JP2001000175A - 枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ）の培養方法、該方法によって培養される微生物の培養物、該培養物由来の水溶性ビタミンＫ誘導体ならびに該微生物の培養物またはビタミンＫ誘導体を含む食品、飲料または飼料 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 ビタミンＫ誘導体を最も多量に枯草菌(Bacil
lus subtilis)の菌体内に貯蔵するようにこの微生物を
培養する方法を提供する。 【解決手段】 枯草菌(Bacillus subtilis)を培養し、
該微生物の菌体内で産生されたビタミンＫが菌体外に放
出される前に該微生物菌体を回収することからなる枯草
菌(Bacillus subtilis)の培養方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、枯草菌(Bacillus
subtilis)の培養方法、当該方法によって培養される微
生物の培養物、該培養物由来の水溶性ビタミンＫ誘導体
ならびに該微生物の培養物または水溶性ビタミンＫ誘導
体を含む食品、飲料または飼料に関するものである。よ
り詳しくは、本発明は、ビタミンＫ誘導体、特にメナキ
ノン−７（ビタミンＫ₂）誘導体を最も多量に枯草菌(Ba
cillus subtilis)の菌体内に貯蔵するように枯草菌(Bac
illus subtilis)を培養する方法、このような方法によ
って培養された菌体内に多量のビタミンＫ誘導体、特に
メナキノン−７（ビタミンＫ ₂）誘導体を蓄積する枯草
菌(Bacillus subtilis)の培養物、このような培養物由
来の水溶性ビタミンＫ誘導体、特に水溶性メナキノン−
７（ビタミンＫ₂）誘導体、ならびに上記培養物または
水溶性ビタミンＫ誘導体、特に水溶性メナキノン−７
（ビタミンＫ₂）誘導体を含む食品、飲料または飼料に
関するものである。

【０００２】

【従来の技術】ビタミンＫは、従来、血液が凝固する際
に必要な因子として知られており、このビタミンの欠乏
は血液凝固能の低下をもたらすので抗出血性ビタミンと
も呼ばれる脂溶性ビタミンの一種である。このビタミン
Ｋの欠乏が血液凝固能の低下をもたらす原因としては、
近年、プロトロンビンを含む数種の血液凝固因子の生合
成にビタミンＫが不可欠であることが示唆された。しか
しながら、血液凝固能の低下を防止するために必要とさ
れるビタミンＫの量はμｇオーダーと極めて微量であ
り、一般的には、成人では腸内細菌から供給されるの
で、ビタミンＫ欠乏症になることはまれであり、また、
ビタミンＫ欠乏性出血症の治療には合成ビタミンＫ₁や
Ｋ₂が医薬品として用いられ、これまではこの予防を目
的として天然ビタミンＫ₁濃縮物が食品として利用され
ているため、ビタミンＫはこれまであまり注目されるこ
とはなかった。

【０００３】しかしながら、近年、ビタミンＫには骨形
成促進作用及び骨吸収抑制作用があり、ビタミンＫの投
与で骨密度が増加することが明らかにされた。一方、骨
粗鬆症は、老化や疾病などの原因によって起こる、骨が
もろくなる病態で、骨折したり、激しい痛みなどを伴
い、老人医療の面から大きな社会問題となりつつある病
気であり、骨粗鬆症患者におけるビタミンＫの血中濃度
を調べてみると健常人に比べて約１／２と少ないことが
報告された。このため、合成ビタミンＫが骨粗鬆症用治
療薬として臨床試験が行われているが、出血症の治療・
予防の場合と異なり、骨粗鬆症の治療・予防では、一日
に４５ｍｇ以上という多量のビタミンＫの投与で骨量を
増す改善効果があることが臨床試験により証明されてい
る。また、骨粗鬆症は発病してからの治療より予防が重
要であり、このためには食品から日常的にビタミンＫを
摂取することが望まれるが、健常者の場合、一日にどの
くらいのビタミンＫを摂取すれば骨量が増し、骨粗鬆症
の予防に役立つかは明らかではない上、既存の食品で上
記したような量を摂取することは難しいと思われる。

【０００４】上述したように、ビタミンＫの摂取は日常
の食品を通じて行われるのが望ましく、実際、ビタミン
Ｋ₁は緑黄色野菜や海草類などから、ビタミンＫ₂は納豆
などの発酵食品から摂取することができる。しかしなが
ら、市販の食品から骨粗鬆症の改善に有効な量であると
の報告のある４５ｍｇのビタミンＫを摂取しようとする
場合、例えば、ビタミンＫを１ｐｐｍ含有する食品で
は、一日に４５ｋｇという多量の食品を食する必要があ
るが、このようなことは実際には非常に困難である。ま
た、食品のうちでビタミンＫの含量が十数ｐｐｍと最も
多いのは納豆であるが、たとえ、このような納豆を食し
ても一日に数百ｇから数ｋｇの量を食さなくてはなら
ず、嗜好上、これだけの量を毎日食することは困難であ
る上、摂取されたビタミンＫの半減期は短く、単発で経
口摂取したのでは効果が不十分であったり、また逆に一
時に大量摂取すると副作用の問題も残されていた。この
ため、ビタミンＫが濃縮されたものを摂取することが望
ましいが、出血症予防のために調製粉乳に添加している
市販の天然ビタミンＫ濃縮物は高価であり、医薬品の合
成ビタミンＫは食品に使用できないという問題があっ
た。

【０００５】ところで、ビタミンＫ類の中で、自然界に
存在するのはビタミンＫ₁およびビタミンＫ₂群のみであ
る。ビタミンＫ₁は、食品中では、特に緑色野菜、植物
油、海藻等に多く含まれており、例えば、海藻・海苔・
茶葉などに数十ｐｐｍ、大豆油、ほうれん草やブロッコ
リーなどに数ｐｐｍ含まれており、また２−メチル−
１，４−ナフトキノンとフィチルアセテートを縮合する
ことよって合成される。また、ビタミンＫ₂群は、側鎖
長の違いによりメナキノン−１〜１４（ＭＫ−１〜１
４）の同族体が知られている。これらのうち、特にメナ
キノン−７（本明細書では、単に「ＭＫ−７」ともい
う）は、ビタミンＫ₂の代表的な物質であり、主に納豆
菌によって合成されるが、自然界では納豆でも数〜十数
ｐｐｍと比較的微量にしか存在しない上半減期が短いた
め、単離が非常に困難であり、これまで、ＭＫ−７高含
量の脂質を調製した例は、特開平８−７３３９６号公報
一例くらいしか知られていない。

【０００６】このため、ビタミンＫ₂を納豆菌等の微生
物を用いて大量に生産することが試みられ、天然ビタミ
ンＫ₂を得る方法としては多くの研究が知られており、
例えば、フラボバクテリウム属に属する微生物の培養液
からビタミンＫ₂を採取する方法（特公平７−２８７４
８号及び特公平７−５１０７０号公報）、大豆煮汁や豆
腐粕等に納豆菌を接種して発酵させることによりビタミ
ンＫを生産する方法（特開平１０−２９５３９３号、特
開平８−１９３７８号、特開平８−９９１６号及び特開
平８−１７３０７８号公報）が挙げられる。これらの方
法に加えて、納豆菌の発酵物をアルコール、エーテル、
エステルやケトン等の有機溶媒による溶媒抽出などを行
うことによって天然ビタミンＫ₂、特に天然ＭＫ−７を
多量に含む濃縮脂質を得る方法（特開平８−７３３９６
号公報）が提案されている。しかしながら、フラボバク
テリウムなどのビタミンＫ生産菌を使用する方法は、フ
ラボバクテリウムが食品としての安全性が証明されてい
ないので、直ちに食品に供することはできないという問
題がある。また、納豆菌を用いてビタミンＫを調製する
方法では、確かに最大約４０ｍｇ／リットル培養液とい
う比較的ビタミンＫ含有量の高い培養物が得られたもの
の、ここで産生するのは水溶性ではなく脂溶性のビタミ
ンＫであるため、その使用できる用途は非常に限定され
たものとなる。さらに、納豆菌の発酵物を有機溶媒で抽
出することによって調製される天然メナキノン−７高含
量脂質は、大豆等の食用に供することができるものを原
料として調製されてはいるものの、有機溶媒を使用する
ため食品に使用する際にはこの有機溶媒を完全に除去し
なければならずこのための設備や時間がさらに必要とな
る上、上記と同様、得られるＭＫ−７高含量脂質はその
名称からも明らかなように脂溶性であるためその使用で
きる用途が限定される。

【０００７】上述したように、納豆、納豆の製造過程で
発生する粕、煮汁等の副産物の発酵物から納豆菌等の微
生物を用いてビタミンＫやＭＫ−７を生産する（即ち、
菌体外からビタミンＫやＭＫ−７を取り出す）方法は多
数報告されてきたが、納豆菌をはじめとする枯草菌(Bac
illus subtilis)の菌体内に貯蔵されたビタミンＫやＭ
Ｋ−７に関する報告は従来ほとんどなかった。

【０００８】

【発明が解決しようとする課題】したがって、本発明の
目的は、ビタミンＫ誘導体、特にメナキノン−７（ビタ
ミンＫ₂）誘導体を最も多量に枯草菌(Bacillus subtili
s)の菌体内に貯蔵するようにこの微生物を培養する方
法、このような方法によって培養された菌体内に多量の
ビタミンＫ誘導体、特にメナキノン−７（ビタミン
Ｋ₂）誘導体を蓄積する枯草菌(Bacillus subtilis)の培
養物、このような培養物由来の水溶性ビタミンＫ誘導
体、特に水溶性メナキノン−７（ビタミンＫ₂）誘導
体、ならびに上記培養物または水溶性ビタミンＫ誘導
体、特に水溶性メナキノン−７（ビタミンＫ₂）誘導体
を含む食品を提供するものである。

【０００９】本発明の他の目的は、通常の食品からは充
分な量の摂取ができないまたは摂取困難な天然ビタミン
Ｋ、特に天然ＭＫ−７を簡単に日常的摂取することを可
能にすることを目的として、ビタミンＫ誘導体、特にメ
ナキノン−７（ビタミンＫ₂）誘導体を最も多量に枯草
菌(Bacillus subtilis)の菌体内に貯蔵するようにこの
微生物を培養する方法、このような方法によって培養さ
れた菌体内に多量のビタミンＫ誘導体、特にメナキノン
−７（ビタミンＫ₂）誘導体を蓄積する枯草菌(Bacillus
subtilis)の培養物、このような培養物由来の水溶性ビ
タミンＫ誘導体、特に水溶性メナキノン−７（ビタミン
Ｋ₂）誘導体、ならびに上記培養物または水溶性ビタミ
ンＫ誘導体、特に水溶性メナキノン−７（ビタミン
Ｋ₂）誘導体を含む食品を提供するものである。

【００１０】本発明のさらなる他の目的は、通常の食品
からは充分な量の摂取ができないまたは摂取困難な天然
ビタミンＫ、特に天然ＭＫ−７を簡単に日常的に摂取す
ることを可能にすることを目的として、ビタミンＫ誘導
体、特にメナキノン−７（ビタミンＫ₂）誘導体を最も
多量に枯草菌(Bacillus subtilis)の菌体内に貯蔵する
ようにこの微生物を培養する方法、このような方法によ
って培養されかつ長時間血中濃度を必要な濃度に高めた
ままそれを維持する効果を有しかつ安全性にも優れたビ
タミンＫ誘導体、特にメナキノン−７（ビタミンＫ₂）
誘導体を多量に菌体内に蓄積する枯草菌(Bacillus subt
ilis)の培養物、長時間血中濃度を必要な濃度に高めた
ままそれを維持する効果を有しかつ安全性にも優れた上
記培養物由来の水溶性ビタミンＫ誘導体、特に水溶性メ
ナキノン−７（ビタミンＫ₂）誘導体、ならびに上記培
養物または水溶性ビタミンＫ誘導体、特に水溶性メナキ
ノン−７（ビタミンＫ₂）誘導体を含む食品を提供する
ものである。

【００１１】

【課題を解決するための手段】本発明者は、上記事情を
鑑みて、納豆の成分（Experientia, 43:1110, 1987；Ac
ta Haematol., 84: 139, 1990；Fibrinolysis, 6: 86,
1992；日本薬剤師会誌、30: 73, 1994；バイオインダス
トリー、14: 47, 1996）、あるいは納豆菌中及び血中ビ
タミンＫの分析（日本血栓止血誌、8: 287, 1997；Fibr
inolysis & Proteolysis, Vol.12, Supplement 1, 205,
p.75, 1998）について鋭意研究を行ってきた結果、納
豆等の納豆菌の発酵物やそれに含まれるビタミンＫの摂
取ではなく、生きた枯草菌そのものの摂取によって高い
血漿中のビタミンＫ、特にＭＫ−７濃度の亢進効果が認
められること、及び特に納豆菌の場合は他に比べて極め
て高い血漿中濃度の持続効果を発揮することを見い出し
た。

【００１２】また、本発明者は、特定の成長段階まで培
養した納豆菌は菌体内に多量のＭＫ−７を蓄積してお
り、この段階で回収された納豆菌またはその培養物その
ものを摂取することによって高い血漿中のビタミンＫ、
特にＭＫ−７濃度が認められかつこのようにして摂取さ
れた際の血漿中のビタミンＫ濃度は長持間持続すること
をも発見した。上記知見に加えて、本発明者は、上記段
階で回収された納豆菌の菌体内に蓄積されたビタミン
Ｋ、特にＭＫ−７は水溶性であることをも発見し、この
ような水溶性のビタミンＫ、特にＭＫ−７を用いること
により、その用途は非常に広がるであろうと期待した。

【００１３】上記知見に基づいて、本発明を完成するに
至った。

【００１４】すなわち、上記諸目的は、以下の（ア）〜
（サ）によって達成される。

【００１５】（ア）枯草菌(Bacillus subtilis)を培養
し、該微生物の菌体内で産生されたビタミンＫが菌体外
に放出される前に該微生物菌体を回収することからなる
枯草菌(Bacillus subtilis)の培養方法。

【００１６】（イ）前記微生物菌体は菌体数が対数期か
ら定常期に入る時期に回収される、前記（ア）に記載の
培養方法。

【００１７】（ウ）前記枯草菌(Bacillus subtilis)は
納豆菌(Bacillus subtilis natto)である、前記（ア）
または（イ）に記載の培養方法。

【００１８】（エ）前記微生物菌体は菌体数が対数期か
ら定常期に入る時期でかつナットウキナーゼが産生され
る前に回収される、前記（ウ）に記載の培養方法。

【００１９】（オ）前記（ア）〜（エ）のいずれかに記
載される培養方法によって培養された枯草菌(Bacillus
subtilis)の培養物。

【００２０】（カ）前記（オ）に記載される枯草菌(Bac
illus subtilis)の培養物由来の水溶性ビタミンＫ誘導
体。

【００２１】（キ）前記ビタミンＫ誘導体はビタミンＫ
₂誘導体である、前記（カ）に記載のビタミンＫ誘導
体。

【００２２】（ク）前記ビタミンＫ₂誘導体はメナキノ
ン−７誘導体である、前記（キ）に記載のビタミンＫ誘
導体。

【００２３】（ケ）前記（オ）に記載の培養物および／
または前記（カ）〜（ク）のいずれかに記載の水溶性ビ
タミンＫ誘導体を含む食品、飲料または飼料。

【００２４】（コ）枯草菌(Bacillus subtilis)の培養
菌体をソックスレー抽出することからなるビタミンＫの
抽出方法。

【００２５】（サ）枯草菌(Bacillus subtilis)の培養
液を酸性化し、沈殿物を得ることからなる水溶性ビタミ
ンＫ誘導体の分取方法。

【００２６】

【発明の実施の形態】本発明を以下に詳細に説明する。

【００２７】本発明の第一の概念によると、枯草菌(Bac
illus subtilis)を培養し、該微生物の菌体内で産生さ
れたビタミンＫが菌体外に放出される前に該微生物菌体
を回収することからなる枯草菌(Bacillus subtilis)の
培養方法が提供される。

【００２８】本発明に使用される枯草菌(Bacillus subt
ilis)は、枯草菌(Bacillus subtilis)に属しかつビタミ
ンＫを産生するものであれば特に制限されず、公知の枯
草菌(Bacillus subtilis)が使用できる。特に、安全性
及びビタミンＫの産生量などを考慮すると、納豆菌(Bac
illus subtilis natto)が本発明において好ましく使用
される。本発明において特に好ましく使用される納豆菌
(Bacillus subtilis natto)としては、特に制限され
ず、高橋菌（高橋祐蔵研究所製、山形）、成瀬菌（株式
会社成瀬醗酵化学研究所製、東京）、宮城野菌（有限会
社宮城野納豆製造所製、仙台）、朝日菌（株式会社朝日
工業製、東京）、日東菌（株式会社日東薬品工業製、京
都）、目黒菌（株式会社目黒研究所製、大阪）等の市販
の納豆菌(Bacillus subtilis natto)；及び雲南SL-001
菌が挙げられる。これらのうち、菌体内に蓄積されるビ
タミンＫ誘導体の産生量を考慮すると、目黒菌、宮城野
菌、高橋菌、成瀬菌、朝日菌、日東菌及び雲南SL-001菌
の順（この順序でビタミンＫ誘導体の産生量が高い）で
好ましく使用される。なお、雲南SL-001菌は、平成１１
年５月７日付で通商産業省工業技術院生命工学工業技術
研究所に、受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−６７１３号で国際
寄託された。

【００２９】本発明において、枯草菌(Bacillus subtil
is)を菌体内で産生されたビタミンＫが菌体外に放出さ
れる前に培養を終了して回収することを必須とし、枯草
菌(Bacillus subtilis)の培養（例えば、培地や培養条
件）などについては、枯草菌(Bacillus subtilis)を一
般的に培養するのと同様の培地及び培養条件が使用でき
る。これにより、ビタミンＫは、菌体外にはほとんど放
出されずに微生物菌体中に選択的にかつ多量に蓄積され
るため、このような特定の状態の菌体を回収するという
簡単な操作によって、ビタミンＫを多量に含む菌体が得
られ、このようにして回収された菌体は、特に納豆菌な
ど安全性が確認されている菌である場合には、菌体から
ビタミンＫを抽出するという操作を介さずとも、そのま
ま菌体を食するあるいはこのような菌体の培養物を一般
的な食品に含ませることも可能である。

【００３０】本発明において、枯草菌(Bacillus subtil
is)菌体の回収時期は、上述したように、菌体内で産生
されたビタミンＫが菌体外に放出される前でなければな
らないが、好ましくは前記微生物の菌体数が対数期から
定常期に入る時期である。また、特に枯草菌(Bacillus
subtilis)が納豆菌(Bacillus subtilis natto)である際
には、対数期から定常期に入る時期でかつナットウキナ
ーゼが産生される前に菌体を回収することが好ましい。
より具体的には、培養時間は培養温度及びｐＨや菌体の
初期濃度等の培養条件および培養方法によって異なるも
のの、例えば、５００ｍｌ容量の三角フラスコを用いて
３００ｍｌの培養液（組成：１．５％ポリペプトン−
Ｓ、１％グルコース、０．１％酵母エキス、ｐＨ７．
２）中に雲南SL-001株を、５×１０⁶個／ｍｌの初期濃
度で接種して３７℃で振盪培養（１００ｒｐｍ）を行っ
た場合、０．５〜４日間、好ましくは６６０ｎｍでの吸
光度で最大値を示した直後（１〜２日間）である。

【００３１】本発明において、枯草菌(Bacillus subtil
is)の培養では、枯草菌(Bacillus subtilis)を一般的に
培養するのと同様の培地及び培養条件が使用され、例え
ば、本発明による培養に使用される培地は、当業者には
公知の成分からなる培地が使用でき特に制限されず、各
種培養成分を適宜混合することにより調製してもあるい
は市販の培地をそのまま使用してもあるいは市販の培地
に上記公知の成分を補助成分として添加した培地を使用
してもよい。この際、培地は、固体または液体培地のい
ずれを使用してもよく使用目的によって適宜選択され、
また、使用する微生物が資化しうる炭素源、適量の窒素
源、無機塩及びその他の栄養素を含有する培地であれ
ば、合成培地または天然培地のいずれであってもよい。

【００３２】本発明による枯草菌(Bacillus subtilis)
の培養において使用できる炭素源は、使用する種によっ
て異なり、使用する菌株が良好に生育し、ビタミンＫを
効率よく産生できるものであれば特に制限されない。具
体的には、デンプンまたはその組成画分、焙焼デキスト
リン、加工デンプン、デンプン誘導体、物理処理デンプ
ン、α−デンプン、可溶性デンプン、アミロース、アミ
ロペクチン、マルトオリゴ糖、シクロデキストリン、プ
ルラン、トウモロコシデンプン、馬鈴薯デンプン、甘藷
デンプン及びデキストリン、グリセリン、ソルビトー
ル、麦芽汁、グルコース等の炭水化物が挙げられる。こ
れらの炭素源のうち、ビタミンＫの産生の観点から、グ
ルコース及びデンプンが好ましく使用される。これらの
炭素源は、単独あるいは２種以上の混合物の形態で使用
できる。

【００３３】本発明による枯草菌(Bacillus subtilis)
の培養において使用できる窒素源もまた、使用する種に
よって異なり、使用する菌株が良好に生育し、ビタミン
Ｋを効率よく産生できるものであれば特に制限されな
い。具体的には、肉エキス、麦芽エキス、ペプトン、大
豆由来のポリペプトン（例えば、ポリペプトン−Ｓ）、
酵母エキス、味液（大豆タンパク酸加水分解物）、大豆
粉末、ミルクカゼイン、カザミノ酸、各種アミノ酸及び
コーンスティープリカー等の有機窒素化合物、およびア
ンモニア、硝酸アンモニウム、硫酸アンモニウム及び塩
化アンモニウムなどのアンモニウム塩、硝酸ナトリウム
などの硝酸塩、尿素等の無機窒素化合物等が挙げられ
る。これらの窒素源のうち、ビタミンＫの産生の観点か
ら、大豆由来のポリペプトン（例えば、ポリペプトン−
Ｓ）及び大豆粉末が好ましく使用される。これらの窒素
源も、単独あるいは２種以上の混合物の形態で使用でき
る。

【００３４】本発明による培養に使用できる無機塩もま
た、使用する種によって異なり、使用する菌株が良好に
生育し、ビタミンＫを良好に産生できうるものであれば
特に制限されないが、具体的には、マグネシウム、マン
ガン、カルシウム、ナトリウム、カリウム、銅、鉄及び
亜鉛などのリン酸塩、塩酸塩、硫酸塩及び酢酸塩等から
選ばれた１種または２種以上を使用することができる。

【００３５】また、本発明による培養に市販の培地を使
用する場合の市販の培地としては、例えば、栄養ブイヨ
ン(nutrient broth)（乾燥ブイヨン）（日水製薬株式会
社または日本製薬株式会社製）、ポリペプトン−Ｓ（和
光純薬製）などが挙げられる。

【００３６】または、本発明において、枯草菌(Bacillu
s subtilis)の培養に使用する培地として、オカラ、大
豆、味噌や納豆製造時に副生する大豆煮汁、豆腐や油揚
げ製造時に副生する豆腐粕、大豆を原料とした製油時に
副生する大豆粕、味噌製造時の副産物である大豆の種皮
など、納豆菌によって発酵できる材料を使用してもよ
い。この際、必要であれば、この材料に上記したような
炭素源、窒素源及び無機塩を適宜添加してもよい。

【００３７】本発明において、枯草菌(Bacillus subtil
is)の培養は、従来公知の方法と同様にして行われ、そ
の際の培養条件は、使用する菌株、培地の組成及び培養
法によって適宜選択され、使用する菌株が増殖しビタミ
ンＫを効率よく産生できる条件であれば特に制限されな
い。培養温度は、通常、２０〜４５℃、好ましくは３７
〜４２℃であり、また、培養に適当な培地のｐＨは、通
常、６．０〜９．５、好ましくは７．０〜８．５であ
る。

【００３８】本発明の第二の概念によると、上記方法に
よって培養された枯草菌(Bacillussubtilis)の培養物が
提供される。

【００３９】本発明において、「枯草菌(Bacillus subt
ilis)の培養物」ということばは、上記方法によって培
養された枯草菌(Bacillus subtilis)菌体および枯草菌
(Bacillus subtilis)菌体外に産生された産物の双方を
含む。後者の場合では、雲南SL-001菌が、より高い菌体
外での収率を示すため、好ましい。

【００４０】また、本発明の第三の概念によると、本発
明の第二の概念の培養物由来の水溶性ビタミンＫ誘導体
が提供される。

【００４１】上述したように、本発明の方法によって培
養された枯草菌(Bacillus subtilis)の培養物は、多量
のビタミンＫ、特にビタミンＫ₂、さらに特にメナキノ
ン−７（ＭＫ−７）をその菌体内に蓄積している。具体
的には、本発明の方法によって培養された枯草菌(Bacil
lus subtilis)の培養物中に蓄積されるビタミンＫ、ビ
タミンＫ₂およびＭＫ−７の量は、使用する菌体や培地
の種類や培養条件などによって変化するが、それぞれ、
通常、１０〜２００ｍｇ／１００ｇ真空熱乾燥菌体であ
る。より具体的には、目黒菌を３％大豆ペプトン培地中
で３７℃で２日間振盪培養（１００ｒｐｍ）した場合、
菌体中のＭＫ−７量は最大約７０ｍｇ／１００ｇ乾燥菌
体であり、これは科学技術庁の食品分析表による納豆に
おける量（８７０μｇ／１００ｇ）の約８０倍量に相当
する。なお、本明細書において、菌体内に蓄積されるＭ
Ｋ−７、ＭＫ−４及びビタミンＫ₁の量は、下記実施例
の項で記載される方法によって測定された値である。

【００４２】本発明の方法によって培養された枯草菌(B
acillus subtilis)の培養物を濾過や遠心分離等の既知
の方法により集菌した後、これを凍結乾燥、風乾、真空
熱乾燥等の公知の方法により乾燥し、この乾燥菌体を水
に溶解したところ、ビタミンＫが水に溶け出してくる。
即ち、この菌体中には多量のビタミンＫ（特にＭＫ−
７）が含まれる点を合わせて考慮すると、菌体内に蓄積
されたビタミンＫ（特にＭＫ−７）は菌体内では何らか
の変化を受けて水溶性となっていると考えられ、このよ
うな水溶性が付与された形態のビタミンＫ、ビタミンＫ
₂及びメナキノン−７（ＭＫ−７）を、本願明細書にお
いて、それぞれ、「水溶性ビタミンＫ誘導体」（また
は、単に「ビタミンＫ誘導体」と称する）、「水溶性ビ
タミンＫ₂誘導体」（または、単に「ビタミンＫ₂誘導
体」と称する）及び「水溶性メナキノン−７誘導体（水
溶性ＭＫ−７誘導体）」と称する。この際、水溶性メナ
キノン−７誘導体は、ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気
泳動で測定される際に約１０万の分子量の単一のバンド
を示す点、ゲル瀘過で測定される際には１０万以上の分
子量を示す点、およびメナキノン−７の分子量が約６４
９である点を考慮することにより、ＭＫ−７に何らかの
物質（例えば、糖タンパク質）が結合して安定化されて
水に可溶性のビタミンＫ誘導体（ビタミンＫ₂誘導体及
びメナキノン−７誘導体を含む；以下、省略）が菌体内
で形成されるのではないかと推定される。しかしなが
ら、上記仮説によって本発明の概念が限定されるもので
はないことはいうまでもない。

【００４３】本発明において、水に対するビタミンＫ誘
導体、ビタミンＫ₂誘導体及びメナキノン−７誘導体の
溶解度は、使用する菌体や培地の種類、培養条件及び培
養物の処理（抽出）方法などによって変化する。例え
ば、ビタミンＫ誘導体の溶解度は、培養菌体の水抽出操
作による場合、約１０５μｇ／１００ｍｌ水（２０℃）
であり、液体培養上清の場合、約３００μｇ／１００ｍ
ｌ水（２０℃）であり、さらに、納豆の水抽出操作によ
る場合、約１，５００μｇ／１００ｍｌ水（２０℃）で
ある。

【００４４】本発明の第四の概念によると、上記第二の
概念による培養物および／または上記第三の概念による
水溶性ビタミンＫ誘導体を含む食品、飲料または飼料が
提供される。

【００４５】本発明に係る食品、飲料または飼料は、特
に納豆菌などの安全性が確認されている菌を使用する場
合には、上記第二の概念による培養物および／または上
記第三の概念による水溶性ビタミンＫ誘導体のみから構
成されてもよい。

【００４６】あるいは、本発明に係る食品、飲料または
飼料は、上記第二の概念による培養物および／または上
記第三の概念による水溶性ビタミンＫ誘導体を通常食す
ることのできる食品、飲料または飼料に含ませたもので
あってもよい。この際、通常食することのできる食品、
飲料または飼料としては、例えば、オカラ、オカラ納
豆、納豆、大豆、味噌や納豆製造時に副生する大豆煮
汁、豆腐や油揚げ製造時に副生する豆腐粕、大豆を原料
とした製油時に副生する大豆粕、味噌製造時の副産物で
ある大豆の種皮、ヨーグルト、チーズ等の乳製品、かま
ぼこ、ちくわ、はんぺん、さつま揚げ、なると、つみれ
等の水産練り製品、でんぶ等の魚介類加工品、ソーセー
ジ、フランクフルト、レバーペースト等の食肉加工品、
豆腐、焼き豆腐、生揚げ、油揚げ、がんもどき、おか
ら、凍り豆腐、湯葉等の豆製品、ピューレ等の野菜加工
品、マッシュポテト、くず、はるさめ、こんにゃく、し
らたき等の芋加工品、もち、白玉、白飯、麩、ビーフ
ン、マカロニ、スパゲッティ、そうめん、そば、うど
ん、中華めん、即席麺、食パン、乾パン、アンパン等の
穀物の加工品、冷凍食品、栄養補助食品、ジャム等の甘
味類、バター、マーガリン、マヨネーズ、ドレッシング
等の油脂類、あめ、らくがん、せんべい、あられ、カス
テラ、ようかん、もなか、まんじゅう、大福もち、だん
ご、ういろう、チョコレート、ビスケット、クッキー、
ドーナツ、ケーキ、パイ、アイスクリーム、プリン、バ
バロア、ガム等の菓子類、豆腐、ゼリー、コンニャク、
寒天またはトコロテン等のゲル状食品、コンブ、ワカ
メ、ノリ、テングサ等の海草類など、すべての食品；各
種果汁ジュース（オレンジ、パイナップル、リンゴ、ブ
ドウ、メロン及びイチゴジュース等を含む）、各種炭酸
飲料、お茶（煎茶、ウーロン茶等を含む）、飲むヨーグ
ルト、牛乳、豆乳、調製乳、ミネラルウォーター、清涼
飲料、コーヒー、紅茶、ココアなど、すべての飲料；な
らびにブタ、ウシ、ウマ、ヒツジやヤギ等の家畜、イ
ヌ、ネコ、ウサギやハムスター等のペット、家禽及び魚
など、通常、飼育される動物用のエサ（飼料）が挙げら
れる。

【００４７】また、本発明において、食品、飲料または
飼料が本発明による培養物を含む場合の食品における培
養物の添加量は、使用する菌体や培地の種類や培養条件
さらには水溶性ビタミンＫ誘導体の含量などによって変
化するが、食品では、通常、０．００１〜２０重量％の
菌体乾燥物、好ましくは０．１〜５重量％の菌体乾燥物
を含む量であり、飲料では、通常、０．０００１〜５
（ｗ／ｖ）％の菌体乾燥物、好ましくは０．０１〜５
（ｗ／ｖ）％の菌体乾燥物を含む量であり、さらに、飼
料では、通常、０．０００１〜５重量％の菌体乾燥物、
好ましくは０．００１〜１重量％の菌体乾燥物を含む量
である。また、食品、飲料または飼料が本発明による水
溶性ビタミンＫ誘導体を含む場合の食品における水溶性
ビタミンＫ誘導体の量は、上記と同様使用する菌体や培
地の種類や培養条件などによって変化するが、食品で
は、通常、０．００００１〜１０重量％の水溶性ビタミ
ンＫ誘導体、好ましくは０．０００１〜０．１重量％の
水溶性ビタミンＫ誘導体を含む量であり、飲料では、通
常、０．００００１〜０．１（ｗ／ｖ）％の水溶性ビタ
ミンＫ誘導体、好ましくは０．０００１〜０．０１（ｗ
／ｖ）％の水溶性ビタミンＫ誘導体を含む量であり、さ
らに、飼料では、通常、０．００００１〜１０重量％の
水溶性ビタミンＫ誘導体、好ましくは０．０００１〜１
重量％の水溶性ビタミンＫ誘導体を含む量である。

【００４８】したがって、本発明の水溶性ビタミンＫ
（特にＭＫ−７）誘導体を多量に含む菌体培養物および
／またはこのような培養物由来の水溶性ビタミンＫ（特
にＭＫ−７）誘導体を含む食品を摂取することにより、
従来に比べてビタミンＫ、特にＭＫ−７を無理なく（不
快感を過度に伴うことなく）、効率よくかつ一回に多量
に摂取することができ、また、特に納豆菌の場合には、
安全性も確保でき好ましい。

【００４９】本発明の第五の概念によると、枯草菌(Bac
illus subtilis)の培養菌体をソックスレー抽出するこ
とからなるビタミンＫの抽出方法が提供される。

【００５０】上記概念の一実施態様を以下に記載する。
まず、培養された微生物菌体をソックスレー抽出器を用
いてヘキサン、ジエチルエーテル、アセトン、エタノー
ル及びイソプロパノール等の有機溶媒で使用する有機溶
媒の沸点でソックスレー抽出し、脂溶性画分を得る。次
に、この画分をヘキサン、ジエチルエーテル、アセト
ン、エタノール及びイソプロパノール等の有機溶媒で３
０〜１００℃で０．１〜２０時間、抽出する。得られた
抽出物を上記と同様の有機溶媒で所定の総容量にまで希
釈する。希釈された抽出物の一部を水及びイソプロパノ
ールと混和し、さらにタッチミキサーを使用するなどに
より上記と同様の有機溶媒とさらに混和する。得られた
液体混合物を遠心し、上清を乾固した後、残渣をエタノ
ールに溶解することにより、ビタミンＫ₂（ＭＫ−７、
ＭＫ−４）及びビタミンＫ₁等のより純度の高い脂溶性
のビタミンＫが調製される。

【００５１】上記方法によって、脂溶性のビタミンＫが
公知の方法に比してより効率的に抽出され、これにより
ビタミンＫ₂（ＭＫ−７、ＭＫ−４）及びビタミンＫ₁等
の脂溶性のビタミンＫがより高い収率で培養菌体から回
収できる。

【００５２】本発明の第六の概念によると、枯草菌(Bac
illus subtilis)の培養液を酸性化し、沈殿物を得るこ
とからなる水溶性ビタミンＫ誘導体の分取方法が提供さ
れる。

【００５３】上記概念の一実施態様を以下に記載する。
枯草菌(Bacillus subtilis)を公知の方法または上記方
法によって培養し、培養液を得る。次に、この培養液の
ｐＨを下げる、好ましくはｐＨを１〜３に調整すること
によって沈殿物が得られ、この沈殿物には菌体内に蓄積
された及び菌体外に放出された水溶性ビタミンＫ誘導体
が含まれる。したがって、この沈殿物を遠心分離などに
よって分離することによって、水溶性ビタミンＫ誘導体
が分取できる。

【００５４】または、枯草菌(Bacillus subtilis)を公
知の方法または上記方法によって培養し、得られた培養
液を遠心分離などによって、菌体を除去した培養上清を
得る。次に、この培養上清のｐＨを下げる、好ましくは
ｐＨを１〜３に調整することによって沈殿物が得られ、
この沈殿物には菌体外に放出された水溶性ビタミンＫ誘
導体が含まれる。したがって、この沈殿物を遠心分離な
どによって分離することによって、水溶性ビタミンＫ誘
導体が分取できる。

【００５５】

【実施例】以下、実施例を参照しながら、本発明をより
具体的に説明する。

【００５６】なお、下記実施例において、ＭＫ−７、Ｍ
Ｋ−４及びビタミンＫ₁の量は、以下の方法に従って測
定した。

【００５７】＜各種ビタミンＫ量の測定方法＞まず、脂
溶性のＭＫ−７、ＭＫ−４及びビタミンＫ₁の場合の菌
体試料の調製方法を以下に説明する：培養された微生物
菌体１ｇ（乾燥重量）を試料として、ソックスレー抽出
器（SIBATA SPC 34, WATER BATH SIBATA WB-6C, 濾紙：
ADVANTEC 84 24×100mm）で脂溶性画分を抽出する。こ
れを１００ｍｌヘキサンで８０℃で６時間抽出した後、
全液量をヘキサンにより１００ｍｌに調節する。この抽
出物１００μｌを１．０ｍｌの蒸留水及び１．５ｍｌの
イソプロパノールと混和し、さらに４．９ｍｌのヘキサ
ンをタッチミキサーで約１０秒間混和する。この混合液
を遠心分離（３，０００ｒｐｍ×１０分、２０℃）す
る。得られた上清部分（有機層：水層＝５．８：１．
７）４．０ｍｌをエバポレーターで濃縮・乾固した後、
これを１００μｌのエタノールに溶解する。このように
して、菌体内に蓄積された脂溶性のＭＫ−７、ＭＫ−４
及びビタミンＫ₁の量を測定するためのＨＰＬＣ試料
（以下、「ソックスレー−ＨＰＬＣ試料」と称する）が
調製される。なお、このソックスレー−ＨＰＬＣ試料を
用いて下記ＨＰＬＣによってＭＫ−７量を測定する方法
を「ソックスレー−ＨＰＬＣ法」と称する。

【００５８】次に、水溶性ビタミンＫ誘導体（ＭＫ−７
を含む）の場合の試料の調製方法を以下に説明する：培
養物をスパーテルでよく練った後に得られた５ｇ量に対
して、蒸留水４５ｍｌを加える。この混合液を、２０℃
で、３，０００ｒｐｍで１０分間、遠心分離し、得られ
た上清０．５ｍｌを抽出試料とする。この抽出試料に、
蒸留水０．５ｍｌ、イソプロパノール１．５ｍｌを混和
し、さらにヘキサン５．０ｍｌを加え撹拌した後、２０
℃で３，０００ｒｐｍで１０分間、遠心分離する。得ら
れた上清４．０ｍｌをエバポレーターで濃縮・乾固し、
１００μｌのエタノールで溶解する。このようにして、
水溶性ＭＫ−７誘導体の量を測定するためのＨＰＬＣ試
料（以下、「ＨＰＬＣ試料」と称する）が調製される。
なお、このＨＰＬＣ試料を用いて下記ＨＰＬＣによって
ＭＫ−７量を測定する方法を「ＨＰＬＣ法」と称する。

【００５９】また、培養液中のＭＫ−７、ＭＫ−４及び
ビタミンＫ₁の量を測定するためのＨＰＬＣ試料として
は、培養液がそのまま使用される。

【００６０】さらに、高速液体クロマトグラフィー（Ｈ
ＰＬＣ）によるＭＫ−７、ＭＫ−４及びビタミンＫ₁量
の測定は、ビタミンＫが白金−アルミナ触媒でハイドロ
キノン体に還元され、蛍光物質になることを利用するも
のである。具体的には、以下の条件で測定する。

【００６１】 装置 ポンプ ：ＰＵ−９８０（日本分光製） インジェクタ ：７１２５（日本分光製） カラムオーブン：ＣＯ−９６５（日本分光製） 検出器 ：蛍光検出器 ８２１−ＦＰ（日本分光製） データ処理装置：Ｃ−Ｒ５Ａ（島津製作所製） 条件 カラム ：ＯＤＳ−ＩＩカラム（４．６×２５０ｍｍ） （島津製作所製） 還元カラム ：白金−アルミナ触媒カラム（和光純薬製、一級白金 −アルミナ、Ｐｔ＝５％を約０．２ｇ充填する； ４．０φ×１０ｍｍ） 移動相 ：９７％エタノール（流速；０．７ｍｌ／分） 分離・還元温度：４０℃ 測定波長 ：励起 ３２０ｎｍ 蛍光 ４３０ｎｍ 注入量 ：１０μｌ このような測定方法によって、ＭＫ−７、メナキノン−
４及びビタミンＫ₁について検量線を作成したところ、
ＭＫ−７の量は、０．０５〜５０ｎｇの範囲で式［−
０．８９６６１＋１．６９９３×１０^-6×（ビタミンＫ
に相当するＨＰＬＣの面積（μＶ，ｓｅｃ））］によっ
て、ならびにメナキノン−４及びビタミンＫ₁の量は、
０．０１〜１０ｎｇの範囲で、それぞれ、式［−０．５
８６５７＋４．８０３０×１０^-9×（ビタミンＫに相当
するＨＰＬＣの面積（μＶ，ｓｅｃ））］及び式［−
０．４４３８１＋４．０６２６×１０^-7×（ビタミンＫ
に相当するＨＰＬＣの面積（μＶ，ｓｅｃ））］によっ
て、測定が可能であった。

【００６２】また、検量線を作成する際のＭＫ−７の標
準品は、以下によって調製した。すなわち、６００ｇの
納豆に、７５％イソプロパノール１リットル及びｎ−ヘ
キサン１リットルを加え、１時間、ゆっくりと撹拌、静
置した。分離した２層のうち上層を取り、無水硫酸ナト
リウムで乾燥、蒸発乾固することにより、抽出物約２０
ｇを得た。これを１０ｍｌのｎ−ヘキサンと混合し、４
００ｍｌのクロマトグラフィー用シリカゲルに通して吸
着させ、２リットルのｎ−ヘキサン／トルエン（１：
１）で溶出・分画した。ＭＫ−７を含む画分を減圧下で
蒸発乾固し、得られたシリカゲル濃縮物を５ｍｌのｎ−
ヘキサンで溶解し、上記と同様にして、再度シリカゲル
カラムで分画し、減圧下で蒸発乾固して約３５０ｍｇを
得た。このうち５０ｍｇを少量のアセトンに溶解し、ア
セトニトリル／メタノール（１：１）で充填した６０ｍ
ｌのクロマトグラフィー用ＯＤＳ−シリカゲルに通液
し、アセトニトリル／メタノール（１：１）で展開し
た。溶出液をＨＰＬＣでモニタリングしながら、ＭＫ−
７と考えられる物質が単独で溶出している画分を分取
し、減圧乾固した。得られた物質について、赤外吸収ス
ペクトラム及びマススペクトラムを得て、ＭＫ−７であ
ることを確認した。なお、この物質の純度を検定したと
ころ、９９．８％であった。また、フィロキノン（ビタ
ミンＫ₁）及びメナキノン−４（ＭＫ−４）の標準品と
しては、それぞれ、シグマ社(Sigma)製の特級品を用い
た。測定は、３回抽出して分析した平均値により求め
た。

【００６３】実施例１ ５００ｍｌ容の三角コルベン内に入れた乾燥ブイヨン
（日水製薬株式会社製）を３％の濃度で０．３％の麦芽
汁に溶かしたもの２００ｍｌを計１０本（総量：２リッ
トル）を１３０℃で約３０分間加圧釜で蒸煮（オートク
レーブ滅菌）した。冷却後、この培養液に、約５×１０
⁸個の宮城野菌（有限会社宮城野納豆製造所、仙台）を
加え、４０℃で３６時間、振盪培養（１００ｒｐｍ）し
た後、集菌、洗浄し、それにほぼ等量のコーンスターチ
を混ぜて４℃で３日間かけて風乾した。この乾燥物は、
生きた納豆菌（胞子及び栄養細胞）を大量に含むもので
あり、これについてメナキノン−７（ＭＫ−７）蓄積量
をＨＰＬＣ法で測定したところ、乾燥菌体１ｇ当たり約
３１．７μｇであった。

【００６４】次に、この乾燥菌体を５人の健常成人に１
ｇずつ毎朝１０時に経口摂取させ、摂取させてから所定
の時間経過後に健常成人から採血し、血漿中のＭＫ−７
濃度を測定した。血漿中のＭＫ−７濃度の経時変化を調
べた結果を図１に示す。図１に示されるように、明らか
な血漿中濃度の亢進が認められ、かつこの亢進は２４時
間以上持続して起こること（ｐ＜０．０５）が分かっ
た。

【００６５】実施例２ 納豆菌として日東菌（株式会社日東薬品工業、京都）の
乾燥物１ｇ（１．８×１０¹⁰個の生細胞を含む）を５人
の健常成人に毎朝１０時に経口摂取させた後、経時的に
採血した。採血された血液から血漿を採り、この血漿中
のＭＫ−７濃度を、実施例１と同様にして測定した。結
果を表１及び図２に示す。なお、本実施例で使用した納
豆菌のＭＫ−７含量をＨＰＬＣ法で測定したところ、約
５１．０μｇ／ｇ乾燥菌体であった。

【００６６】また、対照実験として、上記納豆菌と同量
の純化したＭＫ−７を同様にして５人の健常成人に経口
摂取させ、血漿中のＭＫ−７濃度を測定した結果を下記
表１に示す。

【００６７】

【表１】

【００６８】表１及び図２に示されるように、いずれの
群においても摂取してから４時間目をピークに有意な血
中ＭＫ−７濃度の亢進が確認され（ｐ＜０．００５）、
また納豆菌摂取群の血中濃度亢進効果の方がはるかに長
期間持続し、特に３２時間以降の効果は純化したＭＫ−
７摂取群に比べて有意な差（ｐ＜０．００５）のあるこ
とが分かった。

【００６９】なお、この摂取量ではどの群もトロンボエ
ラストグラフィー、活性部分トロンボプラスチン時間、
あるいは血漿プロトロンビン、プロテインＣ含量などで
調べた血液凝固−線溶系の活性に有意な変化は認められ
なかった。なお、血液のトロンボエラストグラフィー
（ＴＥＧ）パターンは、Hellige社、また、プロトロン
ビン時間（ＰＴ）及び活性化トロンボプラスチン時間
（ＡＰＴＴ）はErma社のClot Digitim TE20装置を用い
て常法通りに行った。

【００７０】実施例３ 下記６種の納豆菌を、それぞれ、５００ｍｌ容の三角フ
ラスコ内で３００ｍｌの３％栄養ブイヨン(nutrient br
oth)（乾燥ブイヨン）（日本製薬株式会社製）培地中で
３０℃で振盪培養（１００ｒｐｍ）した。この際の菌の
成長を６６０ｎｍでの吸光度として測定し、また、培養
液中及び菌体内のＭＫ−７量を経時的に測定した。

【００７１】培養時間に対する、各種納豆菌の成長、培
養液中のＭＫ−７量（μｇ／ｍｌ）および各種納豆菌の
菌体１ｇ当たりのＭＫ−７量（μｇ／ｇ）を、それぞ
れ、図３、図４及び図５に示す。

【００７２】＜使用した納豆菌＞ 雲南SL-001菌（または、「雲南菌」とも称する） 宮城野菌（有限会社宮城野納豆製造所製、仙台） 目黒菌（株式会社目黒研究所製、大阪） 日東菌（株式会社日東薬品工業製、京都） 高橋菌（高橋祐蔵研究所製、山形） 成瀬菌（株式会社成瀬醗酵化学研究所製、東京） 以下、上記納豆菌は菌名のみを記載する。

【００７３】図３から示されるように、菌の成長は、す
べての納豆菌で類似の挙動を示し、６６０ｎｍでの平均
吸光度（ｎ＝６）として表すと、０．５日目で０．５８
３、１日目で１．０１１、２日目で０．９４８、３日目
で０．８５４、５日目で０．５９２、および７日目で
０．５５２であり、これから菌の成長は培養開始後１〜
２日で定常状態となることが分かった。また、培養液中
に放出されるＭＫ−７量は、図４から示されるように、
やはりすべての納豆菌で類似の挙動を示し、６種の納豆
菌による平均値換算で、０．５日目で０．５６３μｇ／
ｍｌ、１日目で１．５９２μｇ／ｍｌ、３日目で３．８
６７μｇ／ｍｌ、５日目で４．３１７μｇ／ｍｌ、７日
目で４．７８４μｇ／ｍｌであり、これから、培地中に
放出されるＭＫ−７量は、菌の成長が定常状態になる１
〜２日目よりもむしろそれ以降に急激に増加し、特に４
日目以降に多量のＭＫ−７が培地中に放出された。この
結果に比例するように、菌体１ｇ当たりのＭＫ−７量に
換算した場合のＭＫ−７量（やはりすべての納豆菌で類
似の挙動を示した）は、図５から示されるように、２日
目で最大（平均で約３００μｇ／ｇ乾燥菌）となり、培
地中に多量の放出し始める４日目以降ではむしろ減って
いくことが分かった。

【００７４】実施例４ オカラ（旭松食品株式会社、飯田市）を−２５℃で凍結
保存し、必要時に解凍して使用した。解凍したオカラ
を、１２０℃で３０分間、オートクレーブで滅菌した
後、約１２０ｍｌ容のポリスチレンペーパー（ＰＳＰ）
容器に入れ、これを納豆菌の培地とした。

【００７５】別途、市販の納豆に使用されている４種の
納豆菌株（高橋菌、成瀬菌、宮城野菌及び朝日菌）、薬
剤として使用されている２種の納豆菌株（日東菌及び目
黒菌）、ならびに中国雲南の納豆から分離された納豆菌
株（雲南菌 SL-001）の合計７種の納豆菌を、それぞ
れ、５００ｍｌ容の三角フラスコ内で１５０ｍｌの３％
栄養ブイヨン(nutrient broth)（乾燥ブイヨン）（日水
製薬株式会社製）培地中で３７℃で３日間、振盪培養
（１００ｒｐｍ）することによって、上記７種の納豆菌
の前培養液を調製した。

【００７６】上記で調製されたオカラ（湿重量５０ｇ）
に、これら計７種の納豆菌の前培養液（生菌数：２×１
０⁸個／ｍｌ）０．５ｍｌを、それぞれ、添加し、３７
℃で８日間、静置して発酵し続けた。

【００７７】発酵し始めてから所定の日数（１、２、
４、６、８日目）経過後、納豆菌を水中に懸濁し、これ
を金属製の茶漉しで濾過した後、遠心分離（３，０００
ｒｐｍ×１０分）することによって、各菌体の培養物を
調製し、これをＭＫ−７測定用のソックスレー−ＨＰＬ
Ｃ試料とした。このようにして調製されたソックスレー
−ＨＰＬＣ試料について、ＭＫ−７量及び線溶（血栓溶
解）活性を測定し、その結果を図６に示す。

【００７８】図６から明らかなように、菌体数１０¹⁰個
当たりの菌体内のＭＫ−７濃度は１〜２日目で高く、そ
れ以降は減少し、これに比例するようにＭＫ−７が培地
中に放出され、培地中に放出されるＭＫ−７の量は、発
酵後２日をピークとするナットウキナーゼ（ＮＫ）によ
る血栓溶解活性が高まる時点（標準フィブリン平板法で
も、合成基質分解法でも発酵開始後２日以内に最高値に
達する）より遅れた４日目をピークとすることが分かっ
た。

【００７９】また、いずれの納豆菌についても、オカラ
湿重量１ｇ当たり１．９μｇ以上という高いＭＫ−７生
産性（水に溶け出した量が、平均で、雲南菌 ３６．６
μｇ／ｇオカラ湿重量；宮城野菌 １．９μｇ／ｇオカ
ラ湿重量；成瀬菌 １４．２μｇ／ｇオカラ湿重量；高
橋菌 ６．８μｇ／ｇオカラ湿重量；朝日菌 １１．９
μｇ／ｇオカラ湿重量；目黒菌 １．９μｇ／ｇオカラ
湿重量；および日東菌５．２μｇ／ｇオカラ湿重量）が
確認された。特に、雲南菌(SL-001)は、３６．６μｇ／
ｇオカラ湿重量という高いＭＫ−７生産量を示し、この
値は、計算上、他の納豆菌の生産量に比べて２〜２０倍
という高い値であり、また、従来報告（山口迪夫監修、
日本食品成分表、医歯薬出版、東京、１９９７年、pp.5
2-53；坂野俊行ら、ビタミン、６２、393-398(1988)；
H. Ikeda and Y. Doi, Eur. J.Biochem., 192, 219-223
(1990)；および池田ひろ、家政誌、４３、643-648(199
2)）されている納豆の分析値（６．２〜８．７μｇ／ｇ
オカラ湿重量）の４倍以上という高いものであった。

【００８０】実施例５ 日東菌を、５００ｍｌ三角フラスコ内で０．５、２及び
３％ポリペプトンＳ（和光純薬製）を含む液体培地３０
０ｍｌ中に生菌数が２×１０⁶個／ｍｌとなるように添
加し、これを３７℃で２日間、振盪培養（１００ｒｐ
ｍ）した。この培養液を遠心分離（３，０００ｒｐｍ×
１０分）し、上清と菌体に分けた。菌体はさらに水洗
し、凍結乾燥した。

【００８１】このように調製された培養上清中のＭＫ−
７量をＨＰＬＣ法を用いて測定し、および菌体内のＭＫ
−７量をソックスレー−ＨＰＬＣ法を用いて測定し、そ
の結果を下記表２に示す。なお、ポリペプトンＳ濃度が
０．５及び３％での菌体の収率は、培地６００ｍｌ（２
本分）当たり、それぞれ、０．２４ｇ（乾燥菌体重量）
及び１．１８ｇ（乾燥菌体重量）であった。

【００８２】

【表２】

【００８３】実施例６ 目黒菌を４１℃で２日間、振盪培養し、この培養液を遠
心分離し、上清と菌体に分けた。

【００８４】つぎに、このように調製された菌体１．０
１１ｇ（乾燥重量）（菌数：５×１０¹¹個）を試料とし
て、ソックスレー抽出器（SIBATA SPC 34, WATER BATH
SIBATA WB-6C, 濾紙：ADVANTEC 84 24×100mm）で脂溶
性画分を６時間抽出した。これを１００ｍｌヘキサンで
８０℃で６時間抽出した後、全液量をヘキサンにより１
００ｍｌに調節する。この抽出物１００μｌを１．０ｍ
ｌの蒸留水及び１．５ｍｌのイソプロパノールと混和
し、さらに４．９ｍｌのヘキサンをタッチミキサーで約
１０秒間混和する。この混合液を遠心分離（３，０００
ｒｐｍ×１０分、２０℃）する。得られた上清（有機
層：水層＝５．８：１．７）１４ｍｌを乾固した後、こ
れを１００μｌのエタノールに溶解する。このようにし
て得られたサンプルについて、ＭＫ−７量をソックスレ
ー−ＨＰＬＣ法を用いて測定したところ、６７２．６μ
ｇ／ｇ乾燥菌体であった。

【００８５】実施例７ 目黒菌を、３７℃で、菌体内に最大量のビタミンＫ誘導
体を蓄積する２日間、培養した。このようにして得られ
た培養物を蒸留水で洗浄した後、凍結乾燥した。この凍
結乾燥物１ｇ（５×１０¹¹細胞／ｇ乾燥重量）を腸溶カ
プセルに充填したものを５人の健常成人（Ａ〜Ｅ）に摂
取させた。なお、この凍結乾燥物中のＭＫ−７含量をソ
ックスレー−ＨＰＬＣ法によって測定したところ、凍結
乾燥物１ｇ当たり、７０８．０μｇのＭＫ−７が含まれ
ていた。所定期間経過後、健常成人から採血し、血漿中
のＭＫ−７濃度を、実施例１と同様にして測定した。結
果を表３に示す。

【００８６】

【表３】

【００８７】表３の結果から、本願発明の菌体培養物を
投与することによって、有意な血漿中のＭＫ−７濃度の
亢進が認められ、かつこの亢進効果は極めて長期間にわ
たり、摂取後少なくとも１週間は血漿中のＭＫ−７濃度
を正常血中濃度範囲（０．８８±０．１９ｎｇ／ｍｌ）
の約２倍に持続できることが分かった。

【００８８】実施例８ 実施例６と同様にして調製された目黒菌由来のＭＫ−７
を乾燥し、白色粉末状のＭＫ−７乾燥物を調製した。こ
のＭＫ−７乾燥物に室温で蛍光灯を５時間照射した。こ
の際、ＭＫ−７量を実施例６と同様にして経時的に測定
し、この結果を図７（白抜きの丸）に示す。図７に示さ
れるように、ＭＫ−７量は、蛍光灯を照射してもほとん
ど変化しなかったことから、本発明により得られたＭＫ
−７は光に対して非常に高い安定性を有することが分か
る。

【００８９】また、このようにして調製されたＭＫ−７
乾燥物を、同条件で蛍光灯照射下で１週間保存した後、
同様にして、ＭＫ−７量を測定したが、ほとんど変化が
認められなかった。

【００９０】比較例１ 菌体を実施例６と同様にして調製した。この菌体２ｇを
乳鉢にとり、海砂３、水３ｍｌを乳鉢に加えた。次に、
この乳鉢に、アセトンで磨砕抽出（２０ｍｌ×４）し、
ガラスフィルターで吸引濾過した。濾液全量を分液ロー
トに移し、ジエチルエーテル１００ｍｌ及び水５０ｍｌ
を添加して抽出して、エーテル層を分離した。水層にさ
らにジエチルエーテル１００ｍｌを添加して、エーテル
層を分離した。これらのエーテル層を合わせて、溶媒を
留去し、さらにこれをシリカゲルクロマトグラフィー
（ヘキサン１０ｍｌ、シリカゲル５ｇ）にかけて、ヘキ
サン／ジエチルエーテル（８５／１５（ｖ／ｖ））３０
ｍｌで溶出した。さらに、溶出液から溶媒を留去した
後、２−プロパノールに溶解し、脂溶性ＭＫ−７を調製
した。

【００９１】このようにして調製された脂溶性ＭＫ−７
を乾燥し、ＭＫ−７乾燥物を調製した。このＭＫ−７乾
燥物に室温で蛍光灯を５時間照射した後、実施例６と同
様にして脂溶性ＭＫ−７を測定し、その結果を図７（黒
塗りの四角）に示す。図７に示されるように、ＭＫ−７
量は、蛍光灯を約３時間照射すると、測定不可能になる
ことから、このようにして調製されたＭＫ−７は光に対
して非常に不安定であることが示される。

【００９２】実施例９ 日東菌を振盪培養し、この培養液を遠心分離して、上清
と菌体に分けた。このようにして調製された微生物菌体
の培養物のＭＫ−７の量をソックスレー−ＨＰＬＣ法に
よって測定したところ、ＭＫ−７量換算で、５６４．０
μｇ／ｇ乾燥菌体であった。

【００９３】この菌体０．１ｇに蒸留水５ｍｌを加え、
超音波処理を行った。次に、処理液を遠心分離し、この
上清について水溶性ＭＫ−７誘導体量をＨＰＬＣ法によ
って測定したところ、５２．６μｇ／ｇ乾燥菌体であっ
た。

【００９４】次に、水溶性ＭＫ−７誘導体を水に溶かし
た溶液について、Sephadex G50カラム（予め、０．１５
Ｍ ＮａＣｌを含む０．０５Ｍ リン酸緩衝液、ｐＨ
７．５で平衡化したもの：２．５×５０ｃｍ）によるゲ
ル濾過を行い、各フラクションについてＭＫ−７含量を
ＨＰＬＣ法によって測定した。この結果を図８に示す。
図８から示されるように、ＭＫ−７を多く含む部分（フ
ラクション番号１７〜２５）は、アミノ酸部分（フラク
ション番号４６〜４９）よりかなり高分子量域に溶出さ
れることが分かる。

【００９５】実施例１０ オカラは、旭松食品株式会社（飯田市）より提供された
ものを、−２５℃で凍結保存し、必要時に解凍して使用
した。

【００９６】別途、中国雲南の納豆から分離した納豆菌
株（雲南菌 SL-001）を、５００ｍｌ容の三角フラスコ
内で１５０ｍｌの３％栄養ブイヨン(nutrient broth)
（乾燥ブイヨン）（日水製薬株式会社製）培地中で３７
℃で３日間、振盪培養（１００ｒｐｍ）することによっ
て、納豆菌の前培養液を調製した。

【００９７】解凍したオカラ１ｋｇ（湿重量）を、１２
０℃で３０分間、オートクレーブで滅菌した後、約１２
０ｍｌ容量のポリスチレンペーパー（ＰＳＰ）容器に入
れた。この容器に、上記で調製された納豆菌の前培養液
を添加し、３７℃で４日間、発酵させた。このようにし
て発酵させたオカラ納豆１ｋｇ（湿重量）に対して、５
リットルの水を加え、室温で１時間撹拌し、遠心分離
（３，０００ｒｐｍ、１０分間）した。得られた上清に
対して、６２０ｇのイオン交換樹脂（DEAE-Sepharose C
L-613）を加え、撹拌した後、室温で３０分間、静置し
た。次に、これをガラスカラム（７．５ｃｍφ×１００
ｃｍ）に充填し、蒸留水及び０．０５Ｍリン酸緩衝液
（ｐＨ７．０）で洗浄した後、０．１〜０．８Ｍ Ｎａ
Ｃｌを含む０．０５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）でグ
ラジエント溶出した。各画分について、ＨＰＬＣによっ
てビタミンＫ量を測定し、ビタミンＫを含む画分をメン
ブランフィルター（Millipore製、分子量１０，００
０）で濃縮し、蒸留水で透析した後、凍結乾燥し、薄黄
色粉末として水溶性ビタミンＫ誘導体を得た。

【００９８】このようにして得られた水溶性ビタミンＫ
誘導体及び上記と同じオカラをイソプロパノールで抽出
したものを、ＨＰＬＣによって分析し、その結果を図９
に示す。なお、図９において、ＭＫ−４、ビタミンＫ₁
及びＭＫ−７の保持時間は、それぞれ、約８．２分、約
１１．３分及び約１７．５分であり、矢印はＭＫ−７の
保持時間を示す。図９から、オカラのイソプロパノール
抽出物の６０％以上が水溶性分画に抽出され、また、ビ
タミンＫとしては、ビタミンＫ₁、ＭＫ−４の量は少な
く、常に９５％以上がＭＫ−７で占められることが分か
った。

【００９９】また、この水溶性ビタミンＫ誘導体につい
て、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動による分
析を行ったところ、分子量約１０万の位置に幅広いなが
ら単一のバンドを示した。この結果から、水溶性ビタミ
ンＫ誘導体は他の糖タンパク質と分子量約１０万の複合
体を形成しているのではないかと考察される。また、こ
の際の納豆１ｋｇからの水溶性ビタミンＫ誘導体の収率
は、３回の操作による平均で、約５．３ｇ（８３０μｇ
水溶性ＭＫ−７誘導体／ｇを含む）であった。

【０１００】実施例１１ ５００ｍｌ容の三角フラスコ５本に、それぞれ、３００
ｍｌの３％乾燥ブイヨン（日水製薬株式会社製）培地を
入れ、１２０℃で１５分間オートクレーブ滅菌した。こ
れらの培地に、雲南SL-001菌を一白金耳ずつ接種し、３
７℃で振盪培養（１００ｒｐｍ）した。４日後、培養液
を合わせたものを遠心分離（５，０００ｒｐｍ×１０
分）し、得られた上清を４００ｍｌずつ３つに分けて、
各上清のｐＨを希塩酸で１．０２、２．０７及び３．０
１に調節した。室温で３時間放置した後、上清を遠心分
離（５，０００ｒｐｍ×１０分、１０℃）し、白色の沈
殿を分離した。この白色沈殿物を少量の蒸留水に溶かし
て、重炭酸アンモニウム粉末でｐＨを７．０に調節した
後、凍結乾燥した。この結果、凍結乾燥物の重量は、
１．０２、２．０７及び３．０１のｐＨの場合、それぞ
れ、０．５２ｇ、０．２８ｇ及び０．３１ｇであった。
次に、この凍結乾燥物について、ＭＫ−７含量（μｇ／
ｇ乾燥物）をソックスレー−ＨＰＬＣ法で調べたとこ
ろ、１．０２、２．０７及び３．０１のｐＨの場合、そ
れぞれ、２，８００μｇ／ｇ乾燥物、２，２００μｇ／
ｇ乾燥物及び２，０００μｇ／ｇ乾燥物であった。さら
に、各凍結乾燥物１５ｍｇを蒸留水５ｍｌに添加した溶
液を遠心分離（１０，０００ｒｐｍ×１０分）した。得
られた上清（水溶性分画）について、同様にしてＭＫ−
７含量を調べたところ、１．０２、２．０７及び３．０
１のｐＨの場合、それぞれ、１，５００μｇ／ｇ乾燥
物、１，８００μｇ／ｇ乾燥物及び１，８００μｇ／ｇ
乾燥物であったから、各水溶性分画の可溶化率は、約５
４％、約８２％及び約９０％であることことが分かっ
た。

【０１０１】実施例１２ 大豆を水道水に一晩浸漬したもの３．９ｋｇを１０５℃
で３０分間オートクレーブ滅菌した後、１ｍ四方のステ
ンレス製トレイ２枚に広げた。これに、普通寒天培地の
スラントに培養された枯草菌(Bacillus subtilis Warbu
rgt)（東京大学応用微生物研究所、ＩＡＭ１２１１８
株）１０白金耳を１００ｍｌの滅菌水に添加したものを
接種し、ウレタン製の蓋をした後、３７℃で４日間静置
培養した。４日後の発酵大豆の全重量（２枚分）は約
４．５ｋｇであった。次に、発酵大豆に１０リットルの
蒸留水を加え、よく撹拌した後、ガーゼ付金網（メッシ
ュ１００ｍｍ）で濾過した。得られた上清中の水溶性Ｍ
Ｋ−７含量をＨＰＬＣ法で測定したところ、総量（即
ち、４．５ｋｇ発酵大豆当たり）２９．８ｍｇが回収で
きた。

【０１０２】実施例１３ ５００ｍｌ三角フラスコに２％ポリペプトン−Ｓ（和光
純薬製）３００ｍｌを入れ、１２０℃で１５分間オート
クレーブ滅菌した。これに、枯草菌(Bacillussubtilis
Warburgt)（東京大学応用微生物研究所、ＩＡＭ１２１
１８株）１白金耳接種し、３７℃で４日間、振盪培養
（１００ｒｐｍ）した。この培養液を遠心分離（６，０
００ｒｐｍ×１０分）し、上清と菌体に分けた。菌体は
さらに水洗して、凍結乾燥した。

【０１０３】上清について、ＭＫ−７含量をＨＰＬＣ法
で測定したところ、１４０μｇ／１００ｍｌ上清であっ
た。また、菌体についても、ＭＫ−７含量をソックスレ
ー−ＨＰＬＣ法で測定したところ、２２ｍｇ／１００ｇ
凍結乾燥菌体であった。

【０１０４】実施例１４ 朝食のみ絶食させた健常成人（２１〜６３歳、男性）５
人に、実施例９で調製された１０００μｇの水溶性ＭＫ
−７誘導体を含む水溶性ビタミンＫ誘導体を、午前１０
時に経口摂取させた後、経時的に採血し、水溶性ＭＫ−
７誘導体の血中濃度を測定した。なお、比較対照とし
て、１０００μｇの精製ＭＫ−７を経口摂取させて同様
の実験を行った。また、本実施例に参加した健常成人に
は、既往症及び血液検査による異常は認められなかっ
た。

【０１０５】この結果、血漿中の主要なビタミンＫはＭ
Ｋ−７であり、水溶性ＭＫ−７誘導体投与後の血漿中の
ＭＫ−７濃度は、投与前が１．３±０．８ｎｇ／ｍｌ
（血漿）であったのに対して、投与後４時間目にはその
約４０倍の４９．９±２９．１ｎｇ／ｍｌ（血漿）（ｐ
＜０．０５）にまで増加し、さらにその亢進効果は等量
の純ＭＫ−７を経口投与した場合に比べて、はるかに長
持間（２４時間目において、純ＭＫ−７群では３．２±
２．３ｎｇ／ｍｌであるのに対して、水溶性ＭＫ−７誘
導体群では２１．０±１２．１ｎｇ／ｍｌ、ｐ＜０．０
５）持続することが分かった。

【０１０６】実施例１５ 鍋の中に、牛乳４００ｇ、砂糖８０ｇ及びコーンスター
チ８ｇを入れて、撹拌・混合しながら加熱した。この混
合液を沸騰直前で火を弱めて冷却した後、これに実施例
３と同様にして培養された宮城野菌の培養物を凍結乾燥
した物（７３０μｇ ビタミンＫ／ｇ乾燥菌体）１０ｇ
を加え、さらに約２分間よく撹拌した。これとは別にボ
ールに卵黄４０ｇをとって、泡立てた。この泡立てた卵
黄に、上記の撹拌混合物全部を徐々に添加し、混合し
た。次に、これを水冷した後、冷蔵庫で１０℃以下まで
冷却した。最後に、この冷却した混合物に、さらに泡立
てた生クリーム１５０ｇ及びバニラエッセンス５ｇを加
えて、アイスクリームフリーザーに入れて冷やして固め
ることによって、ビタミンＫ入りアイスクリームを製造
した。

【０１０７】実施例１６ 日東菌を、２リットルのジャーファーメンター中で、培
養液（グルコース１０ｇ、ポリペプトン５ｇ及び酵母エ
キス５ｇを水で１リットルに溶かしたもの）０．８リッ
トル中に接種し、４０℃で、通気拡散培養（５００ｒｐ
ｍの撹拌速度；０．５リットル／分の通気量）により、
１．５日間発酵した。

【０１０８】このようにして得られた日東菌の培養物の
ＭＫ−７量を従来の方法（坂野ら、ビタミン、６２：３
９３〜３９８、１９８８年）に準じて抽出・測定した。
簡潔にいうと、上記で得られた日東菌の培養物を凍結乾
燥し、その凍結乾燥粉末０．１ｇにイソプロパノール１
０ｍｌを加え、タッチミキサーで撹拌抽出した後、遠心
分離（３，０００ｒｐｍ×１０分）した。上清１００μ
ｌを１．０ｍｌの水及び１．５ｍｌのイソプロパノール
と混和し、さらに４．９ｍｌのヘキサンをタッチミキサ
ーで約１０秒間混和した。この混合液を遠心分離（３，
０００ｒｐｍ×１０分、２０℃）した。得られた上清部
分（有機層：水層＝５．８：１．７）４．０ｍｌをエバ
ポレーターで濃縮・乾固した後、これを１００μｌのエ
タノールに溶解した。このようにして、調製された試料
について、上記各種ビタミンＫ量の測定方法の項に記載
されたＨＰＬＣ条件と同様の条件を用いて、培養物のＭ
Ｋ−７量を測定したことろ、１５．１μｇ／ｇであっ
た。また、上記操作において、イソプロパノールの代わ
りにクロロホルム／メタノール（１：１）混合液及びエ
ーテルを用いて、上記操作を繰り返したところ、ＭＫ−
７量は、それぞれ、１５．０μｇ／ｇ及び１３．６μｇ
／ｇであり、イソプロパノールを用いた場合とほぼ同等
のＭＫ−７量を示した。

【０１０９】これに対して、上記と同様にして得られた
日東菌の培養物について、ＭＫ−７量をソックスレー−
ＨＰＬＣ法で測定した結果、日東菌の培養物のＭＫ−７
量は、５６４．０μｇ／ｇであった。

【０１１０】これらの結果から、従来の方法では、納豆
菌を効率よく抽出することが困難であり、培養物のＭＫ
−７量が良好に測定できなかったのに対して、本願発明
で使用されるソックスレー−ＨＰＬＣ法は、従来の方法
に比べて、ＭＫ−７の抽出効率が向上し、培養物のＭＫ
−７量をより良好に測定することができることが示され
た。

【０１１１】

【発明の効果】上述したように、本発明の枯草菌(Bacil
lus subtilis)の培養方法は、枯草菌(Bacillus subtili
s)を培養し、該微生物の菌体内で産生されたビタミンＫ
が菌体外に放出される前に該微生物菌体を回収すること
からなることを特徴とするものである。したがって、本
発明の方法により、枯草菌(Bacillus subtilis)をビタ
ミンＫ誘導体、特にメナキノン−７誘導体を最も多量に
菌体内に貯蔵した状態で回収できる。このため、従来に
比べてより多量の水溶性ビタミンＫ誘導体、特にメナキ
ノン−７誘導体が培養物から回収できる。さらに、特に
納豆菌を使用した場合には、その安全性は確保されてい
るため、上記方法によって培養された培養物またはこの
ような培養物由来の水溶性ビタミンＫ誘導体を含む食
品、飲料または飼料は、従来に比べて多量の水溶性ビタ
ミンＫ誘導体、特にメナキノン−７誘導体を含みかつ高
い安全性を有するため、このような食品、飲料または飼
料を食することによって、ビタミンＫを効率的にかつ簡
単に日常的に摂取することができ、これにより骨粗鬆症
の改善がより一層期待できる。

【０１１２】また、本発明の培養方法によって培養され
る培養物由来の水溶性ビタミンＫ誘導体は、従来脂溶性
であったビタミンＫを水溶性にその性質を変えることが
可能であるという画期的な発明を包含するものであり、
さらに、本発明による水溶性ビタミンＫ誘導体は優れた
光安定性を有するものである。この発明により、従来に
比べてビタミンＫの用途がかなり拡大できることはいう
までもなく、ゆえに本発明は産業上の観点から非常に高
い価値を有することが期待できる。

【０１１３】さらに、本発明による培養物または水溶性
ビタミンＫ誘導体を含む食品を摂取することにより、効
率よく血中ビタミンＫ濃度を高めることができ、また、
従来の薬品や食品で摂取されるビタミンＫそのものに比
べて血中濃度の高まりをはるかに長持間持続できること
から、骨粗鬆症予防のより高い効果も期待できる。

【図面の簡単な説明】

【図１】は、実施例１における調製された納豆菌乾燥物
１ｇを各々５人の健常成人に経口摂取させた時の、経時
的な血漿中のビタミンＫ（メナキノン−７）濃度の変化
を示すグラフである。

【図２】は、実施例２における納豆菌乾燥物１．８×１
０¹⁰細胞を各々５人の健常成人に経口摂取させた時の、
経時的な血漿中のビタミンＫ（メナキノン−７）濃度の
変化を示すグラフである。

【図３】は、実施例３における培養時間に対する各種納
豆菌の成長を示すグラフである。

【図４】は、実施例３における培養時間に対する各種納
豆菌の培養液中のＭＫ−７量を示すグラフである。

【図５】は、実施例３における培養時間に対する各種納
豆菌の菌体内に蓄積されたＭＫ−７量を示すグラフであ
る。

【図６】は、実施例４における菌体内に蓄積されるＭＫ
−７量、線溶活性及び菌体外に放出されたＭＫ−７量を
示すグラフである。

【図７】は、実施例７及び比較例１において、蛍光灯に
よる照射時間に対するＭＫ−７量を示すグラフである。

【図８】は、実施例１０において、ゲル濾過を行った際
のパターンおよび各フラクションにおけるＭＫ−７量を
示すグラフである。

【図９】は、実施例９において、水溶性ビタミンＫ誘導
体及びオカラのイソプロパノール抽出物のＨＰＬＣ分析
結果示すグラフである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） // Ａ６１Ｋ 31/00 ６０３ Ａ６１Ｋ 31/00 ６０３Ｊ ４Ｃ２０６ 31/12 31/12 35/74 35/74 Ａ Ｆターム(参考） 2B150 AA01 AA02 AA03 AA05 AA06 AA08 AA10 AA20 AB10 AC02 AC03 DA18 DD12 DD21 DD26 DE16 4B018 LB04 LE02 MD07 MD23 MD58 MD88 ME02 4B064 AD94 CA02 CC10 CC13 CE08 DA01 DA10 4B065 AA19X AC16 BC03 BC15 BC26 CA09 CA42 4C087 AA01 AA02 AA03 AA04 AA10 BC64 BC65 CA10 CA11 CA36 MA01 MA17 MA52 ZA53 ZA96 ZA97 ZC29 ZC61 4C206 AA01 AA02 AA03 AA04 CB28 MA01 MA04 MA37 MA72 ZA53 ZA96 ZA97 ZC29 ZC61 (54)【発明の名称】 枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ）の培養方法、該方法によって培養される微生物の 培養物、該培養物由来の水溶性ビタミンＫ誘導体ならびに該微生物の培養物またはビタミンＫ誘 導体を含む食品、飲料または飼料

Claims (11)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 枯草菌(Bacillus subtilis)を培養し、
   該微生物の菌体内で産生されたビタミンＫが菌体外に放
   出される前に該微生物菌体を回収することからなる枯草
   菌(Bacillus subtilis)の培養方法。
2. 【請求項２】 該微生物菌体は菌体数が対数期から定常
   期に入る時期に回収される、請求項１に記載の培養方
   法。
3. 【請求項３】 該枯草菌(Bacillus subtilis)は納豆菌
   (Bacillus subtilisnatto)である、請求項１または２に
   記載の培養方法。
4. 【請求項４】 該微生物菌体は菌体数が対数期から定常
   期に入る時期でかつナットウキナーゼが産生される前に
   回収される、請求項３に記載の培養方法。
5. 【請求項５】 請求項１〜４のいずれかに記載される培
   養方法によって培養された枯草菌(Bacillus subtilis)
   の培養物。
6. 【請求項６】 請求項５に記載される枯草菌(Bacillus
   subtilis)の培養物由来の水溶性ビタミンＫ誘導体。
7. 【請求項７】 該ビタミンＫ誘導体はビタミンＫ₂誘導
   体である、請求項６に記載のビタミンＫ誘導体。
8. 【請求項８】 該ビタミンＫ₂誘導体はメナキノン−７
   誘導体である、請求項７に記載のビタミンＫ誘導体。
9. 【請求項９】 請求項５に記載の培養物および／または
   請求項６から８のいずれかに記載の水溶性ビタミンＫ誘
   導体を含む食品、飲料または飼料。
10. 【請求項１０】 枯草菌(Bacillus subtilis)の培養菌
    体をソックスレー抽出することからなるビタミンＫの抽
    出方法。
11. 【請求項１１】 枯草菌(Bacillus subtilis)の培養液
    を酸性化し、沈殿物を得ることからなる水溶性ビタミン
    Ｋ誘導体の分取方法。