CN115792046B - 一种适用于类蛇毒肽和芋螺肽混合物质的hplc分析方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种适用于类蛇毒肽和芋螺肽混合物质的HPLC分析方法，其特征在于：第一步：设定液相色谱条件；第二步：配制分析用流动相，其中；流动相A为0.1%甲酸水溶液；流动相B为乙腈；第三步：设定分析程序为等度洗脱，洗脱浓度：流动相A：40~80%，流动相B：20~60%，流速：1mL/min；第四步：配制一个或多个类蛇毒肽和芋螺肽混合物质的待测样品溶液，所述类蛇毒肽和芋螺肽混合物质的待测样品为仅类蛇毒肽和芋螺肽混合物质，或者为含类蛇毒肽和芋螺肽的混合物；等。本发明的HPLC分析方法操作简单，连续测定类蛇毒肽和芋螺肽时，节约大量的时间成本和经济成本，简化了操作的复杂性，同时有着很好的分析效果。

Description

一种适用于类蛇毒肽和芋螺肽混合物质的HPLC分析方法

技术领域

本发明属于分析化学领域，具体涉及一种适用于类蛇毒肽和芋螺肽混合物质的高效液相色谱(HPLC)分析方法。

背景技术

类蛇毒肽，INCI名为：二肽二氨基丁酰苄基酰胺二乙酸盐，是一种模拟蛇毒毒素Waglerin 1 活性的合成三肽。该三肽可拮抗性的与乙酰胆碱受体结合，局部阻断神经传递肌肉收缩信息，使脸部肌肉放松，以达到抚纹祛皱的目的。

芋螺是一类肉食性热带海洋软体动物，全球有约500多种。芋螺能够通过毒管分泌一类特殊的多肽类毒液，用于捕食和防御。毒液主要由一些小肽所组成，统称芋螺毒素(Conotoxin)或者芋螺肽（Cononpeptide）。这些小肽类毒素一般由 10-46个氨基酸组成，富含二硫键，具有特殊的结构，芋螺肽也是一个高度折叠的胜肽，它穿透力强，稳定性高，皮肤相容性佳且不易过敏，其经过排序、人工合成提供非常强效的肌肉松弛作用，从而达到防老抗皱的效果。

类蛇毒肽和芋螺肽是经常被添加到化妆品中的即时祛皱肽，二者因为具有起效快的优势而被广泛应用。两者也会搭配使用，此时为了确定化妆品中所添加的功效成分时需要一套合适的HPLC分析方法才能确定。

理论塔板数是色谱的柱效参数之一，用于定量表示色谱柱的分离效率。目前对类蛇毒肽进行HPLC分析时，理论塔板数低是现有技术中存在着的主要问题。当色谱柱长度相同时，理论塔板数越大说明色谱柱的分离效率越高，峰形越好，相应地，可以获得更加准确的线性图形。从而为未知样品中类蛇毒肽和芋螺肽的含量测定提供更加准确的标准曲线。

现有技术中，对于类蛇毒肽和芋螺肽单一成分的HPLC分析方法已有很多报道，但是在使用的过程中测定二者混合物含量时会出现很多问题，如：峰宽过宽，检测时间久，以及前伸峰或拖尾峰导致的理论塔板数过低等问题，甚至有些分析方法的流动相配比选择不合理，流动相pH高于或低于色谱柱使用范围，或者导致色谱柱压力超负荷，从而导致色谱柱的柱效降低。但没有发现关于同一种方法能够将二者同时分析的报道，一般一种方法只能分析一种物质，无法将上述两种肽分开。

发明内容

发明要解决的问题

针对现有技术存在的问题，本发明的目的之一是解决常规流动相（甲醇-水，乙腈-水）无法对类蛇毒肽和芋螺肽进行合理洗脱的相关问题。

本发明的再一目的是在保证类蛇毒肽和芋螺肽的分析方法稳定的前提下，合理使用C18色谱柱，使其不会因为流动相不合适而遭到一定损伤，影响其柱效，同时也可以实现一次分析即可将两种肽完全分离，并可以做到对样本进行快速的检测。同时还能实现一次分析即可准确计算其中两种肽各自的含量。

用于解决问题的方案

本发明涉及：

1、一种适用于类蛇毒肽和芋螺肽混合物质的HPLC分析方法，其特征在于：

第一步：设定液相色谱条件；

第二步：配制分析用流动相，其中流动相A为0.1%甲酸水溶液；流动相B为乙腈；

第三步：设定分析程序为等度洗脱，洗脱浓度：流动相A：40~80%，流动相B：20~60%，流速：1mL/min；

第四步： 配制一个或多个类蛇毒肽和芋螺肽混合物质的待测样品溶液，所述类蛇毒肽和芋螺肽混合物质的待测样品为仅类蛇毒肽和芋螺肽混合物质，或者为含类蛇毒肽和芋螺肽的混合物；

第五步： 采用所述分析程序对其中一个类蛇毒肽和芋螺肽混合物质的待测样品溶液进行测定，记录色谱图；

第六步：任选地根据标准曲线计算类蛇毒肽和芋螺肽的含量；

第七步：采用流动相B清洗色谱柱1~5min；

第八步：重复第五步和第七步，对其他未测的类蛇毒肽和芋螺肽混合物质的待测样品依次进行测定。

2、根据项目1所述的一种适用于类蛇毒肽和芋螺肽混合物质的HPLC分析方法，其特征在于：所述标准曲线通过配制同时含有类蛇毒肽和芋螺肽两种物质的标准溶液，并采用所述第一步中的相同的液相色谱条件进行测定而建立。

3、根据项目1所述的一种适用于类蛇毒肽和芋螺肽混合物质的HPLC分析方法，其特征在于：波长范围为200~300nm。

4、根据项目1或2所述的一种适用于类蛇毒肽和芋螺肽混合物质的HPLC分析方法，其特征在于：采用填料为C18的色谱柱。

5、根据项目1或2所述的一种适用于类蛇毒肽和芋螺肽混合物质的HPLC分析方法，其特征在于：色谱柱为填料为十八烷基键合相且规格为5μm，250*4.6mm的色谱柱，流速为1mL/min 。

6、根据项目1或2所述的一种适用于类蛇毒肽和芋螺肽混合物质的HPLC分析方法，其特征在于：色谱柱柱温为室温，进样量为5~10μL，进样器温度为环境温度，待测样品采集时间为3~5min 。

7、根据项目1或2所述的一种适用于类蛇毒肽和芋螺肽混合物质的HPLC分析方法，其特征在于：所述类蛇毒肽和芋螺肽混合物质的待测样品中的类蛇毒肽和芋螺肽的浓度范围均为0.1~1.0g/L。

发明的效果

本发明发现了一种新的适用于类蛇毒肽和芋螺肽混合物质的HPLC分析方法，其可以实现对同时含有类蛇毒肽和芋螺肽的混合物质样品的连续分析测定，且色谱峰峰形呈正态分布的同时，理论塔板数很可观；其次，本发明的适用于含有类蛇毒肽和芋螺肽混合物质的HPLC分析方法，可以实现同时对类蛇毒肽和芋螺肽的分析并能够进行纯度及含量计算。并且利用此方法同时对不同浓度的类蛇毒肽和芋螺肽混合样品进行分析，二者均可以得到很好的线性。

本发明的适用于含有类蛇毒肽和芋螺肽混合物质的HPLC分析方法操作简单，可以实现连续分析测定类蛇毒肽和芋螺肽混合物质的同时，节约大量的时间成本和经济成本，大大简化了操作的复杂性。该技术不仅能够节省时间，分析所用的流动相为此行业常用成分，同时将此发明所用的色谱柱与本公司其他肽类分析所用色谱柱统一，使得在进行不同肽类分析切换时无需更换色谱柱，仅需更换流动相再对其清洗即可。从而使得利用此方法更利于全程自动化的实现。

附图说明

图1为实施例1中的不同浓度（0.1 g/L、0.2 g/L、0.4 g/L、0.6 g/L、0.8g/L）的类蛇毒肽和芋螺肽混合物质样品的HPLC图。

图2为实施例1中的不同浓度（0.1 g/L、0.2 g/L、0.4 g/L、0.6 g/L、0.8 g/L）的类蛇毒肽（a）和芋螺肽（b）的峰面积-浓度线性关系图。

图3为实施例2的芋螺肽和类蛇毒肽混合物质样品的HPLC图。

图4为比较例1的类蛇毒肽和芋螺肽混合物质样品的HPLC图。

图5为比较例2的类蛇毒肽和芋螺肽混合物质样品的HPLC图。

图6为比较例3的类蛇毒肽和芋螺肽混合物质样品的HPLC图。

图7为比较例4的单一种芋螺肽的HPLC图。

图8为比较例4的类蛇毒肽和芋螺肽混合物质样品的HPLC图。

具体实施方式

本发明的一种适用于类蛇毒肽和芋螺肽混合物质的HPLC分析方法包括以下步骤：

第一步：设定液相色谱条件；

第二步：配制分析用流动相，其中流动相A为0.1%甲酸水溶液；流动相B为乙腈；

第三步：设定分析程序为等度洗脱，洗脱浓度：流动相A：40~80%，流动相B：20~60%，流速：1mL/min；

第四步： 配制一个或多个类蛇毒肽和芋螺肽混合物质的待测样品溶液，所述类蛇毒肽和芋螺肽混合物质的待测样品为仅类蛇毒肽和芋螺肽混合物质，或者为含类蛇毒肽和芋螺肽的混合物；

第五步： 采用所述分析程序对其中一个类蛇毒肽和芋螺肽混合物质的待测样品溶液进行测定，记录色谱图；

第六步：任选地根据标准曲线计算类蛇毒肽和芋螺肽的含量；

第七步：采用流动相B清洗色谱柱1~5min；

第八步：重复第五步和第七步，对其他未测的类蛇毒肽和芋螺肽混合物质的待测样品依次进行测定。

上述标准曲线通过配制含有不同浓度类蛇毒肽和芋螺肽混合物的标准溶液，并采用上述第一步中的液相色谱条件进行测定，在同一体系下依据浓度和峰面积的线性关系而建立。同一体系是指在同一个既含有类蛇毒肽又含有芋螺肽的样品中。

流动相为: 流动相A为0.1%甲酸水溶液；流动相B为乙腈。分析程序为等度洗脱，洗脱浓度：流动相A：40~80%，流动相B：20~60%，优选流动相A：60%，流动相B：40%。选择该范围能够获得最好的分析效果。流动相流速为0.8~1.2 mL/min，优选1mL/min。流速选择很关键，提高流速可以缩短分析周期，节省时间，然而如果流速选取不恰当，流速过快，则可能导致和杂峰分离效果不好；流速过慢，可能导致色谱峰峰宽加大，影响分析精度。同时为使目标肽的峰能够完全显现，肽浓度不宜过高，否则会导致目标峰封顶，从而即使在峰顶处有杂峰出现也无法判断；但浓度也不能太低，否则当有杂峰出现时，由于峰高过低会被误判断为基线不平所致。

所述类蛇毒肽和芋螺肽混合物质的待测样品中的类蛇毒肽和芋螺肽的浓度范围均为0.1~1.0g/L，优选0.1~0.8g/L。

检测波长由待测的肽类本身性质所决定，不受分析条件影响。但对于类蛇毒肽和芋螺肽混合物质，优选波长范围为200~300nm，更优选200~220nm、260~280nm，特别优选205nm。原因是：对类蛇毒肽和芋螺肽两种物质分别进行全波长扫描，结果显示类蛇毒肽和芋螺肽均在205nm有较强的光吸收，故最优选205nm作为HPLC分析的检测波长。

色谱柱为常规使用的色谱柱，优选填料为十八烷基硅烷键合相的色谱柱，例如依利特SinoChrom ODS-AP 300Å。

色谱柱柱温为室温，优选25℃，进样量为3～10μL，优选5μL。

进样器温度为环境温度，待测样品采集时间为2~5min ，优选4min。

下面通过具体实施例对本发明的技术方案作进一步描述说明。

以下结合附图，通过实施例进一步说明本发明，但不作为对本发明的限制。但是，应理解，这些实施例仅仅是示例性的，并不意图限制本发明。如无特殊说明，本发明的实施例中所采用的原材料均为本领域常用的原材料，实施例中所采用的方法，均为本领域的常规方法。

实施例1. 类蛇毒肽和芋螺肽的分析

仪器与条件：

采用Agilent1260InfinityII LC高效液相色谱仪及OpenLabCDS2软件系统；以依利特ODS柱为分析柱，柱温25℃；紫外检测波长为205nm。

流动相：A：0.1%甲酸水溶液； B：乙腈。

洗脱浓度：流动相A：60%，流动相B：40%。

流速： 1.0mL/min。

温度:25℃。

进样量：5μL。

分析程序：等度洗脱；洗脱浓度：流动相A：60% ，流动相B：40%。

实验步骤：

将类蛇毒肽和芋螺肽分别以0.001g、0.002g、0.004g、0.006g、0.008g的量称取各五组样品，并将称取的相同质量的类蛇毒肽样品和芋螺肽样品作为一组混合后溶解于超纯水中定容至10mL，即得类蛇毒肽和芋螺肽浓度分别为0.1g/L、0.2g/L、0.4g/L、0.6g/L和0.8g/L的类蛇毒肽和芋螺肽混合溶液。

在同一体系中，对浓度分别为0.1g/L、0.2g/L、0.4g/L、0.6g/L、0.8g/L的类蛇毒肽和芋螺肽混合溶液进行HPLC测定，并对各自的峰进行积分得到峰面积。各浓度类蛇毒肽和芋螺肽的保留时间和理论塔板数如下表所示，HPLC图如图1所示。

经验证，类蛇毒肽和芋螺肽浓度与色谱峰面积呈线性的浓度范围为0.1g/L~0.8g/L，线性曲线如图2所示，类蛇毒肽和芋螺肽的浓度-峰面积线性回归方程如下所示：

类蛇毒肽：y = ax + b

其中：y：峰面积

x: 类蛇毒肽浓度

a: 12645.88292

b: 152.37325

芋螺肽：y = ax + b

其中：y：峰面积

x: 芋螺肽浓度

a: 8887.19615

b: -18.51517

实施例2. 类蛇毒肽和芋螺肽的线性关系验证

除了采用配制类蛇毒肽和芋螺肽的浓度均为0.5g/L的类蛇毒肽和芋螺肽的混合溶液之外，以与实施例1相同的方式对此溶液进行HPLC分析测定，其HPLC图如图3所示，将二者的峰面积分别代入各自的标准曲线，计算得到的浓度分别为：类蛇毒肽：0.547 g/L，芋螺肽：0.529g/L。误差均在10%以内，所以此标准曲线适用于计算未知浓度芋螺肽或类蛇毒肽的含量。

按照上述色谱条件可以连续对各浓度的类蛇毒肽和芋螺肽混合溶液进行高效液相色谱分析，而且可以将类蛇毒肽和芋螺肽完全分离，且得到较高的理论塔板数，分析结果如图3所示，类蛇毒肽和芋螺肽的保留时间分别为2.882min和2.475min。

比较例1.

除了将实施例2的流动相中的甲酸水溶液更换为水之外，以与实施例2相同的方式对类蛇毒肽和芋螺肽混合溶液进行HPLC分析测定，结果如图4所示，类蛇毒肽与芋螺肽的色谱峰连结到一起，分离失败。

比较例2.

除了将实施例2的流动相中甲酸水溶液换成KH₂PO₄水溶液之外，以与实施例2相同的方式对类蛇毒肽和芋螺肽混合溶液进行HPLC分析测定，结果如图5所示，类蛇毒肽与芋螺肽的色谱峰虽说提高了分离效果却仍然连结到一起，无法进行谱图分析。

比较例3.

除了将实施例2的乙腈换成甲醇之外，以与实施例2相同的方式对类蛇毒肽和芋螺肽混合溶液进行HPLC分析测定，结果如图6所示，类蛇毒肽与芋螺肽的分离效果较好，但是类蛇毒肽的色谱峰与溶剂峰相连，类蛇毒肽的色谱峰将溶剂的正峰完全包含住了，这样就会影响类蛇毒肽的峰面积从而影响其含量的计算，分析结果失真。

比较例4.

采用已报道的技术资料CN201911319237中所公开的芋螺肽制备用HPLC条件对芋螺肽单一成分进行分析，分析条件如下表所示。

芋螺肽单一成分的HPLC分析测定结果如图7所示。以同样的分析方法分析类蛇毒肽和芋螺肽的混合物，其结果如图8所示。由图7和图8可以看出基线随着分析程序的进行一直在下降，直至A相占比恢复至初始的3%并稳定后基线才恢复至初始高度。由图7得知单一物质分析出现两个色谱峰，由图8得知两种物质出现3个峰，这可能是由于分析条件不合适所致，因此该分析条件仅适用于芋螺肽制备时的粗分离，而不能用于芋螺肽和/或类蛇毒肽的分析标定。

综上可知，本发明的适用于类蛇毒肽和芋螺肽混合物质的HPLC分析方法操作简单，可以对混合物质中的类蛇毒肽和芋螺肽进行分离制备同时还具有良好的线性，实现对混合物质中的类蛇毒肽和芋螺肽的含量进行分析检测，不仅可以节约大量的时间成本和经济成本，而且大大简化了操作的复杂性的同时有着很好的分析效果。

Claims (7)

1.一种适用于类蛇毒肽和芋螺肽混合物质的HPLC分析方法，其特征在于：

第一步：设定液相色谱条件；

第二步：配制分析用流动相，其中流动相A为0.1%甲酸水溶液；流动相B为乙腈；

第三步：设定分析程序为等度洗脱，洗脱浓度：流动相A：60%，流动相B：40%，流速：1mL/min；

第四步： 配制一个或多个类蛇毒肽和芋螺肽混合物质的待测样品溶液，所述类蛇毒肽和芋螺肽混合物质的待测样品为含类蛇毒肽和芋螺肽的混合物；

第五步： 采用所述分析程序对其中一个类蛇毒肽和芋螺肽混合物质的待测样品溶液进行测定，记录色谱图；

第六步：任选地根据标准曲线计算类蛇毒肽和芋螺肽的含量；

第七步：采用流动相B清洗色谱柱1~5min；

第八步：重复第五步和第七步，对其他未测的类蛇毒肽和芋螺肽混合物质的待测样品依次进行测定；

采用填料为C18的色谱柱。

2.根据权利要求1所述的一种适用于类蛇毒肽和芋螺肽混合物质的HPLC分析方法，其特征在于：所述标准曲线通过配制同时含有类蛇毒肽和芋螺肽两种物质的标准溶液，并采用所述第一步中的相同的液相色谱条件进行测定而建立。

3.根据权利要求1所述的一种适用于类蛇毒肽和芋螺肽混合物质的HPLC分析方法，其特征在于：波长范围为200~300nm。

4.根据权利要求1或2所述的一种适用于类蛇毒肽和芋螺肽混合物质的HPLC分析方法，其特征在于：所述类蛇毒肽和芋螺肽混合物质的待测样品为仅含有类蛇毒肽和芋螺肽的混合物质。

5.根据权利要求1或2所述的一种适用于类蛇毒肽和芋螺肽混合物质的HPLC分析方法，其特征在于：色谱柱为填料为十八烷基键合相且规格为5μm，250*4.6mm的色谱柱，流速为1mL/min。

6.根据权利要求1或2所述的一种适用于类蛇毒肽和芋螺肽混合物质的HPLC分析方法，其特征在于：色谱柱柱温为室温，进样量为5~10μL，进样器温度为环境温度，待测样品采集时间为3~5min。

7.根据权利要求1或2所述的一种适用于类蛇毒肽和芋螺肽混合物质的HPLC分析方法，其特征在于：所述类蛇毒肽和所述芋螺肽样品的浓度分别为0.1~1.0g/L。

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