CN106434674B - 一种微小分子RNA-758-3p及其作为抗肿瘤标志物的用途 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种微小分子RNA‑758‑3p(miR‑758‑3p)及其在预防和治疗肝癌疾病以及抗肿瘤药物中的应用,所述miR‑758‑3p的核苷酸序列如下所示:5`‑UUUGUGACCUGGUCCACUAACC‑3`。该miR‑758‑3p在肝癌组织中表达水平相较于对应癌旁正常肝组织表达水平、以及其在肝癌细胞系hepG2、SMMC‑7721、HCCLM3细胞系中表达下调。说明miR‑758‑3p对mtor基因具有特异性靶向抑制作用,能够有效抑制细胞增殖,细胞迁移和细胞侵袭以及自愈能力。因此,本发明为开发以miR‑758‑3p为策略的原发性肝癌的预防、诊断、治疗的基础研究和抗肿瘤药物研究提供重要的意义和应用前景。
Description
技术领域
本发明属于生物制药领域,具体涉及一种微小分子RNA-758-3p及其作为抗肿瘤标志物的用途。
背景技术
原发性肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是常见的危害人类健康的恶性肿瘤,其发病率和病死率分别占恶性肿瘤的第五位和第二位,且一半以上发生在中国。迄今其病因不明,临床治疗效果不佳,因此开展肝癌发病机制及临床治疗的研究是减轻其危害的基本途径。
常规的HCC肝癌诊断主要为:血清甲胎蛋白AFP检测,肝脏B超检查或磁共振检查,肝动脉造影,肝穿刺活组织检查,外科手术活检或冰冻切片检查等。其中AFP已成为最有价值的肝癌标志物,多年以来一直作为诊断肝癌的重要参考依据。但是30%~40%的肝癌病人的AFP阴性,因而延误了肝癌的诊断。因此,寻找有效的肿瘤标志物用于癌变机理研究、药物靶标的设计、肿瘤的诊断及高危人群的筛查成为肝癌研究的当务之急。
MicroRNA(miRNA)是一类长度约为18-25nt的内源性非编码单链小RNA。miRNA可以通过靶向结合mRNA在转录后水平调控基因表达,有研究表明,miR-758-3p与动脉粥样硬化等心血管疾病的发生发展有关。而在临床研究中,miR-758-3p在肝癌等肿瘤中的作用以及其在细胞中的调控作用机制以及对肿瘤细胞的功能影响仍不清楚。因此,开发以miR-758-3p为策略的原发性肝癌的预防、诊断、治疗的基础研究和抗肿瘤药物研究具有重要的意义和应用前景。
发明内容
本发明是基于以下研究意外获得的:
1.实时荧光定量PCR检测显示在miR-758-3p在肝癌组织中表达水平相较于对应癌旁正常肝组织表达水平明显下调。
2.本发明通过qRT-PCR对正常肝细胞系LO2以及肝癌细胞系hepG2、SMMC-7721、HCCLM3细胞系中miR-758-3p表达量的检测显示其在肝癌细胞系中表达下调。
3.本发明通过TargetScan、miRanda等预测软件对miR-758-3进行靶基因预测,通过双荧光素酶报告实验验证了其对mtor的特异性靶向抑制作用。
4.本发明通过转染mimic,inhibitor,nc,inhibitor-nc等分别建立了miR-758-3p的过表达以及抑制表达细胞模型。
5.本发明从cck8,划痕实验和transwell肿瘤细胞侵袭实验,证实了mir-758-3p过表达能够有效抑制细胞增殖,细胞迁移和细胞侵袭以及自愈能力。
6.本发明表明microRNA在临床实践中有非常重要的意义,将成为新一代的肿瘤生物诊断标志物和用于肿瘤治疗的分子靶标。尤其是开辟了以miR-758-3p为主的肿瘤疾病全新靶标的研究,也为研制抗肿瘤新药开辟新的途径。
因此,本发明的目的在于提供一种微小分子RNA-758-3p(miR-758-3p)在预防和治疗肝癌疾病以及抗肿瘤药物中的作用,所述miR-758-3p的核苷酸序列如下所示:5`-UUUGUGACCUGGUCCACUAACC-3`(序列表SEQ ID NO 1)。
优选地,在本发明所述的miR-758-3p在肝癌组织中表达水平相较于对应癌旁正常肝组织表达水平明显下调。
优选地,在本发明所述的miR-758-3p在肝癌细胞系hepG2、SMMC-7721、HCCLM3细胞系中表达下调。
优选地,在本发明所述的miR-758-3p对mtor基因具有特异性靶向抑制作用。
优选地,在本发明所述的miR-758-3p的过表达能够有效抑制细胞增殖,细胞迁移和细胞侵袭以及自愈能力。
本发明的另一目的在于提供上述微小分子RNA-758-3p在预防或治疗肝癌疾病中的用途。
本发明的又一目的在于提供上述微小分子RNA-758-3p在制备预防或治疗肝癌疾病的药物中的用途。
优选地,本发明所述用途是miR-758-3p通过抑制mtor基因而实现的。
优选地,本发明所述用途为miR-758-3p在肿瘤细胞过表达对相关肿瘤的调控作用和相关疾病药物中的作用。
优选地,本发明所述用途为miR-758-3p在肿瘤细胞过表达对肝部肿瘤的调控作用、以及预防或治疗肝癌药物中的作用。
由上可知,本发明首次意外地发现了miR-758-3p分子可以单独地在肝癌等肿瘤中的抑癌作用,以及其抑制细胞增殖,细胞迁移和细胞侵袭以及自愈能力等的调控作用机制以及对肿瘤细胞的功能影响。因此,本发明为开发以miR-758-3p为策略的原发性肝癌的预防、诊断、治疗的基础研究和抗肿瘤药物研究提供重要的意义和应用前景。
附图说明
图1为miR-758-3p在原发性肝癌组织及癌旁组织中的表达图;
图2为miR-758-3p在正常肝细胞系LO2与肝癌细胞系hepG2、HCCLM3、SMMC-7721表达图;
图3为双荧光素酶报告系统验证miR-758-3p靶向抑制mtor萤光素酶活性实验图;
图4为miR-758-3p过表达和抑制表达模型实验图;
图5为CCK8实验验证miR-758-3p明显抑制了肝癌细胞hepG2细胞的增殖实验图;
图6为miR-758-3p抑制肝癌细胞hepG2细胞迁移的划痕实验图;
图7为miR-758-3p明显抑制肝癌细胞的侵袭的transwell实验图。
具体实施方式
以下通过具体实施例进一步对本发明的技术方案进行说明,应理解以下仅为本发明的示例性说明,并不用于限制本发明权利要求的保护范围。
本发明实施例中如无特别指明,所用试剂或药品均为可商业渠道购买获得的。
实施例1采用qRT-PCR检测miR-758-3p表达。
收集宁夏医科大学总医院病理科2015-2016年期间原发性肝癌病人福尔马林固定后石蜡包埋组织34例,分别连续切片6-7um厚5片,二甲苯脱蜡后按照石蜡包埋组织切片miRNA提取试剂盒(TIANGEN)说明书提取RNA。之后将提取的RNA按照Thermo ScientificRevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit(Thermo)说明书反转录为cDNA。以U6作为内参基因,采用-△△CT相对定量法检测miR-758-3p在肝癌及癌旁组织的相对表达量。
如图1所示,其显示了提取了福尔马林固定后石蜡包埋组织中RNA,反转录为cDNA,运用qRT-PCR方法检测了miR-758-3p在原发性肝癌组织及癌旁组织中的表达情况。
如图1结果说明,通过对34对肝癌及癌旁组织中miR-758-3p的表达量进行统计学分析,可以得到在肝癌及癌旁组织中miR-758-3p的表达有差异,并且其在肝癌组织中表达相对于癌旁组织下调。
实施例2miR-758-3p在肝癌细胞系的表达
将冻存于液氮中的正常细胞系LO2与肝癌细胞系(购自吉凯基因)hepG2、HCCLM3、SMMC-7721细胞进行复苏,并用含有10%FBS的DMEM培养基在37℃,5%CO2的条件下与细胞培养箱培养24~48h后用胰酶消化并收集细胞,使用trizol裂解细胞后,分别加入氯仿、异丙醇以及75%乙醇纯化抽提RNA后,同样条件对RNA按照Thermo Scientific RevertAidFirst Strand cDNA Synthesis Kit(Thermo)说明书反转录为cDNA。并以U6为内参,LO2细胞中miR-758-3p表达量为对照,采用-△△CT相对定量法检测miR-758-3p在肝癌细胞系hepG2、HCCLM3、SMMC-7721中的相对表达量,结果见图2。
由图2可知,miR-758-3p在肝癌细胞系hepG2、HLLM3、SMMC-7721细胞中表达水平相对于正常肝细胞LO2降低。
实施例3miR-758-3p靶向抑制mtor萤光素酶活性实验
1、pMIR-Report-mtor-3`UTR载体构建与鉴定。
设计靶基因mtor3`UTR野生型以及突变型PCR所用上下游引物(引物序列(SEQ IDNO 2~5)为:
mtor上游引物CCCAAGCTTGATTTGGTTCCCAGGACA;
mtor下游引物CGACGCGTCCTCCCTACTAGCGGTCA;
mtor-mut上游引物CGACGCGTTTCGATGTTAAGTCAAAACCCGTATT;
下游引物CGACGCGTCCTCCCTACTAGCGGTCA
再通过PCR得到目的片段。将靶基因目的片段与空的pMIR-Report载体同时进行mluI以及Hindiii双酶切,并通过琼脂糖凝胶电泳进行验证并回收酶切后产物。之后,将线性化的靶基因片段以及pMIR-Report(萤火虫荧光素酶报告载体)在T4连接酶的作用下进行连接,连接条件为16℃4h,4℃过夜。将连接产物转化到感受态细胞(DH5a)中,挑取单菌落,提取质粒,进行菌落PCR、双酶切以及测序验证。
2、双荧光素酶报告实验。
将HEK-293T细胞接种于96孔板,使转染时细胞密度达到70%~80%。将pMIR-report-mtor-3`UTR野生型/突变型载体,pRL-TK(海参荧光素酶报告载体)、miR-758-3pmimic/miR-758-3p inhibitor/nc/inhibitor-nc(购自上海吉玛公司)在lipo2000(Invitrogen公司)作用下共转染入HEK-293T细胞中。转染后继续培养48h,并按照promega双荧光素酶试剂盒说明书裂解细胞进行萤火虫荧光以及海肾荧光检测,检测仪器为微孔板发光分析仪。
如图3所示,双荧光素酶报告系统验证了miR-758-3p靶向抑制mtor萤光素酶活性。如图所示,共转染pMIR-report-mtor-3`UTR野生型载体以及miR-758-3p mimic组荧光相对对照组明显降低,而共转染说明pMIR-report-mtor-3`UTR突变型载体以及miR-758-3pmimic组相对对照组并无明显差异,由此可知,miR-758-3p可以靶向mtor并抑制其蛋白表达。
实施例4建立miR-758-3p过表达以及抑制表达细胞模型。
在6孔板中接种hepG2细胞(购自吉凯基因),使其融合度为70%~80%,按照invitrogenlipo2000说明书分别进行转染,转染步骤为:
先用opti-MEM分别溶解lipo2000以及miR-758-3p mimic、miR-758-3pinhibitor、nc、inhibitor-nc,然后将两者混匀,静置15~20min后加入细胞中。转染后继续培养24~48h提取RNA,并进行qRT-PCR检测从而验证过表达以及抑制表达作用。
图4显示了miR-758-3p过表达和抑制表达模型的成功建立,如图4所示,qRT-PCR分别检测转染miR-758-3p mimic/inhibitor,nc/inhibitornc(由上海吉玛基因合成)后的表达水平,可以看出转染miR-758-3p mimic后miR-758-3p表达水平相对nc组明显升高,而转染miR-758-3p inhibitor后miR-758-3p表达水平相对inhibitor-nc组则降低。
实施例5CCK-8实验检测miR-758-3p抑制肝癌细胞hepG2细胞的迁移。培养hepG2细胞,并将其按照分组情况(实验分组:miR-758-3p mimic,miR-758-3p inhibitor,nc,inhibitor-nc;时间分组:0h、24h、48h、72h)以5000/孔的细胞数接种于96孔板中,培养24h后如上步骤进行转染,以转染完成为0h,分别在0h、24h、48h、72h后每孔加入10ulcck-8试剂,继续培养1.5h后用酶联免疫检测仪检测450nm处的吸光度值。通过对24h、48h、72h时各组相对于0h的细胞增值率计算从而比较miR-758-3p对肝癌细胞增殖的影响。
如图5所示,相对于nc组,24h、48h、96h miR-758-3p mimic实验组细胞增值率降低26.9%、39%、34.4%,相对于inhibitor-nc组,inhibitor-miR-1247-5p组细胞增值率增高26%、10.3%、9%。这显示了抑制肝癌细胞hepG2细胞的迁移。
实施例6划痕实验:
在6孔板培养hepG2细胞使其融合度为70%~80%后按照上述方法进行各实验组转染,转染后继续培养至其融合度为100%后,于每个孔中进行划线。划线后分别于0h,24h,48h,72h在显微镜下观察细胞迁移情况并进行拍照后进行数据分析从而比较miR-758-3p对细胞迁移影响。
如图6所示,对转染nc,miR-758-3p mimic,inhibitor-nc,miR-758-3p inhibitor48h后细胞迁移的距离进行统计学分析后可看出mimic组相对于nc组迁移能力明显减弱,而inhibiitor组相对于inhibitor组迁移能力增强。这显示了划痕实验验证了miR-758-3p明显抑制了肝癌细胞hepG2细胞的迁移。
实施例7.Transwell实验检测细胞侵袭情况。
Matrigel基质胶来源于BD公司,首先将分装冻存于-20℃的新鲜Matrigel在4℃解冻并按照体积比1:8与无血清DMEM培养基配制成混悬液,包被Transwell(孔径8um)小室;用无菌镊子将Transwell小室放入24孔细胞培养板,将制备好的Matrigel混悬液按70ul/室加入24孔板,放入细胞培养箱中30min,取出后再超净工作台风干30min,在Transwell小室的下室中加入500ul含20%FBS的DMEM培养基,上室中加入制备好的细胞悬液105/孔,细胞常规培养48h,用镊子小心将Transwell小室取出,弃去上室培养基,用无菌棉签轻轻将上室内面残余的细胞以及Matrigel胶刮去,用4%多聚甲醛4℃固定30min,PBS洗两遍,0.1%结晶紫染色20~30min,正置显微镜镜下采集照片,随机选取5个高倍镜视野,技术穿膜的细胞数,并进行统计分析。
如图7所示,结晶紫对穿孔后的细胞染色并分析,可看出miR-758-3p mimic组相对于nc组穿膜细胞数减少,而miR-758-3pinhibitor组相对于inhibitor-nc组穿膜细胞数增多。由此显示了transwell实验验证了miR-758-3p明显抑制了肝癌细胞的侵袭。
以上所述仅是本发明的优选实施方式,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以做出若干改进和润饰,这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 宁夏医科大学
<120> 一种微小分子RNA-758-3p及其作为抗肿瘤标志物的用途
<160> 5
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 22
<212> RNA
<213> microRNA
<400> 1
uuugugaccu gguccacuaa cc 22
<210> 2
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
cccaagcttg atttggttcc caggaca 27
<210> 3
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
cgacgcgtcc tccctactag cggtca 26
<210> 4
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
cgacgcgttt cgatgttaag tcaaaacccg tatt 34
<210> 5
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
cgacgcgtcc tccctactag cggtca 26
Claims (2)
1.一种miR-758-3p在制备治疗肝癌疾病的药物的用途,其特征在于,所述
miR-758-3p的核苷酸序列如下所示:5`-UUUGUGACCUGGUCCACUAACC-3`。
2.据权利要求1所述的用途,其特征在于,所述用途为miR-758-3p在肿瘤细胞过表达对肝部肿瘤的调控作用、以及治疗肝癌药物中的作用。
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