CN111135154B - 一种抗衰老的细菌纤维素膜及其制备方法 - Google Patents
一种抗衰老的细菌纤维素膜及其制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种抗衰老的细菌纤维素膜及其制备方法。所述细菌纤维素膜是通过将细菌纤维素与乙醇酸及甘油复合而制得，其制备方法包括，首先将纯化的细菌纤维素膜通过低温冷冻干燥处理，然后将干燥后的细菌纤维素膜置于乙醇酸与甘油混合溶液中浸润24小时，即得到所述的抗衰老的细菌纤维素膜。本发明所述抗衰老的细菌纤维素膜，不仅具有良好的溶胀性、生物安全性，而且具有调节乙醇酸缓慢释放、提高该药物生物利用度的性能；另外，其能够通过释放乙醇酸促进皮肤细胞的粘附与增殖以及促进成纤维细胞中胶原蛋白的合成，可应用于面膜和抗衰老治疗膜，对延缓生理性皮肤衰老以及治疗病理性皮肤衰老具有良好的疗效。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及一种抗衰老的细菌纤维素膜及其制备方法。
背景技术
由于生物学和环境因素，有可能加速人的衰老过程而使得人们看起来比正常年龄大。过早衰老的特征是皮肤容易受损、松弛，并出现斑点和皱纹。大多数人都希望自己看起来更年轻、更健康，从而提高了对更好的美容护理产品的需求。随着生活水平的不断提高，越来越多的人开始注重外表形象和肌肤保养，例如，面膜作为清洁、护理和营养面部皮肤的护肤产品的使用就非常广泛。
目前，α-羟基酸(AHA)特别是乙醇酸(GA)已经成为对抗临床皮肤病的重要药物之一，皮肤科医生和其他皮肤护理专家已将其长期用于皮肤疾病的治疗。研究表明，GA作为收敛剂具有有益的保湿作用，可去除多余的皮肤油脂并去除角质；光致损伤的皮肤可通过AHA的治疗得到改善，其中GA刺激胶原蛋白和弹性蛋白的产生，并可改善斑驳的色素沉着、粗糙和皱纹。因此，GA是许多化妆品中的主要成分之一，它具有改善上皮细胞代谢、皱纹、剥落和保湿的能力。由于GA的效果与浓度成正比，高浓度的GA也会引起皮肤灼伤和刺激皮肤，含有乙醇酸的化妆品所带来的更大好处与它可能对皮肤造成的巨大风险成正比。如何在保持其最大治疗效果的同时将这种活性成分递送至皮肤是人们当前亟需解决的问题。例如，通过局部控制递送系统来负载该活性成分并缓慢释放到皮肤上，从而大大降低引起皮肤刺激的副作用并最大程度地提高乙醇酸的治疗效果，从而可以很好地实现正常的皮肤保养作用。
有些微生物，例如葡糖木醋杆菌属能够在培养基的表面上产生细胞外形式的纤维素，这种细胞外形式的纤维素被称为天然高分子细菌纤维素水凝胶(BC)，它以膜的形式产生，属于生物纤维素。细菌纤维素因其具有很高的机械强度、孔隙率、含水量(约98％)，很高的亲水性(大量的羟基)、溶胀率、渗透性，良好的透气性、持水性，原位可塑性，以及良好的生物相容性和制备简单等优点，使得其在生物医学领域的应用，尤其是作为伤口敷料方面、组织工程支架、人造血管和药物输送系统等方面具有巨大的应用前景。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明的目的在于提供一种抗衰老的细菌纤维素膜及其制备方法。
细菌纤维素(BC)具有良好的粘附于不规则皮肤表面的能力，另外还对油基配方具有很高的吸收能力，因此BC可以改善患者的依从性。但BC本身没有任何固有的抗衰老活性，从而限制了其在许多生物医学领域中应用。因此，用抗衰老的活性成分如乙醇酸(GA)功能化BC至关重要，GA可以使皮肤感觉平滑容光焕发，并可较长时间保持这种新状态。
本发明人评估了细菌纤维素(BC)膜作为乙醇酸(GA)局部递送系统的载体可行性。通过加入甘油(GL)作为增塑剂和保湿剂以增强药物的可控性，从而减少乙醇酸对皮肤的副作用；另外GL还有助于确保溶解物质的更多吸收，并有助于保持BC基质的水分含量，从而保留其抗张强度、拉伸性、弹性和柔韧性。
本发明制备了BC膜并将乙醇酸和甘油浸渍到BC膜中，研究了其中的乙醇酸释放速率。本发明制备的BC/GA/GL膜具有均匀的乙醇酸分布，发明人还对其形态、结构和机械性能方面进行了表征。在本发明的BC局部控制递送系统(如BC/GA/GL膜)中，施用于皮肤的本发明BC/GA/GL膜的面积精确地确定了其主要活性物质GA的剂量，并且由于这种膜所具有的特性而防止了在被施加到皮肤上之后的药物损失。这样可以使BC的活性成分深入皱纹和细纹。
本发明一个方面提供一种抗衰老的细菌纤维素膜。所述具有抗衰老特性的细菌纤维素膜是利用BC的3D网络结构通过溶液浸润、物理吸附的方法将BC与乙醇酸复合制备而成。
优选的，所述细菌纤维素膜上的乙醇酸负载密度为5-7mg/cm3。
优选的，所述细菌纤维素膜上的还负载有甘油。
本发明另一个方面提供上述抗衰老的细菌纤维素膜的制备方法，其包括以下步骤：
1)通过培养葡糖醋杆菌(Gluconacetobacter xylinum)菌株发酵产生细菌纤维素膜；
2)将步骤1)得到的湿态细菌纤维素膜纯化后进行低温冷冻干燥；
3)将步骤2)得到的干燥的细菌纤维素膜在室温下浸入10％的乙醇酸水溶液中约24h；即得到所述抗衰老的细菌纤维素膜。
在本发明上述方面的一些实施方案中，在步骤2)中纯化后得到的湿细菌纤维素膜在-20℃条件下冷冻12h,然后进行真空冷冻干燥。
真空冷冻干燥的条件是：将湿态的BC膜在－20℃下冻结成固态，然后在真空(1～13帕)下使其中的水分不经液态直接升华成气态，最终使BC脱水干燥。
在本发明上述方面的一些实施方案中，其中在步骤3)的质量分数10％乙醇酸水溶液中添加质量分数3％的甘油。
在本发明上述方面的一些实施方案中，其中步骤1)中的葡糖木醋杆菌为葡糖木醋杆菌ATCC53582。
在本发明上述方面的一些实施方案中，其中步骤2)中的纯化步骤包括：将获得的细菌纤维素膜浸入蒸馏水中2天以去除其中多余的培养基残留物，再将其用0.1M NaOH溶液于100℃下处理30min以除去其中的葡糖木醋杆菌，然后再将其置于蒸馏水中浸泡3天，每天换一次水，以进一步去除杂质及其中的NaOH溶液并使其PH变为中性；最后将其经高温(121℃)高压灭菌20min后保存。
在本发明上述方面的一些实施方案中，其中步骤1)中培养葡糖木醋杆菌的培养基为Herstin-Schramm培养基，其组分包括：5.0gL-1酵母提取物、20gL-1葡萄糖、1.5gL-1一水柠檬酸、20gL-1葡萄糖和6.8gL-1磷酸氢二钠十二水合物。
在本发明上述方面的一些实施方案中，其中步骤1)中将葡糖木醋杆菌接种到上述无菌Herstin-Schramm培养基中，接种菌液的体积占总培养基体积的10％。
在本发明上述方面的一些实施方案中，其中将上述接种的葡糖木醋杆菌在30℃下孵育3-4天，以将细菌纤维素膜厚度调节在5mm的范围内。
本发明又一个方面提供由上述方法制备的细菌纤维素膜在制备抗衰老面膜及抗衰老治疗膜中的应用。
有益效果
体外评估的细胞相容性测试表明本发明制备的细菌纤维素(BC)膜无毒性，而体外药物释放试验则表明本发明BC/GA/GL膜中的乙醇酸(GA)具有缓慢释放的特性，可明显降低其引起皮肤刺激的副作用，并最大程度地提高GA的治疗效果。因此，本发明制备的细菌纤维素膜可以通过调节所述膜中皮肤药物的生物利用度而获得良好的治疗效果。此外，其能够通过释放乙醇酸促进皮肤细胞的粘附与增殖以及促进成纤维细胞中胶原蛋白的合成，在作为面膜以及抗衰老治疗膜，用于延缓生理性皮肤衰老以及治疗病理性皮肤衰老方面具有潜在的应用前景。
附图说明
图1所示为本发明所述抗衰老的细菌纤维素膜的制备方法的示例性流程图。
图2所示为本发明实施例1合成并纯化的细菌纤维素(BC)膜与实施例2和3中制备的BC/GA膜和BC/GA/GL膜样品的外观形貌及SEM形貌图。其中，图2a为湿的纯BC膜，图2b为负载GA的湿BC膜，图2c为负载GA和GL的湿BC膜；而图2d为纯BC膜的表面SEM图，图2e为负载GA的BC膜的SEM图，图2f为负载GA和GL的BC膜的SEM图。
图3所示为实施例1中合成并纯化的BC膜与本发明实施例2和3中制备的BC/GA膜和BC/GA/GL膜样品的机械性能结果；其中图3a所示为所述BC、BC/GA和BC/GA/GL膜样品的拉伸应力-应变曲线结果；图3b所示为所述BC、BC/GA和BC/GA/GL膜样品的杨氏模量结果。
图4a所示为本发明实施例1合成并纯化的细菌纤维素(BC)膜与实施例2和3中制备的BC/GA膜和BC/GA/GL膜样品的溶胀性能结果；图4b所示为在37℃的PBS(pH 7.4)中所述BC/GA膜和BC/GA/GL膜样品的乙醇酸的累计释放曲线。
图5a和5b所示分别为在PS对照和本发明实施例1合成并纯化的细菌纤维素(BC)膜与实施例2和3中制备的BC/GA膜和BC/GA/GL膜样品上培养的NIH3T3和HaCaT细胞释放的LDH活力水平结果。
图6a和6b所示分别为在PS对照和本发明实施例1合成并纯化的细菌纤维素(BC)膜与实施例2和3中制备的BC/GA膜和BC/GA/GL膜样品上培养的NIH3T3和HaCaT细胞的细胞活力测试(CCK-8)结果。
图7所示为在本发明实施例1合成并纯化的细菌纤维素(BC)膜与实施例2和3中制备的BC/GA膜和BC/GA/GL膜样品上培养的NIH3T3和HaCaT细胞的死/活细胞染色的共聚焦激光扫描显微镜图像。
图8所示为在本发明实施例1合成并纯化的细菌纤维素(BC)膜与实施例2和3中制备的BC/GA膜和BC/GA/GL膜样品上培养的NIH3T3和HaCaT细胞的细胞形态观察结果图。
图9所示为在PS对照和本发明实施例1合成并纯化的细菌纤维素(BC)膜与实施例2和3中制备的BC/GA膜和BC/GA/GL膜样品上培养的NIH3T3成纤维细胞合成的前胶原蛋白I型C端肽(PICP)的ELISA检测结果。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
主要材料来源
柠檬酸一水合物、酵母提取物、磷酸盐缓冲盐水(PBS)、磷酸氢二钠十二水合物、蛋白胨和葡萄糖等化学试剂购自Sigma-Aldrich(美国密苏里州圣路易斯)。乙醇酸(GA)、甘油(GL)、氢氧化铵、四丁基磷酸二氢铵、氢氧化钠和HPLC级甲醇购自国药集团化学试剂有限公司(中国上海)。葡糖醋杆菌(Gluconacetobacter xylinum)菌株ATCC 53582为好氧型的革兰氏阴性菌，购买于美国模式培养物集存库(American Type Culture Collection,Manassas,VA,USA)。在使用所有试剂之前，没有进一步的处理。
实施例1：细菌纤维素(BC)的合成
细菌纤维素是由葡糖醋杆菌(G.xylinum)菌株ATCC 53582分泌产生的。该菌株生长的培养基为HS液体培养基(Hestrin&Schramm)，其主要成分为：5.0gL-1酵母提取物、20gL-1葡萄糖、1.5gL-1一水柠檬酸、20gL-1葡萄糖和6.8gL-1磷酸氢二钠十二水合物。培养基由Milli-Q超纯水配制，在使用前经高温(121℃)高压灭菌20min。将葡糖醋杆菌菌株ATCC53582接种到上述无菌Herstin-Schramm培养基中，接种菌液的体积占总培养基体积的10％。将接种有细菌的细菌培养液在30℃下孵育3-4天，以将BC厚度调节在毫米范围内。由于BC是细菌发酵的代谢副产物，因此产物的厚度与培养时间成正比(厚度随培养时间的增加而增加)。
合成的细菌纤维素用以下方法进行纯化。具体地，将获得的细菌纤维素膜浸入蒸馏水中2天以去除其中多余的培养基残留物，再将其用0.1M NaOH溶液于100℃下处理30min以除去其中的葡糖醋杆菌细胞碎片。然后再将其置于蒸馏水中浸泡3天，每天换一次水，以进一步去除杂质及其中的NaOH溶液并使其PH变为中性。最后，将其经高温(121℃)高压灭菌20min后保存，以用于BC/GA和BC/GA/GL膜的制备及其分析。
实施例2：负载GA的细菌纤维素膜的制备
1)将实施例1中制备的纯化的BC膜剪成相同大小的块状膜(厚0.42cm，宽2cm，长4cm)，并对其进行低温冷冻干燥；所述低温冷冻干燥是湿细菌纤维素膜在-20℃条件下冷冻12h,然后进行真空冷冻干燥。
真空冷冻干燥的条件是：将湿态的BC膜在－20℃下冻结成固态，然后在真空(1～13帕)下使其中的水分不经液态直接升华成气态，最终使BC脱水干燥。
2)将步骤1)得到的干燥的细菌纤维素膜在室温下浸入30mL的10％乙醇酸水溶液中约24h；
3)步骤2)中得到的细菌纤维素膜浸入到灭菌蒸馏水中漂洗30s，以除去其表面未浸润的乙醇酸溶液，即得到所述负载GA的细菌纤维素膜(BC/GA)。
实施例3：负载GA和GL的细菌纤维素膜的制备
1)将实施例1中制备的纯化的BC膜剪成相同大小的块状膜(厚0.42cm，宽2cm，长4cm)，并对其进行低温冷冻干燥，条件同实施例2；
2)将步骤1)得到的干燥的细菌纤维素膜在室温下浸入到30mL的含10％乙醇酸和3％甘油的水溶液中约24h；
3)步骤2)中得到的细菌纤维素膜浸入到灭菌蒸馏水中漂洗30s，以除去其表面未浸润的乙醇酸和甘油溶液，即得到所述负载GA和GL的细菌纤维素膜(BC/GA/GL)。
表1：本发明中所测试的几种细菌纤维素(BC)膜样品的组成及含量
测试例：BC、BC/GA和BC/GA/GL膜样品的表征
图2所示为本发明实施例1合成并纯化的细菌纤维素(BC)膜与实施例2和3中制备的BC/GA膜和BC/GA/GL膜样品的外观形貌及SEM形貌图。其中，图2a为湿的纯BC膜，图2b为负载GA的湿BC膜，图2c为负载GA和GL的湿BC膜；可以看出，与纯BC膜相比，加入了GA之后所得到的膜(BC/GA膜)变厚了；并且在纯BC膜中加入GA和GL后，所得到的复合膜(BC/GA/GL膜)的厚度相比BC/GA膜进一步增加，这说明GA和GL的加入增加了BC膜的溶胀性能。另外，将纯BC膜、BC/GA膜和BC/GA/GL膜分别进行冷冻干燥(在-50℃下冷冻48h)后，其结构形貌的SEM图分别如图2d、2e和2f所示，其中图2d为纯BC膜的表面SEM图，图2e为负载GA的BC膜的SEM图，图2f为负载GA和GL的BC膜的SEM图；可以看出，本发明中这三种膜均具有三维的多孔网络结构；其中，纯BC膜具有较为致密的结构；与纯BC膜相比，GA的加入使得BC/GA膜的孔隙率与孔径增加；而GA和GL的同时存在使得BC/GA/GL膜的孔隙率与孔径都进一步地增加，使得其结构变得较为疏松。由此可知，甘油(GL)的存在限制了干燥过程中BC的3D结构塌陷的程度，并且由于GL具有很高的润滑度、油性和亲水性，通过将甘油(GL)分子掺入BC网络可降低BC纳米纤维之间的分子间吸引力，从而保持纳米纤维的滑动性，因此增加膜孔径并保持其很好的柔韧性。而高度多孔的结构可使药物分子GA更容易负载到BC基质中。另外，在BC/GA膜和BC/GA/GL膜的表面上均没有观察到GA的晶体或聚集体的存在，也表明GA已成功地浸润并很好地分散在BC的三维网络结构中。
图3所示为实施例1中合成并纯化的BC膜与本发明实施例2和3中制备的BC/GA膜和BC/GA/GL膜的机械性能结果；其中拉伸强度的应力-应变结果(图3a)与杨氏模量结果(图3b)表明，与纯的BC膜相比，GA的复合降低了BC/GA和BC/GA/GL膜的断裂点的拉伸强度和杨氏模量。然而，与BC/GA膜相比，由于甘油(GL)的加入，甘油的增塑剂特性使得BC/GA/GL膜硬度和脆性降低，因此其断裂处拉伸强度与断裂伸长率增加。同时，结果发现，与纯的BC膜与BC/GA膜相比，本发明中BC/GA/GL复合膜的杨氏模量最低，这表明通过甘油加入，使得本发明中的BC/GA/GL膜表现出较强的延展性，因此更易于固定和操纵，使其在用于美容面膜以及临床治疗膜中具有潜在的应用前景。
将实施例1合成并纯化的BC膜与本发明实施例2和3中制备的BC/GA膜和BC/GA/GL膜冷冻干燥48小时，然后检测其在生理盐水(0.9％NaCl)中的溶胀行为，图4a显示了所述BC、BC/GA和BC/GA/GL膜在生理盐水中浸润不同时间后测得的溶胀能力曲线。结果发现，所有样品均显示出相似的趋势，而相比纯BC膜，添加乙醇酸后的BC/GA膜的溶胀率明显提高，而且添加乙醇酸(GA)和甘油(GL)后的BC/GA/GL膜的溶胀率则进一步增加。将样品浸泡在蒸馏水中150分钟后，所述BC、BC/GA和BC/GA/GL膜的最大溶胀率分别为607％，836％和1038％。这表明，与BC、BC/GA膜相比，本发明制备的BC/GA/GL膜具有更强的溶胀能力。此外，该结果与发明的BC/GA/GL膜的SEM结果相呼应，这是由于在BC膜中掺入GA和GL后，BC/GA/GL膜的高度多孔结构赋予其较高的吸水能力，进而也增强其溶胀性能。结果表明，观察到的溶胀能力增加将在GA从BC膜释放到皮肤中发挥重要作用。
通过高效液相色谱仪(HPLC)对实施例2和3中制备的BC/GA膜和BC/GA/GL膜系统中负载的乙醇酸的实际量以及在37℃、pH 7.4 PBS中，不同时间间隔后GA体外释放累计百分比进行测定。将所述膜中GA的实际负载量确定为，制备BC/GA和BC/GA/GL膜之前所配置的GA溶液中乙醇酸的总量与制备之后用蒸馏水漂洗BC/GA与BC/GA/GL膜后残留在溶液中乙醇酸的含量之差。将所述膜中GA的负载密度确定为，所制备的BC/GA与BC/GA/GL膜的单位体积内的GA的实际负载量。在pH 7.4 PBS中，不同时间间隔后GA体外释放累计百分比确定为，GA体外总释放量与BC/GA或BC/GA/GL膜中负载的乙醇酸的实际量的比值。实验结果得出(表1)，本发明实施例2中制备的BC/GA膜与实施例3中制备的BC/GA/GL膜系统中有效负载的GA的实际含量分别为19.5mg和22.4mg，其中的GA的负载密度分别为5.80mg/cm3和6.67mg/cm3。图4b所示为本发明中实施例2和3中BC/GA和BC/GA/GL膜中乙醇酸的释放曲线。其中，对于BC/GA膜，在最初的10分钟内乙醇酸呈现出爆发式的释放(约占总乙醇酸的71.3％)，然后缓慢释放，360分钟左右时几乎获得最大释放量；相比之下，对于BC/GA/GL膜，仅约52.6％的乙醇酸在10分钟内迅速释放，随之而来的是缓慢且可持续的释放且其释放速度比BC/GA膜慢得多，并且乙醇酸在PBS中释放360分钟后仍远未达到最大值。以上结果不仅表明，BC可以用作药物GA的递送载体，而且证明了在BC/GA膜中添加甘油可以有效地控制乙醇酸从BC膜中的释放。药物释放延迟的原因可归结为两个因素：一方面，与BC/GA膜相比，本发明中BC/GA/GL膜由于添加了甘油而具有较高的溶胀能力并使之厚度增加，因而乙醇酸从较厚的膜扩散到纳米纤维网络再扩散到PBS溶液，这一过程的药物释放变得缓慢。另一方面，甘油的润滑性，软化与渗透作用，使得有助于确保乙醇酸被更多地吸收到BC基质中，而其高粘性又能防止了GA被迅速地释放出来，因而使药物在BC的3D网络中停留的时间更长，从而达到持续而缓慢的释放效应。该效应不仅能降低药物的副作用，也有利于提高药物的利用度。
将实施例1合成并纯化的BC膜与本发明实施例2和3中制备的BC/GA膜和BC/GA/GL膜进行生物相容性检测，结果如图5、6、7、8所示。从图5可知，将NIH3T3细胞(图5a)和HaCaT细胞(图5b)在PS、BC、BC/GA和BC/GA/GL膜上培养1天和3天后，各组中两种细胞的细胞培养液中乳酸脱氢酶(LDH)的活性均没有显著性差异，说明了本发明制备的BC/GA膜和BC/GA/GL膜均是无毒、生物安全的。其中PS是指没有任何其他材料的细胞培养板对照组。*p<0.05；**p<0.01表示与BC组相比，分别有显著性和极显著性差异。
此外，通过CCK-8测试评估了在所述三种膜上培养的NIH3T3和HaCaT的细胞活力。如图6所示，将NIH3T3和HaCaT细胞分别在PS、BC、BC/GA和BC/GA/GL膜上培养1天和5天后，BC、BC/GA和BC/GA/GL膜上的NIH3T3和HaCaT细胞的细胞活力均高于80％，表明本发明中BC、BC/GA和BC/GA/GL膜均具有良好的生物相容性。并且，细胞培养1天后发现，与BC相比，BC/GA与BC/GA/GL膜上的NIH3T3和HaCaT细胞均显示出较高的细胞活力，且此时BC/GA膜上的细胞活力最强。分析原因，BC/GA膜和BC/GA/GL膜均可以通过释放GA来增强细胞活力，而由于甘油的阻碍作用，BC/GA/GL膜中乙醇酸的释放速率要比BC/GA膜更低,因此BC/GA/GL组所培养细胞的细胞活力较BC/GA组稍低。然而，细胞培养5天后发现，NIH3T3和HaCaT在BC/GA/GL膜上的细胞活力均高于BC和BC/GA组，并且在BC/GA/GL和BC组之间的细胞活力出现显著差异(p<0.05)。这种现象可能归因于，在细胞培养3天后更换培养基时，BC/GA膜中所含的乙醇酸可能几乎已经全部被释放并去除，而此时在BC/GA/GL膜中持续而缓慢的GA的释放导致其培养基中乙醇酸的总含量反过来高于BC/GA组，从而更有利于维持较高的细胞增殖活力。其中PS是指没有任何其他材料的细胞培养板对照组。*p<0.05；**p<0.01表示与BC组相比，分别有显著性和极显著性差异。
为了进一步评估细胞增殖活性，将在本发明实施例1制备的BC膜上和实施例2和3制备的BC/GA和BC/GA/GL膜上培养了1天和5天的NIH3T3和HaCaT细胞进行了活/死细胞染色，其激光共聚焦图片如在图7所示。结果发现，在BC、BC/GA和BC/GA/GL上孵育的NIH3T3和HaCaT细胞均具有较高的活性，几乎未观察到死亡细胞。这三种膜上两种细胞的细胞数均随时间增加，这反映在绿色荧光的增加上。然而，在任何时间点(第1天和第5天)，BC/GA和BC/GA/GL膜上的这两种细胞的数量都比在纯BC上的细胞数多。同样，结果发现，在细胞在培养1天后，BC/GA膜上的这两种细胞的细胞数就大于BC/GA/GL上的细胞数，而在第5天发现了相反的结果，即BC/GA/GL膜上的细胞密度均高于BC/GA膜上的这两种细胞的细胞数，该结果与CCK-8结果高度一致。这些结果都表明，GA能够促进细胞增殖活力，并且，本发明中BC/GA/GL膜系统中通过甘油来控制乙醇酸的缓慢而持续的释放，从而延长了药效时间，提高了药物的利用率与治疗效果。
另外，对在本发明实施例1制备的BC膜上和实施例2和3制备的BC/GA和BC/GA/GL膜上培养了1天和5天的NIH3T3和HaCaT细胞进行细胞形态观察。结果如图8所示，相比BC膜，NIH3T3细胞在BC/GA和BC/GA/GL膜(特别是BC/GA膜)上培养1天后，表现出更多的板状伪足或薄的丝状伪足，这表明它们在BC/GA和BC/GA/GL膜上均表现出更好的细胞黏附和铺展。同时，对于HaCaT细胞，在BC、BC/GA和BC/GA/GL膜上培养1天后，结果发现，在BC膜上的大多数细胞是小而圆形的，而在BC/GA和BC/GA/GL膜(尤其是BC/GA膜)上的细胞开始变大，并且细胞呈现鳞片状。但培养5天后，尽管所有膜上的NIH3T3和HaCaT细胞随时间的推移都得到了更好的铺展与增殖，并呈片式生长，但是在BC/GA和BC/GA/GL膜上铺展的细胞数量远多于BC膜上的细胞，特别是在BC/GA/GL膜上的细胞数量最多，呈现出的相连接的细胞片最大。这些结果也与上述实验中CCK-8测定(图6)和共聚焦(图7)的结果一致。可见乙醇酸和甘油对增强细胞增殖和粘附有很大贡献。
胶原蛋白是人体内最丰富的蛋白质，存在于肌腱、皮肤、肌肉和骨骼中。其占真皮基质中约80％的细胞外物质，有助于皮肤的细胞完整性，促进弹性、紧致性和强度。迄今为止，科学家已经鉴定出20多种不同的胶原蛋白亚型。在人类皮肤中，成纤维细胞合成I型胶原蛋白，这是最主要的一种胶原蛋白，并且是在组织重塑、皮肤衰老、伤口愈合和皮肤纤维化中起重要作用的主要成分之一。胶原蛋白的合成过程始于前胶原蛋白，在前胶原蛋白中，特定的蛋白酶将前胶原蛋白裂解为羧基末端前肽，氨基末端前肽和胶原蛋白分子以形成胶原蛋白肽，然后形成完整的胶原蛋白纤维。因此，胶原纤维合成的程度可以通过羧基末端前肽的产生来表示。
将在本发明实施例1制备的BC膜上和实施例2和3制备的BC/GA和BC/GA/GL膜上的NIH3T3成纤维细胞培养3天后，对其细胞培养液中的I型前胶原蛋白的羧基末端肽(PICP)进行ELISA检测；其中PS是指没有任何其他材料的细胞培养板对照组。如图9所示，与BC膜相比，BC/GA和BC/GA/GL组中释放到培养基中的PICP含量分别增加了12％和8.4％，这表明BC/GA和BC/GA/GL膜都可以通过乙醇酸(GA)的释放来有效地诱导NIH3T3细胞内源性I型胶原蛋白的合成。然而，由于BC/GA/GL膜药物释放缓慢，释放的乙醇酸含量较BC/GA膜更低，因此导致BC/GA/GL组中所培养细胞的PICP产量要稍微低于BC/GA组。因此，该结果不仅可以证明乙醇酸对NIH3T3细胞中胶原合成的积极的促进作用，而且再次证明本发明成功地构建了一种基于BC的药物缓释系统(BC/GA/GL膜)。综上测试结果表明，本发明中构建的BC/GA/GL膜系统能通过甘油(GL)来调节乙醇酸(GA)的缓慢而持续的释放，以最大程度地提高其药效，降低其副作用，并控制乙醇酸在局部给药时的生物利用度，从而更有利于促进皮肤细胞活力、粘附与增殖并且增加胶原蛋白的合成。因此，本发明的BC/GA/GL膜在制备抗衰老面膜或者治疗膜，以延缓或皮肤衰老方面具有潜在的应用前景。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Claims (9)
1.一种抗衰老的细菌纤维素膜，其特征在于，利用细菌纤维素的3D网络结构通过溶液浸润、物理吸附的方法将细菌纤维素与乙醇酸及甘油复合制备而成，所述细菌纤维素膜上的乙醇酸负载密度为5-7mg/cm3。
2.权利要求1所述抗衰老的细菌纤维素膜的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)通过培养葡糖醋杆菌(Gluconacetobacter xylinum)菌株产生细菌纤维素膜；
2)将步骤1)得到的湿态细菌纤维素膜纯化后进行低温冷冻干燥；
3)将步骤2)得到的干燥的细菌纤维素膜在室温下浸入含质量分数10%乙醇酸和质量分数3%甘油的水溶液中24 h，即得到所述的抗衰老的细菌纤维素膜。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，在步骤2)中纯化后得到的湿细菌纤维素膜在-20℃条件下冷冻12h, 然后进行真空冷冻干燥。
4.如权利要求2或3所述的方法，其特征在于，步骤2)中的纯化步骤包括：将获得的细菌纤维素膜浸入蒸馏水中2天以去除其中多余的培养基残留物，再将其用0.1M NaOH溶液于100℃下处理30 min以除去其中的葡糖木醋杆菌，然后再将其置于蒸馏水中浸泡3天，每天换一次水，以进一步去除杂质及其中的NaOH溶液并使其PH变为中性；最后将其经高温高压灭菌20 min后保存。
5.如权利要求2或3所述的方法，其特征在于，步骤1)中培养葡糖木醋杆菌的培养基为Herstin-Schramm培养基，其组分包括：5.0 gL-1酵母提取物、20 gL-1葡萄糖、1.5 gL-1一水柠檬酸和6.8 gL-1磷酸氢二钠十二水合物。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，将葡糖木醋杆菌接种到上述无菌Herstin-Schramm培养基中，接种菌液的体积占总培养基体积的10%。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，将上述接种的葡糖木醋杆菌在30℃下孵育3-4天，以将细菌纤维素膜厚度调节在5mm的范围内。
8.权利要求2-7中任一项所述方法制备的细菌纤维素膜在制备抗衰老面膜中的应用。
9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述抗衰老面膜为抗衰老治疗膜。
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