CN109513044B - 用于微整形的再生组织基质微粒植入剂、制备方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明提出一种用于微整形的再生组织基质微粒植入剂、制备方法及应用。所述再生组织基质微粒植入剂，包含再生组织基质微粒和分散剂，所述再生组织基质微粒含微粒状态的细胞外基质，再生组织基质微粒中DNA残留量在2.0ng/mg以下；所述分散剂包括磷酸盐缓冲液、自体富血小板血浆、聚电解质溶液、细胞生长因子、利多卡因；所述再生组织基质微粒和分散剂的比例为1g：5～80mL。本发明提出的组合物，基于再生组织基质微粒粒径分布窄的优势，易于注射，且本制备工艺保留了再生组织基质的三维框架结构，更易于细胞粘附和迁入，有利于毛细血管的生长，使被填充部位重建血运；可修复因多次注射玻尿酸、取出假体后造成的组织损伤。

Description

用于微整形的再生组织基质微粒植入剂、制备方法及应用

技术领域

本发明属于再生医学领域，具体涉及一种用于组织修复的再生组织基质微粒植入剂、及其制备方法和应用。

背景技术

近年来，随着社会经济的快速发展，人们对美有着更高追求，极大促进微创注射再生医学技术的迅猛发展。

微创注射技术所需的注射填充剂(又称皮肤填充剂(Dermal Filler)、软组织填充剂(Soft Tissue Filler))主要用于创伤、先天性缺损、后天损伤性缺陷、先天性畸形等缺陷的整形美容与修复治疗，包括面部微整形、耳朵微整形、丰胸、关节软组织损伤的填充修复，正颌、正畸修复手术的补充，并具有创伤小、恢复快等独特优势，在创伤重建、颌面部软组织缺陷修复、隆鼻和下巴隆起等方面具有十分广阔的应用前景。

充填剂是通过充填真皮或更深组织间隙的容量丢失来矫正皱纹和面部塑形。目前，用于微创注射技术的充填剂包括生物降解类填充剂和非生物降解类填充剂两类。生物降解类填充剂最早出现在1983年，并应用于自体软组织填充，使用自体、异体真皮来修复面部瘢痕。

美国FDA于2003年12月批准首个非动物源性的透明质酸类抗皱产品，该物质为含有丰富粘多糖的高分子聚合物，并使用交联技术延长了其抗皱时长，保持抗皱效果持续4～12个月。但是使用者在多次使用后出现面部皮肤松弛现象，并随着注射次数的增多机体表现的耐受越明显，出现依赖现象，注射频率增大。

FDA于2006年批准钙羟基磷灰石(CaHA)用于修复中到重度的皱纹和艾滋病引起的真皮萎缩，由类似于骨骼的球形微粒组成重悬于羧甲基纤维素钠凝胶中，可以使注射部位产生新的凝胶，维持时间在15个月以上。因羟基磷灰石注射后会表现出充填剂的游走或溢出、色素沉着和罕见的色素减退等副作用，在国内未被批准使用。

美国FDA批准聚乳酸(PLA)用于治疗艾滋病相关的真皮萎缩(2004年)和修复中度到重度皱纹(2009年)，它是采用α-羟基酸合成的生物可降解产品，注射入皮肤后引起亚临床炎症反应和胶原纤维增生，最后导致皮肤组织进展性体积增大。这类产品同样存在被代谢吸收的缺陷。

非生物降解类填充剂包括聚甲基丙烯酸甲酯微球和液体可注射性硅胶。

真皮充填剂维持又可以分为短效、长效、半永久性、永久性四大类。美国常用的真皮充填剂效果维持时间如下表所示。

表1

专利CN1718249A以新鲜猪皮为原料，去掉毛皮上的异物，削去皮下组织，经过脱脂、碱液处理、剖层、酶液软化、戊二醛交联、漂白处理、微粒化加工、真空无菌灌装、Co₆₀辐照处理得到一种可注射软组织生物填充材料，其属于异种皮粒，难以血管化，注射后产生抗原或者坏死等不良后果。

目前常用的填充剂通过增加真皮层组织的容量，从而达到抚平皱纹、改善脸部缺陷、雕塑完美肌肤的目的，维持作用的要么时间短，要么由于异种胶原蛋白存在的天然缺陷(降解速度较快，容易出现不均匀)，增加了使用者的经济压力和临床医生的操作难度。

发明内容

为了解决现有技术的缺陷，本发明提供了一种可皮下充填的用于微整形的再生组织基质微粒植入剂。

本发明还提出所述再生组织基质微粒植入剂的制备方法。

本发明进一步提出所述再生组织基质微粒植入剂的应用。

实现本发明上述目的的技术方案为：

一种用于微整形的再生组织基质微粒植入剂，包含再生组织基质微粒和分散剂，所述再生组织基质微粒含微粒状态的细胞外基质，所述再生组织基质微粒中DNA残留量在2.0ng/mg以下，所述再生组织基质微粒的粒径在1.2mm以下，D50在0.018～1.0mm之间；所述分散剂包括磷酸盐缓冲液、自体富血小板血浆、聚电解质溶液、细胞生长因子、利多卡因中的一种或多种；所述再生组织基质微粒和分散剂的比例为1g：5～80mL。

其中，所述的聚电解质选自羧甲基壳聚糖、羧甲基纤维素钠、透明质酸、硫酸软骨素、海藻酸钠、聚谷氨酸中的一种或几种，聚电解质溶液的浓度为1.0～30g/L，优选为2.0～20g/L；

其中，所述的分散剂中包括细胞生长因子、利多卡因中的一种或两种；细胞生长因子在所述再生组织基质微粒植入剂中的浓度为0.2～50mg/L，优选0.2～10mg/L；和/或，利多卡因在所述再生组织基质微粒植入剂中的浓度为2-～20g/L；优选为2～4g/L。

所述的再生组织基质微粒植入剂的制备方法，包括步骤：

1)将异体皮原料投入碱的甘油溶液中，浸泡振荡处理，得半成品A；

2)将半成品A去除表皮后，投入表面活性剂溶液中，超声浸泡处理，得半成品B；

3)将半成品B剪裁成小皮片，以沉浸的方式浸入到液氮中3～10min，取出为半成品C；

4)在高速旋转离心力的作用下，用转刀对半成品C进行切割，得到半成品D；

5)将半成品D置于D-氨基酸溶液中浸泡，固液分离得到半成品E；所述的D-氨基酸溶液选自天冬氨酸、丙氨酸、谷氨酸、丝氨酸中的一种或几种；

6)将半成品E与分散剂混合。

其中，步骤1)中所述碱为氢氧化钠和/或氢氧化钾，所述碱的浓度为0.5～5％；进一步优选碱液的浓度是1～3％；

和/或，所述的异体皮原料投入碱的甘油溶液中，在25～35℃下浸泡1～10h并振荡处理。

其中，步骤2)所述的表面活性剂是SDS或者Triton X-100；所述表面活性剂溶液的浓度为0.1～0.3g/L；

超声浸泡条件为：20～45KHz，温度为1～20℃，超声1～5min，浸泡1～4h，优选重复超声和浸泡处理2-6次，重复前换新的表面活性剂溶液。

其中，将半成品B用交联剂进行交联，然后进行剪裁；

所述的交联剂为质量浓度0.1～0.6％的京尼平溶液，交联的时间为2～24h。

其中，步骤4)中所述的半成品D由进料口进入速度是50～100g/min，优选50～80g/min；和/或

步骤5)中优选用天冬氨酸、丙氨酸、谷氨酸、丝氨酸的浓度分别为0.8～1.4，1.2～1.8，0.4～0.6，4～10.8μmol/L组成的氨基酸水溶液，按体积比例1:(0.8～1.2):(0.8～1.2):(0.8～1.2)配制。

其中，所述自体富血小板血浆的制备方法为：富血小板血浆的制备方法为：采集自体静脉血于抗凝管中，一次相对低速离心(100×g，离心10min)，使血浆和血小板与红细胞和白细胞分成三层；取中间层富血小板层，获得富血小板血浆；所述的抗凝管中抗凝剂是枸橼酸钠。

其中，步骤6)所述分散剂为聚电解质溶液，混合时，体系温度降温到4℃以下。

传统制备皮粒的方法为手工剪制，该法简单便捷，无需特殊器械，但费时费力，现今微粒制备机械大多具有以下缺点：(1)皮片柔软，不易固定、切割；(2)刀片间距小，皮片易夹入刀片间；(3)刀片不够锋利或组织粘连，皮片不能彻底离断。因此发明一种快速的制备再生组织基质微粒的制备方法用以维持疗效时间长且安全、可塑性好的介质作为真皮填充剂，且形成一种长期稳定储存的均一的悬液用于真皮填充也需要解决。

本发明进一步提出所述再生组织基质微粒植入剂的应用。

本发明所述的再生组织基质微粒植入剂在制备治疗先天性的缺损及后天损伤性造成的组织缺损填充材料中的应用；所述先天性的缺损及后天损伤性造成的组织缺损的发生部位包括鼻尖、鼻梁骨、鼻唇沟、太阳穴、唇、下巴、耳垂、胸部、面部、阴茎。

本发明还包括进行埋线线雕之后，无论是由于局部脂肪与软组织的流失所造成的局部凹陷感，还是家族遗传因素颅骨突出而显得凹陷，都可以采用线雕技术进行修整。使用平滑线、螺旋线、麻绳线、液态填充线，在真皮底层配合浅筋膜层进行井字格交叉织网布线，针对局部凹陷填充，根据局部凹陷坍塌情况适当配合适当剂量，进行深、中层次皮肤的填充，并抚平整体皮肤。其中所述的埋线位置，特别是针对丰太阳穴。

使用本发明的再生组织基质微粒的植入剂时，所述再生组织基质微粒的植入剂在使用前需先进行如下操作：将植入剂直接进行摇匀，根据临床需要进行使用。使用时要依缺损部位进行消毒、麻醉，视施打技巧、植入深度、植入部位及患者年龄、生活习惯之不同而有不同的效果

本发明的有益效果在于：

采用本发明的制备方法得到的再生组织基质微粒，粒径均一，粒度分布更为窄，并且本发明的制备工艺保留了再生组织基质的三维框架结构，更易于细胞粘附和迁入，有利于毛细血管的生长，使被填充部位重建血运，恢复生机；可修复因多次注射玻尿酸、取出假体后造成的组织损伤，具备优良的填充效果。

本发明还提供的再生组织基质微粒的植入剂可以长期稳定地存在而不发生团聚，有利于再生组织基质微粒在溶液中稳定，确保微粒均一的混悬在液体中。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。实施例中涉及的操作如无特殊说明，均为本领域常规技术操作。

实施例1

1)异体皮原料投入碱的甘油溶液中，在35℃浸泡10小时h振荡处理，得半成品A；

2)将半成品A去除表皮后，用无菌纯水冲洗0.1～5.0min，投入表面活性剂0.3g/L的SDS溶液中，在超声频率45KHz，超声温度为20℃，超声时间5min，浸泡3h，换新的表面活性剂溶液；重复处理3次，得半成品B。

3)将半成品B用无菌纯水冲洗0.1～5.0min，投入到0.6％的京尼平pH为6.5的水溶中交联24h，用无菌纯水冲洗5min。

4)将步骤3)处理后的半成品B剪裁成的小皮片的大小是(0.3～1)×(0.3～1)cm²，以沉浸式方式浸入到液氮中10min，得到半成品C。

5)将半成品C由进料口进入速度是100g/min，在转刀以15000转/min的转速高速旋转离心力的作用下，转刀对半成品C进行切割，得到粒径小于环筛孔径2mm的微粒经过环筛被收集在收集器里得到半成品D。

6)将半成品D用无菌纯水冲洗5.0min，后置于谷氨酸0.5μmol/L氨基酸溶液中浸泡5min，离心过滤得到半成品E。

7)将半成品E与分散剂混合。

本实施例的分散剂为浓度为5g/L海藻酸钠的水溶液。混合时，体系温度降温到4℃以下，将1克半成品E配制加入到50mL分散剂的溶液中，振荡混匀，再经电子束辐照灭菌，使用时再混匀。或将半成品E，分散剂溶液分别灭菌真空无菌灌装，使用时再混匀，即制得可临床使用的再生组织基质植入剂。

实施例2

本实施例用于微整形的再生组织基质微粒植入剂中，分散剂为富血小板血浆，富血小板血浆的制备方法为：在无菌条件下采集自体静脉血10mL于抗凝管中，一次相对低速离心(100×g，离心10min)，使血浆和血小板与红细胞和白细胞分成三层；取中间层富血小板层，获得较佳的血小板浓度的富血小板血浆；所述的抗凝管中抗凝剂是枸橼酸钠。取富血小板血浆与半成品E根据比重采用医用三通混匀后，即可以进行微整形的真皮充填的注射使用。

实施例3-5

实施例3-5均是采用实施例1的步骤得到，其参数不同之处如下表2。

表2实施例1-5试验步骤中各参数

DNA残留检测

根据《脱细胞异体真皮基质》医疗器械产品技术要求中3.6条款的标准检测各实施例之半成品E(再生组织基质微粒)中DNA残留量，结果见表3，DNA残留量在0.3～0.7ng/mg之间。

表3实施例1-5半成品E的DNA残留分析

	实施例1	实施例2	实施例3	实施例4	实施例5
						DNA残留量(ng/mg)	0.3	0.4	0.5	0.6	0.7

马尔文粒度分析仪测定粒径

使用马尔文粒度分析仪测定时，D50表示一个样品的累计粒度分布百分数达到50％时所对应的粒径。D50常用来表示粉体的平均粒度。D95一个样品的累计粒度分布百分数达到95％时所对应的粒径。它的物理意义是粒径小于它的微粒占97％。D10一个样品的累计粒度分布百分数达到10％时所对应的粒径。D10和D95常用来表示粉体粗细两端的粒度指标。

对其他实施例产品同样检测，实施例1-5半成品E微粒的粒径在1.2mm以下，其D50在0.018～1.0mm之间，D95在0.025～1.2mm之间，D10在0.45～20μm。

对比例1

本对比例的操作同实施例1，区别仅在于步骤4)中的操作不同，该对比例的冷冻操作为：步骤4)对再生组织基质的皮片预处理，将皮片预先剪裁成小皮片，在低温冷冻使用超低温冰箱(-80℃)进行超低温冷藏，冷冻后取出；

对比例2

本对比例的操作同实施例1，区别仅在于步骤4)中将半成品B剪裁成的小皮片的大小是0.6×0.6cm²后，皮片不经冷冻干燥，直接进行步骤5)的操作。

实施例1中环筛的孔径为2mm，微粒大小在1mm以内。

表4实施例1和对比例的半成品E的粒度分布

	D10(μm)	D50(μm)	D95(μm)
				实施例1	563	896	1108
对比例1	236	1022	1504
				对比例2	352	989	1362

从表4可以看出，虽然微粒的平均粒度虽然都达到1mm以内，超越的本发明专利的制备方法得到的微粒粒径范围比较宽，均一度差，而依照本发明方法制备的再生组织基质微粒粒度分布更狭窄，粒径更均一，基于对比例1、2粒度分布情况，本发明所提供的实施例1-5在粒径分布和粒径均一程度上显著，填充效果更好。证明本发明所主张的制备方法中，通过条件参数的控制可达到理想的水平。

应用实施例1

皮肤刺激性试验

以志愿者为试验对象，进行皮肤刺激试验研究，考察实施例1-5的植入剂在试验条件下产生的刺激反应的潜能。具体的操作方法如下所述：选取5名健康的志愿者，分别将实施例1-5的植入剂直接接触手背皮肤，于接触后在24±2h对接触部位的红斑、水肿情况进行记录。试验结果如下表5所示。

表5在24±2h接触部位的红斑、水肿情况

	红斑情况	水肿情况
			实施例1	无红斑	无水肿
实施例2	无红斑	无水肿
			实施例3	无红斑	无水肿
实施例4	无红斑	无水肿
			实施例5	无红斑	无水肿

从表3的记录结果可看出，实施例1-5的植入剂不会对皮肤造成刺激，温和无毒，不会引起皮肤不适症状的产生。

应用实施例2

生物相容性分析

取环状切除术后幼儿包皮分离成纤维细胞，将原代细胞长满约75％即可传代，传至第3代，将细胞与实施例1与对比例1和对比例2所得的再生组织基质微粒联合体外培养2～3d，倒置相差显微镜和扫描电镜观察细胞在支架材料上的黏附、生长及增殖情况，并计算细胞在材料上的黏附率；XTT比色法检测细胞的生长增殖情况。

结果显示实施例1、对比例1和2所得的再生组织基质微粒均显示，实施例1成纤维细胞在支架材料上分布均匀，12h内细胞开始伸展、黏附，24～48天完全伸展变形，胞体细长呈长梭形，核卵圆形居中，细胞呈栅栏状、漩涡状生长；72h支架上的布满细胞。

对比例1成纤维细胞在支架材料上分布均匀，32h内细胞开始伸展、黏附，三四天完全伸展变形，胞体细长呈长梭形，核卵圆形居中，细胞呈栅栏状、漩涡状生长；一周支架上的布满细胞。

对比例2成纤维细胞在支架材料上分布均匀，24h内细胞开始伸展、黏附，两三天完全伸展变形，胞体细长呈长梭形，核卵圆形居中，细胞呈栅栏状、漩涡状生长；一周支架上的布满细胞。

而人成纤维细胞细胞与实施例1所得的再生组织基质微粒混合培养后平均黏附率为95.30％，比对比例1所得的再生组织基质微粒的黏附率均高21.3个点，比对比例2所得的再生组织基质微粒的黏附率均高16.8个点，并保持正常的生长增殖速度，表明本发明技术方案所得的微粒支架对细胞具有更良好的黏附性；本发明工艺制备的再生组织基质基质材料与人成纤维细胞复合后相容性更好。

应用实施例3稳定性试验

将相同质量的实施例1分别加入水，生理盐水，PBS溶液，聚电解质液体至相同高度的液面，混匀后装入同一规格的量筒，测量装载液表面点位，结果显示表面绝对电动势，水<生理盐水≈PBS溶液<聚电解质液体，说明本发明技术方案的的表面电动势增大，本发明技术方案的植入剂更加的稳定。

完成上述试验将4种悬液静置40分钟min后，澄清液体的体积(V)，V水>V生理盐水≈VPBS溶液>V聚电解质液体，由此本发明植入剂比单纯的再生组织基质微粒在生理盐水中更溶液形成均一稳定的悬液，更易于微创注射的稳定进行

应用实施例4：

本发明针对志愿者进行再生组织基质微粒植入剂(实施例2)，Ⅰ型胶原蛋白植入，脱细胞异种真皮微粒植入剂植入，三名志愿者植入三个月后触摸的柔软度与原有皮肤的差异性比较，结果是实施例2<Ⅰ型胶原蛋白植入<脱细胞异种真皮微粒植入剂植入，本发明的产品在植入人体后相较于人体本身的差异度最小。另再对维持充填时间长短进行比较，结果是实施例2>脱细胞异种真皮微粒植入剂>Ⅰ型胶原蛋白植入，说明本发明产品植入剂植入人体内更接近皮肤原有的结构，随着材料的降解和细胞的繁殖，形成新的与自身功能和形态相适应的有活力的组织和器官，可达到永久替代，保持的时间更长，减少其他产品多次注射的问题。

以上的实施例仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通工程技术人员对本发明的技术方案作出的各种变型和改进，均应落入本发明的权利要求书确定的保护范围内。

Claims (2)

1.一种用于微整形的再生组织基质微粒植入剂制备方法，其特征在于，包括步骤：

1)异体皮原料投入碱的甘油溶液中，在35℃浸泡10小时振荡处理，得半成品A；所述碱为KOH，碱的浓度为5％；

2)将半成品A去除表皮后，用无菌纯水冲洗0.1-5.0min，投入表面活性剂0.3g/L的SDS溶液中，在超声频率45KHz，超声温度为20℃，超声时间5min，浸泡3h，换新的表面活性剂溶液；重复处理3次，得半成品B；

3)将半成品B用无菌纯水冲洗0.1-5.0min，投入到0.6％的京尼平pH为6.5的水溶液中交联24h，用无菌纯水冲洗5min；

4)将步骤3)处理后的半成品B剪裁成的小皮片的大小是1×1cm²，以沉浸式方式浸入到液氮中10min，得到半成品C；

5)将半成品C由进料口进入速度是100g/min，在转刀以15000转/min的转速高速旋转离心力的作用下，转刀对半成品C进行切割，得到粒径小于环筛孔径2mm的微粒经过环筛被收集在收集器里得到半成品D；

6)将半成品D用无菌纯水冲洗5.0min，后置于谷氨酸0.5μmol/L氨基酸溶液中浸泡5min，离心过滤得到半成品E，离心力200xg，离心时间10min；

7)将半成品E与分散剂混合；分散剂为浓度为5g/L海藻酸钠的水溶液，混合时，体系温度降温到4℃以下，将1克半成品E配制加入到50mL分散剂的溶液中，振荡混匀，再经电子束辐照灭菌，使用时再混匀，电子束辐照强度为20kGy，细胞生长因子终浓度为0，利多卡因为0；或将半成品E，分散剂溶液分别灭菌真空无菌灌装，使用时再混匀，即制得可临床使用的再生组织基质植入剂。

2.权利要求1所述的方法制备得到的再生组织基质微粒植入剂在制备治疗先天性的缺损及后天损伤性造成的组织缺损填充材料中的应用；所述先天性的缺损及后天损伤性造成的组织缺损的发生部位包括鼻尖、鼻梁骨、鼻唇沟、太阳穴、唇、下巴、耳垂、胸部、阴茎。