CN112006951A - 酸橙地上部分的发酵提取物 - Google Patents

Abstract

本发明涉及酸橙地上部分的发酵提取物及其获得方法。本发明还涉及酸橙发酵提取物在对抗皮肤衰老的用途，以及作为抗氧化活性剂用于预防/减少氧化应激和/或使皮肤排毒的用途。

Description

酸橙地上部分的发酵提取物

技术领域

本发明涉及酸橙(Citrus aurantium)地上部分的发酵提取物、获得其的方法、含有其的化妆品或皮肤病学组合物以及各种化妆品用途。

背景技术

皮肤主要由三层组成，即从最表层开始，表皮，真皮和皮下。

特别地，表皮由角质形成细胞(大多数)、黑素细胞(涉及皮肤色素沉着)和朗格汉斯细胞组成。它的功能是保护人体免受外部环境影响并确保其完整性，特别是减慢微生物或化学物质的渗透，并防止皮肤中水分的蒸发。

为此，角质形成细胞经历定向成熟的连续过程，在此过程中，位于表皮基底层的角质形成细胞在其分化的最后阶段形成角质细胞，这些角质细胞是呈角质化包膜形式的完全角质化的死细胞，该角质化包膜由蛋白质和脂质(例如神经酰胺)组成。在该分化过程中，还形成了角质细胞表皮脂质，然后在角质层中组织成双层(片状)。它们与前述的角质化包膜一起参与表皮的屏障功能。

随着皮肤老化，它变得更薄，失去体积和弹性，并且其屏障功能受损。

自由基的产生是加速皮肤老化的主要因素之一。这种产生主要是由于暴露于紫外线、污染和气候变化导致的。它导致氧化应激，这是导致人体某些组成成分(诸如蛋白质、脂肪酸以及细胞DNA)降解的原因。

可以通过抗氧化剂的作用将这些自由基中和。对抗皮肤老化的已知方法之一是将含有此类抗氧化剂的化妆品组合物施用于皮肤。

由于消费者越来越愿意转向含有尽可能少的合成成分的天然产品，并且鉴于对化学工业化合物的监管日益严格，现在人们青睐来自植物提取物的抗氧化剂。

真正需要能够有效对抗皮肤老化和通常的氧化应激的有害作用的植物来源的新型抗氧化剂分子。

发明内容

申请人现已证明酸橙(Citrus aurantium)地上部分的提取物具有显著的抗氧化能力。这种提取物的特殊性在于它是发酵提取物，即通过涉及发酵步骤的提取过程获得。如本申请中所证明的，这种提取物通过激活氧化应激反应途径，特别是核因子E2相关因子2(NRF2)途径，降低了细胞中自由基的含量。

因此，在第一方面，本发明涉及酸橙地上部分的发酵提取物。

该提取物可通过包括以下步骤的提取方法获得：用酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)种的酵母发酵酸橙地上部分的提取物。

因此，本发明还涉及酸橙地上部分的发酵提取物，其可通过包括以下步骤的方法获得：用属于酿酒酵母种的酵母发酵酸橙地上部分的提取物。

本发明的另一方面涉及化妆品和/或皮肤病学组合物，其在生理上可接受的介质中包含至少一种如上所述的酸橙的发酵提取物。

最后，本发明还涉及上述提取物用于预防/减少皮肤老化的用途，还涉及其作为抗氧化活性剂、用于预防/减少氧化应激和/或使皮肤排毒的用途。

发明详述

根据第一方面，本发明涉及发酵酸橙的地上部分的提取物。该提取物可通过包括以下步骤的方法获得：用属于酿酒酵母种的酵母发酵酸橙提取物。

酸橙，通常被称为“bitter orange”或“Bigaradia”，是芸香科的木本植物。它是一棵多刺的常绿乔木，高3-10米，带有芬芳的花和可食用的果。根据本发明的提取物是从酸橙地上部分获得的提取物，即从花、叶、果或嫩枝或其混合物获得的提取物。在优选实施方案中，所述提取物是来自酸橙的花(也称为“橙花”)的提取物。

本文中，术语“发酵”提取物是指经过发酵步骤的提取物。在本发明的上下文中，该发酵步骤是用属于酿酒酵母种的酵母进行的。

酿酒酵母种的酵母是众所周知的，并且特别用于食品工业，尤其是在面包制造领域或用于酒精饮料的发酵，例如用在酿酒学领域中。本领域技术人员知道如何获得这样的酵母以实施本发明。

在具体实施方案中，所述酵母属于酿酒酵母贝氏变种(Saccharomycescerevisiae var.bayanus)品种。根据该实施方案，酵母可以选自以IOC Fizz+、IOCDivine、IOC 18-2007或其混合物销售的酵母菌株。所有这些菌株均由the Institut

de la Vigne et du Vin列在名录中，并且本领域技术人员可以容易地获得。

IOC Fizz+酵母菌株是分别以保藏号号LYCC 6022：LA CLAIRE CGC62和LYCC6039：LA CLAIRE SP665保藏在巴斯德研究所的两种酵母的混合物。

IOC Divine菌株对应于保藏于巴斯德研究所的保藏号为LYCC 7000的菌株，并且菌株18-2007对应于保藏于巴斯德研究所的保藏号为CNCM I-5320的菌株。

在本发明的上下文中使用的酵母菌株可以是干燥形式、液体形式或酵母乳形式。

在具体实施方案中，酿酒酵母菌株为干燥形式。

典型地，使用酿酒酵母菌株进行发酵步骤，所述酿酒酵母菌株相对于待发酵溶液为1-5质量％，特别是相对于待发酵溶液为2-3质量％，更特别地为相对于待发酵溶液为2质量％。

在具体实施方案中，发酵步骤可以借助于发酵剂进行。该发酵剂由用酿酒酵母菌株发酵的浓缩酸橙提取物制备。用于发酵剂的提取物典型地浓缩至干物质含量为5-30％。

根据该实施方案，发酵步骤通过将该发酵剂添加到酸橙提取物中来进行。发酵剂的使用启动发酵，因此改进了发酵步骤的动力学。

典型地，通过在室温下(或在37℃下)用10重量％的酿酒酵母干酵母将在水中浓缩为5％-50％，特别地为15％-30％干物质的酸橙提取物发酵约2小时来制备发酵剂。将1-5重量％的该发酵剂，优选2重量％的发酵剂添加至用于发酵步骤的酸橙提取物中。

用于获得根据本发明的发酵提取物的酸橙提取物可以通过本领域技术人员已知的任何提取方法来获得。

典型地，用于制备植物提取物的方法包括以下步骤：

a)用至少一种醇溶剂和/或水提取植物(在当前情况下为酸橙地上部分)；

b)例如通过筛分过滤a)中获得的混合物，以去除植物残留物，

c)任选地，使步骤b)中获得的混合物脱色；和

d)去除溶剂并浓缩提取物。

为了获得根据本发明的酸橙发酵提取物，典型地在上述步骤a)-d)之后添加步骤e)，该步骤e)包括用属于酿酒酵母种的酵母发酵从步骤d)获得的提取物。

步骤a)可以进一步包括破碎植物，典型地是其花和/或叶，以获得小于5cm，优选小于2cm的粒径。

提取步骤用至少一种由醇溶剂和/或水组成的提取溶剂进行。典型的植物与溶剂之比为1-10(重量/重量)。

在具体实施方案中，该醇溶剂是96°乙醇。

提取溶剂可含有0-100体积％的水和0-100体积％的醇溶剂。在具体实施方案中，提取溶剂包含100％的水，在另一实施方案中，其包含100％的乙醇。提取溶剂还可包含50体积％的水和50体积％的乙醇。

在具体实施方案中，水可以是去离子水。在本发明中，提取溶剂典型地是去离子水。

提取步骤持续至少1小时，优选至少2小时，特别是至少3小时，并且可以重复一次或两次。

如上所述，提取方法可包括其中来自步骤b)的混合物被脱色的步骤。该步骤的目的是去除提取物中存在的色素，诸如叶绿素和叶黄素。本领域技术人员熟悉几种去除这些颜料的方法。例如，脱色可以通过使混合物与活性炭接触来进行。脱色后，将混合物过滤以去除碳残留物。

典型地，步骤d)涉及将提取物浓缩至干物质与水的比例为5-30％，优选15％-30％。

该浓缩步骤典型地通过蒸发提取溶剂(醇溶剂和/或水)来进行。例如，该提取可以在真空下进行。

来自步骤d)的酸橙提取物，即浓缩的酸橙提取物，可用于制备上述发酵剂。

上述方法可以进一步包括步骤d)和e)之间的步骤d’)，其中将含有浓缩提取物的混合物进行精细过滤(典型地以2μm或甚至0.2μm)以去除细颗粒和残留细菌。

该方法可以进一步包括步骤f)，其中将发酵提取物过滤，然后稀释以获得含有1-15重量％干物质，特别是约10重量％干物质的提取物。该提取物可以是澄清且稳定的水溶液形式。

在具体实施方案中，根据本发明的获得酸橙发酵提取物的方法包括以下步骤：

a)将研磨成细度小于2cm的橙花粉末在75℃下用去离子水提取两次，最少2小时，植物/溶剂的比例为1-10(重量/重量)；

b)将混合物过滤至4μm；

c)通过与活性炭接触1小时使所得混合物脱色，然后进行微滤至1μm以去除碳残留物；

d)通过真空蒸发去除部分水，直至达到接近15％(重量/重量)的干物质含量来将提取物浓缩；

d’)将混合物以0.2μm过滤；

e)将具有2重量％的发酵剂混合物在37℃下发酵24-48小时，所述发酵剂通过将步骤d)获得的部分提取物浓缩成在水中的30％干物质，并添加10重量％的干酿酒酵母酵母在37℃下第一次发酵2小时而获得的；

f)然后，将发酵提取物以1μm过滤，然后稀释，以获得含有1-10％重量干物质的提取物，向其中添加0.7％苯氧基乙醇或20％1,3-丙二醇(10％干物质/70％水，重量/重量比)以更好地保存。

根据本发明的发酵提取物具有显著的抗氧化性能。如以下实施例所示(尤其参见实施例2和3)，其显著降低了皮肤细胞(诸如角质形成细胞)的氧化应激。特别地，它激活了核因子E2-相关因子2(NRF2)途径，已知该途径是对氧化应激的反应途径。NRF2是一种转录因子，通过其与称为抗氧化剂响应元件(ARE)的调控序列的结合，可以表达编码抗氧化剂酶的基因。因此，该途径的激活具有通过抗氧化剂的作用减少组织中自由基含量的作用。

如上所述，自由基的产生以及该产生导致的氧化应激是加速皮肤老化的主要因素之一。自由基的减少，和因此氧化应激的减少，可抵抗皮肤老化(诸如皱纹和细纹)的迹象、由于表皮和/或真皮中的组织损失而导致的紧致度和弹性下降；由于微循环减少和表皮细胞更新减慢而导致的光亮损失、与黑色素合成异常相关的色素沉着斑点的出现、或由于角质层屏障功能降低和表皮更新速度减慢而导致的皮肤干燥。

因此，根据另一方面，本发明涉及酸橙地上部分的发酵提取物用于预防/减少皮肤老化的用途。

本发明还涉及酸橙地上部分的发酵提取物作为抗氧化活性剂和/或预防/减少氧化应激和/或使皮肤排毒的用途。

“抗氧化”活性剂是具有抗自由基特性的化合物，即具有中和自由基的能力，特别是与这些自由基相关的氧化反应的能力。这种中和导致组织中自由基含量的减少。

“氧化应激”是组织中过量的自由基和抗氧化剂之间的不平衡。因此，通过提供抗氧化活性剂来中和自由基有助于减少这种氧化应激。下文实施例3显示了测量氧化应激的方法，特别是抗氧化活性剂对该氧化应激的影响。

皮肤中自由基和氧化应激的减少有助于使皮肤“排毒”，即获得“排毒”作用。术语“排毒”是指对抗自由基对皮肤的有害作用的作用。

可以有利地将本发明的提取物掺入化妆品或皮肤病学组合物中。因此，根据另一方面，本发明涉及化妆品或皮肤病学组合物，其在化妆品或药学上可接受的载体中包含根据本发明的酸橙部分的醇提取物。

优选地，所述提取物在化妆品或皮肤病学组合物中以占组合物总重量的0.001-10％的比例，特别是0.01-10％的比例，优选0.1-10％的比例存在。所述化妆品或皮肤病学组合物可以特别适合于局部应用。

有利地，所述化妆品或皮肤病学组合物可以是粉末、乳液、微乳液、纳米乳液、悬浮液、溶液、洗剂、乳膏、水凝胶或水醇凝胶、泡沫、精华液(serum)、用于气雾剂的溶液或分散体、或脂质囊泡的分散体的形式。

在乳液的情况下，它可以是油包水或水包油乳液。

根据本发明的化妆品或皮肤病学组合物还可包括根据各种成分和施用形式选择的溶剂。

实例包括水(优选为软化水)、醇(诸如乙醇)或二甘醇醚(诸如乙二甘醇单甲醚或二甘醇单甲基醚)。

除了根据本发明的提取物外，所述化妆品组合物还可包含至少一种本领域常用的添加剂，例如至少一种选自润肤剂或湿润剂、胶凝剂和/或增稠剂、表面活性剂、油、活性剂、染料、防腐剂、抗氧化剂、活性剂、有机或无机粉末、防晒剂和香料的化合物。

特别地，所述组合物可以含有：

-一种或多种润肤剂或湿润剂，其可以选自例如甘油、乙二醇、水溶性聚硅氧烷(诸如以名称KF6011(Shin Etsu)销售的)和水溶性霍霍巴油(诸如以名称Resplanta Jojoba(Res Pharma)销售的)。

相对于组合物的总重量，所述润肤剂或湿润剂可以以0-30重量％，优选2-10重量％的含量存在于组合物中。

-用于水相的一种或多种胶凝剂和/或增稠剂，例如选自纤维素衍生物、植物来源的胶(瓜尔豆、刺槐豆、藻酸盐、角叉菜胶、果胶)、微生物来源(黄原胶)、粘土(锂蒙脱石)、由INCI名称标识的材料“丙烯酰二甲基牛磺酸铵/VP共聚物”和“丙烯酰二甲基牛磺酸铵/山嵛醇聚醚-25甲基丙烯酸酯聚合物”(诸如由科莱恩以名称Aristoflex AVC和HMB销售的那些)。

相对于组合物的总重量，所述胶凝剂和/或增稠剂可以以0-10重量％的含量存在于组合物中。

-一种或多种表面活性剂，优选非离子表面活性剂，相对于组合物的总重量，其以0-8重量％，优选0.5-3重量％的含量存在。

-一种或多种挥发性或非挥发性的室温液体脂肪(通常称为油)；直链、环状或支链的烃或聚硅氧烷，例如异十二烷、环戊二甲基硅氧烷、二甲基聚硅氧烷、异壬酸异壬酯或季戊四醇四异硬脂酸酯，相对于组合物的总重量，其含量优选为0-约10重量％，优选0.5-5重量％。

-一种或多种具有生物学活性的天然或合成来源的活性剂，例如选自维生素、微量元素、尿囊素，植物蛋白、植物提取物、保湿剂、抗老化剂、抗氧化剂、光泽增强剂和其混合物。特别地，所述活性剂选自香荚兰果水、烟酰胺、透明质酸及其衍生物、酵母提取物及其混合物。

-一种或多种水溶性染料，例如丽春红二钠盐、茜素绿二钠盐、喹啉黄、苋菜三钠盐、酒石黄二钠盐、罗丹明一钠盐、品红或叶黄素二钠盐，相对于组合物的总重量，其含量优选为0-约2重量％。

通常用于化妆品中的其他添加剂也可以存在于根据本发明的组合物中，诸如在技术领域中众所周知的防腐剂、抗氧化剂或香料。

技术人员能够从所有这些可能的添加剂中选择要添加到组合物中的那些添加剂的性质和数量，以使其保留其所有性能。

现在将通过以下非限制性实施例说明本发明。

附图简要说明

图1：显示了通过根据本发明的酸橙提取物在角质形成细胞中调节的不同生物途径的图。

图2：用根据本发明的酸橙提取物处理后角质形成细胞中氧化应激的降低。

具体实施方式

实施例1根据本发明的提取酸橙的方法：

1)将干燥的橙花花朵破碎至小于2cm的细度；

2)然后，在75℃下用去离子水将橙花粉末提取两次，最少2小时，植物/溶剂的比例为1-10(重量/重量)；

3)以100μm筛分混合物以去除植物残留物，然后静置过夜，再次过滤至4μm；

4)通过与活性炭接触1小时使所得混合物脱色以去除色素(诸如叶绿素和叶黄素)。

5)通过微滤(至1μm)将脱色的混合物与碳残留物分离；

6)通过真空蒸发去除部分水，直到达到接近15％(重量/重量)的干物质含量来将提取物浓缩；

7)将混合物以0.2μm过滤，以去除细颗粒和残留细菌；

8)为了制备用于发酵提取物的发酵剂，将步骤6)获得的部分提取物浓缩成在水中的30％干物质，然后添加10重量％的干酵母酿酒酵母贝氏变种。将该混合物在室温搅拌2小时。该混合物构成发酵剂。

9)将2重量％的发酵剂添加到步骤6)的混合物中；

10)在室温下搅拌24-48小时并在黑暗中发酵后，将发酵提取物静置过夜，以去除形成的气泡；

11)然后，将发酵后的提取物以1μm过滤，然后稀释以获得含有10％干物质的提取物，添加0.7％苯氧基乙醇以更好地保存或添加20％1,3-丙二醇(10％干物质/70％水，重量/重量比)，然后将整体以0.2μm过滤。

下表1给出了酸橙提取物的含量。

表1：通过本发明的方法获得的酸橙提取物的组合物

如上所述，根据本发明的方法完全从橙花提取物中去除了单糖。根据本发明的方法还增加了提取物中的多酚含量。

实施例2-用根据本发明的酸橙提取物处理的正常人角质形成细胞中氧化应激反应途径的活化。

方案：

将来自三个不同供体的正常人表皮角质形成细胞(年龄介于19至30岁)接种在24孔板中，并在SFM补充角质形成细胞培养基中于37℃、5％CO₂下培养48h。然后，将细胞与0.4％酸橙提取物一起温育或不温育(对照)24h。在n＝2的条件下进行。温育结束时，去除培养上清液，并用PBS冲洗细胞单层。根据供应商的建议，使用

分离试剂提取总RNA。通过毛细管电泳(2100生物分析仪，安捷伦)评估RNA的数量和质量。合成互补DNA，并在Affymetrix GeneChip人转录组阵列2.0上产生转录组。使用Ingenuity Pathway Analysis软件(

Qiagen)对其表达受至少2倍调节的基因进行了生物信息学分析。该软件在Ingenuity Knowledge数据库中收集有关分子间相互作用、生物网络和规范途径的信息。

结果：

通过酸橙提取物调节的生物途径如图1所示。酸橙提取物在角质形成细胞中激活的主要细胞功能是响应涉及31个基因的氧化应激反应的NRF2途径。表1列出了在该生物途径中过表达的基因。

实施例3：用根据本发明的酸橙提取物处理的正常人角质形成细胞中氧化应激的降低

方案：

将来自27岁供体的正常人表皮角质形成细胞接种在6孔板中，并在37℃、5％CO₂下培养72h。然后，用0.4％酸橙提取物温育或不温育细胞(对照)24h，然后用50μM甲萘醌亚硫酸氢钠(Sigma)处理细胞以诱导氧化应激。使用MitoSOX红色线粒体超氧化物指示剂(Lifetechnologies)荧光探针观察到氧化应激。在应激后1.5h拍摄培养物的照片，并定量荧光信号的强度。

结果：

与对照条件相比，用酸橙提取物处理后观察到信号强度降低了63％(图2)。

实施例4：化妆品组合物

对于技术人员，可以以传统方式制备以下组合物。以下所示的量以重量百分比表示。大写字母中的成分根据INCI标识进行识别。

4A-油/水乳液

4b-油/水霜乳液

这些组合物可以每天在早晨和/或晚上施用于皮肤。

Claims (12)

1.酸橙地上部分的提取物，其中所述提取物是发酵提取物。

2.酸橙地上部分的发酵提取物，其可通过包括以下步骤的方法获得：用属于酿酒酵母种的酵母发酵酸橙地上部分的提取物。

3.根据权利要求2的提取物，其中所述酿酒酵母种的酵母是酿酒酵母贝氏变种品种。

4.根据权利要求3的提取物，其中所述酿酒酵母贝氏变种品种的酵母是IOC Fizz+菌株的酵母。

5.根据权利要求3的提取物，其中所述酿酒酵母贝氏变种品种的酵母是IOC Divine菌株的酵母。

6.根据权利要求3的提取物，其中所述酿酒酵母贝氏变种品种的酵母是IOC 18-2007菌株的酵母。

7.根据权利要求1-6中任一项的提取物，其中所述酸橙提取物是花提取物。

8.获得酸橙地上部分发酵提取物的方法，所述方法包括以下步骤：

a)用至少一种醇溶剂和/或水提取酸橙的地上部分；

b)过滤在a)中获得的混合物以去除植物残余物；

c)任选地，使由步骤b)获得的混合物脱色；

d)去除提取溶剂并浓缩所得提取液；和

e)通过属于酿酒酵母种的酵母发酵从酸橙获得的提取物。

9.根据权利要求8的方法，其中所述发酵步骤通过用酿酒酵母菌株发酵浓缩的酸橙提取物制备的发酵剂来进行。

10.化妆品组合物，其包含根据权利要求1-7之一的酸橙提取物。

11.根据权利要求1-7之一的提取物用于预防/减少皮肤老化的化妆品用途。

12.根据权利要求1-7之一的提取物的化妆品作为抗氧化活性剂和/或用于预防/减少氧化应激和/或使皮肤排毒的用途。

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