳ずつ接種し、 3 7 °Cで振盪培養（ 1 0 0 r p m) した。 4日後、培養液を合わせたものを遠心分離（ 5 , O O O r p m x l O分）し、得られた上清を 4 0 0 m lずつ 3つに分けて、各上清の p Hを希塩酸で 1. 0 2、 2. 0 7及び 3. 0 1に調節した。室温で 3時間放置した後、上清を遠心分離（ 5 , O O O r p mx l O分、 1 0 °C) し、白色の沈殿を分離した。この白色沈殿物を少量の蒸留水に溶かして、重炭酸アンモニゥム粉末で p Hを 7. 0に調節した後、凍結乾燥した。この結果、凍結乾燥物の重量は、 1. 0 2、 2. 0 7及び 3. 0 1の p Hの場合、それぞれ、 0. 5 2 g、 0. 2 8 g及び 0. 3 1 gであった。このような操作を繰り返した。

次に、この凍結乾燥物 1 g (乾燥重量）を、 1 0 O m lへキサンでソックスレ一抽出器（SIBATA SPC 34， WATER BATH SIBATA WB-6C, 濾紙： ADVANTEC 84 24 x 100mm) で 8 0 °Cで 6時間抽出した後、全液量をへキサンにより 1 0 0 m lに調節した。この抽出物 1 0 0〃 1を 1. O m l の蒸留水及び 1. 5 m 1のイソプロパノールと混和し、さらに 4. 9 m 1のへキサンを夕ツチミキサーで約 1 0秒間混和した。この混合液を遠心分離（ 3 , O O O r p mx l O分、 2 0。C) した。得られたへキサン層 4. 0 m 1をエバポレーターで濃縮 ' 乾固した後、これを 1 0 0〃 1 のエタノールに溶解した。このようにして調製された試料について、実施例 1 と同様の H P L C法によって、 MK— 7含量、PL g/g乾燥物）を測定したところ、 1 . 0 2、 2. 0 7及び 3. 0 1の p Hの場合、それそれ、 2， 8 0 0〃 g/g乾燥物、 2， 2 0 0 g/ g乾燥物及び 2， 0 0 0 g/g乾燥物であった。

さらに、各凍結乾燥物 1 5 m gを蒸留水 5 m 1に添加した溶液を遠心分離（ 1 0， O O O r pmx l 0分）した。得られた上清（水溶性分画）について、同様にして MK— 7誘導体の含量を調べたところ、 1 . 0 2、 2. 0 7及び 3. 0 1の 11の場合、それぞれ、 1， 5 0 0〃 g /g乾燥物、 1 , 8 0 0〃 g/g乾燥物及び 1， 8 0 0〃 g/g乾燥物であったから、各水溶性分画の可溶化率は、約 5 4 %、約 8 2 %及び約 9 ◦ %であることことが分かつた。

産業上の利用可能性

本発明の雲南 SL-001菌はビタミン Kまたはその誘導体を効率良く産生できる。

また、本発明の雲南 SL-001菌は食品から単離したものであり、高い安全性を有するため、本発明の雲南 SL-001菌の培養物及び培養液をそのまま食品添加物としてあるいは食品として使用できる。

さらに、本発明の雲南 SL-001菌の培養物及び培養液から得られたビ夕ミン Kまたはそのビタミン K誘導体もまた、雲南 SL-001菌が食品を源とし、その培養物及び培養液は安全であるので、高い安全性を有するゆえに、本発明の雲南 SL-001菌の培養物及び培養液から得られたビタミン Kまたはそのビ夕ミン K誘をそのまま食品添加物としてあるいは食品として使用するこもできる。上記利点に加えて、本発明の雲南 SL- 001菌は、脂溶性のビタミン Kに加えて、水溶性のビタミン K誘導体をも高い収率で産生するため、より広範な用途が期待できる。

Claims

請求の範囲

1. 枯草菌（Bacillus subtilis)に属する雲南 SL-001菌 F E RM B P - 6 7 1 3。