CN114146222A - 一种细胞外囊泡微囊材料及其制备方法和用途 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种细胞外囊泡微囊材料及其制备方法和用途，涉及皮肤修复材料和细胞外囊泡材料技术领域，所述细胞外囊泡微囊材料由细胞外囊泡，羧甲基几丁糖，马齿苋提取物，甘油，玻尿酸钠和水等组成；本发明的细胞外囊泡微囊材料，能用于急慢创伤修复材料、面部动力性皱纹填充材料和肌肤修复和抗衰老材料中，具有很好的修复、填充皮肤的作用，抗衰老效果明显；本发明的细胞外囊泡微囊材料的制备方法，通过β射线处理技术使羧甲基几丁糖凝胶上的碳、氢基进行交联，将细胞外囊泡外层充分包被在羧甲基几丁糖凝胶中，形成微囊结构，细胞外囊泡聚集在凝胶网格中，能够保持细胞外囊泡上蛋白质、脂质、核糖和多糖等生物分子的活性。

Description

一种细胞外囊泡微囊材料及其制备方法和用途
技术领域
本发明涉及皮肤修复材料和细胞外囊泡材料技术领域，具体说是一种细胞外囊泡微囊材料及其制备方法和用途。
背景技术
面部修复材料包括急慢创伤修复材料、面部动力性皱纹填充材料和肌肤修复和抗衰老材料等。皮肤随着年龄的增大，会出现血液循环变慢，皮下组织脂肪层开始变得松弛而欠缺弹性等问题，或者在受到外部伤害后皮肤也会出现伤口，面部修复材料能够通过涂覆或者浅导促进伤口的愈合，包括各种组织的再生、肉芽组织增生、疤痕组织的形成，是各种过程的协同作用，好的面部修复材料能够从时间上减少人们的痛苦并且在最大程度上减少疤痕的产生。
目前市面上用得较多的创伤修复材料主要分为天然生物材料(自体组织、异体组织和异种组织)、人工生物材料( 动物性、植物性、金属材料等)和复合生物材料三种。其中，人工生物材料容易产生免疫反应，并且修复填充效果不佳；天然生物材料及复合生物材料由于其自身修复上的优势在低温生物保存技术改进和提高后有着充分广阔的前景。如壳聚糖作为地球上含量仅低于纤维素的天然多糖，主要存在于植物，海洋无脊椎动物，昆虫，真菌细胞壁和微生物中，来源广泛，不仅具有良好的物理机械性能，还有很好的生物相容性和降解性，无毒性，可以用于创面修复；但是壳聚糖本身的修复能力并不佳需要进行改性处理。
细胞外囊泡是一种由细胞释放到细胞外基质的膜性小囊泡，广泛地存在于各种体液和细胞上清液中，其表面携带蛋白质、脂质、核糖和多糖等生物活性分子，可以在细胞间传递信号，在细胞通讯、细胞迁移、血管新生、细胞修复过程中有着重要作用，因此细胞外囊泡是理论上可以修复细胞的天然生物材料，但是如何保存细胞外囊泡，保持其携带的蛋白质、脂质、核糖和多糖等生物分子的活性是现在亟需解决的问题。
目前对细胞外囊泡的保存条件进行的研究发现，细胞外囊泡的储存条件严苛，需要在-20℃~-80℃下进行保存，并且即使在上述温度下保存也会对其性能有明显的影响，如中性粒细胞来源的细胞外囊泡样品中囊泡数量和形态没有明显变化，但是其磷酯酰丝氨酸外翻明显增多的情况，影响细胞外囊泡的性能。
发明内容
为解决外囊泡不易保存，现有的保存条件影响其生物活性的问题，本发明的目的是提供一种细胞外囊泡微囊材料及其制备方法和用途。
本发明为实现上述目的，通过以下技术方案实现：
一种细胞外囊泡微囊材料，以重量份计，由以下原料组成：细胞外囊泡20~30份，羧甲基几丁糖1~2份，马齿苋提取物1~5份，甘油3~5份，PE9010 3~5份，玻尿酸钠1~2份和水50~70份。
优选的，以重量份计，由以下原料组成：细胞外囊泡25份，羧甲基几丁糖1.5份，马齿苋提取物4份，甘油4份，PE9010 4份，玻尿酸钠1.5份和水60份。
优选的，所述羧甲基几丁糖为脱蛋白羧甲基几丁糖。
优选的，所述细胞外囊泡的直径为30~200纳米。
本发明还包括一种细胞外囊泡微囊材料的制备方法，包括以下步骤：
①以重量份计，将羧甲基几丁糖1~2份加入到水50~70份中，搅拌分散乳化20~30分钟，向其中加入醋酸至pH为2~4，在低于50转/分的转速下搅拌20~30分钟，向其中加入氢氧化钠调节pH值至6.8~8.5得到凝胶，待用；
②向步骤①所得的凝胶中加入细胞外囊泡20~30份，在高于1000转/分的转速下搅拌20~30分钟，然后在1~5KGY剂量的β射线对凝胶进行交联处理20~50秒，将细胞外囊泡包被在凝胶中形成微囊，得到细胞外囊泡微囊凝胶；
③向步骤②所得的细胞外囊泡微囊凝胶加入马齿苋提取物1~5份，甘油3~5份，PE9010 3~5份和玻尿酸钠1~2份，搅拌分散均匀，得到细胞外囊泡微囊材料。
优选的制备方法，β射线的剂量为3KGY。
优选的制备方法，β射线交联处理的时间为30~40秒。
本发明还包括一种细胞外囊泡微囊材料，在制备急慢创伤修复材料、面部动力性皱纹填充材料和肌肤修复和抗衰老材料中的应用。
本发明相比现有技术具有以下优点：
本发明的细胞外囊泡微囊材料，能用于急慢创伤修复材料、面部动力性皱纹填充材料和肌肤修复和抗衰老材料中，具有很好的修复、填充皮肤的作用，抗衰老效果明显。
本发明的细胞外囊泡微囊材料的制备方法，首先通过β射线处理技术使羧甲基几丁糖凝胶上的碳、氢基进行交联，将细胞外囊泡外层充分包被在羧甲基几丁糖凝胶中，形成微囊结构，细胞外囊泡聚集在凝胶网格中，能够保持细胞外囊泡上蛋白质、脂质、核糖和多糖等生物分子的活性；然后将微囊与马齿苋提取物、玻尿酸钠、甘油等辅料混合；设计巧妙，工艺易于实现工业化。
附图说明
图1为面部检测仪对皮肤的七项项目测试的结果图；
图2为使用和不使用细胞外囊泡微囊材料对端粒体长度的影响结果示意图；
图3为使用和不使用细胞外囊泡微囊材料（AB-MSCevs）对S期细胞数目的影响结果示意图；
图4为使用和不使用细胞外囊泡微囊材料对骨小梁面积的影响结果图；
图5为使用和不使用细胞外囊泡微囊材料对破骨细胞数目的影响结果图；
图6为使用和不使用细胞外囊泡微囊材料对OPN染色的影响结果图。
具体实施方式
本发明的目的是提供本发明的细胞外囊泡微囊材料及其制备方法和用途，通过以下技术方案实现：
一种细胞外囊泡微囊材料，以重量份计，由以下原料组成：细胞外囊泡20~30份，羧甲基几丁糖1~2份，马齿苋提取物1~5份，甘油3~5份，PE9010 3~5份，玻尿酸钠1~2份和水50~70份。
马齿苋提取物既具有广谱的抗菌消炎作用，可防治皮肤湿疹、过敏性皮炎、接触性皮等皮肤病；又有良好的氧自由基清除能力和抗氧化的作用，并且还能增加皮肤的保湿性。
优选的，以重量份计，由以下原料组成：细胞外囊泡25份，羧甲基几丁糖1.5份，马齿苋提取物4份，甘油4份，PE9010 4份，玻尿酸钠1.5份和水60份。
优选的，所述羧甲基几丁糖为脱蛋白羧甲基几丁糖，优选的脱蛋白羧甲基几丁糖。
优选的，所述细胞外囊泡的直径为30~200纳米。
本发明还包括一种细胞外囊泡微囊材料的制备方法，包括以下步骤：
①以重量份计，将羧甲基几丁糖1~2份加入到水50~70份中，搅拌分散乳化20~30分钟，向其中加入醋酸至pH为2~4，在低于50转/分的转速下搅拌20~30分钟，向其中加入氢氧化钠调节pH值至6.8~8.5得到凝胶，待用；
②向步骤①所得的凝胶中加入细胞外囊泡20~30份，在高于1000转/分的转速下搅拌20~30分钟，然后在1~5KGY剂量的β射线对凝胶进行交联处理20~50秒，将细胞外囊泡包被在凝胶中形成微囊，得到细胞外囊泡微囊凝胶；
③向步骤②所得的细胞外囊泡微囊凝胶加入马齿苋提取物1~5份，甘油3~5份，PE9010 3~5份和玻尿酸钠1~2份，搅拌分散均匀，得到细胞外囊泡微囊材料。
本发明的细胞外囊泡微囊材料的制备方法，通过β射线将羧甲基几丁糖中的碳、氢交联，能将细胞外囊泡包被在交联后的羧甲基几丁糖中，形成微囊，并且β射线的剂量和处理时间既能保证碳、氢基充分交联，又不会破坏细胞外囊泡中的蛋白、MircRNA和DNA等其他物质的活性。
本发明中采用β射线交联的羧甲基几丁糖和采用化学交联剂进行交联有明显区别，采用化学交联剂进行交联只能将细胞外囊泡进行网格定位，不能形成包被颗粒。
优选的制备方法，β射线的剂量为3KGY。
优选的制备方法，β射线交联处理的时间为30~40秒。
本发明还包括一种细胞外囊泡微囊材料，在制备急慢创伤修复材料、面部动力性皱纹填充材料和肌肤修复和抗衰老材料中的应用。
羧甲基几丁糖又名羧甲基壳聚糖。
本发明实施例中的羧甲基几丁糖和脱蛋白羧甲基几丁糖购买于江苏省南通绿神生物工程有限公司；
本发明实施例中的马齿苋提取物购买于韩国百朗德(BIOLAND)公司；
本发明实施例中的细胞外囊泡购买于青岛益康益家医疗科技有限公司。
本发明的细胞外囊泡微囊材料为凝胶状液体，pH值在7.0~10.5之间，在25℃时，动力粘度的范围为5000mPa.s～80000mPa.s。
以下结合具体实施例来对本发明作进一步的描述。
实施例1
一种细胞外囊泡微囊材料，由以下原料组成：细胞外囊泡200g，羧甲基几丁糖10g，马齿苋提取物10g，甘油30g，PE9010 30g，玻尿酸钠10g和水500g。
实施例2
一种细胞外囊泡微囊材料，由以下原料组成：细胞外囊泡300g，羧甲基几丁糖20g，马齿苋提取物50g，甘油50g，PE9010 50g，玻尿酸钠20g和水700g。
实施例3
一种细胞外囊泡微囊材料，由以下原料组成：细胞外囊泡220g，羧甲基几丁糖12g，马齿苋提取物20g，甘油32g，PE9010 38g，玻尿酸钠12g和水520g；
所述羧甲基几丁糖为脱蛋白羧甲基几丁糖；所述细胞外囊泡的直径为30~200纳米。
实施例4
一种细胞外囊泡微囊材料，由以下原料组成：细胞外囊泡280g，羧甲基几丁糖18g，马齿苋提取物40g，甘油38g，PE9010 32g，玻尿酸钠18g和水580g；
所述羧甲基几丁糖为脱蛋白羧甲基几丁糖；所述细胞外囊泡的直径为30~200纳米。
实施例5
一种细胞外囊泡微囊材料，由以下原料组成：细胞外囊泡250g，羧甲基几丁糖15g，马齿苋提取物40g，甘油40g，PE9010 40g，玻尿酸钠15g和水600g；
所述羧甲基几丁糖为脱蛋白羧甲基几丁糖；所述细胞外囊泡的直径为30~200纳米。
实施例6
实施例1所述的细胞外囊泡微囊材料的制备方法，包括以下步骤：
①将羧甲基几丁糖10g加入到水500g中，搅拌分散乳化20分钟，向其中加入醋酸至pH为2，在低于50转/分的转速下搅拌20分钟，向其中加入氢氧化钠调节pH值至6.8，得到凝胶，待用；
②向步骤①所得的凝胶中加入细胞外囊泡200g，在高于1000转/分的转速下搅拌20分钟，然后在1KGY剂量的β射线对凝胶进行交联处理20秒，将细胞外囊泡包被在凝胶中形成微囊，得到细胞外囊泡微囊凝胶；
③向步骤②所得的细胞外囊泡微囊凝胶加入马齿苋提取物10g，甘油30g，PE901030g和玻尿酸钠10g，搅拌分散均匀，得到细胞外囊泡微囊材料。
实施例7
实施例2所述的细胞外囊泡微囊材料的制备方法，包括以下步骤：
①将羧甲基几丁糖20g加入到水700g中，搅拌分散乳化30分钟，向其中加入醋酸至pH为4，在低于50转/分的转速下搅拌30分钟，向其中加入氢氧化钠调节pH值至8.5得到凝胶，待用；
②向步骤①所得的凝胶中加入细胞外囊泡300g，在高于1000转/分的转速下搅拌20~30分钟，然后在5KGY剂量的β射线对凝胶进行交联处理50秒，将细胞外囊泡包被在凝胶中形成微囊，得到细胞外囊泡微囊凝胶；
③向步骤②所得的细胞外囊泡微囊凝胶加入马齿苋提取物50g，甘油50g，PE901050g和玻尿酸钠20g，搅拌分散均匀，得到细胞外囊泡微囊材料。
实施例8
实施例3所述的细胞外囊泡微囊材料的制备方法，包括以下步骤：
①将羧甲基几丁糖12g加入到水520g中，搅拌分散乳化25分钟，向其中加入醋酸至pH为2.5，在低于50转/分的转速下搅拌22分钟，向其中加入氢氧化钠调节pH值至7.0得到凝胶，待用；所述羧甲基几丁糖为脱蛋白羧甲基几丁糖；
②向步骤①所得的凝胶中加入细胞外囊泡220g，在高于1000转/分的转速下搅拌22分钟，然后在2KGY剂量的β射线对凝胶进行交联处理30秒，将细胞外囊泡包被在凝胶中形成微囊，得到细胞外囊泡微囊凝胶；所述细胞外囊泡的直径为30~200纳米；
③向步骤②所得的细胞外囊泡微囊凝胶加入马齿苋提取物20g，甘油32g，PE901038g和玻尿酸钠12g，搅拌分散均匀，得到细胞外囊泡微囊材料。
实施例9
实施例4所述的细胞外囊泡微囊材料的制备方法，包括以下步骤：
①将羧甲基几丁糖18g加入到水580g中，搅拌分散乳化28分钟，向其中加入醋酸至pH为3.5，在低于50转/分的转速下搅拌25分钟，向其中加入氢氧化钠调节pH值至8.0得到凝胶，待用；所述羧甲基几丁糖为脱蛋白羧甲基几丁糖；
②向步骤①所得的凝胶中加入细胞外囊泡280g，在高于1000转/分的转速下搅拌25分钟，然后在4KGY剂量的β射线对凝胶进行交联处理40秒，将细胞外囊泡包被在凝胶中形成微囊，得到细胞外囊泡微囊凝胶；所述细胞外囊泡的直径为30~200纳米；
③向步骤②所得的细胞外囊泡微囊凝胶加入马齿苋提取物40g，甘油38g，PE901032g和玻尿酸钠18g，搅拌分散均匀，得到细胞外囊泡微囊材料。
实施例10
实施例5所述的细胞外囊泡微囊材料的制备方法，包括以下步骤：
①将羧甲基几丁糖15g加入到水600g中，搅拌分散乳化25分钟，向其中加入醋酸至pH为3，在低于50转/分的转速下搅拌20~30分钟，向其中加入氢氧化钠调节pH值至7.5得到凝胶，待用；所述羧甲基几丁糖为脱蛋白羧甲基几丁糖；
②向步骤①所得的凝胶中加入细胞外囊泡250g，在高于1000转/分的转速下搅拌28分钟，然后在3KGY剂量的β射线对凝胶进行交联处理35秒，将细胞外囊泡包被在凝胶中形成微囊，得到细胞外囊泡微囊凝胶；所述细胞外囊泡的直径为30~200纳米；
③向步骤②所得的细胞外囊泡微囊凝胶加入马齿苋提取物40g，甘油40g，PE901040g和玻尿酸钠15g，搅拌分散均匀，得到细胞外囊泡微囊材料。
应用实施例
采用本发明实施例的细胞外囊泡微囊材料进行肌肤修复，使用时将本发明的细胞外囊泡微囊材料涂抹（也可浅导）于面部，以7天为一个疗程，在治疗前，皮肤有脸上除了脸颊和下巴有青春痘，有的青春痘颗粒比较大，有的比较小，并且分布很密集，并且消下去的青春痘也留有印记；治疗后，脸上的皮肤明显改善，青春痘去除明显，并且没有留下印记，可以看出本发明的细胞外囊泡微囊材料具有很好的肌肤修复效果。
采用本发明实施例10所得的细胞外囊泡微囊材料进行面部皱纹填充，使用时将本发明的细胞外囊泡微囊材料涂抹（也可浅导）于面部，以7天为一个疗程，使用前后采用面部肌肤检测仪对皮肤的毛孔粗糙程度、RGB色斑、RGB皱纹、UV色素、UV粉刺、UV水分七项项目测试，结果如图1所示，可以看出使用7天后，皮肤毛孔缩小12%，皱纹缩减23%，肌肤光滑度增加13%，色素下降17%，色斑下降24%，皮肤的状态明显好转，脸色红润、细腻，有光泽。
采用本发明细胞外囊泡微囊材料进行抗衰老实验，给小白鼠注射实施例10所得的细胞外囊泡微囊材料，注射剂量为2.5μg/次，5μg/次，10μg/次，每周注射一次，同时做空白对比试验，注射4周后进行结果比对观察，发现注射剂量为2.5μg/次，5μg/次，10μg/次时，细胞增殖率分别为8%、10%和12%；
三种剂量下，对小白鼠β-gal的平均阳性率为22%，与空白对照组相比，间充质干细胞克隆形成率平均增加36%，如图2所示，端粒体长度由1.0（空白对照组）增加到1.45（三种剂量下统计的平均值），如图3所示，S期（细胞进行DNA复制期）细胞数目明显增多数目100个以上（两峰之间的阴影处）；可以看出，本发明的细胞外囊泡微囊材料可以促进细胞的明显增殖和端粒体的延长，具有很好的抗衰老效果；
将剂量为5μg/次的小白鼠进行解剖，观察骨小梁面积、破骨细胞数目和OPN染色染色结果，其由图4的结果可以看出，相比空白对照组，本发明细胞外囊泡微囊材料（UC-EVs）能够提高骨小梁面积，由图5的结果可以看出，相比空白对照组，本发明细胞外囊泡微囊材料（UC-EVs）能够减少破骨细胞数目，由图6的结果可以看出，相比空白对照组，本发明细胞外囊泡微囊材料（UC-EVs）能够增加OPN染色，综上，可以看出本发明细胞外囊泡微囊材料能够改善衰老小鼠的骨质和年轻化。

Claims (8)

1.一种细胞外囊泡微囊材料，其特征在于：以重量份计，由以下原料组成：细胞外囊泡20~30份，羧甲基几丁糖1~2份，马齿苋提取物1~5份，甘油3~5份，PE9010 3~5份，玻尿酸钠1~2份和水50~70份。
2.根据权利要求1所述的一种细胞外囊泡微囊材料，其特征在于：以重量份计，由以下原料组成：细胞外囊泡25份，羧甲基几丁糖1.5份，马齿苋提取物4份，甘油4份，PE9010 4份，玻尿酸钠1.5份和水60份。
3.根据权利要求1所述的一种细胞外囊泡微囊材料，其特征在于：所述羧甲基几丁糖为脱蛋白羧甲基几丁糖。
4.根据权利要求1所述的一种细胞外囊泡微囊材料，其特征在于：所述细胞外囊泡的直径为30~200纳米。
5.权利要求1所述一种细胞外囊泡微囊材料的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
①以重量份计，将羧甲基几丁糖1~2份加入到水50~70份中，搅拌分散乳化20~30分钟，向其中加入醋酸至pH为2~4，在低于50转/分的转速下搅拌20~30分钟，向其中加入氢氧化钠调节pH值至6.8~8.5得到凝胶，待用；
②向步骤①所得的凝胶中加入细胞外囊泡20~30份，在高于1000转/分的转速下搅拌20~30分钟，然后在1~5KGY剂量的β射线对凝胶进行交联处理20~50秒，将细胞外囊泡包被在凝胶中形成微囊，得到细胞外囊泡微囊凝胶；
③向步骤②所得的细胞外囊泡微囊凝胶加入马齿苋提取物1~5份，甘油3~5份，PE90103~5份和玻尿酸钠1~2份，搅拌分散均匀，得到细胞外囊泡微囊材料。
6.根据权利要求5所述的一种细胞外囊泡微囊材料的制备方法，其特征在于：β射线的剂量为3KGY。
7.根据权利要求5所述的一种细胞外囊泡微囊材料的制备方法，其特征在于：β射线交联处理的时间为30~40秒。
8.权利要求1所述的一种细胞外囊泡微囊材料的应用，其特征在于：在制备急慢创伤修复材料、面部动力性皱纹填充材料和肌肤修复和抗衰老材料中的应用。
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