CN1928088A - 来源于病毒巨噬细胞炎性蛋白ⅱn端15肽的串联表达方法 - Google Patents
来源于病毒巨噬细胞炎性蛋白ⅱn端15肽的串联表达方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN1928088A CN1928088A CN 200610036429 CN200610036429A CN1928088A CN 1928088 A CN1928088 A CN 1928088A CN 200610036429 CN200610036429 CN 200610036429 CN 200610036429 A CN200610036429 A CN 200610036429A CN 1928088 A CN1928088 A CN 1928088A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- ggt
- ttg
- gct
- tcc
- aga
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims abstract description 49
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 title claims abstract description 36
- 241000700605 Viruses Species 0.000 title claims abstract description 28
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 28
- 102000009571 Macrophage Inflammatory Proteins Human genes 0.000 title claims description 22
- 108010009474 Macrophage Inflammatory Proteins Proteins 0.000 title claims description 22
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 57
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 15
- 208000030507 AIDS Diseases 0.000 claims abstract description 12
- 230000006798 recombination Effects 0.000 claims abstract description 11
- 238000005215 recombination Methods 0.000 claims abstract description 11
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims abstract description 8
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 claims abstract description 7
- 239000004365 Protease Substances 0.000 claims abstract description 7
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 claims abstract description 7
- 102100034612 Annexin A4 Human genes 0.000 claims abstract description 6
- 108090000669 Annexin A4 Proteins 0.000 claims abstract description 6
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 claims abstract description 6
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 claims abstract description 3
- JOEHPBQVSCDCHE-BKGQOYFSSA-N (4r,7s,10s,13s,19s,22s,25s,28s,31s,34r)-34-amino-22-(4-aminobutyl)-10-(3-amino-3-oxopropyl)-31-benzyl-13,19-bis[3-(diaminomethylideneamino)propyl]-25-[(1r)-1-hydroxyethyl]-28-(2-methylpropyl)-6,9,12,15,18,21,24,27,30,33-decaoxo-7-propan-2-yl-1,2-dithia-5, Chemical compound N1C(=O)[C@@H](N)CSSC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H]1CC1=CC=CC=C1 JOEHPBQVSCDCHE-BKGQOYFSSA-N 0.000 claims description 16
- 101000953872 Human herpesvirus 8 type P (isolate GK18) Viral macrophage inflammatory protein 2 Proteins 0.000 claims description 16
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 claims description 11
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 claims description 9
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 7
- 108090000190 Thrombin Proteins 0.000 claims description 6
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 6
- 238000012216 screening Methods 0.000 claims description 6
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 claims description 5
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 claims description 4
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 claims description 4
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 claims description 4
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 claims description 4
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 claims description 4
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 3
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 3
- IHUKVJKKTBLTEE-QMMMGPOBSA-N (2s)-2-acetamido-5-[[amino-(methylcarbamoylamino)methylidene]amino]-n-methylpentanamide Chemical compound CNC(=O)NC(N)=NCCC[C@H](NC(C)=O)C(=O)NC IHUKVJKKTBLTEE-QMMMGPOBSA-N 0.000 claims description 2
- 241000235342 Saccharomycetes Species 0.000 claims description 2
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 claims description 2
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 claims description 2
- -1 histidine nucleic acids Chemical class 0.000 claims 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 claims 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 7
- 102100031650 C-X-C chemokine receptor type 4 Human genes 0.000 abstract description 4
- 101000922348 Homo sapiens C-X-C chemokine receptor type 4 Proteins 0.000 abstract description 4
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 abstract description 4
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 abstract description 3
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 abstract description 2
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 abstract 1
- 230000007026 protein scission Effects 0.000 abstract 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 abstract 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 14
- 102000019034 Chemokines Human genes 0.000 description 8
- 108010012236 Chemokines Proteins 0.000 description 8
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 8
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 8
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 7
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 6
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 6
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 5
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 5
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 5
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 5
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 4
- 102000009410 Chemokine receptor Human genes 0.000 description 4
- 108050000299 Chemokine receptor Proteins 0.000 description 4
- 241000725303 Human immunodeficiency virus Species 0.000 description 4
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 4
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 4
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010084455 Zeocin Proteins 0.000 description 3
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 3
- 230000003042 antagnostic effect Effects 0.000 description 3
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 3
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 3
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 3
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 3
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Natural products C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 3
- CWCMIVBLVUHDHK-ZSNHEYEWSA-N phleomycin D1 Chemical compound N([C@H](C(=O)N[C@H](C)[C@@H](O)[C@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@H](O)C)C(=O)NCCC=1SC[C@@H](N=1)C=1SC=C(N=1)C(=O)NCCCCNC(N)=N)[C@@H](O[C@H]1[C@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](CO)O1)O[C@@H]1[C@H]([C@@H](OC(N)=O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1)O)C=1N=CNC=1)C(=O)C1=NC([C@H](CC(N)=O)NC[C@H](N)C(N)=O)=NC(N)=C1C CWCMIVBLVUHDHK-ZSNHEYEWSA-N 0.000 description 3
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 3
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 3
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 102100035875 C-C chemokine receptor type 5 Human genes 0.000 description 2
- 101710149870 C-C chemokine receptor type 5 Proteins 0.000 description 2
- 108700010070 Codon Usage Proteins 0.000 description 2
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 2
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 2
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 2
- 101000702488 Rattus norvegicus High affinity cationic amino acid transporter 1 Proteins 0.000 description 2
- 108700005078 Synthetic Genes Proteins 0.000 description 2
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 2
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 description 2
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 2
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 2
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 2
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 2
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 2
- 239000012460 protein solution Substances 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 2
- 229960004072 thrombin Drugs 0.000 description 2
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 2
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 2
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 2
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- 102100031172 C-C chemokine receptor type 1 Human genes 0.000 description 1
- 101710149814 C-C chemokine receptor type 1 Proteins 0.000 description 1
- 102100031151 C-C chemokine receptor type 2 Human genes 0.000 description 1
- 101710149815 C-C chemokine receptor type 2 Proteins 0.000 description 1
- 102100024167 C-C chemokine receptor type 3 Human genes 0.000 description 1
- 101710149862 C-C chemokine receptor type 3 Proteins 0.000 description 1
- 102000001902 CC Chemokines Human genes 0.000 description 1
- 108010040471 CC Chemokines Proteins 0.000 description 1
- 108091008927 CC chemokine receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000005674 CCR Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108091008928 CXC chemokine receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000054900 CXCR Receptors Human genes 0.000 description 1
- 229920002101 Chitin Polymers 0.000 description 1
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 1
- 206010059866 Drug resistance Diseases 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 1
- 241001502974 Human gammaherpesvirus 8 Species 0.000 description 1
- 101150062179 II gene Proteins 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 206010035148 Plague Diseases 0.000 description 1
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 1
- 206010052428 Wound Diseases 0.000 description 1
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 1
- 241000607479 Yersinia pestis Species 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 230000008485 antagonism Effects 0.000 description 1
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 230000011712 cell development Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 239000005482 chemotactic factor Substances 0.000 description 1
- 230000035605 chemotaxis Effects 0.000 description 1
- 229940044683 chemotherapy drug Drugs 0.000 description 1
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000007646 directional migration Effects 0.000 description 1
- 239000003596 drug target Substances 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 1
- 239000006167 equilibration buffer Substances 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 1
- 230000036737 immune function Effects 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 238000009630 liquid culture Methods 0.000 description 1
- 230000028744 lysogeny Effects 0.000 description 1
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 230000009401 metastasis Effects 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 239000002808 molecular sieve Substances 0.000 description 1
- 239000002547 new drug Substances 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 230000005305 organ development Effects 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 230000003449 preventive effect Effects 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 230000012846 protein folding Effects 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000012827 research and development Methods 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 230000001568 sexual effect Effects 0.000 description 1
- URGAHOPLAPQHLN-UHFFFAOYSA-N sodium aluminosilicate Chemical compound [Na+].[Al+3].[O-][Si]([O-])=O.[O-][Si]([O-])=O URGAHOPLAPQHLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 230000001502 supplementing effect Effects 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 1
- 230000005740 tumor formation Effects 0.000 description 1
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 1
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 1
- 230000029663 wound healing Effects 0.000 description 1
- 230000037314 wound repair Effects 0.000 description 1
Landscapes
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
一种来源于病毒巨噬细胞炎性蛋白II N端15肽的串联表达方法是：以病毒巨噬细胞炎性蛋白II N端15肽为目标对象，利用真核表达系统合成一段基因其中包含若干个该15肽基因，他们之间通过蛋白酶酶切序列基因连接起来，在整段基因的5’和3’端加入限制性酶切位点，通过基因重组的方法将该基因连接到质粒载体上，然后转化酵母菌，进行筛选，表达和目的蛋白纯化，纯化后的蛋白再经过蛋白酶的酶切，分离纯化得到目标肽的基因工程串联表达方法。该多肽是特异性拮抗CXCR4的15肽，对预防和治疗艾滋病具有良好的功效，在医药领域具有广阔的前景。
Description
技术领域
本发明涉及医学基因重组合成的制药领域，尤其是一种来源于病毒巨噬细胞炎性蛋白II N端15肽的串联表达方法。
背景技术
艾滋病(AIDS)是一种由艾滋病病毒，即人体免疫缺陷病毒(humanimmunodeficiencyvirus，简称HIV)侵入人体后破坏人体免疫功能，使人体发生多种不可治愈的感染和肿瘤，最后导致被感染者死亡的一种严重传染病。它主要通过血液、性接触、母婴传播等途径在人群中迅速蔓延，但又缺乏有效的预防疫苗与治疗药物，被认为是21世纪的瘟疫。最新的研究发现，中国人比白人和黑人更容易感染HIV病毒，使我们面临更大的挑战。
虽然近年AIDS治疗的临床疗效明显提高，但由于HIV的高度变异性、化疗药物不能完全清除病毒且毒副作用极大、艾滋病治疗费用高昂等因素，市场上尚未有十分有效的治疗药物出现，现有公布的研究成果存在毒副作用大、耐药性以及作用机制等诸多问题，离真正的新药上市还有漫长的距离。
病毒巨嗜细胞炎性蛋白-II(virus macrophage inflammatory protein-II，vMIP-II)是由人疱疹病毒8的K4基因编码的一种病毒趋化因子，与人CC类趋化因子有较大的同源性，是人趋化因子的类似物。vMIP-II的全基因编码95个氨基酸，前二十三个为信号肽序列，最后的一个精氨酸也在蛋白折叠完成后被去除，最后发挥功能的蛋白具有71个氨基酸残基，此蛋白与人的MIP同源性高达41％。vMIP-II与趋化因子受体结合后不引起胞内Ca2+迅速内流，故不引起信号传导，从而对趋化因子与相应受体的结合起到拮抗作用。vMIP-II和CC、CXC趋化因子受体都能结合，所以对趋化因子有广谱的拮抗作用。vMIP-II不同于其他趋化因子的一个独特特点是它能够拮抗包括CCR1，CCR2，CCR3，CCR5，CXCR4和CX3CR等在内的多种趋化因子受体，特别是对CCR5和CXCR4有较高的亲和力。
由于趋化因子与其受体的相互作用控制着各种免疫细胞在循环系统和组织器官间定向迁移，使之到达感染、创伤和异常增殖部位，执行清除感染源、促进创伤愈合和消灭异常增殖细胞、维持组织细胞平衡的功能。因此趋化因子系统在免疫系统功能行使的各个环节中处于关键地位，并由此在病原体的清除、炎症反应、病原体感染、细胞及器官的发育、创伤修复、肿瘤形成及其转移、移植免疫排斥等方面都起着重要的作用；具有以趋化因子及其受体分子为药物靶点，通过激活或拮抗趋化因子受体的信号传导来调控趋化因子系统的功能。在预防和治疗艾滋病方面具有光明的前景。所以近年来来源于病毒巨噬细胞炎性蛋白II成为国内外研究开发的热点。然而来源于病毒巨噬细胞炎性蛋白II N端15肽在治疗艾滋病的相关报道至目前还没有出现过。
发明内容
本发明的目的是提供一种利用基因工程技术来获得具有预防和治疗艾滋病的来源于病毒巨噬细胞炎性蛋白II N端15肽的新的方法—基因工程串联表达方法以及其在医药方面的应用。
本发明是这样实现的：本发明来源于病毒巨噬细胞炎性蛋白II N端15肽的基因表达方法是以病毒巨噬细胞炎性蛋白II N端15肽为目标对象，建立一种利用真核表达系统获得该段短肽的新方法——基因工程串联表达方法，即合成一段基因其中包含若干个该15肽基因，他们之间通过蛋白酶酶切序列基因连接起来，在整段基因的5’和3’端加入限制性酶切位点，通过基因重组的方法将该基因连接到质粒载体上，然后转化酵母菌，进行筛选，表达和目的蛋白纯化，纯化后的蛋白再经过蛋白酶的酶切，分离纯化得到目标肽。
所述的来源于病毒巨噬细胞炎性蛋白II N端15肽的基因表达方法可以利用原核、真核及哺乳动物细胞表达系统以凝血酶酶切位点序列作为中间连接的串联表达病毒巨噬细胞炎性蛋白II N端15肽单肽；
基因重组序列可以设计为：
CCGGAATTC TTG GTC CCA AGA GGT TCC ttg ggt gct tcc tgg cac aga
cca gac aag tgc tgt ttg ggt tac TTG GTC CCA AGA GGT TCC ttg ggt
gct tcc tgg cac aga cca gac aag tgc tgt ttg ggt tac TTG GTC CCA AGA
GGT TCC ttg ggt gct tcc tgg cac aga cca gac aag tgc tgt ttg ggt tac
TTG GTC CCA AGA GGT TCC ttg ggt gct tcc tgg cac aga cca gac aag
tgc tgt ttg ggt tac TTG GTC CCA AGA GGT TCC ttg ggt gct tcc tgg
cac aga cca gac aag tgc tgt ttg ggt tac TTG GTC CCA AGA GGT TCC
ttg ggt gct tcc tgg cac aga cca gac aag tgc tgt ttg ggt tac TTG GTC
CCA AGA GGT TCC TCTCTAGACTG
其中，
N端15肽优化后核酸序列：ttg ggt gct tcc tgg cac aga cca gac aagtgc tgt ttg ggt tac
凝血酶酶切核酸优化后序列：TTG GTC CCA AGA GGT TCC。
所述的来源于病毒巨噬细胞炎性蛋白II N端15肽的基因表达方法可以利用原核、真核及哺乳动物细胞表达系统以多个病毒巨噬细胞炎性蛋白II N端15肽的串联为单位以凝血酶酶切位点序列作为中间连接的串联表达；
基因重组序列可以设计为：
CCGGAATTC TTG GTC CCA AGA GGT TCC ttg ggt gct tcc tgg cacaga cca gac aag tgc tgt ttg ggt tac gctgctgctgct tac ggt ttg tgt tgcaag gac cca aga cac tgg tcc gct ggt ttg TTG GTC CCA AGA GGT TCCttg ggt gct tcc tgg cac aga cca gac aag tgc tgt ttg ggt tac gctgctgctgct tac ggt ttg tgt tgc aag gac cca aga cac tgg tcc gct ggt ttg TTGGTC CCA AGA GGT TCC TCTCTAGACTG
其中，
反向氨基酸序列的核酸序列：tac ggt ttg tgt tgc aag gac cca aga cactgg tcc gct ggt ttg
Linker(序列为4个组氨酸)核酸序列为：gct gct gct gct。
所述的来源于病毒巨噬细胞炎性蛋白II N端15肽的基因表达方法可以是多个病毒巨噬细胞炎性蛋白II N端15肽串联并且与自断裂序列相连接的表达；
基因重组序列可以设计为
CTAGCTAGC ttg ggt gct tcc tgg cac aga cca gac aag tgc tgt ttg ggttac gct gct gct gct ttg ggt gct tcc tgg cac aga cca gac aag tgc tgt ttgggt tac gct gct gct gct tac ggt ttg tgt tgc aag gac cca aga cac tgg tccgct ggt ttg CTCGAGGAC….tag自断裂的病毒巨噬细胞炎性蛋白II N端15肽
或
自断裂的病毒巨噬细胞炎性蛋白II N端15肽 tag CTAGCTAGC ttg ggt gct
tcc tgg cac aga cca gac aag tgc tgt ttg ggt tac gct gct gct gct ttg ggt
gct tcc tgg cac aga cca gac aag tgc tgt ttg ggt tac gct gct gct gct tac
ggt ttg tgt tgc aag gac cca aga cac tgg tcc gct ggt ttg CTCGAGGAC。
所述的来源于病毒巨噬细胞炎性蛋白II N端15肽与病毒巨噬细胞炎性蛋白II具有相同的CXCR4趋化因子受体结合活性，可以用于预防和治疗艾滋病。
本发明病毒巨噬细胞炎性蛋白II N端15肽具有对CXCR4具有特异性拮抗作用，可以用于预防和治疗艾滋病。本发明提供的基因串联表达方法为得到该肽开辟了新的方法，在医药领域具有广阔的前景。
具体实施方式
实施例1
首先从成熟病毒巨噬细胞炎性蛋白II基因中找到其N端15肽的基因序列，
5’ctg gga gcg tcc tgg cat aga ccg gac aag tgc tgt ctc ggt tac 3’
氨基酸序列为：LGASWHRPDKCCLGY。
根据酵母对密码子的偏好性对其进行优化，其优化后的序列为，ttg ggt gct tcctgg cac aga cca gac aag tgc tgt ttg ggt tac，反向氨基酸序列的核酸序列为：tac ggt ttg tgt tgc aag gac cca aga cac tgg tcc gct ggt ttg，反向氨基酸序列：YGLCCKDPRHWSAGL。
蛋白酶选用凝血酶，其酶切的氨基酸序列为L-V-P-R↓G-S酶切位点已标明，核酸序列为：CTG GTC CCC CGG GGC AGC根据酵母对密码子的偏好性对其进行优化，其优化后的序列为，TTG GTC CCA AGA GGT TCC。
设计合成的基因序列为：
CCGGAATTC TTG GTC CCA AGA GGT TCC ttg ggt gct tcc tgg cac aga cca
gac aag tgc tgt ttg ggt tac TTG GTC CCA AGA GGT TCC ttg ggt gct
tcc tgg cac aga cca gac aag tgc tgt ttg ggt tac TTG GTC CCA AGA GGT
TCC ttg ggt gct tcc tgg cac aga cca gac aag tgc tgt ttg ggt tac TTG GTC
CCA AGA GGT TCC ttg ggt gct tcc tgg cac aga cca gac aag tgc tgt ttg
ggt tac TTG GTC CCA AGA GGT TCC ttg ggt gct tcc tgg cac aga cca
gac aag tgc tgt ttg ggt tac TTG GTC CCA AGA GGT TCC ttg ggt gct
tcc tgg cac aga cca gac aag tgc tgt ttg ggt tac TTG GTC CCA AGA GGT
TCC TC TCTAGACTG
共416个核苷酸。
利用限制性内切酶EcoR I、Xba I和T4DNA连接酶进行酶切连接将其连接到中间载体质粒PMD-18上，对重组质粒进行酶切和测序鉴定。将鉴定后的重组质粒PMD-18转化空白大肠杆菌进行质粒放大，然后从中提取质粒rPMD-18，利用限制性内切酶EcoR I、Xba I将目的基因切下来回收，然后用T4 DNA连接酶将其连接到经酶切后的目标载体pPICZ a A上，转化大肠杆菌，利用含抗生素Zeocin的LB平板进行筛选，对筛选得到的菌体提取质粒进行酶切和测序鉴定，对鉴定阳性的菌体进行保菌。
对上述阳性菌进行放大培养，从中提取重组质粒。对质粒用限制性内切酶Sac I进行线性化处理，同时制备酵母感受态。经电击转化，将重组质粒转化到酵母菌中，利用含Zeocin的YPD平板培养基进行筛选，直至出现单菌落。对单菌落在含有Zeocin的液体培养基中进行放大培养，保存菌种。
利用上述得到的含有重组质粒的酵母菌进行小量诱导表达目的蛋白。将菌种接种于5ml YPD培养基中，30℃180rpm振荡过夜后，按1％体积接种于20mlBMGY培养基，28℃180rpm摇瓶培养过夜，离心抽取菌体沉淀，转移入100mlBMMY中，28℃180rpm继续振荡培养2-3天，并于诱导表达起始后，每隔24h补加100％甲醇，体积为培养基总体积的0.1％。
将诱导表达后的菌液经3500rpm，20min离心去除酵母菌，将表达上清用0.45um微膜过滤，然后将滤液再用0.22um的滤膜过滤一次，除大分子物质及脂类。应用Ni亲和层析柱进行纯化，Ni亲和层析柱纯化所用平衡缓冲液为25mmol Tris-Cl，150mmol NaCl，PH 7.4，洗脱缓冲液为25mmol Tris-Cl，150mmol NaCl，350mmol咪唑，PH 7.4，经洗脱，收集洗脱峰蛋白。将得到的蛋白溶液再经过一次Ni亲和层析柱纯化，收集蛋白峰，将收集的蛋白溶液进行透析，冻干，得到目的蛋白。
利用蛋白酶对目的蛋白进行酶切，充分酶切后得到多肽溶液，利用Super dex-75分子筛层析柱进行纯化，所用缓冲液为25mmol Tris-Cl，150mmol NaCl，PH 7.4，收集蛋白峰溶液，进行SDS-PAGE电泳分析确定目的多肽峰溶液，透析，冻干得到来源于病毒巨噬细胞炎性蛋白II N端15肽。
实施例2
设计合成基因如下：所用质粒为pTYB1
CTAGCTAGC ttg ggt gct tcc tgg cac aga cca gac aag tgc tgt ttg ggttac gct gct gct gct ttg ggt gct tcc tgg cac aga cca gac aag tgc tgt ttgggt tac gct gct gct gct tac ggt ttg tgt tgc aag gac cca aga cac tgg tccgct ggt ttg CTCGAGGAC….tag(自断裂)
按照上述基因序列合成目的基因，通过基因重组构建重组质粒
pTYB1-target gene，重组质粒转化大肠杆菌DH5a，用含有青霉素(100ug/ml)的LB平板进行筛选，对筛选得到的大肠杆菌单菌落进行放大培养，从中提取质粒进行酶切和测序鉴定，筛选阳性克隆。
将阳性菌于LB培养基(含青霉素100ug/ml)中培养，温度为37℃，当OD值达到0.5～0.8时进行IPTG诱导表达，IPTG终浓度为0.3～0.5Mm，诱导温度为15～20℃。诱导过夜。
诱导表达后5000g离心10min得到菌体，用柱平衡缓冲液[20mMTris-Cl(PH6.0～8.5)，500mM NaCl，1mM EDTA]重悬菌体，进行超声破碎细胞，然后将破碎后混悬液上chitin亲和柱。
用至少10倍柱平衡缓冲液进行洗脱，直至非特异性结合蛋白全部被洗脱。然后用3倍的自断裂缓冲液[20mM Tris-Cl(PH8.0)，500mM NaCl，1mM EDTA，50mMDTT或半胱氨酸]快速平衡亲和柱，停止洗脱，在4℃～23℃的环境下诱导自断裂16～40小时。
诱导自断裂后，用柱平衡缓冲液继续洗脱，收集蛋白峰，即为目的蛋白，进行SDS-PAGE分析，透析，冻干即得来源于病毒巨噬细胞炎性蛋白II N端15肽。
以上方法得到的来源于病毒巨噬细胞炎性蛋白II N端15肽可以通过趋化抑制实验检测其活性。通过大量的实验证明，通过基因工程串联方法得到的来源于病毒巨噬细胞炎性蛋白II N端15肽与病毒巨噬细胞炎性蛋白II一样具有良好的预防和治疗艾滋病的功效，将在医药领域具有广阔的前景。
Claims (5)
1、一种来源于病毒巨噬细胞炎性蛋白II N端15肽的串联表达方法，其特征在于：以病毒巨噬细胞炎性蛋白II N端15肽为目标对象，利用真核表达系统获得合成一段基因其中包含若干个该15肽基因，他们之间通过蛋白酶酶切序列基因连接起来，在整段基因的5’和3’端加入限制性酶切位点，通过基因重组的方法将该基因连接到质粒载体上，然后转化酵母菌，进行筛选，表达和目的蛋白纯化，纯化后的蛋白再经过蛋白酶的酶切，分离纯化而得到目标肽的基因工程串联表达方法。
2、如权利要求1所述的来源于病毒巨噬细胞炎性蛋白II N端15肽的串联表达方法，其特征在于：利用原核、真核及哺乳动物细胞表达系统以凝血酶酶切位点序列作为中间连接的串联表达病毒巨噬细胞炎性蛋白II N端15肽单肽，
基因重组序列设计为：
CCGGAATTC TTG GTC CCA AGA GGT TCC ttg ggt gct tcc tgg cac aga
cca gac aag tgc tgt ttg ggt tac TTG GTC CCA AGA GGT TCC ttg ggt
gct tcc tgg cac aga cca gac aag tgc tgt ttg ggt tac TTG GTC CCA AGA
GGT TCC ttg ggt gct tcc tgg cac aga cca gac aag tgc tgt ttg ggt tac
TTG GTC CCA AGA GGT TCC ttg ggt gct tcc tgg cac aga cca gac aag
tgc tgt ttg ggt tac TTG GTC CCA AGA GGT TCC ttg ggt gct tcc tgg
cac aga cca gac aag tgc tgt ttg ggt tac TTG GTC CCA AGA GGT TCC
ttg ggt gct tcc tgg cac aga cca gac aag tgc tgt ttg ggt tac TTG GTC
CCA AGA GGT TCC TCTCTAGACTG
其中，
N端15肽优化后核酸序列：ttg ggt gct tcc tgg cac aga cca gac aagtgc tgt ttg ggt tac
凝血酶酶切核酸优化后序列：TTG GTC CCA AGA GGT TCC。
3、如权利要求1所述的来源于病毒巨噬细胞炎性蛋白II N端15肽的串联表达方法，其特征在于：利用原核、真核及哺乳动物细胞表达系统以多个病毒巨噬细胞炎性蛋白II N端15肽的串联为单位以凝血酶酶切位点序列作为中间连接的串联表达；
基因重组序列设计为：
TCTCTAGACTG TTG GTC CCA AGA GGT TCC ttg ggt gct tcc tgg
cac aga cca gac aag tgc tgt ttg ggt tac gctgctgctgct tac ggt ttg tgt
tgc aag gac cca aga cac tgg tcc gct ggt ttg TTG GTC CCA AGA GGT
TCC ttg ggt gct tcc tgg cac aga cca gac aag tgc tgt ttg ggt tac gct
gctgctgct tac ggt ttg tgt tgc aag gac cca aga cac tgg tcc gct ggt ttg
TTG GTC CCA AGA GGT TCC TCTCTAGACTG
其中，
反向氨基酸序列的核酸序列：tac ggt ttg tgt tgc aag gac cca aga cactgg tcc gct ggt ttg
4个组氨酸核酸的Linker序列为：gct gct gct gct。
4、如权利要求1所述的来源于病毒巨噬细胞炎性蛋白II N端15肽的串联表达方法，其特征在于：多个病毒巨噬细胞炎性蛋白II N端15肽串联并且与自断裂序列相连接的表达；
基因重组序列设计为
CTAGCTAGC ttg ggt gct tcc tgg cac aga cca gac aag tgc tgt ttg ggt
tac gct gct gct gct ttg ggt gct tcc tgg cac aga cca gac aag tgc tgt ttg
ggt tac gct gct gct gct tac ggt ttg tgt tgc aag gac cca aga cac tgg tcc
gct ggt ttg CTCGAGGAC tag自断裂的病毒巨噬细胞炎性蛋白II N端15肽
或
自断裂的病毒巨噬细胞炎性蛋白 II N端 15 肽 tag CTAGCTAGC ttg ggt
gct tcc tgg cac aga cca gac aag tgc tgt ttg ggt tac gct gct gct gct ttg
ggt gct tcc tgg cac aga cca gac aag tgc tgt ttg ggt tac gct gct gct gct
tac ggt ttg tgt tgc aag gac cca aga cac tgg tcc gct ggt ttg CTCGAGGAC…。
5、如权利要求1，2，3或4所述的来源于病毒巨噬细胞炎性蛋白II N端15肽的串联表达方法所得的短肽在预防和治疗艾滋病的应用。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN 200610036429 CN1928088A (zh) | 2006-07-11 | 2006-07-11 | 来源于病毒巨噬细胞炎性蛋白ⅱn端15肽的串联表达方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN 200610036429 CN1928088A (zh) | 2006-07-11 | 2006-07-11 | 来源于病毒巨噬细胞炎性蛋白ⅱn端15肽的串联表达方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN1928088A true CN1928088A (zh) | 2007-03-14 |
Family
ID=37858221
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN 200610036429 Pending CN1928088A (zh) | 2006-07-11 | 2006-07-11 | 来源于病毒巨噬细胞炎性蛋白ⅱn端15肽的串联表达方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN1928088A (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN106560475A (zh) * | 2016-04-01 | 2017-04-12 | 天演益合（厦门）生物技术有限公司 | 一种活性短肽基因工程生物合成工艺 |
-
2006
- 2006-07-11 CN CN 200610036429 patent/CN1928088A/zh active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN106560475A (zh) * | 2016-04-01 | 2017-04-12 | 天演益合（厦门）生物技术有限公司 | 一种活性短肽基因工程生物合成工艺 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN111454350B (zh) | 一种重组纤连蛋白突变体及其应用 | |
| CN113621053A (zh) | 一种重组人源胶原蛋白及其制备方法和应用 | |
| KR100496460B1 (ko) | 폴리펩티드 | |
| CN102850450B (zh) | 聚乙二醇化重组人粒细胞集落刺激因子的纯化方法 | |
| WO2014154187A1 (zh) | 二聚体化融合蛋白的制备及应用 | |
| AU2014336815B2 (en) | Fusion protein of ganoderma lucidum immunoregulatory protein and human serum albumin, and production method therefor and uses thereof | |
| CN1928088A (zh) | 来源于病毒巨噬细胞炎性蛋白ⅱn端15肽的串联表达方法 | |
| CN101875691B (zh) | 蝎镇痛抗肿瘤缬精甘肽突变体及其制备方法 | |
| WO2012037771A1 (zh) | 蝎毒肽及其制备方法与用途 | |
| CN108484749B (zh) | 一种重组可溶性人源骨靶向干扰素γ-1b及其制备方法 | |
| CN109748961B (zh) | 镇痛活性肽dkk突变体及其衍生物的制备与应用 | |
| WO2004019856A2 (en) | Glycosylated human interferon alpha isoform | |
| CN109776653B (zh) | 一种人血清白蛋白黏附肽及其应用 | |
| CN1817902A (zh) | 一种重组蝎昆虫毒素及其可溶性表达和纯化方法 | |
| CN1306030C (zh) | 一种人白细胞介素－10基因序列及含该基因序列的大肠杆菌 | |
| CN109467597B (zh) | 一种新型干扰素及其制备方法、组合物和用途 | |
| CN105709211A (zh) | 镇痛活性肽sypu-agp3和sypu-agp4的制备及应用 | |
| CN106986928B (zh) | 一种聚乙二醇化重组人粒细胞刺激因子的纯化方法 | |
| CN101597612B (zh) | 一种超抗原活性增强的sec2突变基因及其制备方法 | |
| WO2005054287A1 (en) | Process for producing human interferon alpha | |
| CN104761631A (zh) | 多位点引入对硝基苯丙氨酸的人肿瘤坏死因子-α | |
| CN1273248A (zh) | 多肽药物的高效基因工程生产方法 | |
| CN1145701C (zh) | 溶血栓药物重组葡激酶 | |
| CN111560059B (zh) | 抗菌肽-sypu2及其突变体及其衍生物和类似物 | |
| CN102690342A (zh) | 抗癌止痛肽vkvr及其制备方法与应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C12 | Rejection of a patent application after its publication | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Open date: 20070314 |