CN114573662A - 一种普卡那肽铵盐的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及多肽纯化技术领域，尤其涉及一种普卡那肽铵盐的制备方法。该方法利用反相柱色谱洗脱转盐方法，明显降低了异丙醇的用量不额外增加成本，相比于原研专利，本发明提供的制备方法获得的产品纯度高，氧化杂质含量低，异丙醇使用量少，仅需一次冻干即可获得普卡那肽铵盐，大大降低了生产成本。
Description
技术领域
本发明涉及多肽技术领域，尤其涉及一种普卡那肽铵盐的制备方法。
背景技术
慢性特发性便秘(chronicidiopathicconstipation，CIC)属于下消化道动力学障碍性疾病，其发病与结肠、肛门直肠动力学及精神心理异常有关，为老年人群的常见多发病，随着现代人生活水平的提高和工作压力的影响,此类疾病有开始趋近于年轻化的趋势。流行病学调查结果显示，世界各国和地区因饮食结构和生活习惯各异，CIC的发病率有较大差异。据不完全统计，欧美等发达国家为2.0％～28.0％；中国南北方地区为9.0％～20.3％,随着国家老龄化时期的到来,CIC的发病率也会有增加的风险。
普卡那肽,英文通用名：Plecanatide，CAS号：467426-54-6,肽序：Asn1-Asp2-Glu3-Cys4-Glu5-Leu6-Cys7-Val8-Asn9-Val10-Ala11-Cys12-Thr13-Gly14-Cys15-Leu16(4和12成环，7和15成环)。分子式：C65H104 O26N18S4,分子量：1681.887,pI：直链肽＝3.51，完全氧化后的pI也按照3.51计，具体肽序如下：
于2017年1月19日获得美国食品药品管理局(FDA)批准上市，商品名为Trulance。普卡那肽是促尿钠排泄的鸟苷酸环化酶C(guanylatecyclase-C，GC-C)受体激动药，能调节胃肠道中的酸碱离子，诱导液体转运进入胃肠道，增加胃肠道的蠕动，适用于治疗成人CIC。
目前，现有的普卡那肽纯化工艺对于转盐采用纯化水和异丙醇进行梯度洗脱的方法，填料可以采用高压C18填料，大孔吸附树脂的聚苯乙烯填料等，先将样品上样,首先反向洗脱色谱柱将里面之前的纯化使用的缓冲盐，乙腈等溶剂置换，再正向洗脱将样品洗脱下色谱柱，从而得到普卡那肽铵盐的产品，普卡那肽本身不含有碱性氨基酸，其含有四个羧基，可与铵根进行结合，从而增加多肽的稳定性。
然而，以上专利公开的方法采用较大量的异丙醇(约30％)，不可避免的将异丙醇中含有的过氧化物带入产品，使得产品有很大几率与过氧化物产生反应，增加了氧化杂质，从而影响产品质量，同时大量的异丙醇去除需要产品进行二次冻干，增加了能源的输出，增加了生产成本。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种普卡那肽铵盐的制备方法。该方法获得的产品纯度高，氧化杂质含量低，异丙醇使用量少，仅需一次冻干即可获得普卡那肽铵盐，大大降低了生产成本。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供一种普卡那肽的转盐纯化方法，包括如下步骤：
1)取经色谱纯化后的普卡那肽馏分，用酸调节pH至2.5-4.5，加水稀释，获得普卡那肽稀释液；
2)将所述普卡那肽稀释液上反相色谱柱，以三氟乙酸铵水溶液为流动相A，以异丙醇为流动相B，等度洗脱7-15min；
3)以氨水为流动相A’，以异丙醇为流动相B，先等度洗脱7-15min，再梯度洗脱，直至洗脱完成；
4)收集洗脱液，所述洗脱液的pH值为6-7，将所述洗脱液冻干，获得普卡那肽铵盐。
本发明利用反相柱色谱洗脱转盐方法，在转盐之前，调节馏分pH至适宜的范围，使得在转盐后馏分纯度明显增高，同时具有适宜的pH，稳定性良好，因此在保存无需加入多余的酸来让馏分进入产品稳定的pH范围，不增加多余的酸根，在得到对称单峰的同时也避免了产品在色谱柱中pH值过高导致产品在色谱柱中不保留，造成产品损失。
一些实施方案中，步骤1)中，所述普卡那肽馏分与水的质量比为1:1。
一些实施方案中，步骤1)中所述酸为磷酸、硫酸、甲酸和三氟乙酸中的任一种；一些具体实施例中，所述酸为磷酸。磷酸为常用与调节pH值的酸，酸性为中强酸且在调节的pH值范围内具有一定的缓冲能力，方便进行pH值的调节。
一些实施方案中，步骤1)中所述用酸调节pH至3.0～4.0，优选为3.5。
本发明中，三氟乙酸铵为第一步洗脱的流动相，三氟乙酸自身具有很强的挥发性，在冻干过程中易于去除，残留量低。一些实施方案中，步骤2)中，所述TFA水溶液的体积百分比浓度为0.05％-0.5％。
本发明对反相色谱柱的填料没有特殊限定，本领域常见的种类即可。
一些实施方案中，步骤2)中，所述等度洗脱的流动相为97％A+3％B。
一些实施方案中，步骤3)中，所述氨水的质量百分比浓度为0.1％。
一些实施方案中，步骤3)中：所述梯度洗脱采用线性梯度洗脱，流动相中A’的含量以0.25％/min的速率逐渐在减少，B的含量以0.25％/min的速率逐渐在增加，直至变化为87％A’+13％B。一些实施方案中，步骤3)中，所述线性梯度洗脱的时间为20～40min。
本发明利用反相柱色谱洗脱转盐方法，明显降低了异丙醇的用量不额外增加成本，相比于原研专利，本发明提供的制备方法获得的产品纯度高，氧化杂质含量低，异丙醇使用量少，仅需一次冻干即可获得普卡那肽铵盐，大大降低了生产成本。
附图说明
图1示实施例1转盐纯化过程中的色谱图；
图2示实施例2转盐纯化过程中的色谱图；
图3示实施例6转盐纯化过程中的色谱图；
图4示对比例1转盐纯化过程中的色谱图；
图5示对比例3中醋酸铵转盐洗脱液的色谱分析图。
具体实施方式
本发明提供了一种普卡那肽铵盐的制备方法。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明中，缩写及英文含义见表1：
表1 缩写及英文含义
本发明采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1：普卡那肽转盐纯化
将定量约为392mg纯化后的产品合格馏分先用硫酸调节至pH2.5，用纯化水稀释一倍后，上样，上样后采用三氟乙酸铵(0.05％TFA用稀氨水调节pH值至6)和异丙醇97:3的比例洗脱反向色谱柱7分钟，然后将三氟乙酸铵更换为0.1％氨水，再洗脱7分钟后，进行线性梯度洗脱(异丙醇含量3％-13％，40min)，直到产品完成洗脱，直接冻干后得到产品356mg，纯度为98.53％，拓扑杂质为0.52％，产品转盐的回收率为90.8％。调节转盐前馏分pH值转盐过程中的色谱图见图1。
实施例2：普卡那肽转盐纯化
将定量约为408mg纯化后的产品合格馏分先用磷酸调节至pH3.5，用纯化水稀释一倍后，上样，上样后采三氟乙酸铵(0.1％TFA用稀氨水调节pH值至6.5)和异丙醇97:3的比例洗脱反向色谱柱10分钟，然后将三氟乙酸铵更换为0.1％氨水，再洗脱10分钟后，进行线性梯度洗脱(异丙醇含量3％-13％，40min)，直到产品完成洗脱，直接冻干后得到产品380mg，纯度为99.05％，拓扑杂质为0.31％，产品转盐的回收率为93.1％，调节转盐前馏分pH值转盐过程中的色谱图见图2。
实施例3：普卡那肽转盐纯化
将定量约为415mg纯化后的产品合格馏分先用磷酸调节至4.5，用纯化水稀释一倍后，上样，上样后采用三氟乙酸铵(0.5％TFA用稀氨水调节pH值至7)和异丙醇97:3的比例洗脱反向色谱柱15分钟，然后将三氟乙酸铵更换为0.1％氨水，再洗脱15分钟后，进行线性梯度洗脱(异丙醇含量3％-13％，40min)，直到产品完成洗脱，直接冻干后得到产品397mg，纯度为98.65％，拓扑杂质为0.38％，产品转盐的回收率为95.7％。
实施例4：普卡那肽转盐纯化
将定量约为554mg纯化后的产品合格馏分先用磷酸调节至4.0，用纯化水稀释一倍后，上样，上样后采用三氟乙酸铵(0.5％TFA用稀氨水调节pH值至6.4)和异丙醇97:3的比例洗脱反向色谱柱8分钟，然后将三氟乙酸铵更换为0.1％氨水，再洗脱8分钟后，进行线性梯度洗脱(异丙醇含量3％-13％，40min)，直到产品完成洗脱，直接冻干后得到产品530mg，纯度为97.85％，拓扑杂质为0.28％，产品转盐的回收率为95.7％。
实施例5：普卡那肽转盐纯化
将定量约为454mg纯化后的产品合格馏分先用三氟乙酸调节至3.0，用纯化水稀释一倍后，上样，上样后采用三氟乙酸铵(0.1％三氟乙酸用稀氨水调节pH值至6.5)和异丙醇97:3的比例洗脱反向色谱柱10分钟，然后将三氟乙酸铵更换为0.1％氨水，再洗脱10分钟后，进行线性梯度洗脱(异丙醇含量3％-13％，40min)，直到产品完成洗脱，直接冻干后得到产品435mg，纯度为97.35％，拓扑杂质为0.58％，产品转盐的回收率为95.8％。
实施例6：普卡那肽转盐纯化(调节pH值)
将定量约为435mg纯化后的产品合格馏分先用磷酸调节至3.0，用纯化水稀释一倍后，上样，上样后采用三氟乙酸铵(0.1％三氟乙酸用稀氨水调节pH值至6.5)和异丙醇97:3的比例洗脱反向色谱柱10分钟，然后将三氟乙酸铵更换为0.1％氨水，再洗脱10分钟后，进行线性梯度洗脱(异丙醇含量3％-13％，40min)，直到产品完成洗脱，得到对称单峰，收集4杯，测定每杯pH值为6.75,6.62，6.53,6.42，将每杯进行检测，转盐合格的馏分冻干，得到产品418mg，纯度为98.93％，拓扑杂质为0.45％。调节转盐前馏分pH值转盐过程中的色谱图见图3，产品转盐的回收率为96.1％。
对比例1：普卡那肽转盐纯化
将定量约为478mg纯化后的产品合格馏分先用硫酸调节至2.0，用纯化水稀释一倍后，上样，上样后采用三氟乙酸铵(0.1％三氟乙酸用稀氨水调节pH值至6.5)和异丙醇97:3的比例洗脱反向色谱柱10分钟，然后将三氟乙酸铵更换为0.1％氨水，再洗脱10分钟后，进行线性梯度洗脱(异丙醇含量3％-13％，40min)，直到产品完成洗脱，直接冻干后得到产品375mg，纯度为97.35％，拓扑杂质为0.88％。转盐过程色谱图见图4，产品转盐的回收率为78.4％。
对比例2：普卡那肽转盐纯化
将定量约为488mg纯化后的产品合格馏分先用磷酸调节至5.5，用纯化水稀释一倍后，上样，上样后采用三氟乙酸铵(0.1％三氟乙酸用稀氨水调节pH值至6.5)和异丙醇97:3的比例洗脱反向色谱柱10分钟，然后将三氟乙酸铵更换为0.1％氨水，再洗脱10分钟后，进行线性梯度洗脱(异丙醇含量3％-13％，40min)，直到产品完成洗脱，直接冻干后得到产品405mg，纯度为97.02％，拓扑杂质为0.38％。产品转盐的回收率为83.0％。
对比例3：普卡那肽转盐纯化(不调节pH值)
将定量约为435mg纯化后的产品合格馏分先用纯化水稀释一倍后，上样，上样后采用三氟乙酸铵(0.1％三氟乙酸用稀氨水调节pH值至6.5)和异丙醇97:3的比例洗脱反向色谱柱10分钟，然后将三氟乙酸铵更换为0.1％氨水，再洗脱10分钟后，进行线性梯度洗脱(异丙醇含量3％-13％，40min)，直到产品完成洗脱，得到不对称的双肩峰，收集4杯，测定每杯pH值为7.25,7.32，7.53,7.72，将每杯进行检测，转盐合格的馏分冻干，得到产品308mg，纯度为98.86％，拓扑杂质为0.43％，产品转盐的回收率为70.8％。取醋酸铵转盐洗脱液的进行色谱分析，结果见图5。
对比例4：普卡那肽转盐纯化(调节pH值)
将定量约为435mg纯化后的产品合格馏分先用磷酸调节至3.0，用纯化水稀释一倍后，上样，上样后采用醋酸铵(0.1％醋酸用稀氨水调节pH值至6.5)和异丙醇97:3的比例洗脱反向色谱柱10分钟，然后将醋酸铵更换为0.1％氨水，再洗脱10分钟后，进行线性梯度洗脱(异丙醇含量3％-13％，40min)，直到产品完成洗脱，得到对称单峰，收集4杯，测定每杯pH值为6.63,6.54，6.41,6.32，将每杯进行检测，发现在产品馏分中产生了一个杂质，此杂质不是拓扑杂质，而是乙酰基和多肽氨基结合的乙酰化杂质。
对比例5：普卡那肽转盐纯化(调节pH值)
将定量约为435mg纯化后的产品合格馏分先用磷酸调节至3.0，用纯化水稀释一倍后，上样，上样后采用甲酸铵(0.1％甲酸用稀氨水调节pH值至6.5)和异丙醇97:3的比例洗脱反向色谱柱10分钟，然后将甲酸铵更换为0.1％氨水，再洗脱10分钟后，进行线性梯度洗脱(异丙醇含量3％-13％，40min)，直到产品完成洗脱，得到对称单峰，收集4杯，测定每杯pH值为6.73,6.64，6.54,6.46，将每杯进行检测，转盐合格的馏分冻干，得到产品408mg，后产品用高分辨质谱进行检测发现产品中含有一个原研不含有的加12的杂质，经过分析为甲酸的醛基和多肽的氨基结合形成的甲酰化杂质。甲酸铵转盐的API高分辨质谱结果见表2。
表2
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种普卡那肽的转盐纯化方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)取经色谱纯化后的普卡那肽馏分，用酸调节pH至2.5-4.5，加水稀释，获得普卡那肽稀释液；
2)将所述普卡那肽稀释液上反相色谱柱，以三氟乙酸铵水溶液为流动相A，以异丙醇为流动相B，等度洗脱7-15min；
3)以氨水为流动相A’，以异丙醇为流动相B，先等度洗脱7-15min，再梯度洗脱，直至洗脱完成；
4)收集洗脱液，所述洗脱液的pH值为6-7，将所述洗脱液冻干，获得普卡那肽铵盐。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤1)中，所述普卡那肽与水的质量比为1：1。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤1)中所述酸为磷酸、硫酸、甲酸和三氟乙酸中的任一种；
优选的，所述酸为磷酸。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤1)中所述用酸调节pH至3.0-4.0。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤2)中，所述三氟乙酸铵水溶液的pH值为6-7。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤2)中，所述等度洗脱的流动相为97％A+3％B。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤3)中，所述氨水的体积百分比浓度为0.1％。
8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤3)中，所述等度洗脱的流动相为97％A’+3％B。
9.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤3)中，所述梯度洗脱采用线性梯度洗脱，流动相中A’的含量以0.25％/min的速率逐渐在减少，B的含量以0.25％/min的速率逐渐在增加。
10.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于，步骤3)中，线性梯度洗脱的洗脱时间为20-40min。
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