CN117467561A - 一种养肝护肝的益生菌发酵物及其应用 - Google Patents

一种养肝护肝的益生菌发酵物及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于食品药品加工技术领域，具体涉及一种养肝护肝的益生菌发酵物及其应用。为了开发食品级、高效、健康、安全的护肝产品，本发明经过多次筛选，筛选得到一株具有养肝护肝功效的植物乳植杆菌Fd‑01，并利用该菌对枸杞子进行连续循环发酵及发酵酶解，再经过浓缩、提纯后得到多肽浓缩物，所得多肽浓缩物富含短链脂肪酸、小分子肽、枸杞多糖，食用后能快速被吸收利用，有利于修复药物性、急性、慢性、过劳性等各类肝脏氧化损伤，在日常食用时，可以非常好、非常及时、非常高效地养护肝脏，保持肝脏健康。本发明为开发食品级、高效、健康、安全的护肝产品提供了新的思路，具有重要的潜在应用价值。

Description

一种养肝护肝的益生菌发酵物及其应用
技术领域
本发明属于食品药品加工技术领域，具体涉及一种养肝护肝的益生菌发酵物及其应用。
背景技术
肝脏是人体糖、蛋白、脂肪这三大营养物质的代谢中心，负责调控人体内的各种代谢活动，肝脏健康与否直接关系到人体的健康状况。随着人们生活节奏的加快，肝脏每日超负荷工作，再加上不良的生活习惯，如：睡眠不足、暴饮暴食、不吃早餐、药物滥用、不良情绪、过量饮酒等，肝脏常常处于亚健康状态，日积月累，肝损伤不断累积及加剧，容易导致机体发病，诱发急性肝炎、慢性肝炎、药物性肝炎、酒精中毒性肝炎、肝硬化、肝衰竭、肝癌、肥胖等疾病。因此，在日常中加强对肝脏的养护，及时高效地修复肝损伤，增强肝脏免疫力，显得格外重要。
目前，市面上的护肝类产品大部分是植物提取物或西药类，其中，植物提取物分子量较大，人体吸收利用率低，导致受损的肝脏得不到及时养护，久而久之，肝脏时常处于亚健康状态。西药类虽有一定效果，但存在副作用，间接危害肝脏或人体其他器官，不适合作为食品进行日常肝脏保养。因此，积极寻找食品级、高效、健康、安全的护肝产品至关重要。
益生菌作为天然的微生物，能够发酵食物基质，分解大分子物质并代谢出短链脂肪酸、活性蛋白、多糖、氨基酸、小分子肽等多种营养物质，能够被人体吸收利用，转运至肝脏参与代谢活动，有利于保持肝脏健康。因此利用益生菌在体外制成小分子发酵浓缩物，食用后能被快速吸收，修复肝细胞损伤，进而提高肝脏酶的活性，提高肝脏的解毒能力，能够非常高效的发挥养护肝脏的作用。可见，挖掘具有养护肝脏作用的益生菌及其多肽浓缩物，有利于开发新的食品级高效护肝产品。
发明内容
为了克服上述现有技术的不足，本发明筛选得到一株具有养肝护肝作用的益生菌—植物乳植杆菌Fd-01，再利用该菌对枸杞子进行发酵，制成富含短链脂肪酸、小分子肽、枸杞多糖的多肽浓缩物，食用后能快速被吸收利用，进而快速地实现养肝护肝的效果，具有广阔的应用前景。
为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：
本发明第一方面提供了一种养肝护肝的益生菌，所述益生菌为植物乳植杆菌Fd-01，保藏编号为CGMCC No.27643。
植物乳植杆菌Fd-01具有养肝护肝的效果，包括修复药物性、急性、慢性、过劳性等各类肝脏氧化损伤，提高肝脏酶的活性，进而提高肝脏的解毒能力和免疫力，进而起到养肝护肝的作用。
本发明第二方面提供了一种养肝护肝的益生菌发酵物，由第一方面所述的植物乳植杆菌Fd-01对枸杞子进行发酵后制得；所述枸杞子为新鲜枸杞子。
本发明第三方面提供了第二方面所述的养肝护肝的益生菌发酵物的制备方法，包括以下步骤：
S1、一轮发酵物的制备：
S11、破壁：将枸杞子洗净、破壁、灭菌，得到枸杞子原浆；
S12、连续循环发酵处理：将植物乳植杆菌Fd-01接种于枸杞子原浆中，经过3次连续循环发酵及膜分离后，合并3次滤液，得到一轮发酵物；
S2、二轮发酵物的制备：
在碱性条件下对枸杞子原浆进行提取、灭菌后，接种植物乳植杆菌Fd-01进行发酵酶解，再经提纯、醇沉后得到二轮发酵物；
S3、将一轮发酵物与二轮发酵物溶解、混匀，经膜分离和干燥后得到益生菌发酵物。
本发明利用植物乳植杆菌Fd-01对枸杞子进行连续循环发酵及发酵酶解，再经过浓缩、提纯后得到多肽浓缩物，富含短链脂肪酸、小分子肽、枸杞多糖，食用后能快速被吸收利用，修复药物性、急性、慢性、过劳性等各类肝脏氧化损伤，在日常食用时，可以非常好、非常及时、非常高效地养护肝脏，保持肝脏健康，疗效显著，健康安全。
优选地，S12的连续循环发酵处理具体为：将植物乳植杆菌Fd-01的菌液接种于枸杞子原浆中，所述植物乳植杆菌Fd-01菌液的添加体积占枸杞子原浆的5％～10％，搅匀后于37～38℃的条件下发酵2～3d，得一级发酵物；将一级发酵物用8～10倍体积、1～2℃的水洗涤，再通过0.22～0.45μm微滤膜，分离滤液及固体基质，滤液记为基料D1，固体基质记为基料D2，将基料D1通过0.005～0.01μm超滤膜，分离滤液及固体基质，滤液记为基料D3，固体基质记为基料D4；将基料D2和基料D4合并，混匀，于37～38℃的条件下发酵2～3d，得二级发酵物；将二级发酵物用8～10倍体积、1～2℃的水洗涤，再通过0.22～0.45μm微滤膜，分离滤液及固体基质，滤液记为基料E1，固体基质记为基料E2，将基料E1通过0.005～0.01μm超滤膜，分离滤液及固体基质，滤液记为基料E3，固体基质记为基料E4；将基料E2和基料E4合并，混匀，于37～38℃的条件下发酵2～3d，得三级发酵物；将三级发酵物用8～10倍体积、1～2℃的水洗涤，再通过0.22～0.45μm微滤膜，分离滤液及固体基质，滤液记为基料F1，固体基质记为基料F2，将基料F1通过0.005～0.01μm超滤膜，分离滤液及固体基质，滤液记为基料F3，固体基质记为基料F4；将基料D3、E3、F3合并，再转移至1～2℃下冷藏储存，得一轮发酵物。
进一步地，植物乳植杆菌Fd-01菌液的添加体积占枸杞子原浆的比例优选地为7-9％，更加优选地为9％。
优选地，S2的发酵酶解具体为：将20～30重量份枸杞子原浆加入20～30重量份水中调匀，用1～2mol/L HCl、1～2mol/L NaOH溶液调节pH值至9.0～10.0，在25～30℃常温下浸提10～12h，提取次数为2～3次，在室温下以6 000～8 000r/min离心60～80s后，过滤，得沉淀和上清液，上清液记为基料H，沉淀记为基料I；将基料H和基料I分别于135～150℃的温度下，灭菌2～5s，冷却至室温，得到的上清液记为基料J、沉淀记为基料K；将植物乳植杆菌Fd-01的菌液以5～8％的体积比分别接种于基料J和基料K中，搅匀后于37～38℃的条件下连续发酵3～4d，得基料L和基料M；用1～2mol/L NaOH将基料L调节到pH＝7～8，在3～4℃、9000～1000rpm的条件下离心30～40min，过滤，得上清液，在1～2℃下冷藏储存，记为基料N；
向基料M中加入30～40倍煮沸的水，密封，置于沸水浴中，500～600r/min搅拌1～2h，冷却后，在3000～4000r/min的条件下离心5～8min，过滤，分离上清液和残渣，上清液记为基料O，残渣记为基料P；向基料P中加入30～40倍煮沸的水，密封，置于沸水浴中，500～600r/min搅拌1～2h，冷却后，在3000～4000r/min的条件下离心5～8min，过滤，分离上清液和残渣，上清液记为基料Q，残渣记为基料R；合并基料O和基料Q，加热煮沸，保持40～60min，冷却后，加入5～6倍浓度为75～95％的乙醇，搅匀后，置于2～4℃下冷藏6～8h后，在4000～5000r/min的条件下离心10～15min，分离上清液和沉淀，沉淀即为糖肽，记为基料S；基料N和基料S即为二轮发酵物。
优选地，S2的膜分离具体为：用1～10kDa超滤管将一轮发酵物与二轮发酵物的混合物在2～4℃、5000～6000g的条件下离心60～90min，收集管底液。
优选地，S2的干燥为冻干，所述冻干为将管底液在冷冻干燥机上冷冻24～36h，并在-50～-40℃的条件下真空干燥24～36h。
优选地，还包括菌种活化步骤：在无菌环境下，将保藏的植物乳植杆菌Fd-01菌种接种于MRS固体培养基上活化后，挑取平板上单菌落接种于MRS液体培养基中，37～38℃下培养12～15h，传代两次，直至菌株浓度达到105～108CFU/mL。
优选地，还包括菌株扩培步骤：将活化后的菌株以1～5％的比例接种于扩培培养基中，培养24～36h，当菌株浓度达到109～1011CFU/mL时，得培养液，即植物乳植杆菌Fd-01的菌液。
优选地，S11具体为：将枸杞子洗净，用破壁机破壁至200～300目，于135～150℃的温度下灭菌2～5s，冷却至室温，得到枸杞子原浆。
本发明第四方面提供了第一方面所述的养肝护肝的益生菌和/或第二方面所述的养肝护肝的益生菌发酵物在制备养肝护肝产品中的应用。
优选地，所述养肝护肝产品包括养肝护肝食品、养肝护肝保健品、养肝护肝药品和养肝护肝营养补充剂。
所述养肝护肝产品可以包括保健品、药品，产品形态可以为液态或固态，可以为粉剂、口服液、悬浮液、膏状物、片剂、颗粒剂等。本发明对植物乳植杆菌Fd-01发酵物(养肝护肝的益生菌发酵物)的应用方式不作严格限制，既可以生产包含有机酸的发酵制品，还可以根据需要用该发酵制品制成干粉，提供下游的应用。
优选地，所述益生菌为活菌体或灭活型菌体。
本发明第五方面提供了一种枸杞肽压片糖果的制备方法，所述枸杞肽压片糖果的原料包括第二方面所述的益生菌发酵物、山梨糖醇，微晶纤维素和硬脂酸镁，所述山梨糖醇、微晶纤维素和硬脂酸镁的质量比为70-80：2-5:1-3，所述益生菌发酵物的添加量占山梨糖醇、微晶纤维素和硬脂酸镁总质量的1.0％-5.0％；所述枸杞肽压片糖果的制备方法为：先将益生菌发酵物、山梨糖醇、微晶纤维素和硬脂酸镁混匀后过50-70目筛网后制得预混料，再于室温、湿度≤50％的条件下将预混料进行压片，控制硬度为15-19kgf，制得枸杞肽压片糖果。
优选地，所述益生菌发酵物的添加量占山梨糖醇、微晶纤维素和硬脂酸镁总质量的2.0％。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明筛选得到一株具有养肝护肝功效的植物乳植杆菌Fd-01，并利用该菌对枸杞子进行连续循环发酵及发酵酶解，再经过浓缩、提纯后得到多肽浓缩物，所得多肽浓缩物富含短链脂肪酸、小分子肽、枸杞多糖，食用后能快速被吸收利用，有利于修复药物性、急性、慢性、过劳性等各类肝脏氧化损伤，在日常食用时，可以非常好、非常及时、非常高效地养护肝脏，保持肝脏健康。本发明为开发食品级、高效、健康、安全的护肝产品提供了新的思路，具有重要的潜在应用价值。
一方面，本发明所提供的养肝护肝益生菌—植物乳植杆菌Fd-01，能够修复药物性、急性、慢性、过劳性等各类肝脏氧化损伤，提高肝脏酶的活性，进而提高肝脏的解毒能力和免疫力，起到养肝护肝的作用。
另一方面，本发明所提供的益生菌发酵物具有养肝护肝的功效，通过植物乳植杆菌对枸杞子进行连续循环发酵及发酵酶解，再经过浓缩、提纯后得到多肽浓缩物，其富含短链脂肪酸、小分子肽、枸杞多糖，食用后能快速被吸收利用，修复药物性、急性、慢性、过劳性等各类肝脏氧化损伤，在日常食用时，可以非常好、非常及时、非常高效地养护肝脏，保持肝脏健康。特别地，用此发酵物制成的产品给人体食用后，能明显看到肝脏各指标从异常快速趋于正常水平，养肝护肝效果非常显著。
另外，本发明所提供的益生菌发酵物采用创新工艺，经过多次筛选获得能够定向养肝护肝的益生菌菌株，再将其接种到枸杞子中进行连续循环发酵及发酵酶解，进而获得丰富的短链脂肪酸、枸杞多糖、小分肽，再经过离心、膜分离技术进行提纯、冻干。使植物乳植杆菌能够定向、高效、集中地分解大分子物质，从而显著提高枸杞肽的养肝护肝功效。同时，本发明的连续循环发酵工艺，发酵过程中使用微滤膜和超滤膜来截留菌体细胞、大分子蛋白及可见杂质，并将这些截留的物质循环回发酵罐中进行再发酵，重复3次，经过这样的循环过程，可以有效解除发酵底物和产物的抑制效果，让菌株更充分得发酵，以获得更高发酵强度的发酵物，具有非常好的新颖性、创造性和实用性。
具体实施方式
下面对本发明的具体实施方式作进一步说明。在此需要说明的是，对于这些实施方式的说明用于帮助理解本发明，但并不构成对本发明的限定。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为可通过常规的商业途径购买得到。
下述实施方式涉及的益生菌中，植物乳植杆菌Fd-01为自己保藏的菌株，其他菌株均购买自中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，具体保藏信息如下：
植物乳植杆菌Fd-01，保藏编号为CGMCC No.27643，分类命名为：植物乳植杆菌(Lactobacillus plantarum)，已于2023年06月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101)，保藏单位的缩写为CGMCC。
植物乳植杆菌JYLP-002，保藏编号为CGMCC No.15801，分类命名为：植物乳植杆菌(Lactobacillus plantarum)，于2018年05月23日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101)，保藏单位的缩写为CGMCC。
植物乳植杆菌JYLP-171，保藏编号为CGMCC No.18037，分类命名为：植物乳植杆菌(Lactobacillus plantarum)，于2019年06月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101)，保藏单位的缩写为CGMCC。
动物双歧杆菌乳亚种JYBR-190，保藏编号为CGMCC No.18092，分类命名为：动物双歧杆菌乳亚种(Bifidobacterium animalis subsp.lactis)，于2019年07月08日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101)，保藏单位的缩写为CGMCC。
嗜酸乳杆菌JYLA-126，保藏编号为CGMCC No.18095，分类命名为：嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)，于2019年07月08日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101)，保藏单位的缩写为CGMCC。
副干酪乳酪杆菌JLPF-131，保藏编号为CGMCC No.18098，分类命名为：副干酪乳酪杆菌(Lacticaseibacillus paracasei)，于2019年07月08日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101)，保藏单位的缩写为CGMCC。
唾液联合乳杆菌JYLS-372，保藏编号为CGMCC No.18044，分类命名为：唾液联合乳杆菌(Ligilactobacillus Salivarius)，于2019年06月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101)，保藏单位的缩写为CGMCC。
罗伊氏粘液乳杆菌JYLB-131，保藏编号为CGMCC No.18040，分类命名为：罗伊氏粘液乳杆菌(Lactobacillus reuteri)，于2019年06月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101)，保藏单位的缩写为CGMCC。
两歧双歧杆菌JYBB-163，保藏编号为CGMCC No.18091，分类命名为：两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)，于2019年07月08日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101)，保藏单位的缩写为CGMCC。
实施例1养肝护肝益生菌的筛选
一、养肝护肝益生菌菌种的筛选
(1)实验菌种
动物双歧杆菌乳亚种JYBR-190、嗜酸乳杆菌JYLA-126、副干酪乳酪杆菌JLPF-131、植物乳植杆菌Fd-01、唾液联合乳杆菌JYLS-372、罗伊氏粘液乳杆菌JYLB-131，两歧双歧杆菌JYBB-163，分别编号A-G。
(2)样品制备
取100g乳清粉，加入900g水溶解，制得复原乳清，在85℃的条件下杀菌10min后，冷却至38℃，分别接种1×108CFU的实验菌种，搅匀后，在38℃的条件下培养64h，取出并转入4℃的冰箱中冷藏12h，于3000r/min离心15min，过滤，分离出上清液。
(3)实验药品
对乙酰氨基酚(APAP，上海麦克林生化科技有限公司)；谷胱甘肽(GSH，华美生物工程公司)。
(4)实验动物
动物SPF级C57BL/6小鼠雄性，7周龄，18～22g，购自南方医科大学实验动物中心。在清洁级层流架中饲养实验动物，饲养环境：相对湿度(75±10)％，温度(23±2)℃，照明时间12h/d(7:00—19:00开灯)。适应性饲养1周后进行实验。
(5)分组与给药
将小鼠随机分成9组，每组8只，分组及给药方式如表1所示。
表1急性肝损伤小鼠造模、分组及给药情况表
(6)肝脏样品处理
给药结束6h后，各鼠分别脱臼处死，剖腹取肝，用2℃生理盐水冲洗血污，滤纸醮干。准确称取0.25g肝脏放入玻璃匀浆器内，在冷浴条件下，用0.02moL EDTA：6％三氯醋酸(1：3)混合溶液制成5％匀浆，用J2-21型高速离心机在13 000r/min下冷冻离心20min，取上清液0.5mL，装入测定管中，测定谷胱甘肽(GSH)的含量。
(7)GSH含量测定
取试管11支(9只GSH测定管、1只GSH标准管和1只空白管)，各依次加入表2所示的试剂。每加一试剂必须摇至混匀，当最后加入50％氢氧化铵溶液(试管应倒转2次)显色后，应立即比色。用蒸馏水调校零点，在λ＝520nm处进行比色，记录各组小鼠各管的光密度值(OD)，最后按下列公式计算小鼠肝脏的GSH含量，结果如表3。
表2各管加入试剂的顺序及量(mL)
试剂名称 测定管 标准管 空白管
肝匀浆上清液 0.5 / /
GSH标准液(0.1mg/mL) / 0.6 /
蒸馏水 0.5 0.4 1.0
10％三氯醋酸溶液 1.0 1.0 1.0
硫酸铵粉末(化学纯，g) 1.5 1.5 1.5
饱和硫酸铵溶液 1.0 1.0 1.0
0.05mol/L亚硝酸铁氰化钠硫酸铵饱和溶液 0.5 0.5 0.5
50％氢氧化铵溶液 0.7 0.7 0.7
(8)实验结果
此次实验使用对乙酰氨基酚建立急性肝损伤模型，以肝脏的谷胱甘肽(GSH)含量变化来判断肝脏养护情况，筛选出能够有效养护肝脏的益生菌种。
当对乙酰氨基酚过量使用时，就会被细胞色素酶转化为大量的NAPQI，导致细胞内GSH的储存迅速耗尽，还会与线粒体膜发生反应，进而导致肝脏发生氧化应激反应，最终引起集中于肝小叶的细胞坏死。同时，死亡的肝细胞也能释放蛋白水解酶，通过破坏邻近肝细胞来加重APAP诱导的肝损伤。GSH在肝脏中含量最高，是机体在生化代谢和肝脏的解毒过程中的重要物质，能保护多种含巯基酶的活性，在解除进入体内的药物毒物方面发挥了重要的作用。此外，GSH还能清除机体内的ROS，减轻肝脏氧化应激反应，保护肝脏。
由表3可知，与空白组相比，模型组的小鼠肝脏GSH含量显著性降低，说明小鼠的肝脏受到严重损伤，表示造模成功。A组～G组的小鼠肝脏GSH含量均有不同程度的增加，说明乳清发酵液能有效保养肝脏，提高肝脏的免疫力，抵御肝损伤，即菌种能养护肝脏。其中，植物乳植杆菌Fd-01的GSH含量最高，因此，选择乳植杆菌属的菌种作为养护肝脏的最佳菌种进行下一步研究。
表3小鼠肝脏GSH含量(μmoL/g)
二、养肝护肝的乳植杆菌属菌株筛选
(1)实验菌株
植物乳植杆菌JYLP-002，植物乳植杆菌JYLP-171，植物乳植杆菌Fd-01，分别编号H～J。
(2)样品制备
取菌粉(委托河北弗蒙特生物科技有限公司生产)H～J适量，分别用0.9％生理盐水制备成1％浓度的菌悬液，于4℃的条件下冷藏待用。
(3)实验动物
6周龄清洁级ICR小白鼠，体重(15±2)g，购自哈尔滨兽医研究所。
(4)小鼠造模
将小鼠采用6μL/g混合溶剂(CCl4：橄榄油＝1：5)灌胃10天，建立慢性肝损伤小鼠模型。灌胃前，随机抽取4只小鼠的血清，灌胃第10天后，随机抽取4只小鼠的血清，按照AST、ALT检测试剂盒说明书检测小鼠血清的ALT、AST活性，结果如表4。
(5)分组与给药
将慢性肝损伤小鼠随机分成4组，每组18只，分别编号H组、I组、J组、K组。其中，H～J组为实验组，K组为不接种菌体的空白对照组，实验组每只小鼠腹腔注射菌悬液0.4mL，随后正常喂养15天。
(6)肝脏谷丙转氨酶和谷草转氨酶活力测定
在第0、3、6、9、12、15天在每组随机抽取3只小鼠，进行剖杀，切取其肝脏，测定谷丙转氨酶(GOT)和谷草转氨酶(GPT)活性，结果如表5、表6所示。
1)谷丙转氨酶(ALT/GPT)的测定
将小鼠肝脏切下，准确称量组织总质量，制成1％的组织匀浆，3500r/min离心10min，取上清液，按照试剂盒说明书的要求进行测定，得到各管OD值，代入说明书提供的标准曲线中求出相应的酶活力单位，最后代入以下计算公式计算出组织中的GPT活力：
2)谷草转氨酶(ALT/GOT)的测定
将小鼠肝脏切下，准确称量组织总量，制成1％的组织匀浆，3500r/min离心10min，取上清液，按照试剂盒说明书的要求进行测定，得到各管OD值，代入标准曲线中求出相应的酶活力单位，最后代入以下计算公式计算出组织中的GOT活力：
(7)实验结果
肝脏是小白鼠营养物质消化的主要腺体，也是尿素合成的主要场所。谷丙转氨酶和谷草转氨酶活性显著提高，能够加快尿素生成，减少氨基酸代谢产物对机体的毒害。由表4可知，灌胃前、灌胃后小鼠ALT、AST指标显著性增加，说明小鼠的肝脏损伤，表示小鼠慢性肝损伤模型造模成功。
通过谷丙转氨酶和谷草转氨酶活性的测定，表5和表6的结果表明，经过植物乳植杆菌干预后，这两种酶的活性在15d内都呈现先升高后下降的趋势，说明植物乳植杆菌可诱导这两种酶活性提高，加强对毒物的排出，其中Fd-01效果最好。随着时间的延长这两种酶的活力都开始下降，逐渐趋于正常水平，说明植物乳植杆菌能够调节修复肝损伤后，能将肝脏酶活性调节至正常水平，保持肝脏健康。其中，植物乳植杆菌Fd-01调节效果最好，因此选择植物乳植杆菌Fd-01作为养肝护肝菌株进行下一步的研究。
表4灌胃前、灌胃后小鼠血清ALT、AST活性变化
卡门氏单位
灌胃前 灌胃后
ALS 7.21±1.07 29.18±2.51
AST 10.35±1.14 39.46±1.28
表5肝脏谷丙转氨酶活力(U/mgprot)
天数 K组 H组 I组 J组
第0天 80.61±0.53 80.32±1.14 80.95±0.88 81.72±1.22
第3天 81.25±1.16 94.50±1.73 97.64±1.29 120.01±1.15
第6天 81.04±1.27 104.39±1.51 115.70±1.81 90.37±2.68
第9天 80.99±0.68 117.20±2.91 83.27±1.66 50.24±3.71
第12天 81.32±1.71 73.44±1.72 42.28±1.76 20.43±1.92
第15天 81.19±0.46 32.89±0.85 25.93±1.54 17.92±1.43
表6肝脏谷草转氨酶活力(U/mgprot)
天数 K组 H组 I组 J组
第0天 63.15±1.28 62.73±1.08 63.29±1.77 63.62±1.99
第3天 62.18±2.27 68.56±3.12 69.57±1.32 75.80±2.32
第6天 63.73±1.70 71.36±2.63 72.39±2.15 33.47±1.85
第9天 63.48±2.83 50.43±1.28 48.11±1.35 16.34±1.37
第12天 62.92±3.59 25.16±1.83 18.53±1.14 15.56±1.18
第15天 62.38±1.91 23.37±1.54 17.72±2.16 14.65±2.07
实施例2养肝护肝益生菌发酵物及糖果压片的制备
一、植物乳植杆菌Fd-01发酵制备枸杞肽
对枸杞子进行连续循环发酵及发酵酶解，再经过浓缩、提纯后得到多肽浓缩物，具体如下：
1、植物乳植杆菌Fd-01发酵比例筛选
(1)破壁：将60重量份新鲜枸杞子洗净，用破壁机破壁至200目，平均分成2份，每份30重量份(另一个30份用于后续发酵酶解比例筛选实验)，记为基料A；
(2)灭菌：将其中30重量份的基料A于135℃的温度下灭菌2s，冷却至室温，得基料B；
(3)MRS培养基(g/L)的配制：蛋白胨10，牛肉浸粉8，酵母浸粉4，葡萄糖20，磷酸氢二钾2，柠檬酸氢二铵2，乙酸钠5，硫酸镁0.2，硫酸锰0.04，吐温80 1.0，pH 5.8，118℃灭菌15min，固体培养基则添加琼脂15g/L；
(4)扩培培养基(g/L)的配制：脱脂乳粉30，葡萄糖70，基料A 40，pH 5.8，135℃灭菌2s；
(5)菌种活化：在无菌环境下，将保藏的植物乳植杆菌Fd-01菌种接种于MRS固体培养基上活化后，挑取平板上的单菌落接种于MRS液体培养基中，38℃下培养12h，传代两次，直至菌株浓度达到107CFU/mL；
(6)菌株扩培：将活化后的菌株以1％的体积比接种于扩培培养基中，培养24h，当菌株浓度达到109CFU/mL时，得培养液，记为基料C；
(7)连续循环发酵：将一定量的植物乳植杆菌Fd-01培养液(基料C)接种于基料B中，菌株培养液的添加体积占基料B的0.0％、3.0％、5.0％、7.0％、9.0％、11.0％，搅匀后于38℃的条件下发酵2d，得一级发酵物，将一级发酵物用10倍体积的纯化水(2℃)洗涤，再通过0.22μm微滤膜分离滤液及固体基质，滤液记为基料D1，固体基质记为基料D2；将基料D1通过0.005μm超滤膜分离滤液及固体基质，滤液记为基料D3，固体基质记为基料D4；将基料D2和基料D4合并，混匀，于38℃的条件下发酵2d，得二级发酵物；将二级发酵物用10倍体积的纯化水(2℃)洗涤，再通过0.22μm微滤膜分离滤液及固体基质，滤液记为基料E1，固体基质记为基料E2，将基料E1通过0.005μm超滤膜分离滤液及固体基质，滤液记为基料E3，固体基质记为基料E4；将基料E2和基料E4合并，混匀，于38℃的条件下发酵2d，得三级发酵物；将三级发酵物用10倍体积的纯化水(2℃)洗涤，再通过0.22μm微滤膜分离滤液及固体基质，滤液记为基料F1，固体基质记为基料F2，将基料F1通过0.005μm超滤膜分离滤液及固体基质，滤液记为基料F3，固体基质记为基料F4。将基料D3、E3、F3合并，再转移至2℃的冰箱中冷藏储存，得到一轮发酵物，记为基料G(6种不同发酵比例的发酵物分别标记为基料G1、基料G2、基料G3、基料G4、基料G5、基料G6)。
(8)短链脂肪酸含量测定：采用气相色谱法对基料G1、基料G2、基料G3、基料G4、基料G5、基料G6进行短链脂肪酸含量测定，结果如表8所示。
其中，气相色谱法测定包括以下操作步骤：
1)样品提取：分别取2mL基料G于15mL离心管中，加入50％的硫酸溶液0.2mL，再加入乙醚2.0mL，振荡30次后离心(＞10000r/min)5min，置冰箱(4℃)内放置30min，取上层乙醚溶液作为GC分析。
2)气相色谱条件：色谱柱：FFAP弹性石英毛细管柱(30m×0.25mm×0.25μm)；色谱柱温度程序：100℃(1min)→150℃(5min)；载气:高纯氮气，纯度≥99.999％；载气流速2mL/min；进样口温度：270℃；进样方式：无分流进样，进样量2.0μL；检测器温度(FID)：280℃。
3)检测：在气相色谱条件下进样测定，记录空白及样品色谱图，按外标法以峰面积计算，结果如表7所示。
4)按照同样的方法，同样的条件，以自动进样法测定标准品“乙酸、丙酸、丁酸”等6种(Short Chain Fattty Acids，SCFA)，得到其色谱峰，记录各色谱峰的保留时间。
(9)实验结果
短链脂肪酸(SCFA)也称挥发性脂肪酸，是含有1～6个碳原子的有机脂肪酸的总称，主要包括乙酸、丙酸和丁酸。乙酸绝大部分会被吸收入血液，进入肝中代谢，主要用于脂质和胆固醇的合成，并作为周边组织的能源，有利于降脂护肝。丙酸经结肠吸收后可作为糖异生的底物，并能抑制3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶活性而降低胆固醇的合成，有利于养护肝脏。丁酸能被结肠上皮细胞吸收利用，是结肠、盲肠能量的首选来源，有利于保持肠道健康，减轻毒素在肝脏累积。
由表7可知，基料G5的短链脂肪酸含量最高，因此，选择基料G5的添加量作为最佳发酵比例，即9％。
表7不同发酵比例的发酵物的短链脂肪酸含量/％
基料G1 基料G2 基料G3 基料G4 基料G5 基料G6
乙酸 0.00 0.39 0.75 2.14 4.01 3.28
丙酸 0.00 0.26 0.53 1.67 3.34 2.61
丁酸 0.00 0.23 0.34 0.55 1.56 1.10
2、植物乳植杆菌Fd-01发酵酶解比例筛选
(1)提取：取30重量份基料A，加入30重量份蒸馏水调匀，用1mol/L HCl、1mol/LNaOH溶液调节pH值至9.0，在25℃常温下浸提10h，提取2次，在室温下以6 000r/min离心60s后，过滤，得沉淀和上清液，上清液记为基料H，沉淀记为基料I；
(2)灭菌：将基料H和基料I分别于135℃的温度下灭菌2s，冷却至室温，得基料J(上清液)和基料K(沉淀)；
(3)发酵酶解：将基料C按一定的比例分别接种于基料J和基料K中，基料C的添加质量占基料J或基料K的0.0％、1.0％、3.0％、5.0％、7.0％、9.0％，搅匀后于38℃的条件下连续发酵3d，得基料L和基料M；
(4)提纯：用1mol/L NaOH将基料L调节到pH＝7，在4℃、9000rpm的条件下离心30min，过滤，得上清液，在2℃的冰箱中冷藏储存，记为基料N；
(5)醇沉：向基料M加入30倍煮沸的蒸馏水，密封，置于沸水浴中，500r/min搅拌1h，冷却后，在3000r/min的条件下离心5min，过滤，分离上清液和残渣，上清液记为基料O，残渣记为基料P；向基料P加入30倍煮沸的蒸馏水，密封，置于沸水浴中，500r/min搅拌1h，冷却后，在3000r/min的条件下离心5min，过滤，分离上清液和残渣，上清液记为基料Q，残渣记为基料R。合并基料O和基料Q，加热煮沸，保持40min，冷却后，加入5倍浓度为95％的乙醇，搅匀后，置于4℃的冰箱中冷藏6h后，在4000r/min的条件下离心10min，分离上清液和沉淀，沉淀即为糖肽，记为基料S，所得基料N和基料S为二轮发酵物；
(6)混合：将基料S用10倍蒸馏水溶解，冷却至4℃后，与基料G5、基料N混匀后，得基料T1；
(7)膜分离：用10kDa超滤管将基料T1在4℃、5000g的条件下离心60min，收集管底液，记为基料U1。
(8)冻干：将基料U1在冷冻干燥机上冷冻24h，在-50℃的条件下真空干燥24h，得基料V(不同菌株添加量发酵制得的基料分别标记为基料V1、基料V2、基料V3、基料V4、基料V5、基料V6)，即得益生菌发酵物—枸杞肽。
根据中华人民共和国国家标准QB/T 5298-2018(低聚肽含量测定方法)对基料V1的低聚肽进行含量检测，结果如表8。
根据中华人民共和国国家标准QB/T5298-2018(相对分子质量小于1000u的蛋白质水解物所占比例的测定方法)对基料V1-6的蛋白质水解物(相对分子质量小于1000u)进行含量检测，结果如表8。
根据中华人民共和国轻工行业标准QB/T 5176-2017(枸杞多糖)对基料V1-6的枸杞多糖进行含量检测，结果如表8。
(9)实验结果
由表8可知，随着植物乳植杆菌Fd-01接种量的增加，低聚肽、蛋白质水解物、枸杞多糖的含量也在不断增加，说明Fd-01能将枸杞子中的糖类、蛋白质类大分子酶解成小分子，当接种量为5％时，枸杞子发酵酶解产物中低聚肽的量、蛋白质水解物的量、多糖含量均达到平稳状态。因此，选择基料V4的添加量作为益生菌发酵枸杞子的最佳添加量，即5％。
表8枸杞子发酵酶解产物的相关指标
3、枸杞肽压片糖果的制备
(1)混料：将70重量份山梨糖醇，2重量份微晶纤维素和1重量份硬脂酸镁混匀，再加入一定量步骤2最佳工艺制备的枸杞肽，枸杞肽的添加量占上述混合物总质量的0.0％、0.5％、1.0％、1.5％、2.0％、2.5％，混匀后过60目筛网后得预混料。
(2)直压：调节室温20℃、湿度≤40％后，将预混料置于压片机上直接压片，控制硬度为15kgf，得枸杞肽压片糖果(不同枸杞肽添加量的压片糖果分别标记为1-6号枸杞肽压片糖果)。
对比例1枸杞子压片糖果的制备
(1)破壁：将30重量份新鲜枸杞子洗净，用破壁机破壁至200目，记为基料A；
(2)灭菌：将基料A于135℃的温度下灭菌2s，冷却至室温，得基料B；
(3)冻干：将基料B在冷冻干燥机上冷冻24h，在-50℃的条件下真空干燥24h，得基料V，即得枸杞子粉；
(4)混料：将70重量份山梨糖醇，2重量份微晶纤维素和1重量份硬脂酸镁混匀，再加入一定量上述步骤制备的枸杞子粉，枸杞子粉的添加量占上述混合物总质量的2.5％，混匀后过60目筛网后得预混料。
(2)直压：调节室温20℃、湿度≤40％后，将预混料置于压片机上直接压片，控制硬度为15kgf，得枸杞子压片糖果。
对比例2Fd-01压片糖果的制备
(1)混料：将70重量份山梨糖醇，2重量份微晶纤维素和1重量份硬脂酸镁混匀，再加入植物乳植杆菌Fd-01菌粉，植物乳植杆菌Fd-01菌粉的添加量占上述混合物总质量的2.5％，混匀后过60目筛网后得预混料。
(2)直压：调节室温20℃、湿度≤40％后，将预混料置于压片机上直接压片，控制硬度为15kgf，得Fd-01压片糖果。
对比例3 7号枸杞肽压片糖果的制备
(1)破壁：将30重量份新鲜枸杞子洗净，用破壁机破壁至200目，记为基料A；
(2)灭菌：将基料A于135℃的温度下灭菌2s，冷却至室温，得基料B；
(3)MRS培养基(g/L)的配制：蛋白胨10，牛肉浸粉8，酵母浸粉4，葡萄糖20，磷酸氢二钾2，柠檬酸氢二铵2，乙酸钠5，硫酸镁0.2，硫酸锰0.04，吐温80 1.0，pH 5.8，118℃灭菌15min，固体培养基则添加琼脂15g/L；
(4)扩培培养基(g/L)的配制：脱脂乳粉30，葡萄糖70，基料A 40，pH 5.8，135℃灭菌2s；
(5)菌种活化：在无菌环境下，将保藏的植物乳植杆菌Fd-01菌种接种于MRS固体培养基上活化后，挑取平板上的单菌落接种于MRS液体培养基中，38℃下培养12h，传代两次，直至菌株浓度达到107CFU/mL；
(6)菌株扩培：将活化后的菌株以1％的体积比接种于扩培培养基中，培养24h，当菌株浓度达到109CFU/mL时，得培养液，记为基料C；
(7)连续循环发酵：将一定量的植物乳植杆菌Fd-01培养液(基料C)接种于基料B中，菌株培养液的添加体积占基料B的9.0％，搅匀后于38℃的条件下发酵2d，得一级发酵物，将一级发酵物用10倍体积的纯化水(2℃)洗涤，再通过0.22μm微滤膜分离滤液及固体基质，滤液记为基料D1，固体基质记为基料D2；将基料D1通过0.005μm超滤膜分离滤液及固体基质，滤液记为基料D3，固体基质记为基料D4；将基料D2和基料D4合并，混匀，于38℃的条件下发酵2d，得二级发酵物；将二级发酵物用10倍体积的纯化水(2℃)洗涤，再通过0.22μm微滤膜分离滤液及固体基质，滤液记为基料E1，固体基质记为基料E2，将基料E1通过0.005μm超滤膜分离滤液及固体基质，滤液记为基料E3，固体基质记为基料E4；将基料E2和基料E4合并，混匀，于38℃的条件下发酵2d，得三级发酵物；将三级发酵物用10倍体积的纯化水(2℃)洗涤，再通过0.22μm微滤膜分离滤液及固体基质，滤液记为基料F1，固体基质记为基料F2，将基料F1通过0.005μm超滤膜分离滤液及固体基质，滤液记为基料F3，固体基质记为基料F4。将基料D3、E3、F3合并，再转移至2℃的冰箱中冷藏储存，得到一轮发酵物，记为基料G。
(8)冻干：将基料G在冷冻干燥机上冷冻24h，在-50℃的条件下真空干燥24h，得基料V，即得益生菌发酵物—枸杞肽；
(9)混料：将70重量份山梨糖醇，2重量份微晶纤维素和1重量份硬脂酸镁混匀，再加入一定量上述步骤制备的枸杞肽，枸杞肽的添加量占上述混合物总质量的2.5％，混匀后过60目筛网后得预混料。
(10)直压：调节室温20℃、湿度≤40％后，将预混料置于压片机上直接压片，控制硬度为15kgf，得7号枸杞肽压片糖果。
对比例4 8号枸杞肽压片糖果的制备
(1)破壁：将30重量份新鲜枸杞子洗净，用破壁机破壁至200目，记为基料A；
(2)提取：取基料A，加入30重量份蒸馏水调匀，用1mol/L HCl、1mol/L NaOH溶液调节pH值至9.0，在25℃常温下浸提10h，提取2次，在室温下以6 000r/min离心60s后，过滤，得沉淀和上清液，上清液记为基料H，沉淀记为基料I；
(3)灭菌：将基料H和基料I分别于135℃的温度下灭菌2s，冷却至室温，得基料J(上清液)和基料K(沉淀)；
(4)MRS培养基(g/L)的配制：蛋白胨10，牛肉浸粉8，酵母浸粉4，葡萄糖20，磷酸氢二钾2，柠檬酸氢二铵2，乙酸钠5，硫酸镁0.2，硫酸锰0.04，吐温80 1.0，pH 5.8，118℃灭菌15min，固体培养基则添加琼脂15g/L；
(5)扩培培养基(g/L)的配制：脱脂乳粉30，葡萄糖70，基料A 40，pH 5.8，135℃灭菌2s；
(6)菌种活化：在无菌环境下，将保藏的植物乳植杆菌Fd-01菌种接种于MRS固体培养基上活化后，挑取平板上的单菌落接种于MRS液体培养基中，38℃下培养12h，传代两次，直至菌株浓度达到107CFU/mL；
(7)菌株扩培：将活化后的菌株以1％的体积比接种于扩培培养基中，培养24h，当菌株浓度达到109CFU/mL时，得培养液，记为基料C；
(8)发酵酶解：将基料C按一定的比例分别接种于基料J和基料K中，基料C的添加质量占基料J或基料K的0.0％、1.0％、3.0％、5.0％、7.0％、9.0％，搅匀后于38℃的条件下连续发酵3d，得基料L和基料M；
(9)提纯：用1mol/L NaOH将基料L调节到pH＝7，在4℃、9000rpm的条件下离心30min，过滤，得上清液，在2℃的冰箱中冷藏储存，记为基料N；
(10)醇沉：向基料M加入30倍煮沸的蒸馏水，密封，置于沸水浴中，500r/min搅拌1h，冷却后，在3000r/min的条件下离心5min，过滤，分离上清液和残渣，上清液记为基料O，残渣记为基料P；向基料P加入30倍煮沸的蒸馏水，密封，置于沸水浴中，500r/min搅拌1h，冷却后，在3000r/min的条件下离心5min，过滤，分离上清液和残渣，上清液记为基料Q，残渣记为基料R。合并基料O和基料Q，加热煮沸，保持40min，冷却后，加入5倍浓度为95％的乙醇，搅匀后，置于4℃的冰箱中冷藏6h后，在4000r/min的条件下离心10min，分离上清液和沉淀，沉淀即为糖肽，记为基料S，所得基料N和基料S为二轮发酵物；
(11)混合：将基料S用10倍蒸馏水溶解，冷却至4℃后，与基料N混匀后，得基料T1；
(12)膜分离：用10kDa超滤管将基料T1在4℃、5000g的条件下离心60min，收集管底液，记为基料U1。
(13)冻干：将基料U1在冷冻干燥机上冷冻24h，在-50℃的条件下真空干燥24h，得基料V，即得益生菌发酵物—枸杞肽；
(14)混料：将70重量份山梨糖醇，2重量份微晶纤维素和1重量份硬脂酸镁混匀，再加入一定量上述步骤制备的枸杞肽，枸杞肽的添加量占上述混合物总质量的2.5％，混匀后过60目筛网后得预混料。
(15)直压：调节室温20℃、湿度≤40％后，将预混料置于压片机上直接压片，控制硬度为15kgf，得8号枸杞肽压片糖果。
实验例1枸杞肽压片糖果养肝护肝功效的人群测试试验
(1)实验样品：1-8号枸杞肽压片糖果、枸杞子压片糖果、Fd-01压片糖果、市售护肝压片糖果(O.H.Health北欧健康)。
(2)食用方式：直接吞服，每日1片，连续10天。
(3)人群招募：招募55名志愿者(从公司内部招募)，志愿者的谷丙转氨酶(GPT)，谷草转氨酶(GOT)均偏高(均为55U/L以上)，年龄范围22～60岁。
(4)试验方法：将志愿者随机分成11组，每组5人，记为A、B、C、D、E、F、G、H、I、J、K组，安排志愿者分别服用上述样品，即A组志愿者食用1号枸杞肽压片糖果、B组志愿者食用2号枸杞肽压片糖果、C组志愿者食用3号枸杞肽压片糖果、D组志愿者食用4号枸杞肽压片糖果、E组志愿者食用5号枸杞肽压片糖果、F组志愿者食用6号枸杞肽压片糖果、G组志愿者食用市售某护肝压片糖果、H组志愿者食用枸杞子压片糖果、I组志愿者食用Fd-01压片糖果、J组志愿者食用7号枸杞肽压片糖果、K组志愿者食用8号枸杞肽压片糖果，记录志愿者的谷丙转氨酶(GPT)，谷草转氨酶(GOT)在食用前后的变化情况，结果如表9。
由表9可知，志愿者在食用枸杞肽护肝压片糖果、市售某护肝压片糖果后，其肝脏的谷丙转氨酶(GPT)，谷草转氨酶(GOT)等指标均有不同程度的降低，说明肝损伤有得到缓解。其中E组、F组志愿者的GPT、GOT的数值前后变化最为显著，且显著优于市售产品，说明5号枸杞肽压片糖果效果最好，E组和F组差异不明显，说明枸杞肽的添加量达到饱和状态，因此选择5号枸杞肽添加量作为最优组方，即2％。可见，本发明的枸杞肽为植物乳植杆菌Fd-01发酵枸杞子制成的枸杞肽浓缩物，其富含短链脂肪酸、小分子肽、枸杞多糖，食用后能快速被吸收利用，修复药物性、急性、慢性、过劳性等各类肝脏氧化损伤，在日常食用时，可以非常好、非常及时、非常高效地养护肝脏，保持肝脏健康，疗效显著，健康安全。
此外，通过
表9受试人群的GPT、GOT指标变化(U/L)
以上对本发明的实施方式作了详细说明，但本发明不限于所描述的实施方式。对于本领域的技术人员而言，在不脱离本发明原理和精神的情况下，对这些实施方式进行多种变化、修改、替换和变型，仍落入本发明的保护范围内。

Claims (10)

1.一种养肝护肝的益生菌，其特征在于，所述益生菌为植物乳植杆菌Fd-01，保藏编号为CGMCC No.27643。
2.一种养肝护肝的益生菌发酵物，其特征在于，由权利要求1所述的植物乳植杆菌Fd-01对枸杞子进行发酵后制得。
3.权利要求2所述的养肝护肝的益生菌发酵物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、一轮发酵物的制备：
S11、破壁：将枸杞子洗净、破壁、灭菌，得到枸杞子原浆；
S12、连续循环发酵处理：将植物乳植杆菌Fd-01接种于枸杞子原浆中，经过3次连续循环发酵及膜分离后，合并3次滤液，得到一轮发酵物；
S2、二轮发酵物的制备：
在碱性条件下对枸杞子原浆进行提取、灭菌后，接种植物乳植杆菌Fd-01进行发酵酶解，再经提纯、醇沉后得到二轮发酵物；
S3、将一轮发酵物与二轮发酵物溶解、混匀，经膜分离和干燥后得到益生菌发酵物。
4.根据权利要求3所述的养肝护肝的益生菌发酵物的制备方法，其特征在于，S12的连续循环发酵处理具体为：将植物乳植杆菌Fd-01的菌液接种于枸杞子原浆中，所述植物乳植杆菌Fd-01菌液的添加体积占枸杞子原浆的5％～10％，搅匀后于37～38℃的条件下发酵2～3d，得一级发酵物；将一级发酵物用8～10倍体积、1～2℃的水洗涤，再通过0.22～0.45μm微滤膜，分离滤液及固体基质，滤液记为基料D1，固体基质记为基料D2，将基料D1通过0.005～0.01μm超滤膜，分离滤液及固体基质，滤液记为基料D3，固体基质记为基料D4；将基料D2和基料D4合并，混匀，于37～38℃的条件下发酵2～3d，得二级发酵物；将二级发酵物用8～10倍体积、1～2℃的水洗涤，再通过0.22～0.45μm微滤膜，分离滤液及固体基质，滤液记为基料E1，固体基质记为基料E2，将基料E1通过0.005～0.01μm超滤膜，分离滤液及固体基质，滤液记为基料E3，固体基质记为基料E4；将基料E2和基料E4合并，混匀，于37～38℃的条件下发酵2～3d，得三级发酵物；将三级发酵物用8～10倍体积、1～2℃的水洗涤，再通过0.22～0.45μm微滤膜，分离滤液及固体基质，滤液记为基料F1，固体基质记为基料F2，将基料F1通过0.005～0.01μm超滤膜，分离滤液及固体基质，滤液记为基料F3，固体基质记为基料F4；将基料D3、E3、F3合并，再转移至1～2℃下冷藏储存，得一轮发酵物。
5.根据权利要求3所述的养肝护肝的益生菌发酵物的制备方法，其特征在于，S2的发酵酶解具体为：将20～30重量份枸杞子原浆加入20～30重量份水中调匀，用1～2mol/L HCl、1～2mol/L NaOH溶液调节pH值至9.0～10.0，在25～30℃常温下浸提10～12h，提取次数为2～3次，在室温下以6 000～8 000r/min离心60～80s后，过滤，得沉淀和上清液，上清液记为基料H，沉淀记为基料I；将基料H和基料I分别于135～150℃的温度下，灭菌2～5s，冷却至室温，得到的上清液记为基料J、沉淀记为基料K；将植物乳植杆菌Fd-01的菌液以5～8％的体积比分别接种于基料J和基料K中，搅匀后于37～38℃的条件下连续发酵3～4d，得基料L和基料M；用1～2mol/L NaOH将基料L调节到pH＝7～8，在3～4℃、9000～1000rpm的条件下离心30～40min，过滤，得上清液，在1～2℃下冷藏储存，记为基料N；
向基料M中加入30～40倍煮沸的水，密封，置于沸水浴中，500～600r/min搅拌1～2h，冷却后，在3000～4000r/min的条件下离心5～8min，过滤，分离上清液和残渣，上清液记为基料O，残渣记为基料P；向基料P中加入30～40倍煮沸的水，密封，置于沸水浴中，500～600r/min搅拌1～2h，冷却后，在3000～4000r/min的条件下离心5～8min，过滤，分离上清液和残渣，上清液记为基料Q，残渣记为基料R；合并基料O和基料Q，加热煮沸，保持40～60min，冷却后，加入5～6倍浓度为75～95％的乙醇，搅匀后，置于2～4℃下冷藏6～8h后，在4000～5000r/min的条件下离心10～15min，分离上清液和沉淀，沉淀即为糖肽，记为基料S；基料N和基料S即为二轮发酵物。
6.根据权利要求3所述的养肝护肝的益生菌发酵物的制备方法，其特征在于，S2的膜分离具体为：用1～10kDa超滤管将一轮发酵物与二轮发酵物的混合物在2～4℃、5000～6000g的条件下离心60～90min，收集管底液。
7.权利要求1所述的养肝护肝的益生菌和/或权利要求2所述的养肝护肝的益生菌发酵物在制备养肝护肝产品中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述养肝护肝产品包括养肝护肝食品、养肝护肝保健品、养肝护肝药品和养肝护肝营养补充剂。
9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述益生菌为活菌体或灭活型菌体。
10.一种枸杞肽压片糖果的制备方法，其特征在于，所述枸杞肽压片糖果的原料包括权利要求2所述的益生菌发酵物、山梨糖醇，微晶纤维素和硬脂酸镁，所述山梨糖醇、微晶纤维素和硬脂酸镁的质量比为70-80：2-5:1-3，所述益生菌发酵物的添加量占山梨糖醇、微晶纤维素和硬脂酸镁总质量的1.0％-5.0％；所述枸杞肽压片糖果的制备方法为：先将益生菌发酵物、山梨糖醇、微晶纤维素和硬脂酸镁混匀后过50-70目筛网后制得预混料，再于室温、湿度≤50％的条件下将预混料进行压片，控制硬度为15-19kgf，制得枸杞肽压片糖果。
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