KR20100123641A - 단백질 정제 방법 및 시스템 - Google Patents

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KR20100123641A
KR20100123641A KR1020100045284A KR20100045284A KR20100123641A KR 20100123641 A KR20100123641 A KR 20100123641A KR 1020100045284 A KR1020100045284 A KR 1020100045284A KR 20100045284 A KR20100045284 A KR 20100045284A KR 20100123641 A KR20100123641 A KR 20100123641A
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sbp
protein
recombinant protein
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starch
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KR1020100045284A
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마가렛 다흐-트시르 장
치아-친 슈
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심프슨 바이오테크 컴퍼니 리미티드
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Abstract

본 발명은 스타치 결합 단백질(SBP)-태그 부착된 재조합 단백질을 이용한 단백질 정제 방법 및 시스템을 제공한다. 또한, 본 발명은 SBP-태그 부착된 재조합 단백질을 회수하기 위한 SBP-결합 매트릭스를 기술한다. 따라서, 본 발명의 표적 단백질의 정제 방법은 재활용가능하며, 편리하고, 비용이 저렴하다.

Description

단백질 정제 방법 및 시스템{METHOD AND SYSTEM FOR PROTEIN PURIFICATION}
본 출원은 2009년 5월 15일자 미국 가출원번호 61/178,816에 대한 우선권을 주장한다. 이건 우선권 출원의 내용은 전체 내용이 원용에 의해 본 명세서에 명확하게 포함된다.
본 발명은 단백질 정제 방법 및 시스템에 관한 것으로, 보다 상세하게는 스타치 결합 단백질을 이용한 방법 및 시스템에 관한 것이다.
미생물 시스템에서의 발현을 통한 단백질 생산은 부가가치가 높고 의학적으로 중요한 단백질에 대한 유용한 소스가 되고 있다. 재조합 단백질의 정제 및 회수는 발효 공정 설계에 있어 주된 고려 사항이다. 전통적인 단백질 정제 방법을 이용하여 산물을 분리할 수 있지만, 개선된 방법들은 재조합 단백질의 용도도 고려한다. 재조합 단백질은 친화성 컬럼 크로마토그래피로 정제할 수 있는데, 원하는 재조합 단백질 성분은 친화성 매트릭스에 결합하는 폴리펩타이드에 대한 공유 결합을 이용하여 정제한다.
친화성 컬럼 크로마토그래피 원리를 이용하여 단백질을 분리하는 특정 시스템들이 알려져 있다.
미국 특허 5,643,758에는 말토스-결합 단백질(MBP: maltose-binding protein)을 포함하는 시스템이 기술되어 있다. 클로닝한 유전자를 pMAL 벡터에서 MBP를 코딩하는 malE 유전자의 하류에 삽입시킨다. 이 벡터를 숙주 세포에 형질전환함으로써, 재조합 단백질을 숙주 세포에서 발현시킬 수 있다. 세포 라이세이트(lysate)나 배지 분획을 친화성 매트릭스 아밀로스를 포함하는 컬럼에 주입하여 여러번 헹군 다음 다량의 말토스를 이용하여 재조합 단백질을 용출시킨다.
미국 특허 5,202,247에는 셀룰로스-결합 도메인을 포함하는 시스템이 기술되어 있다. 셀룰로스 컬럼을 이용하여 셀룰로스-결합 도메인을 포함하는 재조합 단백질을 정제할 수 있다. 세포 라이세이트나 배지 분획을 컬럼에 주입하여 헹군다. 셀룰로스-결합 도메인과 셀룰로스 간의 상호작용은 중성 pH에서의 소수성 상호작용에 의해 추진되는 것으로 보인다. 일반적인 용출 방법에서는, 투석 및 여과에 의해 저극성 용매를 제거하기 전에 에틸렌 글리콜과 같은 저극성 용매를 이용한다.
이러한 현행 단백질 정제 시스템에는 몇가지 문제점이 있다. 정제 과정이 불편하고 노동 집약적이다. 정제에 사용하는 컬럼도 비싸다. 이들 시스템의 단백질 정제 한계로는, EDTA-함유 샘플과 같은 특정 조건에 있는 재조합 단백질은 분리할 수 없을 뿐만 아니라 현재 사용되고 있는 단백질 태그(tag)는 본 발명의 표적 단백질 보다 큰 표적 단백질에 비해 상대적으로 큰 점을 들 수 있다.
현재, (a) 사료를 물에 투입하면 효소가 빠르게 흘러가 버리고, (b) 사료 펠렛화 온도가 100℃ 이상일 경우 효소 활성이 파괴되는 등과 같은, 수생 사료용 효소 제품으로 이용하는데에는 몇 가지 문제들이 있다.
발명의 개요
본원에 구체적으로 기술되고 광의적으로 설명된 바와 같이, 본 발명의 내용은 스타치 결합 단백질(SBP)-태그 부착된 재조합 단백질, SBP-결합 매트릭스 및 이의 단백질 정제 용도에 관한 것이다.
일부 구현예에서, 본 발명은,
(a) 스타치 결합 단백질(SBP)-태그 부착된 재조합 단백질을 포함하는 용액을 제공하는 단계;
(b) 상기 용액을 SBP-결합 매트릭스를 포함하는 제1 용기에 투입하는 단계;
(c) 상기 단계 (b)의 제1 용기로, 알카리 버퍼를 용출시켜, 혼합물을 수득하는 단계;
(d) 상기 혼합물을, 제2 용기에서, SBP와 재조합 단백질의 절단 용액과 혼합하여, 반응 혼합물을 수득하는 단계; 및
(e) 상기 반응 혼합물을 SBP-결합 매트릭스가 포함된 제3 용기에 투입하여, 재조합 단백질을 회수하는 단계를 포함하는, 재조합 단백질의 정제 방법을 제공한다.
또한, 다른 구현예에서, 본 발명은,
(a) SBP-태그 부착된 재조합 단백질을 포함하는 용액을 제공하기 위한 수단;
(b) 상기 용액을 SBP-결합 매트릭스가 포함된 제1 용기에 투입하기 위한 수단;
(c) 혼합물을 수득하기 위해, 상기 (b)의 제1 용기로 알카리 버퍼를 용출시키기 위한 수단;
(d) 반응 혼합물을 수득하기 위해, 상기 혼합물을, 제2 용기에서, SBP와 재조합 단백질의 절단 용액과 혼합하기 위한 수단; 및
(e) 재조합 단백질을 회수하기 위해, 상기 반응 혼합물을 SBP-결합 매트릭스가 포함된 제3 용기에 투입하기 위한 수단을 포함하는, 재조합 단백질의 정제 시스템을 제공한다.
일부 측면에서, SBP-결합 매트릭스는 스타치, 아밀로펙틴, 아밀로스 수지, 덱스트린 수지 또는 알기네이트 비드를 포함한다.
일부 측면에서, (a)의 스타치 결합 단백질(SBP)-태그 부착된 재조합 단백질은 세포로부터 유래되며, (b)의 SBP-결합 매트릭스는 스타치이다.
다른 측면에서, (b)의 제1 용기, (d)의 제2 용기 또는 (e)의 제3 용기는 일회용이다.
다른 측면에서, (d)의 혼합물에 SBP-엔도프로테아제가 추가로 첨가된다. 구체적인 측면에서, SBP-엔도프로테아제는 SBP-SARS 프로테아제 또는 SBP-엔테로키나제이다.
다른 측면에서, (a)의 용액의 pH는 4 내지 6이다.
다른 측면에서, (c)의 버퍼의 pH는 7 내지 11이다.
또다른 측면에서, 스타치 결합 단백질(SBP)-태그 부착된 재조합 단백질은 SBP와 표적 단백질 사이에 엔도프로테아제 인지부위를 포함한다.
또다른 측면에서, (b)의 용액의 pH는 4 내지 8이다.
또다른 측면에서, 일부 구현예들은 단계 (e) 이전에 pH를 5 내지 7로 조정하는 중화 단계를 더 포함한다.
또다른 측면에서, 일부 구현예들은 pH를 5-7로 중화하기 위한 수단을 더 포함한다.
일부 구현예에서, 전술한 구현예들 중 임의의 방법에 의해 제조되며, SBP 태그와 표적 단백질이 융합된, 열 안정적인 재조합 단백질을 제공한다.
일부 측면에서, 표적 단백질은 리파제, 자일라나제 또는 피타제이다.
다른 구현예에서, 본 발명은 SBP 태그와 단백질 A를 포함하는 재조합 단백질의 제조 방법으로서, 상기 재조합 단백질이 효모나 박테리아에 의해 발현되는, 재조합 단백질의 제조 방법을 제공한다.
특정 측면에서, 상기 효모는 피키아(Pichia)이다.
특정 측면에서, 상기 박테리아는 E. Coli이다.
본 발명의 한가지 이상의 구현예에 대한 상세 내용은 하기에 첨부되는 설명에 기술되어 있다. 본 발명의 그외 특징과 이점은 구체적인 설명과 청구범위에서 명확해질 것이다.
전술한 일반적인 설명과 하기의 상세한 설명은 모두 예에 불과하며, 청구된 본 발명에 대한 추가적인 설명을 제공하기 위한 것으로 이해된다.
발명의 상세한 설명
본 발명을 설명하고 청구함에 있어, 후술되는 정의에 따라 하기 용어를 사용한다.
본원에서, 용어 "재조합 단백질"은 재조합 DNA로부터 유래된 단백질이다. 용어 "재조합 DNA"는 천연적으로는 존재하지 않으며, 정상적으로는 함께 존재하지 않는 DNA 서열들을 조합하여 제조한, DNA 형태이다.
본원에서, 용어 "스타치 결합 단백질"은 "SBP"로 약칭되며, 이는 스타치에 대한 결합 친화성을 가진 모든 폴리펩타이드를 정의하는 것으로 의도된다.
본원에서, 용어 "SBP 태그(들)"은 SBP의 친화성 태그이고, 용어 "친화성 태그"은 단백질에 부착된 태그로서 친화성 기법을 이용하여 생물학적 비정제 소스로부터 정제될 수 있다.
본원에서, 용어 "SBP-태그 부착된 재조합 단백질은 친화성 태그로서 유전자 삽입된 SBP 펩타이드 서열을 가진, 재조합 단백질을 의미한다.
용어 "SBP-결합 매트릭스"는 본원에서 SBP와 결합할 수 있는 임의 타입의 매트릭스를 의미한다. SBP-결합 매트릭스의 예로는, 스타치, 아밀로펙틴, 아밀로스 수지, 덱스트린 수지 및 알기네이트 비드가 있으나, 이들로 한정되는 것은 아니다.
본원에서, 용어 "SBP-엔도프로테아제"는 태그로서 SBP와 결합할 수 있는 임의 타입의 엔도프로테아제를 지칭한다. 엔도프로테아제는 말단 부분이 아닌 아미노산(즉, 분자의 내부)의 펩타이드 결합을 절단하는 효소이다. SBP-엔도프로테아제의 예로는 SBP-SARS 프로테아제 또는 SBP-엔테로키나제가 있으나, 이들로 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시는, 재활용가능하며, 편리하고, 단가가 낮은 SBP-태그 부착된 재조합 단백질 및 SBP-결합 매트릭스를 사용한 표적 단백질의 정제 방법 및 시스템과 관련하여, 이하에서 상세하게 설명된다.
일부 구현예에서, 본 발명은,
(a) 스타치 결합 단백질(SBP)-태그 부착된 재조합 단백질을 포함하는 용액을 제공하는 단계;
(b) 상기 용액을 SBP-결합 매트릭스를 포함하는 제1 용기에 투입하는 단계;
(c) 상기 단계 (b)의 제1 용기로, 알카리 버퍼를 용출시켜, 혼합물을 수득하는 단계;
(d) 상기 혼합물을, 제2 용기에서, SBP와 재조합 단백질의 절단 용액과 혼합하여, 반응 혼합물을 수득하는 단계; 및
(e) 상기 반응 혼합물을 SBP-결합 매트릭스가 포함된 제3 용기에 투입하여, 재조합 단백질을 회수하는 단계를 포함하는, 재조합 단백질의 정제 방법을 제공한다.
본 발명의 일부 구현예에서, 상기 SBP-결합 매트릭스는 스타치, 아밀로펙틴, 아밀로스 수지, 덱스트린 수지 또는 알기네이트 비드를 포함한다.
일부 구현예에서, 본 발명은,
(a) SBP-태그 부착된 재조합 단백질을 포함하는 용액을 제공하는 단계;
(b) 상기 용액을 스타치 매트릭스가 포함된 제1 용기에 투입하는 단계;
(c) 상기 단계 (b)의 제1 용기로 알카리 버퍼를 용출시켜 혼합물을 수득하는 단계;
(d) 상기 혼합물을, 제2 용기에서, SBP와 재조합 단백질의 절단 용액과 혼합하여 반응 혼합물을 수득하는 단계; 및
(e) 상기 반응 혼합물을 스타치 매트릭스가 포함된 제3 용기에 투입하여, 재조합 단백질을 회수하는 단계를 포함하는, 재조합 단백질의 정제 방법을 제공한다.
바람직한 구현예에서, 단계 (b)의 제1 용기, 단계 (d)의 제2 용기 또는 단계 (e)의 제3 용기는 일회용이다. 단계 (d)의 혼합물에 SBP-엔도프로테아제가 추가로 첨가된다. 가장 바람직한 구현예에서. SBP-엔도프로테아제는 SBP-SARS 프로테아제 또는 SBP-엔테로키나제이다.
바람직한 구현예에서, 단계 (a)의 용액의 pH는 4 내지 6이고, 단계 (c)의 버퍼의 pH는 7 내지 11이다. 가장 바람직한 구현예에서, 단계 (a)의 용액의 pH는 5 내지 6이고, 단계 (c)의 버퍼의 pH는 8 내지 9이다. 단계 (c)의 버퍼는 pH 11일 때 교환력이 가장 우수하지만, 과도한 알카리 조건은 표적 단백질을 손상시킬 수 있다. 따라서, 상기 버퍼의 권장 pH는 8 내지 9이다. 또한, 버퍼는 pH 2 내지 4에서 단백질을 해리시킬 수 있지만, 알카리 조건이 권장된다.
바람직한 구현예에서, 스타치 결합 단백질(SBP)-태그 부착된 재조합 단백질은 SBP와 표적 단백질 사이에 엔도프로테아제 인지부위를 포함한다. 일부 구현예에서, 단계 (b)의 용액은 SBP-태그 부착된 재조합 단백질을 회수하기 위해, pH는 4 내지 8이다. 일부 바람직한 구현예에서, 상기 pH는 5 내지 7이 좋다.
일부 구현예에서, 상기 방법은, 단계 (e) 이전에 pH를 5 내지 7로 조정하는 중화 단계를 더 포함한다. 부가적으로, 상기 제3 용기의 상기 반응 혼합물에는 태그가 없는 재조합 단백질이 회수되며, 이때 SBP 태그, SBP-엔도프로테아제 및 절단되지 않은 SBP-태그 부착된 재조합 단백질은 SBP-결합 매트릭스에 포획된다.
또한, 본 발명은,
(a) 세포로부터 SBP-태그 부착된 재조합 단백질을 포함하는 용액을 제공하기 위한 수단;
(b) 상기 용액을 SBP-결합 매트릭스가 포함된 제1 용기에 투입하기 위한 수단;
(c) 혼합물을 수득하기 위해, 상기 (b)의 제1 용기로 알카리 버퍼를 용출시기 위한 수단;
(d) 반응 혼합물을 수득하기 위해, 상기 혼합물을, 제2 용기에서, SBP와 재조합 단백질의 절단 용액과 혼합하기 위한 수단; 및
(e) 재조합 단백질을 회수하기 위해, 상기 반응 혼합물을 SBP-결합 매트릭스가 포함된 제3 용기에 투입하기 위한 수단을 포함하는, 재조합 단백질의 정제 시스템을 제공한다.
본 발명의 일부 구현예에서, 상기 SBP-결합 매트릭스는 스타치, 아밀로펙틴, 아밀로스 수지, 덱스트린 수지 또는 알기네이트 비드를 포함한다.
바람직한 구현예에서, (b)의 제1 용기, (d)의 제2 용기 또는 (e)의 제3 용기는 일회용이다. 단계 (d)의 혼합물에 SBP-엔도프로테아제가 추가로 첨가된다. 가장 바람직한 구현예에서, SBP-엔도프로테아제는 SBP-SARS 프로테아제 또는 SBP-엔테로키나제이다.
바람직한 구현예에서, (a)의 용액의 pH는 4 내지 6이고, (c)의 버퍼의 pH는 7 내지 11이다. 가장 바람직한 구현예에서, (a)의 용액의 pH는 5 내지 6이고, (c)의 버퍼의 pH는 8 내지 9이다.
바람직한 구현예에서, 스타치 결합 단백질(SBP)-태그 부착된 재조합 단백질은 SBP와 표적 단백질 사이에 엔도프로테아제 인지부위를 포함한다. 일부 구현예에서, (b)의 용액은 SBP-태그 부착된 재조합 단백질을 회수하기 위해, pH는 4 내지 8이다. 일부 바람직한 구현예에서, 상기 pH는 5 내지 7이 좋다.
일부 구현예에서, 상기 시스템은, (e)의 수단 이전에 pH를 5 내지 7로 조정하는 중화 수단을 더 포함한다. 부가적으로, 상기 제3 용기의 상기 반응 혼합물에서는 태그가 없는 재조합 단백질이 회수되며, 이때 SBP 태그, SBP-엔도프로테아제 및 절단되지 않은 SBP-태그 부착된 재조합 단백질은 SBP-결합 매트릭스에 포획된다.
일부 구현예에서, 전술한 구현예들 중 임의의 방법에 의해 제조되며, SBP 태그와 표적 단백질이 융합된, 열 안정적인 재조합 단백질을 제공한다. 특정 구현예에서, 표적 단백질은 리파제, 자일라나제 또는 피타제이다. 따라서, 상기 단백질의 열 안정성은 쉽게 높일 수 있으며, 적용 분야는 매우 광범위하게 확장된다.
다른 구현예에서, 본 발명은 SBP 태그와 단백질 A를 포함하며, 효모에 의해 발현되는, 재조합 단백질의 제조 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, 상기 효모는 피키아 파스토리스(Pichia pastoris)이다. 따라서, 본 발명은 단백질의 정제가 필요한, 진단, 연구 목적 및 산업적인 적용 등의 모든 적용 분야에 이용할 수 있다.
도 1은 융합 단백질의 고특이적 절단과, 이후의 친화력-기반의 신속한 포착 및 모든 SBP-태그가 부착된 잔류물(즉, SBP-태그가 부착된 엔도프로테아제; SBP-태그가 부착된 표적 단백질; 유리형 SBP)의 제거를 위한 시스템을 나타낸다.
도 2는 SBP-피타제 및 피타제의 수중에서의 양상을 나타낸 것이다.
도 3은 수중에서의 SBP-피타제 해리 실험 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 여러가지 타입의 수지에 대한 SBP-eGFP의 결합 분석 결과를 나타낸 SDS-PAGE이다. (a)는 아밀로펙틴의 결과이다. (b)는 아밀로스 수지의 결과이다. (c)는 덱스트린 수지의 결과이다.
도 5는 알기네이트 비드에 대한 SBP-eGFP의 결합 분석 결과를 나타낸 SDS-PAGE이다.
도 6은 친화성-태그 부착 정제 및 "클린-컷(clean-cut)" 태그 제거 공정의 결과를 나타낸 것이다(좌측: LZ8의 결과; 우측: eGFP의 결과).
도 7은 SBP-SpA 아밀로스 수지를 이용한 면역글로불린의 정제 결과를 나타낸 것이다. (A)는 E. coli로부터 정제한 SBP-SpA의 결과이다. (B)는 Pichia로부터 정제한 SBP-SpA의 결과이다.
하기 실시예들은 예시를 위한 것일 뿐 이들로 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 단백질 정제
SBP -태그 부착된 단백질의 구축 및 발현
SBP(스타치 결합 단백질) 유전자를 PCR로 증폭시킨 다음, SBP와 표적 단백질 유전자 사이에 있는 엔도프로테아제 절단부위를 이용하여 표적 단백질의 N-말단과 융합시켰다. 그런 후, 융합 단백질의 유전자를 피키아 파스토리스 발현 벡터인 pPICZαA에 AOX1 프로모터의 통제 하에 클로닝한 다음, 피키아 파스토리스 GS115에서 발현시키기 위해 형질전환하였다. SBP-표적 단백질 유전자를 가지고 있는 피키아 파스토리스 형질전환체를 BMGY 배지에서 24시간 배양하였다. 원심분리에 의해 세포를 회수하고, 이를 0.5% 메탄올이 함유된 BMMY에 재현탁하였다. SBP-태그 부착된 융합 단백질의 발현을 유도하기 위해, 24시간 마다 메탄올(0.5% w/w)을 첨가하였다. 5일간 유도한 다음, 원심분리하여 세포를 제거하고, 이후 정제를 위해 무세포 발효 배양물을 수집하였다.
1차 스타치 컬럼을 통한 SBP -태그 부착된 재조합 단백질의 정제
무세포 발효 배양물을 1차 스타치 컬럼에 적용하였다(도 1). SBP-태그 부착된 재조합 단백질은 스타치에 부착되지만, 불순물은 통과하여 흐른다. 결합된 SBP-태그 부착된 재조합 단백질은 글리신 버퍼 pH11로 용출시킬 수 있으며, 이후 보관을 위해 트리스 버퍼 pH 7.4에서 다시 투석할 수 있다.
SBP -태그 부착된 재조합 단백질의 엔도프로테아제 절단
용출된 SBP-태그 부착된 재조합 단백질을 적정 버퍼에서 SBP-엔도프로테아제와 혼합하였다. SBP-태그를 제거하기 위해, SBP-프로테아제에 의해 SBP-태그와 표적 단백질 사이에 있는 프로테아제 인지부위를 절단할 수 있다.
태그가 없는 표적 단백질의 정제
SBP-엔도프로테아제를 처리한 후, 반응 혼합물을 2차 스타치 컬럼에 적용하였다. 유리형 SBP, SBP-엔도프로테아제 및 절단되지 않은 SBP-태그 부착된 재조합 단백질을 포함하는 불순물들은 스타치 컬럼에 포획할 수 있다. 완전하게 절단되어 천연 N-말단을 가지고 있는 표적 단백질은 컬럼 통과 분획(flow through fraction)으로서 회수하였다.
실시예 2. 열 안정성 비교
SBP 유전자를 PCR로 증폭한 다음 표적 효소의 N-말단에 융합시켰다. R. 오리제(R. oryzae)의 리파제 유전자, 반추위(ruminal) 곰팡이 비정제 배양물 유래의 자일라나제 유전자 및 E. coli 유래 피타제 유전자를 클로닝하여 SBP에 융합하였다. SBP-리파제, SBP-자일라나제 및 SBP-피타제 융합 단백질을 전술한 방법으로 발현시켜 본 발명에서 사용하였다.
여러가지 소스로부터 유래된 리파제의 열 안정성
리파제 활성 1 유닛(U)은 30℃, pH 7.0 조건에서 0.3 mM 4-니트로페닐 팔미테이트 중에서 샘플이 1 분당 1 μmol의 p-니트로페놀을 방출하는 것으로 정의하였다. SBP-리파제(52500 U/g) 및 F-AP15 리파제(32430 U/g, R. 오리제 리파제는 Amano Enzyme Inc.에서 구입)를, 수분율 15% 또는 20%의 대두박(soybean meal) 발효물과 혼합하여 1 g 당 100 U가 되게 하였다. 여러가지 소스로부터 유래된 혼성 100 U/g의 리파제를 칭량하여, 12 g을 100 ml의 혈청 바이얼에 넣었다. 샘플이 든 혈청 바이얼을 닫고, 10분 동안 85℃나 90℃에서 살균하였다. 각 리파제의 각각의 조건을 2번 테스트하였다. 각 처리 후, 리파제의 활성을 측정하였다. 그 결과는 표 1 및 표 2에 나타내었다.
총 수분율 15%의 대두박 발효물
샘플명 처리 온도(℃) 처리 시간(분) 백분율(%)
SBP-리파제 25℃ 0 100%
SBP-리파제 85℃ 10 86.78%
SBP-리파제 90℃ 10 86.2%
F-AP15 25℃ 0 100%
F-AP15 85℃ 10 66.82%
F-AP15 90℃ 10 37.02%
총 수분율 20%의 대두박 발효물
샘플명 처리 온도(℃) 처리 시간(분) 백분율(%)
SBP-리파제 25℃ 0 100%
SBP-리파제 85℃ 10 75%
SBP-리파제 90℃ 10 58%
F-AP15 25℃ 0 100%
F-AP15 85℃ 10 19.61%
F-AP15 90℃ 10 8.56%
데이타를 통해, SBP-리파제의 열 안정성이 F-AP15 리파제 보다 명백히 우수하다는 것이 확인되었다. 수분율 15%의 대두박 발효물의 경우, 85℃에서 10분간 열처리한 후의, SBP-리파제의 잔류 활성은 86.78%였으며, F-AP15 리파제의 잔류 활성은 66.82%였다. 90℃에서 10분간 열처리한 후에는, SBP-리파제의 잔류 활성은 여전히 86.2%였지만, F-AP15 리파제의 잔류 활성은 37.02%에 불과하였다.
수분율 20%의 대두박 발효물의 경우, 85℃에서 10분간 열처리한 후의, SBP-리파제의 잔류 활성은 75%였으며, F-AP15 리파제의 잔류 활성은 19.61%였다. 90℃에서 10분간 열처리한 후에는, SBP-리파제의 잔류 활성은 여전히 58%였지만, F-AP15 리파제의 잔류 활성은 8.56%에 불과하였다.
여러가지 소스의 자일라나제의 열 안정성
자일라나제 활성 1 유닛(U)은 50℃, pH 5.3 조건에서 1.2%(w/v) 자일란 중에서 샘플이 1 분당 1 μmol의 자일로스를 방출하는 것으로 정의하였다. SBP-자일라나제(3028 U/g) 및 자일라나제(304 U/g, 피키아 파스토리스에서 발현시킨 SBP가 없는 자일라나제)를, 수분율 15% 또는 20%의 대두박 발효물과 혼합하여 1 g 당 100 U가 되게 하였다. 여러가지 소스로부터 유래된 혼성 100 U/g의 자일라나제를 칭량하여, 12 g을 100 ml의 혈청 바이얼에 넣었다. 샘플이 든 혈청 바이얼을 닫고, 10분 동안 85℃나 90℃에서 살균하였다. 처리 후, 자일라나제의 활성을 측정하였다. 그 결과는 표 3 및 표 4에 나타내었다.
총 수분율 15%의 대두박 발효물
샘플명 처리 온도(℃) 처리 시간(분) 백분율(%)
SBP-자일라나제 25℃ 0 100%
SBP-자일라나제 85℃ 10 96.40%
SBP-자일라나제 90℃ 10 91.01%
자일라나제 25℃ 0 100%
자일라나제 85℃ 10 85.43%
자일라나제 90℃ 10 79.52%
총 수분율 20%의 대두박 발효물
샘플명 처리 온도(℃) 처리 시간(분) 백분율(%)
SBP-자일라나제 25℃ 0 100%
SBP-자일라나제 85℃ 10 93.79%
SBP-자일라나제 90℃ 10 86.27%
자일라나제 25℃ 0 100%
자일라나제 85℃ 10 84%
자일라나제 90℃ 10 79%
데이타는, SBP-자일라나제의 열 안정성이 SBP-태그가 없는 자일라나제 보다 명백히 우수한 것으로 나타내었다. 수분율 15%의 대두박 발효물의 경우, 85℃에서 10분간 열처리한 후의, SBP-자일라나제의 잔류 활성은 96.40%였으며, 자일라나제의 잔류 활성은 85.43%였다. 90℃에서 10분간 열처리한 후에는, SBP-자일라나제의 잔류 활성은 91.01%였지만, 자일라나제의 잔류 활성은 79.52%였다.
수분율 20%의 대두박 발효물의 경우, 85℃에서 10분간 열처리한 후의, SBP-자일라나제의 잔류 활성은 93.79%였으며, 자일라나제의 잔류 활성은 84%였다. 90℃에서 10분간 열처리한 후에는, SBP-자일라나제의 잔류 활성은 86.27%였지만, 자일라나제의 잔류 활성은 79%였다.
여러가지 소스의 피타제의 열 안정성
피타제 활성 1 유닛(U)은, 37℃, pH 5.0 조건에서 1.2mM 소듐 피테이트로부터 1 분당 1 μmol의 무기 인(P)를 방출하는데 필요한 효소의 양으로 정의하였다. SBP-피타제(10500 U/g) 및 SBP가 없는 피타제(6972 U/g)를, 수분율 15% 또는 20%의 대두박 발효물과 혼합하여 1 g 당 100 U가 되게 하였다. 여러가지 소스로부터 유래된 혼성 100 U/g의 피타제를 칭량하여, 12 g을 100 ml의 혈청 바이얼에 넣었다. 샘플이 든 혈청 바이얼을 닫고, 10분 동안 85℃나 90℃에서 살균하였다. 각 피타제의 각 조건을 2번 테스트하였다. 처리 후, 피타제의 활성을 측정하였다. 그 결과는 표 5 및 표 6에 나타내었다.
총 수분율 15%의 대두박 발효물
샘플명 처리 온도(℃) 처리 시간(분) 백분율(%)
SBP-피타제 25℃ 0 100%
SBP-피타제 85℃ 10 88.1%
SBP-피타제 90℃ 10 74.3%
피타제 25℃ 0 100%
피타제 85℃ 10 82.8%
피타제 90℃ 10 59.5%
총 수분율 20%의 대두박 발효물
샘플명 처리 온도(℃) 처리 시간(분) 백분율(%)
SBP-피타제 25℃ 0 100%
SBP-피타제 85℃ 10 76.6%
SBP-피타제 90℃ 10 48.5%
피타제 25℃ 0 100%
피타제 85℃ 10 55%
피타제 90℃ 10 28.9%
수생 피타제 제품의 개발
본 발명은 (a) 스타치를 흡착시켜, 사료를 물에 투입하였을 때 효소가 쉽게 씻겨나가지 않도록 수생 사료 상에 효소를 고정하고, (b) 상기 효소의 열 안정성을 실질적으로 증가시킴으로써, SBP-피타제를 수생 사료에 적용할 수 있음을 입증하였다. 도 2는 수중에서의 SBP-피타제 및 피타제의 양태를 나타낸다. 도 3은 수중에서의 SBP-피타제 방출 실험 결과이다. 여러가지 소스 유래의 피타제 분말 0.4 g을 순수한 물 40 ml에 첨가하여 25℃에서 볼태그싱하였다. 이 용액을 그 후 3000 rpm으로 30분간 원심분리하였다. 침전물에 아세테이트 버퍼(pH 6.0) 5 ml을 첨가하고, 30분간 초음파 진동기로 진동을 가하였다. 마지막으로, 피타제의 활성을 측정하였다. A 또는 B사의 피타제는 이를 물에 투입하면 바로 물에 씻겨 유실되었다. 반면에, SBP-피타제는 물에 투입한 후 16시간이 경과하였을 때에도 80% 이상의 활성을 여전히 유지하였다.
실시예 3. 여러가지 타입의 SBP 매트릭스에 대한 SBP - eGFP 의 결합 분석
여러가지 타입의 수지에 대한 SBP - eGFP 의 결합 분석
미리 헹군 아밀로펙틴, 아밀로스 수지(Bio-Rad Laboratories Inc., Hercules, California, U.S.), 덱스트린 수지(GE Healthcare., Waukesha, US) 및 세파덱스(Sigma., Saint Louis, Missouri, U.S)를 결합 버퍼(50 mM NaOAc, pH 5.5) 중에서 SBP-eGFP와 함께 총 부피 200 ㎕에서 농도 0.3 mg/ml로 교반하였다. 25℃에서 3시간 교반하면서 인큐베이션한 후, 샘플을 원심분리하였다. 상층액(미결합 단백질)과 수지 펠렛(결합 단백질)을 끓인 후 SDS-PAGE를 실시하였다. 결합 분석 결과는 도 4(A) 내지 (C)에 나타내었다.
알기네이트 비드에 대한 SBP - eGFP 의 결합 분석
미리 헹군 알기네이트 비드 250 ㎕를 결합 버퍼(50 mM NaOAc, pH 5.5) 중에서 SBP-eGFP와 함께 총 부피 1 ml에서 농도 0.6 mg/ml로 교반하였다. 25℃에서 3시간 교반하면서 인큐베이션한 후, 샘플을 원심분리하였다. 상층액(미결합 단백질)을 끓인 후 SDS-PAGE를 실시하였다. 알기네이트 비드는 결합 버퍼 1 ml로 헹구었다. 그 후, 용출 버퍼(10 mM 글리신/NaOH, pH11) 1 ml을 첨가하여, 알기네이트 비드와 함께 25℃에서 30분간 교반하였다. 용출물과 남아있는 비드를 끓인 후 SDS-PAGE를 수행하였다. 결합 분석 결과는 도 5에 나타내었다.
실시예 4. LZ8 (의학용 곰팡이 유래의 면역 조절제) 또는 eGFP 를 정제하기 위한 친화성-태그 부착 정제 및 " 클린 -컷" 태그 제거 과정
SBP 유전자를 PCR 증폭한 후, 이를 SBP와 표적 단백질 사이에 엔테로키나제 절단부위(eks)가 존재하게 LZ8의 C-말단(LZ8-eks-SBP) 또는 eGFP의 N-말단(SBP-eks-eGFP)에 융합하였다. SBP 유전자를 증폭하여 엔테로키나제의 C-말단(EK-SBP)에 융합하였다. LZ8-eks-SBP 및 EK-SBP를 피키아 파스토리스에서 발현시키고, SBP-eks-eGFP는 곤충 세포에서 발현시켰다.
SBP-표적 단백질(LZ-8-eks-SBP 또는 SBP-eks-eGFP)을 1차 스타치-결합 컬럼에서 정제한 다음 SBP-프로테아제(EK-SBP)를 첨가하여 50 mM 소듐 아세테이트(pH 5.5) 중에서 37℃에서 3시간 동안 SBP-표적 단백질을 절단하였다. 이 혼합물을 2차 스타치-결합 컬럼에 가하였는데, 통과 분획은 태그가 제거된 표적 단백질(LZ-8-eks 또는 eGFP)이며, 이후 컬럼을 50 mM 소듐 아세테이트(pH 5.5)로 헹군 다음, 10 mM 글리신/NaOH(pH11) 버퍼를 이용하여 SBP-태그 부착된 잔류물(유리 SBP; EK-SBP 및 LZ-8-eks-SBP, SBP-eks-eGFP)을 용출시켰다. 용출물에 대해 SDS-PAGE를 수행하였고, 그 결과는 도 6에 나타낸다(좌측: LZ8의 결과; 우측: eGFP 결과).
실시예 5. SBP - SpA 아밀로스 수지에 의한 면역글로불린의 정제
IgG를 정제하기 위해, SBP와 E. coli 또는 피키아에서 정제한 단백질 A의 융합 단백질인 SBP-SpA를 CNBr-활성화된 아가로스 수지(Santa Cruz　Biotechnology)에 고정시켰다. IgG의 정제는 SBP-SpA 수지가 충진된 컬럼에 샘플을 적용하여 수행할 수 있다. 투명한 혈청을 수지에 적용하기 전에, 혈청 샘플은 결합 버퍼(100 mM Tris + 150 mM NaCl, pH 8.5)로 4배 희석시켜야 한다. 샘플은 유속 0.5-1 ml/min로 적용한 다음, 10컬럼 부피배의 결합 버퍼(100 mM Tris + 150 mM NaCl, pH 8.5)로 헹구었다. 용출은 50 mM 글리신/HCl, pH 2.5로 수행하였다. IgG가 용출되면 바로 1M Tris, pH8.0으로 중화하고, 20배 농축하였다. 용출물에 대해 SDS-PAGE를 실시하였고, 그 결과는 도 7에 나타내었는데, (A)는 E. coli에서 정제한 SBP-SpA의 결과이고, (B)는 피키아에서 정제한 SBP-SpA의 결과를 나타낸다.
요컨대, 본 발명은 다음과 같은 효과가 있다.
1. 매우 낮은 생산 단가: 예로, 태그 제거 공정을 제외한 공정에서의 피타제에 대한 친화성 태그로서의 스타치의 단가는 g 당 1.5 달러 이하이다.
2. 클린 -컷(태그-제거) 단백질: 클린-컷(태그-제거) 단백질은 본원에 기술된 SBP-엔도프로테아제 태그 제거 시스템에 의해 제조할 수 있다.
3. 높은 회수율: 본원에 기술된 시스템의 회수율은 매우 높아, 그 비율은 70% 이상이며, 선택적으로 실험실 규모에서는 90% 이상이었다.
4. 매우 높은 발효 역가 : 본원의 시스템의 발효 역가는 매우 높아, 그 비율이 10 g/L이상일 수 있었다(즉, 피키아 발현 시스템).
5. 다수의 숙주에서 성공적으로 발현되는 단백질: 모든 단백질 및 효소들이 다수의 숙주(예, 피키아 파스토리스, 사카로마이세스 세레비지애, E. Coli, 곤충 세포, 효모 등)에서 발현되었다.
6. 발현율이 낮은 단백질도 수득가능함: 이제 발현율이 낮은 단백질도 대규모 배치와 저가 스타치 수지를 이용하여 저렴하게 수득할 수 있다.
7. 일회용 단백질 정제 및 태그 제거 서브-시스템: 본 발명에서 제공되는 일회용 단백질 정제 및 태그 제거 서브-시스템은 오염 가능성을 낮춘다.
그외 구현예들
본 명세서에 기술된 모든 구성들은 임의 조합으로 조합할 수 있다. 본 명세서에 기술된 각 구성은 동일한, 동등한 또는 유사한 목적을 제공하는 대체 구성으로 치환할 수 있다. 즉, 명확하게 기술된 경우를 제외하고는, 기술된 각각의 구성은 일반적인 등가 또는 유사한 구성 시리즈의 예에 불과하다. 상기 설명으로부터, 당업자는 본 발명의 기본적인 특징을 쉽게 확인할 수 있으며, 본 발명의 사상과 범위내에서, 다양한 용도와 조건에 맞게 본 발명에 다양한 변화나 변형을 가할 수 있다. 이에, 그외 구현예들도 첨부되는 청구범위내에 포함된다.
본 명세서에 언급된 모든 특허 및 공개문헌들은 본 발명이 속하는 당해 분야의 당업자의 수준을 나타낸다. 모든 특허 및 공개문헌들은 각각의 개별 공개문헌들이 구체적이고 개별적으로 원용에 의해 포함되는 바와 동일한 수준으로 원용에 의해 본 발명에 포함된다.

Claims (27)

  1. 재조합 단백질의 정제 방법으로서,
    (a) 스타치 결합 단백질(SBP)-태그 부착된 재조합 단백질을 포함하는 용액을 제공하는 단계;
    (b) 상기 용액을 SBP-결합 매트릭스를 포함하는 제1 용기에 투입하는 단계;
    (c) 상기 단계 (b)의 제1 용기로, 알카리 버퍼를 용출시켜, 혼합물을 수득하는 단계;
    (d) 상기 혼합물을, 제2 용기에서, SBP와 재조합 단백질의 절단 용액과 혼합하여, 반응 혼합물을 수득하는 단계; 및
    (e) 상기 반응 혼합물을 SBP-결합 매트릭스가 포함된 제3 용기에 투입하여, 재조합 단백질을 회수하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 재조합 단백질의 정제 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 SBP-결합 매트릭스가 스타치, 아밀로펙틴, 아밀로스 수지, 덱스트린 수지 또는 알기네이트 비드인 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 단계 (a)에서 상기 스타치 결합 단백질(SBP)-태그 부착된 재조합 단백질이 세포로부터 유래되며, 상기 단계 (b)에서 상기 SBP-결합 매트릭스는 스타치인 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 단계 (b)의 제1 용기, 상기 단계 (d)의 제2 용기 또는 상기 단계 (e)의 제3 용기가 일회용인 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 단계 (d)에서 혼합물에 SBP-엔도프로테아제가 추가로 첨가되는 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제5항에 있어서, 상기 SBP-엔도프로테아제가 SBP-ASRS 프로테아제 또는 SBP-엔테로키나제인 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제1항에 있어서, 상기 단계 (a)의 용액은 pH가 4 내지 6인 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제1항에 있어서, 상기 단계 (c)의 버퍼는 pH가 7 내지 11인 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제1항에 있어서, 상기 스타치 결합 단백질(SBP)-태그 부착된 재조합 단백질이 엔도프로테아제 인지부위를 SBP와 표적 단백질 사이에 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제1항에 있어서, 상기 단계 (b)의 용액은 pH가 4 내지 8인 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제1항에 있어서, 상기 단계 (e) 이전에 pH를 5 내지 7로 조정하는 중화 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 재조합 단백질의 정제 시스템으로서,
    (a) SBP-태그 부착된 재조합 단백질을 포함하는 용액을 제공하기 위한 수단;
    (b) 상기 용액을 SBP-결합 매트릭스가 포함된 제1 용기에 투입하기 위한 수단;
    (c) 혼합물을 수득하기 위해, 상기 (b)의 제1 용기로 알카리 버퍼를 용출시키기 위한 수단;
    (d) 반응 혼합물을 수득하기 위해, 상기 혼합물을, 제2 용기에서, SBP와 재조합 단백질의 절단 용액과 혼합하기 위한 수단; 및
    (e) 재조합 단백질을 회수하기 위해, 상기 반응 혼합물을 SBP-결합 매트릭스가 포함된 제3 용기에 투입하기 위한 수단을 포함하는 것을 특징으로 하는, 재조합 단백질의 정제 시스템.
  13. 제12항에 있어서, 상기 SBP-결합 매트릭스가 스타치, 아밀로펙틴, 아밀로스 수지, 덱스트린 수지 또는 알기네이트 비드인 것을 특징으로 하는 정제 시스템.
  14. 제12항에 있어서, 상기 단계 (a)에서 상기 스타치 결합 단백질(SBP)-태그 부착된 재조합 단백질이 세포로부터 유래되며, 상기 단계 (b)에서 상기 SBP-결합 매트릭스는 스타치인 것을 특징으로 하는 정제 시스템.
  15. 제12항에 있어서, 상기 (b)의 제1 용기, 상기 (d)의 제2 용기 또는 상기 (e)의 제3 용기가 일회용인 것을 특징으로 하는 정제 시스템.
  16. 제12항에 있어서, 상기 (d)의 혼합물에 SBP-엔도프로테아제가 추가로 첨가되는 것을 특징으로 하는 정제 시스템.
  17. 제16항에 있어서, 상기 SBP-엔도프로테아제가 SBP-ASRS 프로테아제 또는 SBP-엔테로키나제인 것을 특징으로 하는 정제 시스템.
  18. 제12항에 있어서, 상기 (a)의 용액은 pH가 4 내지 6인 것을 특징으로 하는 정제 시스템.
  19. 제12항에 있어서, 상기 단계 (c)의 버퍼는 pH가 7 내지 11인 것을 특징으로 하는 정제 시스템.
  20. 제12항에 있어서, 상기 스타치 결합 단백질(SBP)-태그 부착된 재조합 단백질이 엔도프로테아제 인지부위를 SBP와 표적 단백질 사이에 포함하는 것을 특징으로 하는 정제 시스템.
  21. 제12항에 있어서, 상기 (b)의 용액은 pH가 4 내지 8인 것을 특징으로 하는 정제 시스템.
  22. 제12항에 있어서, pH를 5 내지 7로 조정하는 중화 수단을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 정제 시스템.
  23. 제1항의 방법에 따라 제조되며, SBP 태그와 표적 단백질이 용합된, 열 안정적인 재조합 단백질.
  24. 제23항에 있어서, 상기 표적 단백질이 리파제, 자일라나제 또는 피타제인 것을 특징으로 하는 재조합 단백질.
  25. SBP 태그와 단백질 A를 포함하는 재조합 단백질의 제조 방법으로서, 상기 재조합 단백질이 효모나 박테리아에 의해 발현되는 것인 재조합 단백질의 제조 방법.
  26. 제25항에 있어서, 상기 효모는 피키아(Pichia)인 것을 특징으로 하는 방법.
  27. 제25항에 있어서, 상기 박테리아는 E. coli인 것을 특징으로 하는 방법.
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