CN111728890A - 重组谷胱甘肽过氧化物酶及其双功能抗氧化酶在抗氧化抗衰老方面的应用 - Google Patents
重组谷胱甘肽过氧化物酶及其双功能抗氧化酶在抗氧化抗衰老方面的应用 Download PDFInfo
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Abstract
重组谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)及重组兼备谷胱甘肽过氧化物酶和超氧化物歧化酶活性的双功能抗氧化酶(GPX‑L‑APSOD)在制备抗氧化抗衰老防晒剂、晒后修复剂或抗衰老化妆品中的应用,属于生物技术领域。可以以1比1000的体积比例将GPX或GPX‑L‑APSOD添加到已有的防晒剂或晒后修复剂中,增加其抗氧化抗衰老能力,制备成复合型抗氧化抗衰老防晒剂或晒后修复剂。或将GPX或GPX‑L‑APSOD与多种载体或辅料合用,制备成新型抗氧化抗衰老防晒剂或晒后修复剂。还可以与化妆品的各种成分如保湿剂、粘度调节剂、香味剂等合用,制备成抗衰老化妆品。上述产品抗氧化活性强,对皮肤无刺激性,具有较高的实用价值和良好的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域,具体涉及重组谷胱甘肽过氧化物酶及其双功能抗氧化酶在抗氧化抗衰老方面的应用,具体可用于制备抗氧化抗衰老防晒剂、晒后修复剂或抗衰老化妆品。
背景技术
在人类的生存环境中,由于大气臭氧层的保护,阻挡了太阳光中99%的紫外线辐射,但在过去的十几年里,随着大气臭氧层的不断消耗,地球表面的紫外线强度越来越大。紫外线可以穿透皮肤,导致皮肤氧化应激产生活性氧(ROS),从而破坏皮肤细胞的细胞膜,DNA和蛋白质。同时紫外线也是光老化的元凶,紫外线长期照射皮肤会加速皮肤老化,使皮肤失去光泽、变粗糙、增厚、过早出现皱纹与色斑。目前,人们使用的防晒剂主要包括物理防晒剂和化学防晒剂。物理防晒剂是通过反射或散射作用,阻挡掉紫外线来达到防晒的目的,其缺点是容易影响汗腺分泌,甚至造成毛孔堵塞等。化学防晒剂是指一些具有吸收紫外线功能的有机化合物,其缺点是对皮肤有一定的刺激性,容易出现过敏症状。无论是物理防晒还是化学防晒都是以减少紫外线为目的从而达到防晒的效果,不具有抗氧化抗衰老作用,无法及时清除ROS,抑制紫外线造成的皮肤光老化。因此,抗氧化抗衰老防晒剂与晒后修复剂具有良好的开发前景。
重组谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)是具有抗氧化功能的过氧化物分解酶,它可以高效的将有毒的过氧化物还原成无毒的羟基化合物,从而及时清除ROS,保护组织细胞免受氧化应激损伤。超氧化物歧化酶也是一类重要的抗氧化酶,它具有特殊的生理活性,是超氧阴离子(O2·-)的唯一清除剂,能转化O2·-为过氧化氢(H2O2),继而被重组谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)将其分解为水(H2O),从而达到清除ROS的目的。本课题组的中国专利201510431360.1与201710583460.5分别公开了由UAG工程菌制备的重组谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)与重组兼备谷胱甘肽过氧化物酶和超氧化物歧化酶活性的双功能抗氧化酶(GPX-L-ApSOD),这两种重组抗氧化酶都具有较高的抗氧化活性与较好的稳定性。本发明目的在于针对现有技术的不足,应用这两种重组抗氧化酶研究其对紫外线诱导的皮肤表皮细胞损伤与皮肤老化的预防与治疗作用,为新型抗氧化抗衰老防晒剂、晒后修复剂或抗衰老化妆品的研发奠定基础。含有GPX或GPX-L-ApSOD的防晒剂、晒后修复剂或抗衰老化妆品,抗氧化活性强,对皮肤无刺激性,具有较高的实用价值和良好的应用前景。
发明内容
本发明的第一个目的在于提供重组谷胱甘肽过氧化物酶(GPX,包括GPX1、GPX2、GPX3、GPX4、GPX5、GPX6、GPX7和GPX8)在制备预防皮肤表皮细胞损伤的防晒剂中的应用。具体见本发明内容有益效果的(1)~(5)和实施例(3)~(7),也见图2~图6。
本发明的第二个目的在于提供重组谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)在制备治疗皮肤表皮细胞损伤的晒后修复剂中的应用。具体见本发明内容有益效果的(6)~(10)和实施例(8)~(12),也见图7~图11。
本发明的第三个目的在于提供重组兼备谷胱甘肽过氧化物酶和超氧化物歧化酶活性的双功能抗氧化酶(GPX-L-ApSOD,包括GPX1-L-ApSOD、GPX2-L-ApSOD、GPX3-L-ApSOD、GPX4-L-ApSOD、GPX5-L-ApSOD、GPX6-L-ApSOD、GPX7-L-ApSOD、GPX8-L-ApSOD)在制备预防皮肤表皮细胞损伤的防晒剂中的应用。具体见本发明内容有益效果的(11)~(15)和实施例(13)~(17),也见图12~图16。
本发明的第四个目的在于提供重组兼备谷胱甘肽过氧化物酶和超氧化物歧化酶活性的双功能抗氧化酶(GPX-L-ApSOD)在制备治疗皮肤表皮细胞损伤的晒后修复剂中的应用。具体见本发明内容有益效果的(16)~(20)和实施例(18)~(22),也见图17~图21。
本发明的第五个目的在于提供重组谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)在制备预防皮肤老化的防晒剂或抗衰老化妆品中的应用。具体见本发明内容有益效果的(21)~(25)和实施例(23)~(27),也见图22~图26。
本发明的第六个目的在于提供重组谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)在制备治疗皮肤老化的晒后修复剂或抗衰老化妆品中的应用。具体见本发明内容有益效果的(26)~(30)和实施例(28)~(32),也见图27~图31。
本发明的第七个目的在于提供重组兼备谷胱甘肽过氧化物酶和超氧化物歧化酶活性的双功能抗氧化酶(GPX-L-ApSOD)在制备预防皮肤老化的防晒剂或抗衰老化妆品中的应用。具体见本发明内容有益效果的(30)~(35)和实施例(33)~(37),也见图32~图36。
本发明的第八个目的在于提供重组兼备谷胱甘肽过氧化物酶和超氧化物歧化酶活性的双功能抗氧化酶(GPX-L-ApSOD)在制备治疗皮肤老化的晒后修复剂或抗衰老化妆品中的应用。具体见本发明内容有益效果的(35)~(40)和实施例(38)~(42),也见图37~图41。
由于防晒剂的标准用量为2mg/cm2,GPX与GPX-L-ApSOD抗氧化抗衰老的有效剂量为2μg/cm2,因此本发明可以以1比1000的体积比例将GPX或GPX-L-ApSOD添加到已有的防晒剂或晒后修复剂中,增加其抗氧化抗衰老能力,制备成复合型抗氧化抗衰老防晒剂或晒后修复剂。或将GPX或GPX-L-ApSOD与多种载体或辅料合用,制备成新型抗氧化抗衰老防晒剂或晒后修复剂。还可以与化妆品的各种成分如保湿剂、粘度调节剂、香味剂等合用,制备成抗衰老化妆品。
本发明中GPX1表示重组人谷胱甘肽过氧化物酶1,GPX1-L-ApSOD表示重组兼备人谷胱甘肽过氧化物酶1和庞贝蠕虫超氧化物歧化酶活性的双功能抗氧化酶。GPX1与GPX1-L-ApSOD是通过UAG工程菌的表达方法制备(参见中国专利201510431360.1与中国专利201710583460.5)。本发明中提到UVB表示紫外线B,Hacat细胞表示人永生化表皮细胞(来源于ATCC细胞库),0.06U/mLGPX1-L-ApSOD是指GPX1-L-ApSOD中GPX1的活力。根据吉林大学实验动物的护理和使用委员会进行动物实验,实验方案经吉林大学伦理委员会批准。
本发明以GPX1与GPX1-L-ApSOD为实施对象,具有以下有益效果:
(1)GPX1能够预防紫外线引起的皮肤表皮细胞损伤:
在30mJ/cm2UVB诱导的Hacat细胞氧化应激模型中,对照组细胞存活率为99.86±3.49%;GPX1组细胞存活率为99.08±5.16%;UVB模型组细胞存活率仅为46.75±5.77%;而含0.12U/mL GPX1的GPX1预防组细胞存活率为71.09±6.08%;可见GPX1预防组细胞存活率是UVB模型组的1.52倍,这表明GPX1能有效预防紫外线引起的细胞损伤。
(2)GPX1能够预防紫外线引起的皮肤表皮细胞细胞膜损伤:
在30mJ/cm2 UVB诱导的Hacat细胞氧化应激模型中,对照组细胞乳酸脱氢酶的释放率为100.26±8.65%;GPX1组细胞乳酸脱氢酶的释放率为99.09±7.56%;UVB模型组细胞乳酸脱氢酶的释放率为211.48±12.66%;而含0.12U/mL GPX1的GPX1预防组细胞乳酸脱氢酶的释放率为132.07±11.38%;相比于UVB模型组,GPX1预防组细胞乳酸脱氢酶的释放率显著降低,这表明GPX1能有效预防紫外线引起的皮肤表皮细胞细胞膜损伤。
(3)GPX1能够预防紫外线引起的氧化脂质化,降低皮肤表皮细胞丙二醛含量:
在30mJ/cm2 UVB诱导的Hacat细胞氧化应激模型中,对照组细胞丙二醛含量为2.16±0.28(nmol/mg);GPX1组细胞丙二醛含量为2.23±0.33(nmol/mg);UVB模型组细胞丙二醛含量为7.59±0.49(nmol/mg);而含0.12U/mL GPX1的GPX1预防组细胞丙二醛含量为4.89±0.51(nmol/mg);相比于UVB模型组,GPX1预防组细胞丙二醛含量显著降低,这表明GPX1能有效预防紫外线引起的皮肤表皮细胞氧化脂质化。
(4)GPX1能够预防紫外线引起的皮肤表皮细胞DNA损伤:
在30mJ/cm2 UVB诱导的Hacat细胞氧化应激模型中,对照组细胞DNA损伤比率为4.98±0.21%;GPX1组细胞DNA损伤比率为5.16±0.36%;UVB模型组细胞DNA损伤比率为42.19±0.89%;而含0.12U/mL GPX1的GPX1预防组细胞DNA损伤比率为22.07±0.53%;相比于UVB模型组,细胞DNA损伤比率显著降低,这表明GPX1能有效预防紫外线引起的皮肤表皮细胞DNA损伤。
(5)GPX1能够预防紫外线引起的皮肤表皮细胞凋亡:
在30mJ/cm2 UVB诱导的Hacat细胞氧化应激模型中,对照组细胞凋亡率为5.08±0.88%;GPX1组细胞凋亡率为5.99±0.96%;UVB模型组细胞凋亡率为46.36±4.52%;而含0.12U/mL GPX1的GPX1预防组细胞凋亡率为19.86±2.08%;相比于UVB模型组,GPX1预防组细胞凋亡率显著降低,这表明GPX1能有效预防紫外线引起的皮肤表皮细胞凋亡。
(6)GPX1能够治疗紫外线引起的皮肤表皮细胞损伤:
在30mJ/cm2 UVB诱导的Hacat细胞氧化应激模型中,对照组细胞存活率为100.2±4.09%;GPX1组细胞存活率为98.49±4.16%;UVB模型组细胞存活率仅为50.49±6.08%;而含0.12U/mL GPX1的GPX1治疗组细胞存活率为70.48±6.63%;可见GPX1治疗组细胞存活率是UVB模型组的1.4倍,这表明GPX1能有效治疗紫外线引起的细胞损伤。
(7)GPX1能够治疗紫外线引起的皮肤表皮细胞细胞膜损伤:
在30mJ/cm2 UVB诱导的Hacat细胞氧化应激模型中,对照组细胞乳酸脱氢酶的释放率为99.89±7.35%;GPX1组细胞乳酸脱氢酶的释放率为99.29±6.66%;UVB模型组细胞乳酸脱氢酶的释放率为231.28±15.01%;而含0.12U/mL GPX1的GPX1治疗组细胞乳酸脱氢酶的释放率为152.09±15.77%;相比于UVB模型组,GPX1治疗组细胞乳酸脱氢酶的释放率显著降低,这表明GPX1能有效治疗紫外线引起的皮肤表皮细胞细胞膜损伤。
(8)GPX1能够治疗紫外线引起的氧化脂质化,降低皮肤表皮细胞丙二醛含量:
在30mJ/cm2 UVB诱导的Hacat细胞氧化应激模型中,对照组细胞丙二醛含量为2.81±0.31(nmol/mg);GPX1组细胞丙二醛含量为2.92±0.28(nmol/mg);UVB模型组细胞丙二醛含量为6.88±0.36(nmol/mg);而含0.12U/mL GPX1的GPX1治疗组细胞丙二醛含量为3.76±0.43(nmol/mg);相比于UVB模型组,GPX1治疗组细胞丙二醛含量显著降低,这表明GPX1能有效治疗紫外线引起的皮肤表皮细胞氧化脂质化。
(9)GPX1能够治疗紫外线引起的皮肤表皮细胞DNA损伤:
在30mJ/cm2 UVB诱导的Hacat细胞氧化应激模型中,对照组细胞DNA损伤比率为5.38±0.34%;GPX1组细胞DNA损伤比率为5.21±0.42%;UVB模型组细胞DNA损伤比率为50.13±5.68%;而含0.12U/mL GPX1的GPX1治疗组细胞DNA损伤比率为28.88±0.81%;相比于UVB模型组,GPX1治疗组细胞DNA损伤比率显著降低,这表明GPX1能有效治疗紫外线引起的皮肤表皮细胞DNA损伤。
(10)GPX1能够治疗紫外线引起的皮肤表皮细胞凋亡:
在30mJ/cm2 UVB诱导的Hacat细胞氧化应激模型中,对照组细胞凋亡率为6.21±0.93%;GPX1组细胞凋亡率为6.99±0.83%;UVB模型组细胞凋亡率为46.06±3.08%;而含0.12U/mL GPX1的GPX1治疗组细胞凋亡率为20.16±2.61%;相比于UVB模型组,GPX1治疗组细胞凋亡率显著降低,这表明GPX1能有效治疗紫外线引起的皮肤表皮细胞凋亡。
(11)GPX1-L-ApSOD能够预防紫外线引起的皮肤表皮细胞损伤:
在30mJ/cm2 UVB诱导的Hacat细胞氧化应激模型中,对照组细胞存活率为100.3±4.16%;GPX1-L-ApSOD组细胞存活率为99.29±6.06%;UVB模型组细胞存活率仅为50.16±6.08%;而含0.06U/mL GPX1-L-ApSOD的GPX1-L-ApSOD预防组细胞存活率为80.26±7.59%;可见GPX1-L-ApSOD预防组细胞存活率是UVB模型组的1.6倍,这表明GPX1-L-ApSOD能有效预防紫外线引起的细胞损伤。
(12)GPX1-L-ApSOD能够预防紫外线引起的皮肤表皮细胞细胞膜损伤:
在30mJ/cm2 UVB诱导的Hacat细胞氧化应激模型中,对照组细胞乳酸脱氢酶的释放率为100.1±6.89%;GPX1-L-ApSOD组细胞乳酸脱氢酶的释放率为98.16±8.02%;UVB模型组细胞乳酸脱氢酶的释放率为246.5±15.46%;而含0.06U/mLGPX1-L-ApSOD的GPX1-L-ApSOD预防组细胞乳酸脱氢酶的释放率为143.2±16.94%;相比于UVB模型组,GPX1-L-ApSOD预防组细胞乳酸脱氢酶的释放率显著降低,这表明GPX1-L-ApSOD能有效预防紫外线引起的皮肤表皮细胞细胞膜损伤。
(13)GPX1-L-ApSOD能够预防紫外线引起的氧化脂质化,降低皮肤表皮细胞丙二醛含量:
在30mJ/cm2 UVB诱导的Hacat细胞氧化应激模型中,对照组细胞丙二醛含量为2.55±0.36(nmol/mg);GPX1-L-ApSOD组细胞丙二醛含量为2.69±0.52(nmol/mg);UVB模型组细胞丙二醛含量为8.07±0.55(nmol/mg);而含0.06U/mLGPX1-L-ApSOD的GPX1-L-ApSOD预防组细胞丙二醛含量为4.66±0.38(nmol/mg);相比于UVB模型组,GPX1-L-ApSOD预防组细胞丙二醛含量显著降低,这表明GPX1-L-ApSOD能有效预防紫外线引起的皮肤表皮细胞氧化脂质化。
(14)GPX1-L-ApSOD能够预防紫外线引起的皮肤表皮细胞DNA损伤:
在30mJ/cm2 UVB诱导的Hacat细胞氧化应激模型中,对照组细胞DNA损伤比率为6.78±0.58%;GPX1-L-ApSOD组细胞DNA损伤比率为7.25±0.56%;UVB模型组细胞DNA损伤比率为46.15±6.66%;而含0.06U/mLGPX1-L-ApSOD的GPX1-L-ApSOD预防组细胞DNA损伤比率为21.06±3.41%;相比于UVB模型组,GPX1-L-ApSOD预防组细胞DNA损伤比率显著降低,这表明GPX1-L-ApSOD能有效预防紫外线引起的皮肤表皮细胞DNA损伤。
(15)GPX1-L-ApSOD能够预防紫外线引起的皮肤表皮细胞凋亡:
在30mJ/cm2 UVB诱导的Hacat细胞氧化应激模型中,对照组细胞凋亡率为6.01±0.72%;GPX1-L-ApSOD组细胞凋亡率为5.99±0.91%;UVB模型组细胞凋亡率为49.77±6.05%;而含0.06U/mLGPX1-L-ApSOD的GPX1-L-ApSOD预防组细胞凋亡率为21.46±5.68%;相比于UVB模型组,GPX1-L-ApSOD预防组细胞凋亡率显著降低,这表明GPX1-L-ApSOD能有效预防紫外线引起的皮肤表皮细胞凋亡。
(16)GPX1-L-ApSOD能够治疗紫外线引起的皮肤表皮细胞损伤:
在30mJ/cm2 UVB诱导的Hacat细胞氧化应激模型中,对照组细胞存活率为100.05±5.92%;GPX1-L-ApSOD组细胞存活率为99.09±6.66%;UVB模型组细胞存活率仅为49.99±7.38%;而含0.06U/mLGPX1-L-ApSOD的GPX1-L-ApSOD治疗组细胞存活率为75.93±7.33%;可见GPX1-L-ApSOD治疗组细胞存活率是UVB模型组的1.51倍,这表明GPX1-L-ApSOD能有效治疗紫外线引起的细胞损伤。
(17)GPX1-L-ApSOD能够治疗紫外线引起的皮肤表皮细胞细胞膜损伤:
在30mJ/cm2 UVB诱导的Hacat细胞氧化应激模型中,对照组细胞乳酸脱氢酶的释放率为100±5.66%;GPX1-L-ApSOD组细胞乳酸脱氢酶的释放率为100.1±7.19%;UVB模型组细胞乳酸脱氢酶的释放率为210.15±15.16%;而含0.06U/mLGPX1-L-ApSOD的GPX1-L-ApSOD治疗组细胞乳酸脱氢酶的释放率为122.11±12.63%;相比于UVB模型组,GPX1-L-ApSOD治疗组细胞乳酸脱氢酶的释放率显著降低,这表明GPX1-L-ApSOD能有效治疗紫外线引起的皮肤表皮细胞细胞膜损伤。
(18)GPX1-L-ApSOD能够治疗紫外线引起的氧化脂质化,降低皮肤表皮细胞丙二醛含量:
在30mJ/cm2 UVB诱导的Hacat细胞氧化应激模型中,对照组细胞丙二醛含量为3.15±0.55(nmol/mg);GPX1-L-ApSOD组细胞丙二醛含量为2.89±0.34(nmol/mg);UVB模型组细胞丙二醛含量为7.95±0.53(nmol/mg);而含0.06U/mLGPX1-L-ApSOD的GPX1-L-ApSOD治疗组细胞丙二醛含量为3.88±0.59(nmol/mg);相比于UVB模型组,GPX1-L-ApSOD治疗组细胞丙二醛含量显著降低,这表明GPX1-L-ApSOD能有效治疗紫外线引起的皮肤表皮细胞氧化脂质化。
(19)GPX1-L-ApSOD能够治疗紫外线引起的皮肤表皮细胞DNA损伤:
在30mJ/cm2 UVB诱导的Hacat细胞氧化应激模型中,对照组细胞DNA损伤比率为5.02±0.67%;GPX1-L-ApSOD组细胞DNA损伤比率为5.86±0.88%;UVB模型组细胞DNA损伤比率为45.29±5.79%;而含0.06U/mLGPX1-L-ApSOD的GPX1-L-ApSOD预防组细胞DNA损伤比率为23.65±6.26%;相比于UVB模型组,GPX1-L-ApSOD治疗组细胞DNA损伤比率显著降低,这表明GPX1-L-ApSOD能有效治疗紫外线引起的皮肤表皮细胞DNA损伤。
(20)GPX1-L-ApSOD能够治疗紫外线引起的皮肤表皮细胞凋亡:
在30mJ/cm2 UVB诱导的Hacat细胞氧化应激模型中,对照组细胞凋亡率为5.78±0.78%;GPX1-L-ApSOD组细胞凋亡率为6.22±0.98%;UVB模型组细胞凋亡率为45.55±3.45%;而含0.06U/mLGPX1-L-ApSOD的GPX1-L-ApSOD治疗组细胞凋亡率为21.56±2.77%;相比于UVB模型组,GPX1-L-ApSOD治疗组细胞凋亡率显著降低,这表明GPX1-L-ApSOD能有效治疗紫外线引起的皮肤表皮细胞凋亡。
(21)GPX1能够预防紫外线照射引起的皮肤损伤:
在120mJ/cm2 UVB诱导的小鼠皮肤光老化模型中,对照组与GPX1组小鼠皮肤光滑,无损伤,无褶皱且富有弹性。光老化模型组小鼠皮肤干燥粗糙,有褶皱,无弹性且出现红斑炎症。相比于光老化模型组,含2μg/cm2GPX1的GPX1预防组小鼠皮肤损伤现象明显减轻,皮肤褶皱明显减少且恢复弹性。这表明GPX1能有效预防紫外线照射引起的皮肤损伤。
(22)GPX1能够预防紫外线照射引起的表皮增厚:
在120mJ/cm2 UVB诱导的小鼠皮肤光老化模型中,对照组小鼠皮肤表皮厚度为18.49±2.01μm;GPX1组小鼠皮肤表皮厚度为19.49±3.11μm;光老化模型组小鼠皮肤表皮厚度为151.67±18.1μm;含2μg/cm2GPX1的GPX1预防组小鼠皮肤表皮厚度为82.16±5.79μm;相比于光老化模型组,GPX1预防组小鼠皮肤表皮厚度显著降低,这表明GPX1能有效预防紫外线照射引起的表皮增厚。
(23)GPX1能够预防紫外线照射引起的皮肤氧化应激:
在120mJ/cm2 UVB诱导的小鼠皮肤光老化模型中,对照组小鼠皮肤中过氧化氢的含量为10.23±0.99(μmol/mg);GPX1组小鼠皮肤中过氧化氢的含量为12.06±1.08(μmol/mg);光老化模型组小鼠皮肤中过氧化氢的含量为28.49±2.07(μmol/mg);含2μg/cm2GPX1的GPX1预防组小鼠皮肤中过氧化氢的含量为18.79±2.97(μmol/mg);相比于光老化模型组,GPX1预防组小鼠皮肤中过氧化氢的含量显著降低,这表明GPX1能有效预防紫外线照射引起的皮肤氧化应激。
(24)GPX1能够预防紫外线照射引起的皮肤氧化脂质化:
在120mJ/cm2 UVB诱导的小鼠皮肤光老化模型中,对照组小鼠皮肤中丙二醛(MDA)的含量为1.29±0.68(nmol/mg);GPX1组小鼠皮肤中丙二醛(MDA)的含量为1.59±1.07(nmol/mg);光老化模型组小鼠皮肤中丙二醛(MDA)的含量为6.79±1.13(nmol/mg);含2μg/cm2GPX1的GPX1预防组小鼠皮肤中丙二醛(MDA)的含量为4.08±1.1(nmol/mg);相比于光老化模型组,GPX1预防组小鼠皮肤中丙二醛(MDA)的含量显著降低,这表明GPX1能有效预防紫外线照射引起的皮肤氧化脂质化。
(25)GPX1能够预防紫外线照射引起的皮肤胶原蛋白流失:
在120mJ/cm2 UVB诱导的小鼠皮肤光老化模型中,对照组小鼠皮肤中胶原密度比率为100.2±5.26%;GPX1组小鼠皮肤中胶原密度比率为99.85±6.68%;光老化模型组小鼠皮肤中胶原密度比率为63.75±6.01%;含2μg/cm2GPX1的GPX1预防组小鼠皮肤中胶原密度比率为81.03±6.1%;相比于光老化模型组,GPX1预防组小鼠皮肤中胶原密度明显增加,这表明GPX1能有效预防紫外线照射引起的皮肤胶原蛋白流失。
(26)GPX1能够治疗紫外线照射引起的皮肤损伤:
在120mJ/cm2 UVB诱导的小鼠皮肤光老化模型中,对照组与GPX1组小鼠皮肤光滑,无损伤,无褶皱且富有弹性。光老化模型组小鼠皮肤干燥粗糙,有褶皱,无弹性且出现红斑炎症。相比于光老化模型组,含2μg/cm2GPX1的GPX1治疗组小鼠皮肤损伤现象明显减轻,皮肤褶皱明显减少且恢复弹性。这表明GPX1能有效治疗紫外线照射引起的皮肤损伤。
(27)GPX1能够治疗紫外线照射引起的表皮增厚:
在120mJ/cm2 UVB诱导的小鼠皮肤光老化模型中,对照组小鼠皮肤表皮厚度为16.66±3.06μm;GPX1组小鼠皮肤表皮厚度为18.07±4.16μm;光老化模型组小鼠皮肤表皮厚度为163.05±16.19μm;含2μg/cm2GPX1的GPX1治疗组小鼠皮肤表皮厚度为96.49±6.79μm;相比于光老化模型组,GPX1治疗组小鼠皮肤表皮厚度显著降低,这表明GPX1能有效治疗紫外线照射引起的表皮增厚。
(28)GPX1能够治疗紫外线照射引起的皮肤氧化应激:
在120mJ/cm2 UVB诱导的小鼠皮肤光老化模型中,对照组小鼠皮肤中过氧化氢的含量为9.46±1.34(μmol/mg);GPX1组小鼠皮肤中过氧化氢的含量为10.28±2.13(μmol/mg);光老化模型组小鼠皮肤中过氧化氢的含量为31.08±3.09(μmol/mg);含2μg/cm2GPX1的GPX1治疗组小鼠皮肤中过氧化氢的含量为20.49±3.47(μmol/mg);相比于光老化模型组,GPX1治疗组小鼠皮肤中过氧化氢的含量显著降低,这表明GPX1能有效治疗紫外线照射引起的皮肤氧化应激。
(29)GPX1能够治疗紫外线照射引起的皮肤氧化脂质化:
在120mJ/cm2 UVB诱导的小鼠皮肤光老化模型中,对照组小鼠皮肤中丙二醛(MDA)的含量为1.89±0.81(nmol/mg);GPX1组小鼠皮肤中丙二醛(MDA)的含量为1.77±0.99(nmol/mg);光老化模型组小鼠皮肤中丙二醛(MDA)的含量为6.73±1.21(nmol/mg);含2μg/cm2GPX1的GPX1治疗组小鼠皮肤中丙二醛(MDA)的含量为3.99±0.99(nmol/mg);相比于光老化模型组,GPX1治疗组小鼠皮肤中丙二醛(MDA)的含量显著降低,这表明GPX1能有效治疗紫外线照射引起的皮肤氧化脂质化。
(30)GPX1能够治疗紫外线照射引起的皮肤胶原蛋白流失:
在120mJ/cm2 UVB诱导的小鼠皮肤光老化模型中,对照组小鼠皮肤中胶原密度比率为99.8±5.13%;GPX1组小鼠皮肤中胶原密度比率为100.02±7.99%;光老化模型组小鼠皮肤中胶原密度比率为59.79±6.08%;含2μg/cm2GPX1的GPX1治疗组小鼠皮肤中胶原密度比率为82.94±6.13%;相比于光老化模型组,GPX1治疗组小鼠皮肤中胶原密度明显增加,这表明GPX1能有效治疗紫外线照射引起的皮肤胶原蛋白流失。
(31)GPX1-L-ApSOD能够预防紫外线照射引起的皮肤损伤:
在120mJ/cm2 UVB诱导的小鼠皮肤光老化模型中,对照组与GPX1-L-ApSOD组小鼠皮肤光滑,无损伤,无褶皱且富有弹性。光老化模型组小鼠皮肤干燥粗糙,有褶皱,无弹性且出现红斑炎症。相比于光老化模型组,含2μg/cm2GPX1-L-ApSOD的GPX1-L-ApSOD预防组小鼠皮肤损伤现象明显减轻,皮肤褶皱明显减少且恢复弹性。这表明GPX1-L-ApSOD能有效预防紫外线照射引起的皮肤损伤。
(32)GPX1-L-ApSOD能够预防紫外线照射引起的表皮增厚:
在120mJ/cm2 UVB诱导的小鼠皮肤光老化模型中,对照组小鼠皮肤表皮厚度为20.06±3.79μm;GPX1-L-ApSOD组小鼠皮肤表皮厚度为21.12±5.55μm;光老化模型组小鼠皮肤表皮厚度为158.7±12.12μm;含2μg/cm2GPX1-L-ApSOD的GPX1-L-ApSOD预防组小鼠皮肤表皮厚度为76.49±11.01μm;相比于光老化模型组,GPX1-L-ApSOD预防组小鼠皮肤表皮厚度显著降低,这表明GPX1-L-ApSOD能有效预防紫外线照射引起的表皮增厚。
(33)GPX1-L-ApSOD能够预防紫外线照射引起的皮肤氧化应激:
在120mJ/cm2 UVB诱导的小鼠皮肤光老化模型中,对照组小鼠皮肤中过氧化氢的含量为11.22±1.38(μmol/mg);GPX1-L-ApSOD组小鼠皮肤中过氧化氢的含量为13.77±0.97(μmol/mg);光老化模型组小鼠皮肤中过氧化氢的含量为30.47±1.15(μmol/mg);含2μg/cm2GPX1-L-ApSOD的GPX1-L-ApSOD预防组小鼠皮肤中过氧化氢的含量为17.88±2.07(μmol/mg);相比于光老化模型组,GPX1-L-ApSOD预防组小鼠皮肤中过氧化氢的含量显著降低,这表明GPX1-L-ApSOD能有效预防紫外线照射引起的皮肤氧化应激。
(34)GPX1-L-ApSOD能够预防紫外线照射引起的皮肤氧化脂质化:
在120mJ/cm2 UVB诱导的小鼠皮肤光老化模型中,对照组小鼠皮肤中丙二醛(MDA)的含量为2.17±0.75(nmol/mg);GPX1-L-ApSOD组小鼠皮肤中丙二醛(MDA)的含量为2.28±0.85(nmol/mg);光老化模型组小鼠皮肤中丙二醛(MDA)的含量为7.51±1.26(nmol/mg);含2μg/cm2GPX1-L-ApSOD的GPX1-L-ApSOD预防组小鼠皮肤中丙二醛(MDA)的含量为4.68±0.86(nmol/mg);相比于光老化模型组,GPX1-L-ApSOD预防组小鼠皮肤中丙二醛(MDA)的含量显著降低,这表明GPX1-L-ApSOD能有效预防紫外线照射引起的皮肤氧化脂质化。
(35)GPX1-L-ApSOD能够预防紫外线照射引起的皮肤胶原蛋白流失:
在120mJ/cm2 UVB诱导的小鼠皮肤光老化模型中,对照组小鼠皮肤中胶原密度比率为100±4.77%;GPX1-L-ApSOD组小鼠皮肤中胶原密度比率为99.68±7.06%;光老化模型组小鼠皮肤中胶原密度比率为58.06±8.13%;含2μg/cm2GPX1-L-ApSOD的GPX1-L-ApSOD预防组小鼠皮肤中胶原密度比率为83.57±7.88%;相比于光老化模型组,GPX1-L-ApSOD预防组小鼠皮肤中胶原密度明显增加,这表明GPX1-L-ApSOD能有效预防紫外线照射引起的皮肤胶原蛋白流失。
(36)GPX1-L-ApSOD能够治疗紫外线照射引起的皮肤损伤:
在120mJ/cm2 UVB诱导的小鼠皮肤光老化模型中,对照组与GPX1-L-ApSOD组小鼠皮肤光滑,无损伤,无褶皱且富有弹性。光老化模型组小鼠皮肤干燥粗糙,有褶皱,无弹性且出现红斑炎症。相比于光老化模型组,含2μg/cm2GPX1-L-ApSOD的GPX1-L-ApSOD治疗组小鼠皮肤损伤现象明显减轻,皮肤褶皱明显减少且恢复弹性。这表明GPX1-L-ApSOD能有效治疗紫外线照射引起的皮肤损伤。
(37)GPX1-L-ApSOD能够治疗紫外线照射引起的表皮增厚:
在120mJ/cm2 UVB诱导的小鼠皮肤光老化模型中,对照组小鼠皮肤表皮厚度为19.46±2.89μm;GPX1-L-ApSOD组小鼠皮肤表皮厚度为22.88±6.06μm;光老化模型组小鼠皮肤表皮厚度为146.5±8.79μm;含2μg/cm2GPX1-L-ApSOD的GPX1-L-ApSOD治疗组小鼠皮肤表皮厚度为80.6±9.76μm;相比于光老化模型组,GPX1-L-ApSOD治疗组小鼠皮肤表皮厚度显著降低,这表明GPX1-L-ApSOD能有效治疗紫外线照射引起的表皮增厚。
(38)GPX1-L-ApSOD能够治疗紫外线照射引起的皮肤氧化应激:
在120mJ/cm2 UVB诱导的小鼠皮肤光老化模型中,对照组小鼠皮肤中过氧化氢的含量为10.97±1.08(μmol/mg);GPX1-L-ApSOD组小鼠皮肤中过氧化氢的含量为12.79±0.86(μmol/mg);光老化模型组小鼠皮肤中过氧化氢的含量为33.77±6.05(μmol/mg);含2μg/cm2GPX1-L-ApSOD的GPX1-L-ApSOD治疗组小鼠皮肤中过氧化氢的含量为21.76±2.01(μmol/mg);相比于光老化模型组,GPX1-L-ApSOD治疗组小鼠皮肤中过氧化氢的含量显著降低,这表明GPX1-L-ApSOD能有效治疗紫外线照射引起的皮肤氧化应激。
(39)GPX1-L-ApSOD能够治疗紫外线照射引起的皮肤氧化脂质化:
在120mJ/cm2 UVB诱导的小鼠皮肤光老化模型中,对照组小鼠皮肤中丙二醛(MDA)的含量为2.29±0.99(nmol/mg);GPX1-L-ApSOD组小鼠皮肤中丙二醛(MDA)的含量为2.56±0.88(nmol/mg);光老化模型组小鼠皮肤中丙二醛(MDA)的含量为8.66±1.08(nmol/mg);含2μg/cm2GPX1-L-ApSOD的GPX1-L-ApSOD治疗组小鼠皮肤中丙二醛(MDA)的含量为6.07±0.79(nmol/mg);相比于光老化模型组,GPX1-L-ApSOD治疗组小鼠皮肤中丙二醛(MDA)的含量显著降低,这表明GPX1-L-ApSOD能有效治疗紫外线照射引起的皮肤氧化脂质化。
(40)GPX1-L-ApSOD能够治疗紫外线照射引起的皮肤胶原蛋白流失:
在120mJ/cm2 UVB诱导的小鼠皮肤光老化模型中,对照组小鼠皮肤中胶原密度比率为100±6.17%;GPX1-L-ApSOD组小鼠皮肤中胶原密度比率为101.02±5.99%;光老化模型组小鼠皮肤中胶原密度比率为59.99±5.1%;含2μg/cm2GPX1-L-ApSOD的GPX1-L-ApSOD治疗组小鼠皮肤中胶原密度比率为79.88±5.79%;相比于光老化模型组,GPX1-L-ApSOD治疗组小鼠皮肤中胶原密度明显增加,这表明GPX1-L-ApSOD能有效治疗紫外线照射引起的皮肤胶原蛋白流失。
附图说明
图1为本发明所应用的GPX1与GPX1-L-ApSOD的SDS-PAGE电泳图与Western Blot图。其中图(a)为GPX1SDS-PAGE电泳图;图(b)为GPX1 Western Blot图;其中图(c)为GPX1-L-ApSODSDS-PAGE电泳图;图(d)为GPX1-L-ApSOD Western Blot图;SDS-PAGE电泳中M为标准蛋白Marker,分子量分别为14.3kDa、20.1kDa、29.0kDa、44.3kDa、66.4kDa、97.2kDa;Western Blot中M为彩虹蛋白Marker,分子量分别为14kDa、25kDa、30kDa、40kDa、50kDa、70kDa;
图2为本发明GPX1预防紫外线引起的皮肤表皮细胞损伤的细胞存活率图(注:与对照组相比,###P<0.001;与UVB模型组相比,***P<0.001;n=6);
图3为本发明GPX1预防紫外线引起的皮肤表皮细胞细胞膜损伤的乳酸脱氢酶释放率图(注:与对照组相比,###P<0.001;与UVB模型组相比,***P<0.001;n=6);
图4为本发明GPX1预防紫外线引起的皮肤表皮细胞氧化脂质化的丙二醛含量图(注:与对照组相比,###P<0.001;与UVB模型组相比,***P<0.001;n=6);
图5为本发明GPX1预防紫外线引起的皮肤表皮细胞DNA损伤的DNA损伤细胞比率图(注:与对照组相比,###P<0.001;与UVB模型组相比,***P<0.001;n=6);
图6为本发明GPX1预防紫外线引起的皮肤表皮细胞凋亡的细胞凋亡率图(注:与对照组相比,###P<0.001;与UVB模型组相比,***P<0.001;n=6);
图7为本发明GPX1治疗紫外线引起的皮肤表皮细胞损伤的细胞存活率图(注:与对照组相比,###P<0.001;与UVB模型组相比,***P<0.001;n=6);
图8为本发明GPX1治疗紫外线引起的皮肤表皮细胞细胞膜损伤的乳酸脱氢酶释放率图(注:与对照组相比,###P<0.001;与UVB模型组相比,***P<0.001;n=6);
图9为本发明GPX1治疗紫外线引起的皮肤表皮细胞氧化脂质化的丙二醛含量图(注:与对照组相比,###P<0.001;与UVB模型组相比,***P<0.001;n=6);
图10为本发明GPX1治疗紫外线引起的皮肤表皮细胞DNA损伤的DNA损伤细胞比率图(注:与对照组相比,###P<0.001;与UVB模型组相比,***P<0.001;n=6);
图11为本发明GPX1治疗紫外线引起的皮肤表皮细胞凋亡的细胞凋亡率图(注:与对照组相比,###P<0.001;与UVB模型组相比,***P<0.001;n=6);
图12为本发明GPX1-L-ApSOD预防紫外线引起的皮肤表皮细胞损伤的细胞存活率图(注:与对照组相比,###P<0.001;与UVB模型组相比,***P<0.001;n=6);
图13为本发明GPX1-L-ApSOD预防紫外线引起的皮肤表皮细胞细胞膜损伤的乳酸脱氢酶释放率图(注:与对照组相比,###P<0.001;与UVB模型组相比,***P<0.001;n=6);
图14为本发明GPX1-L-ApSOD预防紫外线引起的皮肤表皮细胞氧化脂质化的丙二醛含量图(注:与对照组相比,###P<0.001;与UVB模型组相比,***P<0.001;n=6);
图15为本发明GPX1-L-ApSOD预防紫外线引起的皮肤表皮细胞DNA损伤的DNA损伤细胞比率图(注:与对照组相比,###P<0.001;与UVB模型组相比,***P<0.001;n=6);
图16为本发明GPX1-L-ApSOD预防紫外线引起的皮肤表皮细胞凋亡的细胞凋亡率图(注:与对照组相比,###P<0.001;与UVB模型组相比,***P<0.001;n=6);
图17为本发明GPX1-L-ApSOD治疗紫外线引起的皮肤表皮细胞损伤的细胞存活率图(注:与对照组相比,###P<0.001;与UVB模型组相比,***P<0.001;n=6);
图18为本发明GPX1-L-ApSOD治疗紫外线引起的皮肤表皮细胞细胞膜损伤的乳酸脱氢酶释放率图(注:与对照组相比,###P<0.001;与UVB模型组相比,***P<0.001;n=6);
图19为本发明GPX1-L-ApSOD治疗紫外线引起的皮肤表皮细胞氧化脂质化的丙二醛含量图(注:与对照组相比,###P<0.001;与UVB模型组相比,***P<0.001;n=6);
图20为本发明GPX1-L-ApSOD治疗紫外线引起的皮肤表皮细胞DNA损伤的DNA损伤细胞比率图(注:与对照组相比,###P<0.001;与UVB模型组相比,***P<0.001;n=6);
图21为本发明GPX1-L-ApSOD治疗紫外线引起的皮肤表皮细胞凋亡的细胞凋亡率图(注:与对照组相比,###P<0.001;与UVB模型组相比,***P<0.001;n=6);
图22为本发明GPX1预防紫外线照射引起的皮肤损伤的代表图:
图23为本发明GPX1预防紫外线照射引起的皮肤表皮增厚的数据图(注:与对照组相比,###P<0.001;与光老化模型组相比,***P<0.001;n=6);
图24为本发明GPX1预防紫外线照射引起的皮肤氧化应激的过氧化氢含量图(注:与对照组相比,###P<0.001;与光老化模型组相比,***P<0.001;n=6);
图25为本发明GPX1预防紫外线照射引起的皮肤氧化脂质化的丙二醛含量图(注:与对照组相比,###P<0.001;与光老化模型组相比,***P<0.001;n=6);
图26为本发明GPX1预防紫外线照射引起的皮肤胶原蛋白流失的胶原密度比率图(注:与对照组相比,###P<0.001;与光老化模型组相比,***P<0.001;n=6);
图27为本发明GPX1治疗紫外线照射引起的皮肤损伤的代表图:
图28为本发明GPX1治疗紫外线照射引起的皮肤表皮增厚的数据图(注:与对照组相比,###P<0.001;与光老化模型组相比,***P<0.001;n=6);
图29为本发明GPX1治疗紫外线照射引起的皮肤氧化应激的过氧化氢含量图(注:与对照组相比,###P<0.001;与光老化模型组相比,***P<0.001;n=6);
图30为本发明GPX1治疗紫外线照射引起的皮肤氧化脂质化的丙二醛含量图(注:与对照组相比,###P<0.001;与光老化模型组相比,***P<0.001;n=6);
图31为本发明GPX1治疗紫外线照射引起的皮肤胶原蛋白流失的胶原密度比率图(注:与对照组相比,###P<0.001;与光老化模型组相比,***P<0.001;n=6);
图32为本发明GPX1-L-ApSOD预防紫外线照射引起的皮肤损伤的代表图:
图33为本发明GPX1-L-ApSOD预防紫外线照射引起的皮肤表皮增厚的数据图(注:与对照组相比,###P<0.001;与光老化模型组相比,***P<0.001;n=6);
图34为本发明GPX1-L-ApSOD预防紫外线照射引起的皮肤氧化应激的过氧化氢含量图(注:与对照组相比,###P<0.001;与光老化模型组相比,***P<0.001;n=6);
图35为本发明GPX1-L-ApSOD预防紫外线照射引起的皮肤氧化脂质化的丙二醛含量图(注:与对照组相比,###P<0.001;与光老化模型组相比,***P<0.001;n=6);
图36为本发明GPX1-L-ApSOD预防紫外线照射引起的皮肤胶原蛋白流失的胶原密度比率图(注:与对照组相比,###P<0.001;与光老化模型组相比,***P<0.001;n=6);
图37为本发明GPX1-L-ApSOD治疗紫外线照射引起的皮肤损伤的代表图:
图38为本发明GPX1-L-ApSOD治疗紫外线照射引起的皮肤表皮增厚的数据图(注:与对照组相比,###P<0.001;与光老化模型组相比,***P<0.001;n=6);
图39为本发明GPX1-L-ApSOD治疗紫外线照射引起的皮肤氧化应激的过氧化氢含量图(注:与对照组相比,###P<0.001;与光老化模型组相比,***P<0.001;n=6);
图40为本发明GPX1-L-ApSOD治疗紫外线照射引起的皮肤氧化脂质化的丙二醛含量图(注:与对照组相比,###P<0.001;与光老化模型组相比,***P<0.001;n=6);
图41为本发明GPX1-L-ApSOD治疗紫外线照射引起的皮肤胶原蛋白流失的胶原密度比率图(注:与对照组相比,###P<0.001;与光老化模型组相比,***P<0.001;n=6);
具体实施方式
实施例1.GPX1的制备
按照本课题组已授权专利201510431360.1方法制备GPX1,该专利中详细记载了GPX1的氨基酸序列及制备、表征方法。本发明用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和蛋白印迹(Western blot)鉴定靶蛋白,结果如图1(a)与(b)所示,其分子量为21.9kDa,且与抗GPX1抗体特异性结合,证明成功获得了GPX1蛋白。其GPX活力为27291U/μmol蛋白,高于以往报道的GPX突变体。
实施例2.GPX1-L-ApSOD的制备
按照本课题组已授权专利201710583460.5方法制备GPX1-L-ApSOD,该专利中详细记载了GPX1-L-ApSOD的氨基酸序列及制备、表征方法。本发明用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和蛋白印迹(Western blot)鉴定靶蛋白,结果如图1(c)与(d)所示,其分子量为41.8kDa,且与抗GPX1抗体特异性结合,证明成功获得了GPX1-L-ApSOD蛋白。其GPX和SOD活力分别为9768和8912U/μmol,高于以往报道的双功能酶的GPX活力。高活力的GPX活性可避免因局部过氧化氢浓度过高导致的SOD酶失活,同时GPX对底物过氧化氢的分解可以促进SOD催化的超氧阴离子分解为过氧化氢的反应加速。
实施例3.GPX1对UVB诱导的Hacat细胞损伤的预防作用
Hacat细胞以1×105个/mL接种于含100mL/L胎牛血清的Dulbecco's modifiedEagle's medium(DMEM)培养基的96孔板中,置于细胞恒温培养箱中培养,待细胞生长至85%融合时,将其分为4组,即对照组,GPX1组,UVB模型组及GPX1预防组。对照组加入生理盐水;GPX1组加入0.12U/mL的GPX1;UVB模型组是利用UVB灯(PL-S 9W/01;荷兰皇家飞利浦电子有限公司,波长范围:300-320nm;峰值:311nm)将培养细胞的96孔板置于距紫外光光源垂直距离为10cm的地方进行照射,照射功率为500μW/cm2,照射时间为1分钟,最终产生30mJ/cm2的能量,照射时将96孔板中的DMEM培养基弃掉后加入生理盐水,照射后重新加入DMEM培养基并放入细胞恒温培养箱中再培养24小时;GPX1预防组是提前加入0.12U/mL的GPX1处理细胞1小时,然后用UVB灯进行照射,在照射时将96孔板中的DMEM培养基弃掉后用含有0.12U/mLGPX1的生理盐水处理细胞1分钟,照射后重新加入0.12U/mL的GPX1继续处理细胞24小时;之后每孔加入5mg/mL的MTT溶液20μL,继续培养4小时,终止培养后弃掉孔内培养上清液,每孔加入150μL二甲基亚砜(DMSO)终止反应,振荡10min,使水不溶性的蓝紫色结晶甲臜充分溶解。选择490nm波长,在酶标仪上测定各孔吸光值并计算各组的细胞存活率:细胞存活率(%)=(实验组OD值/对照组OD值)×100%。
如图2所示,在30mJ/cm2UVB诱导的Hacat细胞氧化应激模型中,对照组细胞存活率为99.86±3.49%;GPX1组细胞存活率为99.08±5.16%;UVB模型组细胞存活率仅为46.75±5.77%;而含0.12U/mL GPX1的GPX1预防组细胞存活率为71.09±6.08%;可见GPX1预防组细胞存活率是UVB模型组的1.52倍,这表明GPX1能有效预防紫外线引起的细胞损伤。
实施例4.GPX1对UVB诱导的Hacat细胞细胞膜损伤的预防作用
Hacat细胞以1×105个/mL接种于含100mL/L胎牛血清的Dulbecco's modifiedEagle's medium(DMEM)培养基的96孔板中,置于细胞恒温培养箱中培养,待细胞生长至85%融合时,将其分为4组,即对照组,GPX1组,UVB模型组及GPX1预防组。对照组加入生理盐水;GPX1组加入0.12U/mL的GPX1;UVB模型组是利用UVB灯(PL-S 9W/01;荷兰皇家飞利浦电子有限公司,波长范围:300-320nm;峰值:311nm)将培养细胞的96孔板置于距紫外光光源垂直距离为10cm的地方进行照射,照射功率为500μW/cm2,照射时间为1分钟,最终产生30mJ/cm2的能量,照射时将96孔板中的DMEM培养基弃掉后加入生理盐水,照射后重新加入DMEM培养基并放入细胞恒温培养箱中再培养24小时;GPX1预防组是提前加入0.12U/mL的GPX1处理细胞1小时,然后用UVB灯进行照射,在照射时将96孔板中的DMEM培养基弃掉后用含有0.12U/mLGPX1的生理盐水处理细胞1分钟,照射后重新加入0.12U/mL的GPX1继续处理细胞24小时;之后使用南京建成乳酸脱氢酶试剂盒(A020-2-2),按照说明书所述步骤对细胞上清液中乳酸脱氢酶指标进行测定并用乳酸脱氢酶释放率表示。
如图3所示,在30mJ/cm2 UVB诱导的Hacat细胞氧化应激模型中,对照组细胞乳酸脱氢酶的释放率为100.26±8.65%;GPX1组细胞乳酸脱氢酶的释放率为99.09±7.56%;UVB模型组细胞乳酸脱氢酶的释放率为211.48±12.66%;而含0.12U/mL GPX1的GPX1预防组细胞乳酸脱氢酶的释放率为132.07±11.38%;相比于UVB模型组,GPX1预防组细胞乳酸脱氢酶的释放率显著降低,这表明GPX1能有效预防紫外线引起的皮肤表皮细胞细胞膜损伤。
实施例5.GPX1对UVB诱导的Hacat细胞氧化脂质化的预防作用
Hacat细胞以1×105个/mL接种于含100mL/L胎牛血清的Dulbecco's modifiedEagle's medium(DMEM)培养基的96孔板中,置于细胞恒温培养箱中培养,待细胞生长至85%融合时,将其分为4组,即对照组,GPX1组,UVB模型组及GPX1预防组。对照组加入生理盐水;GPX1组加入0.12U/mL的GPX1;UVB模型组是利用UVB灯(PL-S 9W/01;荷兰皇家飞利浦电子有限公司,波长范围:300-320nm;峰值:311nm)将培养细胞的96孔板置于距紫外光光源垂直距离为10cm的地方进行照射,照射功率为500μW/cm2,照射时间为1分钟,最终产生30mJ/cm2的能量,照射时将96孔板中的DMEM培养基弃掉后加入生理盐水,照射后重新加入DMEM培养基并放入细胞恒温培养箱中再培养24小时;GPX1预防组是提前加入0.12U/mL的GPX1处理细胞1小时,然后用UVB灯进行照射,在照射时将96孔板中的DMEM培养基弃掉后用含有0.12U/mLGPX1的生理盐水处理细胞1分钟,照射后重新加入0.12U/mL的GPX1继续处理细胞24小时;之后使用南京建成丙二醛测定试剂盒(A003-4-1),按照说明书所述步骤对细胞中丙二醛进行测定并用丙二醛含量表示。
如图4所示,在30mJ/cm2 UVB诱导的Hacat细胞氧化应激模型中,对照组细胞丙二醛含量为2.16±0.28(nmol/mg);GPX1组细胞丙二醛含量为2.23±0.33(nmol/mg);UVB模型组细胞丙二醛含量为7.59±0.49(nmol/mg);而含0.12U/mL GPX1的GPX1预防组细胞丙二醛含量为4.89±0.51(nmol/mg);相比于UVB模型组,GPX1预防组细胞丙二醛含量显著降低,这表明GPX1能有效预防紫外线引起的皮肤表皮细胞氧化脂质化。
实施例6.GPX1对UVB诱导的Hacat细胞DNA损伤的预防作用
Hacat细胞以1×105个/mL接种于含100mL/L胎牛血清的Dulbecco's modifiedEagle's medium(DMEM)培养基的6孔板中,置于细胞恒温培养箱中培养,待细胞生长至85%融合时,将其分为4组,即对照组,GPX1组,UVB模型组及GPX1预防组。对照组加入生理盐水;GPX1组加入0.12U/mL的GPX1;UVB模型组利用UVB灯(PL-S 9W/01;荷兰皇家飞利浦电子有限公司,波长范围:300-320nm;峰值:311nm)将培养细胞的6孔板置于距紫外光光源垂直距离为10cm的地方进行照射,照射功率为500μW/cm2,照射时间为1分钟,最终产生30mJ/cm2的能量,照射时将6孔板中的DMEM培养基弃掉后加入生理盐水,照射后重新加入DMEM培养基并放入细胞恒温培养箱中再培养24小时;GPX1预防组是提前加入0.12U/mL的GPX1处理细胞1小时,然后用UVB灯进行照射,在照射时将6孔板中的DMEM培养基弃掉后用含有0.12U/mLGPX1的生理盐水处理细胞1分钟,照射后重新加入0.12U/mL的GPX1继续处理细胞24小时;之后将各组细胞制成单细胞悬液并加入低熔点琼脂糖制备成样品玻片,将样品玻片置于细胞裂解液中裂解1小时,晾干后电泳30分钟,之后取出样品玻片加入25μg/mL溴化乙啶(EB)避光染色10分钟,每组样品玻片在荧光显微镜200倍下随机观察100个细胞,计数拖尾细胞并计算拖尾率(细胞DNA损伤比率)。
如图5所示,在30mJ/cm2 UVB诱导的Hacat细胞氧化应激模型中,对照组细胞DNA损伤比率为4.98±0.21%;GPX1组细胞DNA损伤比率为5.16±0.36%;UVB模型组细胞DNA损伤比率为42.19±0.89%;而含0.12U/mL GPX1的GPX1预防组细胞DNA损伤比率为22.07±0.53%;相比于UVB模型组,细胞DNA损伤比率显著降低,这表明GPX1能有效预防紫外线引起的皮肤表皮细胞DNA损伤。
实施例7.GPX1对UVB诱导的Hacat细胞细胞凋亡的预防作用
Hacat细胞以1×105个/mL接种于含100mL/L胎牛血清的Dulbecco's modifiedEagle's medium(DMEM)培养基的6孔板中,置于细胞恒温培养箱中培养,待细胞生长至85%融合时,将其分为4组,即对照组,GPX1组,UVB模型组及GPX1预防组。对照组加入生理盐水;GPX1组加入0.12U/mL的GPX1;UVB模型组利用UVB灯(PL-S 9W/01;荷兰皇家飞利浦电子有限公司,波长范围:300-320nm;峰值:311nm)将培养细胞的6孔板置于距紫外光光源垂直距离为10cm的地方进行照射,照射功率为500μW/cm2,照射时间为1分钟,最终产生30mJ/cm2的能量,照射时将6孔板中的DMEM培养基弃掉后加入生理盐水,照射后重新加入DMEM培养基并放入细胞恒温培养箱中再培养24小时;GPX1预防组是提前加入0.12U/mL的GPX1处理细胞1小时,然后用UVB灯进行照射,在照射时将6孔板中的DMEM培养基弃掉后用含有0.12U/mLGPX1的生理盐水处理细胞1分钟,照射后重新加入0.12U/mL的GPX1继续处理细胞24小时;之后使用BD公司Annexin V/PI凋亡检测试剂盒(556547),按照说明书所述步骤进行操作,收集细胞后用结合缓冲液冲洗细胞。然后用5μL Annexin V-FITC和10μL PI染色液染色并在室温避光孵育15分钟。最后使用流式细胞仪分析凋亡细胞。细胞凋亡情况用细胞凋亡率表示。
如图6所示,在30mJ/cm2 UVB诱导的Hacat细胞氧化应激模型中,对照组细胞凋亡率为5.08±0.88%;GPX1组细胞凋亡率为5.99±0.96%;UVB模型组细胞凋亡率为46.36±4.52%;而含0.12U/mL GPX1的GPX1预防组细胞凋亡率为19.86±2.08%;相比于UVB模型组,细胞凋亡率显著降低,这表明GPX1能有效预防紫外线引起的皮肤表皮细胞凋亡。
实施例8.GPX1对UVB诱导的Hacat细胞损伤的治疗作用
Hacat细胞以1×105个/mL接种于含100mL/L胎牛血清的Dulbecco's modifiedEagle's medium(DMEM)培养基的96孔板中,置于细胞恒温培养箱中培养,待细胞生长至85%融合时,将其分为4组,即对照组,GPX1组,UVB模型组及GPX1治疗组。对照组加入生理盐水;GPX1组加入0.12U/mL的GPX1;UVB模型组利用UVB灯(PL-S 9W/01;荷兰皇家飞利浦电子有限公司,波长范围:300-320nm;峰值:311nm)将培养细胞的96孔板置于距紫外光光源垂直距离为10cm的地方进行照射,照射功率为500μW/cm2,照射时间为1分钟,最终产生30mJ/cm2的能量,照射时将96孔板中的DMEM培养基弃掉后加入生理盐水,照射后重新加入DMEM培养基并放入细胞恒温培养箱中再培养24小时;GPX1治疗组在UVB灯照射后1小时加入0.12U/mL的GPX1处理细胞24小时;之后每孔加入5mg/mL的MTT溶液20μL,继续培养4小时,终止培养后弃掉孔内培养上清液,每孔加入150μL二甲基亚砜(DMSO)终止反应,振荡10min,使水不溶性的蓝紫色结晶甲臜充分溶解。选择490nm波长,在酶标仪上测定各孔吸光值并计算各组的细胞存活率:细胞存活率(%)=(实验组OD值/对照组OD值)×100%。
如图7所示,在30mJ/cm2 UVB诱导的Hacat细胞氧化应激模型中,对照组细胞存活率为100.2±4.09%;GPX1组细胞存活率为98.49±4.16%;UVB模型组细胞存活率仅为50.49±6.08%;而含0.12U/mL GPX1的GPX1治疗组细胞存活率为70.48±6.63%;可见GPX1治疗组细胞存活率是UVB模型组的1.4倍,这表明GPX1能有效治疗紫外线引起的细胞损伤。
实施例9.GPX1对UVB诱导的Hacat细胞细胞膜损伤的治疗作用
Hacat细胞以1×105个/mL接种于含100mL/L胎牛血清的Dulbecco's modifiedEagle's medium(DMEM)培养基的96孔板中,置于细胞恒温培养箱中培养,待细胞生长至85%融合时,将其分为4组,即对照组,GPX1组,UVB模型组及GPX1治疗组。对照组加入生理盐水;GPX1组加入0.12U/mL的GPX1;UVB模型组利用UVB灯(PL-S 9W/01;荷兰皇家飞利浦电子有限公司,波长范围:300-320nm;峰值:311nm)将培养细胞的96孔板置于距紫外光光源垂直距离为10cm的地方进行照射,照射功率为500μW/cm2,照射时间为1分钟,最终产生30mJ/cm2的能量,照射时将96孔板中的DMEM培养基弃掉后加入生理盐水,照射后重新加入DMEM培养基并放入细胞恒温培养箱中再培养24小时;GPX1治疗组在UVB灯照射后1小时加入0.12U/mL的GPX1处理细胞24小时;之后使用南京建成乳酸脱氢酶试剂盒(A020-2-2),按照说明书所述步骤对细胞上清液中乳酸脱氢酶指标进行测定并用乳酸脱氢酶释放率表示。
如图8所示,在30mJ/cm2 UVB诱导的Hacat细胞氧化应激模型中,对照组细胞乳酸脱氢酶的释放率为99.89±7.35%;GPX1组细胞乳酸脱氢酶的释放率为99.29±6.66%;UVB模型组细胞乳酸脱氢酶的释放率为231.28±15.01%;而含0.12U/mL GPX1的GPX1治疗组细胞乳酸脱氢酶的释放率为152.09±15.77%;相比于UVB模型组,GPX1治疗组细胞乳酸脱氢酶的释放率显著降低,这表明GPX1能有效治疗紫外线引起的皮肤表皮细胞细胞膜损伤。
实施例10.GPX1对UVB诱导的Hacat细胞氧化脂质化的治疗作用
Hacat细胞以1×105个/mL接种于含100mL/L胎牛血清的Dulbecco's modifiedEagle's medium(DMEM)培养基的96孔板中,置于细胞恒温培养箱中培养,待细胞生长至85%融合时,将其分为4组,即对照组,GPX1组,UVB模型组及GPX1治疗组。对照组加入生理盐水;GPX1组加入0.12U/mL的GPX1;UVB模型组利用UVB灯(PL-S 9W/01;荷兰皇家飞利浦电子有限公司,波长范围:300-320nm;峰值:311nm)将培养细胞的96孔板置于距紫外光光源垂直距离为10cm的地方进行照射,照射功率为500μW/cm2,照射时间为1分钟,最终产生30mJ/cm2的能量,照射时将96孔板中的DMEM培养基弃掉后加入生理盐水,照射后重新加入DMEM培养基并放入细胞恒温培养箱中再培养24小时;GPX1治疗组在UVB灯照射后1小时加入0.12U/mL的GPX1处理细胞24小时;之后使用南京建成丙二醛测定试剂盒(A003-4-1),按照说明书所述步骤对细胞中丙二醛进行测定并用丙二醛含量表示。
如图9所示,在30mJ/cm2 UVB诱导的Hacat细胞氧化应激模型中,对照组细胞丙二醛含量为2.81±0.31(nmol/mg);GPX1组细胞丙二醛含量为2.92±0.28(nmol/mg);UVB模型组细胞丙二醛含量为6.88±0.36(nmol/mg);而含0.12U/mL GPX1的GPX1治疗组细胞丙二醛含量为3.76±0.43(nmol/mg);相比于UVB模型组,GPX1治疗组细胞丙二醛含量显著降低,这表明GPX1能有效治疗紫外线引起的皮肤表皮细胞氧化脂质化。
实施例11.GPX1对UVB诱导的Hacat细胞DNA损伤的治疗作用
Hacat细胞以1×105个/mL接种于含100mL/L胎牛血清的Dulbecco's modifiedEagle's medium(DMEM)培养基的6孔板中,置于细胞恒温培养箱中培养,待细胞生长至85%融合时,将其分为4组,即对照组,GPX1组,UVB模型组及GPX1治疗组。对照组加入生理盐水;GPX1组加入0.12U/mL的GPX1;UVB模型组利用UVB灯(PL-S 9W/01;荷兰皇家飞利浦电子有限公司,波长范围:300-320nm;峰值:311nm)将培养细胞的6孔板置于距紫外光光源垂直距离为10cm的地方进行照射,照射功率为500μW/cm2,照射时间为1分钟,最终产生30mJ/cm2的能量,照射时将6孔板中的DMEM培养基弃掉后加入生理盐水,照射后重新加入DMEM培养基并放入细胞恒温培养箱中再培养24小时;GPX1治疗组在UVB灯照射后1小时加入0.12U/mL的GPX1处理细胞24小时;之后将各组细胞制成单细胞悬液并加入低熔点琼脂糖制备成样品玻片,将样品玻片置于细胞裂解液中裂解1小时,晾干后电泳30分钟,之后取出样品玻片加入25μg/mL溴化乙啶(EB)避光染色10分钟,每组样品玻片在荧光显微镜200倍下随机观察100个细胞,计数拖尾细胞并计算拖尾率(细胞DNA损伤比率)。
如图10所示,在30mJ/cm2 UVB诱导的Hacat细胞氧化应激模型中,对照组细胞DNA损伤比率为5.38±0.34%;GPX1组细胞DNA损伤比率为5.21±0.42%;UVB模型组细胞DNA损伤比率为50.13±5.68%;而含0.12U/mL GPX1的GPX1治疗组细胞DNA损伤比率为28.88±0.81%;相比于UVB模型组,GPX1治疗组细胞DNA损伤比率显著降低,这表明GPX1能有效治疗紫外线引起的皮肤表皮细胞DNA损伤。
实施例12.GPX1对UVB诱导的Hacat细胞细胞凋亡的治疗作用
Hacat细胞以1×105个/mL接种于含100mL/L胎牛血清的Dulbecco's modifiedEagle's medium(DMEM)培养基的6孔板中,置于细胞恒温培养箱中培养,待细胞生长至85%融合时,将其分为4组,即对照组,GPX1组,UVB模型组及GPX1治疗组。对照组加入生理盐水;GPX1组加入0.12U/mL的GPX1;UVB模型组利用UVB灯(PL-S 9W/01;荷兰皇家飞利浦电子有限公司,波长范围:300-320nm;峰值:311nm)将培养细胞的6孔板置于距紫外光光源垂直距离为10cm的地方进行照射,照射功率为500μW/cm2,照射时间为1分钟,最终产生30mJ/cm2的能量,照射时将6孔板中的DMEM培养基弃掉后加入生理盐水,照射后重新加入DMEM培养基并放入细胞恒温培养箱中再培养24小时;GPX1治疗组在UVB灯照射后1小时加入0.12U/mL的GPX1处理细胞24小时;之后使用BD公司Annexin V/PI凋亡检测试剂盒(556547),按照说明书所述步骤进行操作,收集细胞后用结合缓冲液冲洗细胞。然后用5μL Annexin V-FITC和10μLPI染色液染色并在室温避光孵育15分钟。最后使用流式细胞仪分析凋亡细胞。细胞凋亡情况用细胞凋亡率表示。
如图11所示,在30mJ/cm2 UVB诱导的Hacat细胞氧化应激模型中,对照组细胞凋亡率为6.21±0.93%;GPX1组细胞凋亡率为6.99±0.83%;UVB模型组细胞凋亡率为46.06±3.08%;而含0.12U/mL GPX1的GPX1治疗组细胞凋亡率为20.16±2.61%;相比于UVB模型组,GPX1治疗组细胞凋亡率显著降低,这表明GPX1能有效治疗紫外线引起的皮肤表皮细胞凋亡。
实施例13.GPX1-L-ApSOD对UVB诱导的Hacat细胞损伤的预防作用
Hacat细胞以1×105个/mL接种于含100mL/L胎牛血清的Dulbecco's modifiedEagle's medium(DMEM)培养基的96孔板中,置于细胞恒温培养箱中培养,待细胞生长至85%融合时,将其分为4组,即对照组,GPX1-L-ApSOD组,UVB模型组及GPX1-L-ApSOD预防组。对照组加入生理盐水;GPX1-L-ApSOD组加入0.06U/ml的GPX1-L-ApSOD;UVB模型组利用UVB灯(PL-S 9W/01;荷兰皇家飞利浦电子有限公司,波长范围:300-320nm;峰值:311nm)将培养细胞的96孔板置于距紫外光光源垂直距离为10cm的地方进行照射,照射功率为500μW/cm2,照射时间为1分钟,最终产生30mJ/cm2的能量,照射时将96孔板中的DMEM培养基弃掉后加入生理盐水,照射后重新加入DMEM培养基并放入细胞恒温培养箱中再培养24小时;GPX1-L-ApSOD预防组是提前加入0.06U/mL的GPX1-L-ApSOD处理细胞1小时,然后用UVB灯进行照射,在照射时将96孔板中的DMEM培养基弃掉后用含有0.06U/mLGPX1-L-ApSOD的生理盐水处理细胞1分钟,照射后重新加入0.06U/mL的GPX1-L-ApSOD继续处理细胞24小时;之后每孔加入5mg/mL的MTT溶液20μL,继续培养4小时,终止培养后弃掉孔内培养上清液,每孔加入150μL二甲基亚砜(DMSO)终止反应,振荡10min,使水不溶性的蓝紫色结晶甲臜充分溶解。选择490nm波长,在酶标仪上测定各孔吸光值并计算各组的细胞存活率:细胞存活率(%)=(实验组OD值/对照组OD值)×100%。
如图12所示,在30mJ/cm2 UVB诱导的Hacat细胞氧化应激模型中,对照组细胞存活率为100.3±4.16%;GPX1-L-ApSOD组细胞存活率为99.29±6.06%;UVB模型组细胞存活率仅为50.16±6.08%;而含0.06U/mL GPX1-L-ApSOD的GPX1-L-ApSOD预防组细胞存活率为80.26±7.59%;可见GPX1-L-ApSOD预防组细胞存活率是UVB模型组的1.6倍,这表明GPX1-L-ApSOD能有效预防紫外线引起的细胞损伤。
实施例14.GPX1-L-ApSOD对UVB诱导的Hacat细胞细胞膜损伤的预防作用
Hacat细胞以1×105个/mL接种于含100mL/L胎牛血清的Dulbecco's modifiedEagle's medium(DMEM)培养基的96孔板中,置于细胞恒温培养箱中培养,待细胞生长至85%融合时,将其分为4组,即对照组,GPX1-L-ApSOD组,UVB模型组及GPX1-L-ApSOD预防组。对照组加入生理盐水;GPX1-L-ApSOD组加入0.06U/ml的GPX1-L-ApSOD;UVB模型组利用UVB灯(PL-S 9W/01;荷兰皇家飞利浦电子有限公司,波长范围:300-320nm;峰值:311nm)将培养细胞的96孔板置于距紫外光光源垂直距离为10cm的地方进行照射,照射功率为500μW/cm2,照射时间为1分钟,最终产生30mJ/cm2的能量,照射时将96孔板中的DMEM培养基弃掉后加入生理盐水,照射后重新加入DMEM培养基并放入细胞恒温培养箱中再培养24小时;GPX1-L-ApSOD预防组是提前加入0.06U/mL的GPX1-L-ApSOD处理细胞1小时,然后用UVB灯进行照射,在照射时将96孔板中的DMEM培养基弃掉后用含有0.06U/mLGPX1-L-ApSOD的生理盐水处理细胞1分钟,照射后重新加入0.06U/mL的GPX1-L-ApSOD继续处理细胞24小时;之后使用南京建成乳酸脱氢酶试剂盒(A020-2-2),按照说明书所述步骤对细胞上清液中乳酸脱氢酶指标进行测定并用乳酸脱氢酶释放率表示。
如图13所示,在30mJ/cm2 UVB诱导的Hacat细胞氧化应激模型中,对照组细胞乳酸脱氢酶的释放率为100.1±6.89%;GPX1-L-ApSOD组细胞乳酸脱氢酶的释放率为98.16±8.02%;UVB模型组细胞乳酸脱氢酶的释放率为246.5±15.46%;而含0.06U/mLGPX1-L-ApSOD的GPX1-L-ApSOD预防组细胞乳酸脱氢酶的释放率为143.2±16.94%;相比于UVB模型组,GPX1-L-ApSOD预防组细胞乳酸脱氢酶的释放率显著降低,这表明GPX1-L-ApSOD能有效预防紫外线引起的皮肤表皮细胞细胞膜损伤。
实施例15.GPX1-L-ApSOD对UVB诱导的Hacat细胞氧化脂质化的预防作用
Hacat细胞以1×105个/mL接种于含100mL/L胎牛血清的Dulbecco's modifiedEagle's medium(DMEM)培养基的96孔板中,置于细胞恒温培养箱中培养,待细胞生长至85%融合时,将其分为4组,即对照组,GPX1-L-ApSOD组,UVB模型组及GPX1-L-ApSOD预防组。对照组加入生理盐水;GPX1-L-ApSOD组加入0.06U/ml的GPX1-L-ApSOD;UVB模型组利用UVB灯(PL-S 9W/01;荷兰皇家飞利浦电子有限公司,波长范围:300-320nm;峰值:311nm)将培养细胞的96孔板置于距紫外光光源垂直距离为10cm的地方进行照射,照射功率为500μW/cm2,照射时间为1分钟,最终产生30mJ/cm2的能量,照射时将96孔板中的DMEM培养基弃掉后加入生理盐水,照射后重新加入DMEM培养基并放入细胞恒温培养箱中再培养24小时;GPX1-L-ApSOD预防组是提前加入0.06U/mL的GPX1-L-ApSOD处理细胞1小时,然后用UVB灯进行照射,在照射时将96孔板中的DMEM培养基弃掉后用含有0.06U/mLGPX1-L-ApSOD的生理盐水处理细胞1分钟,照射后重新加入0.06U/mL的GPX1-L-ApSOD继续处理细胞24小时;之后使用南京建成丙二醛测定试剂盒(A003-4-1),按照说明书所述步骤对细胞中丙二醛进行测定并用丙二醛含量表示。
如图14所示,在30mJ/cm2 UVB诱导的Hacat细胞氧化应激模型中,对照组细胞丙二醛含量为2.55±0.36(nmol/mg);GPX1-L-ApSOD组细胞丙二醛含量为2.69±0.52(nmol/mg);UVB模型组细胞丙二醛含量为8.07±0.55(nmol/mg);而含0.06U/mLGPX1-L-ApSOD的GPX1-L-ApSOD预防组细胞丙二醛含量为4.66±0.38(nmol/mg);相比于UVB模型组,GPX1-L-ApSOD预防组细胞丙二醛含量显著降低,这表明GPX1-L-ApSOD能有效预防紫外线引起的皮肤表皮细胞氧化脂质化。
实施例16.GPX1-L-ApSOD对UVB诱导的Hacat细胞DNA损伤的预防作用
Hacat细胞以1×105个/mL接种于含100mL/L胎牛血清的Dulbecco's modifiedEagle's medium(DMEM)培养基的6孔板中,置于细胞恒温培养箱中培养,待细胞生长至85%融合时,将其分为4组,即对照组,GPX1-L-ApSOD组,UVB模型组及GPX1-L-ApSOD预防组。对照组加入生理盐水;GPX1-L-ApSOD组加入0.06U/ml的GPX1-L-ApSOD;UVB模型组利用UVB灯(PL-S 9W/01;荷兰皇家飞利浦电子有限公司,波长范围:300-320nm;峰值:311nm)将培养细胞的96孔板置于距紫外光光源垂直距离为10cm的地方进行照射,照射功率为500μW/cm2,照射时间为1分钟,最终产生30mJ/cm2的能量,照射时将6孔板中的DMEM培养基弃掉后加入生理盐水,照射后重新加入DMEM培养基并放入细胞恒温培养箱中再培养24小时;GPX1-L-ApSOD预防组是提前加入0.06U/mL的GPX1-L-ApSOD处理细胞1小时,然后用UVB灯进行照射,在照射时将6孔板中的DMEM培养基弃掉后用含有0.06U/mLGPX1-L-ApSOD的生理盐水处理细胞1分钟,照射后重新加入0.06U/mL的GPX1-L-ApSOD继续处理细胞24小时;之后将各组细胞制成单细胞悬液并加入低熔点琼脂糖制备成样品玻片,将样品玻片置于细胞裂解液中裂解1小时,晾干后电泳30分钟,之后取出样品玻片加入25μg/mL溴化乙啶(EB)避光染色10分钟,每组样品玻片在荧光显微镜200倍下随机观察100个细胞,计数拖尾细胞并计算拖尾率(细胞DNA损伤比率)。
如图15所示,在30mJ/cm2 UVB诱导的Hacat细胞氧化应激模型中,对照组细胞DNA损伤比率为6.78±0.58%;GPX1-L-ApSOD组细胞DNA损伤比率为7.25±0.56%;UVB模型组细胞DNA损伤比率为46.15±6.66%;而含0.06U/mLGPX1-L-ApSOD的GPX1-L-ApSOD预防组细胞DNA损伤比率为21.06±3.41%;相比于UVB模型组,GPX1-L-ApSOD预防组细胞DNA损伤比率显著降低,这表明GPX1-L-ApSOD能有效预防紫外线引起的皮肤表皮细胞DNA损伤。
实施例17.GPX1-L-ApSOD对UVB诱导的Hacat细胞细胞凋亡的预防作用
Hacat细胞以1×105个/mL接种于含100mL/L胎牛血清的Dulbecco's modifiedEagle's medium(DMEM)培养基的6孔板中,置于细胞恒温培养箱中培养,待细胞生长至85%融合时,将其分为4组,即对照组,GPX1-L-ApSOD组,UVB模型组及GPX1-L-ApSOD预防组。对照组加入生理盐水;GPX1-L-ApSOD组加入0.06U/ml的GPX1-L-ApSOD;UVB模型组利用UVB灯(PL-S 9W/01;荷兰皇家飞利浦电子有限公司,波长范围:300-320nm;峰值:311nm)将培养细胞的6孔板置于距紫外光光源垂直距离为10cm的地方进行照射,照射功率为500μW/cm2,照射时间为1分钟,最终产生30mJ/cm2的能量,照射时将96孔板中的DMEM培养基弃掉后加入生理盐水,照射后重新加入DMEM培养基并放入细胞恒温培养箱中再培养24小时;GPX1-L-ApSOD预防组是提前加入0.06U/mL的GPX1-L-ApSOD处理细胞1小时,然后用UVB灯进行照射,在照射时将6孔板中的DMEM培养基弃掉后用含有0.06U/mLGPX1-L-ApSOD的生理盐水处理细胞1分钟,照射后重新加入0.06U/mL的GPX1-L-ApSOD继续处理细胞24小时;之后使用BD公司Annexin V/PI凋亡检测试剂盒(556547),按照说明书所述步骤进行操作,收集细胞后用结合缓冲液冲洗细胞。然后用5μL Annexin V-FITC和10μL PI染色液染色并在室温避光孵育15分钟。最后使用流式细胞仪分析凋亡细胞。细胞凋亡情况用细胞凋亡率表示。
如图16所示,在30mJ/cm2 UVB诱导的Hacat细胞氧化应激模型中,对照组细胞凋亡率为6.01±0.72%;GPX1-L-ApSOD组细胞凋亡率为5.99±0.91%;UVB模型组细胞凋亡率为49.77±6.05%;而含0.06U/mL GPX1-L-ApSOD的GPX1-L-ApSOD预防组细胞凋亡率为21.46±5.68%;相比于UVB模型组,GPX1-L-ApSOD预防组细胞凋亡率显著降低,这表明GPX1-L-ApSOD能有效预防紫外线引起的皮肤表皮细胞凋亡。
实施例18.GPX1-L-ApSOD对UVB诱导的Hacat细胞损伤的治疗作用
Hacat细胞以1×105个/mL接种于含100mL/L胎牛血清的Dulbecco's modifiedEagle's medium(DMEM)培养基的96孔板中,置于细胞恒温培养箱中培养,待细胞生长至85%融合时,将其分为4组,即对照组,GPX1-L-ApSOD组,UVB模型组及GPX1-L-ApSOD治疗组。对照组加入生理盐水;GPX1-L-ApSOD组加入0.06U/ml的GPX1-L-ApSOD;UVB模型组利用UVB灯(PL-S 9W/01;荷兰皇家飞利浦电子有限公司,波长范围:300-320nm;峰值:311nm)将培养细胞的96孔板置于距紫外光光源垂直距离为10cm的地方进行照射,照射功率为500μW/cm2,照射时间为1分钟,最终产生30mJ/cm2的能量,照射时将96孔板中的DMEM培养基弃掉后加入生理盐水,照射后重新加入DMEM培养基并放入细胞恒温培养箱中再培养24小时;GPX1-L-ApSOD治疗组在UVB灯照射后1小时加入0.06U/ml的GPX1-L-ApSOD处理细胞24小时;之后每孔加入5mg/mL的MTT溶液20μL,继续培养4小时,终止培养后弃掉孔内培养上清液,每孔加入150μL二甲基亚砜(DMSO)终止反应,振荡10min,使水不溶性的蓝紫色结晶甲臜充分溶解。选择490nm波长,在酶标仪上测定各孔吸光值并计算各组的细胞存活率:细胞存活率(%)=(实验组OD值/对照组OD值)×100%。
如图17所示,在30mJ/cm2 UVB诱导的Hacat细胞氧化应激模型中,对照组细胞存活率为100.05±5.92%;GPX1-L-ApSOD组细胞存活率为99.09±6.66%;UVB模型组细胞存活率仅为49.99±7.38%;而含0.06U/mLGPX1-L-ApSOD的GPX1-L-ApSOD治疗组细胞存活率为75.93±7.33%;可见GPX1-L-ApSOD治疗组细胞存活率是UVB模型组的1.51倍,这表明GPX1-L-ApSOD能有效治疗紫外线引起的细胞损伤。
实施例19.GPX1-L-ApSOD对UVB诱导的Hacat细胞细胞膜损伤的治疗作用
Hacat细胞以1×105个/mL接种于含100mL/L胎牛血清的Dulbecco's modifiedEagle's medium(DMEM)培养基的96孔板中,置于细胞恒温培养箱中培养,待细胞生长至85%融合时,将其分为4组,即对照组,GPX1-L-ApSOD组,UVB模型组及GPX1-L-ApSOD治疗组。对照组加入生理盐水;GPX1-L-ApSOD组加入0.06U/ml的GPX1-L-ApSOD;UVB模型组利用UVB灯(PL-S 9W/01;荷兰皇家飞利浦电子有限公司,波长范围:300-320nm;峰值:311nm)将培养细胞的96孔板置于距紫外光光源垂直距离为10cm的地方进行照射,照射功率为500μW/cm2,照射时间为1分钟,最终产生30mJ/cm2的能量,照射时将96孔板中的DMEM培养基弃掉后加入生理盐水,照射后重新加入DMEM培养基并放入细胞恒温培养箱中再培养24小时;GPX1-L-ApSOD治疗组在UVB灯照射后1小时加入0.06U/ml的GPX1-L-ApSOD处理细胞24小时;之后使用南京建成乳酸脱氢酶试剂盒(A020-2-2),按照说明书所述步骤对细胞上清液中乳酸脱氢酶指标进行测定并用乳酸脱氢酶释放率表示。
如图18所示,在30mJ/cm2 UVB诱导的Hacat细胞氧化应激模型中,对照组细胞乳酸脱氢酶的释放率为100±5.66%;GPX1-L-ApSOD组细胞乳酸脱氢酶的释放率为100.1±7.19%;UVB模型组细胞乳酸脱氢酶的释放率为210.15±15.16%;而含0.06U/mLGPX1-L-ApSOD的GPX1-L-ApSOD治疗组细胞乳酸脱氢酶的释放率为122.11±12.63%;相比于UVB模型组,GPX1-L-ApSOD治疗组细胞乳酸脱氢酶的释放率显著降低,这表明GPX1-L-ApSOD能有效治疗紫外线引起的皮肤表皮细胞细胞膜损伤。
实施例20.GPX1-L-ApSOD对UVB诱导的Hacat细胞氧化脂质化的治疗作用
Hacat细胞以1×105个/mL接种于含100mL/L胎牛血清的Dulbecco's modifiedEagle's medium(DMEM)培养基的96孔板中,置于细胞恒温培养箱中培养,待细胞生长至85%融合时,将其分为4组,即对照组,GPX1-L-ApSOD组,UVB模型组及GPX1-L-ApSOD治疗组。对照组加入生理盐水;GPX1-L-ApSOD组加入0.06U/ml的GPX1-L-ApSOD;UVB模型组利用UVB灯(PL-S 9W/01;荷兰皇家飞利浦电子有限公司,波长范围:300-320nm;峰值:311nm)将培养细胞的96孔板置于距紫外光光源垂直距离为10cm的地方进行照射,照射功率为500μW/cm2,照射时间为1分钟,最终产生30mJ/cm2的能量,照射时将96孔板中的DMEM培养基弃掉后加入生理盐水,照射后重新加入DMEM培养基并放入细胞恒温培养箱中再培养24小时;GPX1-L-ApSOD治疗组在UVB灯照射后1小时加入0.06U/ml的GPX1-L-ApSOD处理细胞24小时;之后使用南京建成丙二醛测定试剂盒(A003-4-1),按照说明书所述步骤对细胞中丙二醛进行测定并用丙二醛含量表示。
如图19所示,在30mJ/cm2 UVB诱导的Hacat细胞氧化应激模型中,对照组细胞丙二醛含量为3.15±0.55(nmol/mg);GPX1-L-ApSOD组细胞丙二醛含量为2.89±0.34(nmol/mg);UVB模型组细胞丙二醛含量为7.95±0.53(nmol/mg);而含0.06U/mLGPX1-L-ApSOD的GPX1-L-ApSOD治疗组细胞丙二醛含量为3.88±0.59(nmol/mg);相比于UVB模型组,GPX1-L-ApSOD治疗组细胞丙二醛含量显著降低,这表明GPX1-L-ApSOD能有效治疗紫外线引起的皮肤表皮细胞氧化脂质化。
实施例21.GPX1-L-ApSOD对UVB诱导的Hacat细胞DNA损伤的治疗作用
Hacat细胞以1×105个/mL接种于含100mL/L胎牛血清的Dulbecco's modifiedEagle's medium(DMEM)培养基的6孔板中,置于细胞恒温培养箱中培养,待细胞生长至85%融合时,将其分为4组,即对照组,GPX1-L-ApSOD组,UVB模型组及GPX1-L-ApSOD治疗组。对照组加入生理盐水;GPX1-L-ApSOD组加入0.06U/ml的GPX1-L-ApSOD;UVB模型组利用UVB灯(PL-S 9W/01;荷兰皇家飞利浦电子有限公司,波长范围:300-320nm;峰值:311nm)将培养细胞的6孔板置于距紫外光光源垂直距离为10cm的地方进行照射,照射功率为500μW/cm2,照射时间为1分钟,最终产生30mJ/cm2的能量,照射时将6孔板中的DMEM培养基弃掉后加入生理盐水,照射后重新加入DMEM培养基并放入细胞恒温培养箱中再培养24小时;GPX1-L-ApSOD治疗组在UVB灯照射后1小时加入0.06U/ml的GPX1-L-ApSOD处理细胞24小时;之后将各组细胞制成单细胞悬液并加入低熔点琼脂糖制备成样品玻片,将样品玻片置于细胞裂解液中裂解1小时,晾干后电泳30分钟,之后取出样品玻片加入25μg/mL溴化乙啶(EB)避光染色10分钟,每组样品玻片在荧光显微镜200倍下随机观察100个细胞,计数拖尾细胞并计算拖尾率(细胞DNA损伤比率)。
如图20所示,在30mJ/cm2 UVB诱导的Hacat细胞氧化应激模型中,对照组细胞DNA损伤比率为5.02±0.67%;GPX1-L-ApSOD组细胞DNA损伤比率为5.86±0.88%;UVB模型组细胞DNA损伤比率为45.29±5.79%;而含0.06U/mLGPX1-L-ApSOD的GPX1-L-ApSOD预防组细胞DNA损伤比率为23.65±6.26%;相比于UVB模型组,GPX1-L-ApSOD治疗组细胞DNA损伤比率显著降低,这表明GPX1-L-ApSOD能有效治疗紫外线引起的皮肤表皮细胞DNA损伤。
实施例22.GPX1-L-ApSOD对UVB诱导的Hacat细胞细胞凋亡的治疗作用
Hacat细胞以1×105个/mL接种于含100mL/L胎牛血清的Dulbecco's modifiedEagle's medium(DMEM)培养基的6孔板中,置于细胞恒温培养箱中培养,待细胞生长至85%融合时,将其分为4组,即对照组,GPX1-L-ApSOD组,UVB模型组及GPX1-L-ApSOD治疗组。对照组加入生理盐水;GPX1-L-ApSOD组加入0.06U/ml的GPX1-L-ApSOD;UVB模型组利用UVB灯(PL-S 9W/01;荷兰皇家飞利浦电子有限公司,波长范围:300-320nm;峰值:311nm)将培养细胞的6孔板置于距紫外光光源垂直距离为10cm的地方进行照射,照射功率为500μW/cm2,照射时间为1分钟,最终产生30mJ/cm2的能量,照射时将6孔板中的DMEM培养基弃掉后加入生理盐水,照射后重新加入DMEM培养基并放入细胞恒温培养箱中再培养24小时;GPX1-L-ApSOD治疗组在UVB灯照射后1小时加入0.06U/ml的GPX1-L-ApSOD处理细胞24小时;之后使用BD公司Annexin V/PI凋亡检测试剂盒(556547),按照说明书所述步骤进行操作,收集细胞后用结合缓冲液冲洗细胞。然后用5μL Annexin V-FITC和10μL PI染色液染色并在室温避光孵育15分钟。最后使用流式细胞仪分析凋亡细胞。细胞凋亡情况用细胞凋亡率表示。
如图21所示,在30mJ/cm2 UVB诱导的Hacat细胞氧化应激模型中,对照组细胞凋亡率为5.78±0.78%;GPX1-L-ApSOD组细胞凋亡率为6.22±0.98%;UVB模型组细胞凋亡率为45.55±3.45%;而含0.06U/mLGPX1-L-ApSOD的GPX1-L-ApSOD治疗组细胞凋亡率为21.56±2.77%;相比于UVB模型组,GPX1-L-ApSOD治疗组细胞凋亡率显著降低,这表明GPX1-L-ApSOD能有效治疗紫外线引起的皮肤表皮细胞凋亡。
实施例23.GPX1对UVB诱导的小鼠皮肤损伤的预防作用
将五周龄(20-25g)的BALB/c小鼠随机分组饲养在温度适宜的环境中,光照/黑暗周期为12h,小鼠可以自由接触食物和水,先让其适应环境7天。之后将小鼠分为4组,即对照组,GPX1组,光老化模型组及GPX1预防组(已与图22中名称一致)。将各组小鼠背部进行脱毛处理,直至皮肤完全暴露,脱毛面积为6~8cm2。对照组每次在UVB照射时,不进行UVB照射直接涂抹生理盐水(20μL/cm2);GPX1组每次在UVB照射时,不进行UVB照射直接涂抹2μg/cm2的GPX1(浓度为0.1μg/μL的GPX1每平方厘米涂抹20μL);光老化模型组利用UVB灯(PL-S 9W/01;荷兰皇家飞利浦电子有限公司,波长范围:300-320nm;峰值:311nm)将脱毛后的小鼠背部置于距紫外光光源垂直距离为5cm的地方进行照射,照射功率为1000μW/cm2,照射时间为2分钟,最终产生120mJ/cm2的能量,一周照射三次共四周。GPX1预防组在每次UVB照射前1小时涂抹2μg/cm2的GPX1(浓度为0.1μg/μL的GPX1每平方厘米涂抹20μL);在实验结束后,利用数码相机对各组小鼠背部的皮肤进行拍照,观察并分析小鼠背部皮肤的损伤程度。
如图22所示,在120mJ/cm2 UVB诱导的小鼠皮肤光老化模型中,对照组与GPX1组小鼠皮肤光滑,无损伤,无褶皱且富有弹性。光老化模型组小鼠皮肤干燥粗糙,有褶皱,无弹性且出现红斑炎症。相比于光老化模型组,含2μg/cm2GPX1的GPX1预防组小鼠皮肤损伤现象明显减轻,皮肤褶皱明显减少且恢复弹性,这表明GPX1能有效预防紫外线照射引起的皮肤损伤。
实施例24.GPX1对UVB诱导的小鼠皮肤表皮增厚的预防作用
将五周龄(20-25g)的BALB/c小鼠随机分组饲养在温度适宜的环境中,光照/黑暗周期为12h,小鼠可以自由接触食物和水,先让其适应环境7天。之后将小鼠分为4组,即对照组,GPX1组,光老化模型组及GPX1预防组。将各组小鼠背部进行脱毛处理,直至皮肤完全暴露,脱毛面积为6~8cm2。对照组每次在UVB照射时,不进行UVB照射直接涂抹生理盐水(20μL/cm2);GPX1组每次在UVB照射时,不进行UVB照射直接涂抹2μg/cm2的GPX1(浓度为0.1μg/μL的GPX1每平方厘米涂抹20μL);光老化模型组利用UVB灯(PL-S 9W/01;荷兰皇家飞利浦电子有限公司,波长范围:300-320nm;峰值:311nm)将脱毛后的小鼠背部置于距紫外光光源垂直距离为5cm的地方进行照射,照射功率为1000μW/cm2,照射时间为2分钟,最终产生120mJ/cm2的能量,一周照射三次共四周。GPX1预防组在每次UVB照射前1小时涂抹2μg/cm2的GPX1(浓度为0.1μg/μL的GPX1每平方厘米涂抹20μL);在实验结束后,通过断颈法处死小鼠,之后得到小鼠皮肤组织并浸泡在4%多聚甲醛中过夜,之后包埋在石蜡中以形成组织块。然后使用石蜡切片机将其切成5μm的组织切片。最后用苏木精—伊红(HE)对组织切片进行染色,并在光学显微镜下对皮肤表皮进行观察,采用AxioVision Rel.4.8软件测量皮肤表皮厚度,每组选择3张照片,每组照片在表皮厚度无明显变化处连续测量6个不重叠的表皮厚度,取平均值作为表皮厚度的量化指标。
如图23所示,在120mJ/cm2 UVB诱导的小鼠皮肤光老化模型中,对照组小鼠皮肤表皮厚度为18.49±2.01μm;GPX1组小鼠皮肤表皮厚度为19.49±3.11μm;光老化模型组小鼠皮肤表皮厚度为151.67±18.1μm;含2μg/cm2GPX1的GPX1预防组小鼠皮肤表皮厚度为82.16±5.79μm;相比于光老化模型组,GPX1预防组小鼠皮肤表皮厚度显著降低,这表明GPX1能有效预防紫外线照射引起的表皮增厚。
实施例25.GPX1对UVB诱导的小鼠皮肤氧化应激的预防作用
将五周龄(20-25g)的BALB/c小鼠随机分组饲养在温度适宜的环境中,光照/黑暗周期为12h,小鼠可以自由接触食物和水,先让其适应环境7天。之后将小鼠分为4组,即对照组,GPX1组,光老化模型组及GPX1预防组。将各组小鼠背部进行脱毛处理,直至皮肤完全暴露,脱毛面积为6~8cm2。对照组每次在UVB照射时,不进行UVB照射直接涂抹生理盐水(20μL/cm2);GPX1组每次在UVB照射时,不进行UVB照射直接涂抹2μg/cm2的GPX1(浓度为0.1μg/μL的GPX1每平方厘米涂抹20μL);光老化模型组利用UVB灯(PL-S 9W/01;荷兰皇家飞利浦电子有限公司,波长范围:300-320nm;峰值:311nm)将脱毛后的小鼠背部置于距紫外光光源垂直距离为5cm的地方进行照射,照射功率为1000μW/cm2,照射时间为2分钟,最终产生120mJ/cm2的能量,一周照射三次共四周。GPX1预防组在每次UVB照射前1小时涂抹2μg/cm2的GPX1(浓度为0.1μg/μL的GPX1每平方厘米涂抹20μL);在实验结束后,通过断颈法处死小鼠,之后得到小鼠皮肤组织并将皮肤组织制备成组织匀浆。通过索莱宝生物公司的过氧化氢测定试剂盒(BC3590),按照说明书所述步骤对小鼠皮肤组织中过氧化氢进行测定。
如图24所示,在120mJ/cm2 UVB诱导的小鼠皮肤光老化模型中,对照组小鼠皮肤中过氧化氢的含量为10.23±0.99(μmol/mg);GPX1组小鼠皮肤中过氧化氢的含量为12.06±1.08(μmol/mg);光老化模型组小鼠皮肤中过氧化氢的含量为28.49±2.07(μmol/mg);含2μg/cm2GPX1的GPX1预防组小鼠皮肤中过氧化氢的含量为18.79±2.97(μmol/mg);相比于光老化模型组,GPX1预防组小鼠皮肤中过氧化氢的含量显著降低,这表明GPX1能有效预防紫外线照射引起的皮肤氧化应激。
实施例26.GPX1对UVB诱导的小鼠皮肤氧化脂质化的预防作用
将五周龄(20-25g)的BALB/c小鼠随机分组饲养在温度适宜的环境中,光照/黑暗周期为12h,小鼠可以自由接触食物和水,先让其适应环境7天。之后将小鼠分为4组,即对照组,GPX1组,光老化模型组及GPX1预防组。将各组小鼠背部进行脱毛处理,直至皮肤完全暴露,脱毛面积为6~8cm2。对照组每次在UVB照射时,不进行UVB照射直接涂抹生理盐水(20μL/cm2);GPX1组每次在UVB照射时,不进行UVB照射直接涂抹2μg/cm2的GPX1(浓度为0.1μg/μL的GPX1每平方厘米涂抹20μL);光老化模型组利用UVB灯(PL-S 9W/01;荷兰皇家飞利浦电子有限公司,波长范围:300-320nm;峰值:311nm)将脱毛后的小鼠背部置于距紫外光光源垂直距离为5cm的地方进行照射,照射功率为1000μW/cm2,照射时间为2分钟,最终产生120mJ/cm2的能量,一周照射三次共四周。GPX1预防组在每次UVB照射前1小时涂抹2μg/cm2的GPX1(浓度为0.1μg/μL的GPX1每平方厘米涂抹20μL);在实验结束后,通过断颈法处死小鼠,之后得到小鼠皮肤组织并将皮肤组织制备成组织匀浆。通过南京建成公司丙二醛测定试剂盒(A003-4-1),按照说明书所述步骤对皮肤组织中丙二醛进行测定并用丙二醛含量表示。
如图25所示,在120mJ/cm2 UVB诱导的小鼠皮肤光老化模型中,对照组小鼠皮肤中丙二醛(MDA)的含量为1.29±0.68(nmol/mg);GPX1组小鼠皮肤中丙二醛(MDA)的含量为1.59±1.07(nmol/mg);光老化模型组小鼠皮肤中丙二醛(MDA)的含量为6.79±1.13(nmol/mg);含2μg/cm2GPX1的GPX1预防组小鼠皮肤中丙二醛(MDA)的含量为4.08±1.1(nmol/mg);相比于光老化模型组,GPX1预防组小鼠皮肤中丙二醛(MDA)的含量显著降低,这表明GPX1能有效预防紫外线照射引起的皮肤氧化脂质化。
实施例27.GPX1对UVB诱导的小鼠皮肤胶原蛋白流失的预防作用
将五周龄(20-25g)的BALB/c小鼠随机分组饲养在温度适宜的环境中,光照/黑暗周期为12h,小鼠可以自由接触食物和水,先让其适应环境7天。之后将小鼠分为4组,即对照组,GPX1组,光老化模型组及GPX1预防组。将各组小鼠背部进行脱毛处理,直至皮肤完全暴露,脱毛面积为6~8cm2。对照组每次在UVB照射时,不进行UVB照射直接涂抹生理盐水(20μL/cm2);GPX1组每次在UVB照射时,不进行UVB照射直接涂抹2μg/cm2的GPX1(浓度为0.1μg/μL的GPX1每平方厘米涂抹20μL);光老化模型组利用UVB灯(PL-S 9W/01;荷兰皇家飞利浦电子有限公司,波长范围:300-320nm;峰值:311nm)将脱毛后的小鼠背部置于距紫外光光源垂直距离为5cm的地方进行照射,照射功率为1000μW/cm2,照射时间为2分钟,最终产生120mJ/cm2的能量,一周照射三次共四周。GPX1预防组在每次UVB照射前1小时涂抹2μg/cm2的GPX1(浓度为0.1μg/μL的GPX1每平方厘米涂抹20μL);在实验结束后,通过断颈法处死小鼠,之后得到小鼠皮肤组织并浸泡在4%多聚甲醛中过夜,之后包埋在石蜡中以形成组织块。然后使用石蜡切片机将其切成5μm的组织切片。最后用天狼星红染色液对组织切片进行染色,并在光学显微镜下对皮肤组织中胶原纤维进行观察,使用ImageJ 1.52软件测量各组图片的胶原密度比率。
如图26所示,在120mJ/cm2 UVB诱导的小鼠皮肤光老化模型中,对照组小鼠皮肤中胶原密度比率为100.2±5.26%;GPX1组小鼠皮肤中胶原密度比率为99.85±6.68%;光老化模型组小鼠皮肤中胶原密度比率为63.75±6.01%;含2μg/cm2GPX1的GPX1预防组小鼠皮肤中胶原密度比率为81.03±6.1%;相比于光老化模型组,GPX1预防组小鼠皮肤中胶原密度明显增加,这表明GPX1能有效预防紫外线照射引起的皮肤胶原蛋白流失。
实施例28.GPX1对UVB诱导的小鼠皮肤损伤的治疗作用
将五周龄(20-25g)的BALB/c小鼠随机分组饲养在温度适宜的环境中,光照/黑暗周期为12h,小鼠可以自由接触食物和水,先让其适应环境7天。之后将小鼠分为4组,即对照组,GPX1组,光老化模型组及GPX1治疗组(已与图27中名称一致)。将各组小鼠背部进行脱毛处理,直至皮肤完全暴露,脱毛面积为6~8cm2。对照组每次在UVB照射时,不进行UVB照射直接涂抹生理盐水(20μL/cm2);GPX1组每次在UVB照射时,不进行UVB照射直接涂抹2μg/cm2的GPX1(浓度为0.1μg/μL的GPX1每平方厘米涂抹20μL);光老化模型组利用UVB灯(PL-S 9W/01;荷兰皇家飞利浦电子有限公司,波长范围:300-320nm;峰值:311nm)将脱毛后的小鼠背部置于距紫外光光源垂直距离为5cm的地方进行照射,照射功率为1000μW/cm2,照射时间为2分钟,最终产生120mJ/cm2的能量,一周照射三次共四周。GPX1治疗组在每次UVB照射后1小时涂抹2μg/cm2的GPX1(浓度为0.1μg/μL的GPX1每平方厘米涂抹20μL);在实验结束后,利用数码相机对各组小鼠背部的皮肤进行拍照,观察并分析小鼠背部皮肤的损伤程度。
如图27所示,在120mJ/cm2 UVB诱导的小鼠皮肤光老化模型中,对照组与GPX1组小鼠皮肤光滑,无损伤,无褶皱且富有弹性。光老化模型组小鼠皮肤干燥粗糙,有褶皱,无弹性且出现红斑炎症。相比于光老化模型组,含2μg/cm2GPX1的GPX1治疗组小鼠皮肤损伤现象明显减轻,皮肤褶皱明显减少且恢复弹性,这表明GPX1能有效治疗紫外线照射引起的皮肤损伤。
实施例29.GPX1对UVB诱导的小鼠皮肤表皮增厚的治疗作用
将五周龄(20-25g)的BALB/c小鼠随机分组饲养在温度适宜的环境中,光照/黑暗周期为12h,小鼠可以自由接触食物和水,先让其适应环境7天。之后将小鼠分为4组,即对照组,GPX1组,光老化模型组及GPX1治疗组。将各组小鼠背部进行脱毛处理,直至皮肤完全暴露,脱毛面积为6~8cm2。对照组每次在UVB照射时,不进行UVB照射直接涂抹生理盐水(20μL/cm2);GPX1组每次在UVB照射时,不进行UVB照射直接涂抹2μg/cm2的GPX1(浓度为0.1μg/μL的GPX1每平方厘米涂抹20μL);光老化模型组利用UVB灯(PL-S 9W/01;荷兰皇家飞利浦电子有限公司,波长范围:300-320nm;峰值:311nm)将脱毛后的小鼠背部置于距紫外光光源垂直距离为5cm的地方进行照射,照射功率为1000μW/cm2,照射时间为2分钟,最终产生120mJ/cm2的能量,一周照射三次共四周。GPX1治疗组在每次UVB照射后1小时涂抹2μg/cm2的GPX1(浓度为0.1μg/μL的GPX1每平方厘米涂抹20μL);在实验结束后,通过断颈法处死小鼠,之后得到小鼠皮肤组织并浸泡在4%多聚甲醛中过夜,之后包埋在石蜡中以形成组织块。然后使用石蜡切片机将其切成5μm的组织切片。最后用苏木精—伊红(HE)对组织切片进行染色,并在光学显微镜下对皮肤表皮进行观察,采用AxioVision Rel.4.8软件测量皮肤表皮厚度,每组选择3张照片,每组照片在表皮厚度无明显变化处连续测量6个不重叠的表皮厚度,取平均值作为表皮厚度的量化指标。
如图28所示,在120mJ/cm2 UVB诱导的小鼠皮肤光老化模型中,对照组小鼠皮肤表皮厚度为16.66±3.06μm;GPX1组小鼠皮肤表皮厚度为18.07±4.16μm;光老化模型组小鼠皮肤表皮厚度为163.05±16.19μm;含2μg/cm2GPX1的GPX1治疗组小鼠皮肤表皮厚度为96.49±6.79μm;相比于光老化模型组,GPX1治疗组小鼠皮肤表皮厚度显著降低,这表明GPX1能有效治疗紫外线照射引起的表皮增厚。
实施例30.GPX1对UVB诱导的小鼠皮肤氧化应激的治疗作用
将五周龄(20-25g)的BALB/c小鼠随机分组饲养在温度适宜的环境中,光照/黑暗周期为12h,小鼠可以自由接触食物和水,先让其适应环境7天。之后将小鼠分为4组,即对照组,GPX1组,光老化模型组及GPX1治疗组。将各组小鼠背部进行脱毛处理,直至皮肤完全暴露,脱毛面积为6~8cm2。对照组每次在UVB照射时,不进行UVB照射直接涂抹生理盐水(20μL/cm2);GPX1组每次在UVB照射时,不进行UVB照射直接涂抹2μg/cm2的GPX1(浓度为0.1μg/μL的GPX1每平方厘米涂抹20μL);光老化模型组利用UVB灯(PL-S 9W/01;荷兰皇家飞利浦电子有限公司,波长范围:300-320nm;峰值:311nm)将脱毛后的小鼠背部置于距紫外光光源垂直距离为5cm的地方进行照射,照射功率为1000μW/cm2,照射时间为2分钟,最终产生120mJ/cm2的能量,一周照射三次共四周。GPX1治疗组在每次UVB照射后1小时涂抹2μg/cm2的GPX1(浓度为0.1μg/μL的GPX1每平方厘米涂抹20μL);在实验结束后,通过断颈法处死小鼠,之后得到小鼠皮肤组织并将皮肤组织制备成组织匀浆。通过索莱宝生物公司的过氧化氢测定试剂盒(BC3590),按照说明书所述步骤对小鼠皮肤组织中过氧化氢进行测定。
如图29所示,在120mJ/cm2 UVB诱导的小鼠皮肤光老化模型中,对照组小鼠皮肤中过氧化氢的含量为9.46±1.34(μmol/mg);GPX1组小鼠皮肤中过氧化氢的含量为10.28±2.13(μmol/mg);光老化模型组小鼠皮肤中过氧化氢的含量为31.08±3.09(μmol/mg);含2μg/cm2GPX1的GPX1治疗组小鼠皮肤中过氧化氢的含量为20.49±3.47(μmol/mg);相比于光老化模型组,GPX1治疗组小鼠皮肤中过氧化氢的含量显著降低,这表明GPX1能有效治疗紫外线照射引起的皮肤氧化应激。
实施例31.GPX1对UVB诱导的小鼠皮肤氧化脂质化的治疗作用
将五周龄(20-25g)的BALB/c小鼠随机分组饲养在温度适宜的环境中,光照/黑暗周期为12h,小鼠可以自由接触食物和水,先让其适应环境7天。之后将小鼠分为4组,即对照组,GPX1组,光老化模型组及GPX1治疗组。将各组小鼠背部进行脱毛处理,直至皮肤完全暴露,脱毛面积为6~8cm2。对照组每次在UVB照射时,不进行UVB照射直接涂抹生理盐水(20μL/cm2);GPX1组每次在UVB照射时,不进行UVB照射直接涂抹2μg/cm2的GPX1(浓度为0.1μg/μL的GPX1每平方厘米涂抹20μL);光老化模型组利用UVB灯(PL-S 9W/01;荷兰皇家飞利浦电子有限公司,波长范围:300-320nm;峰值:311nm)将脱毛后的小鼠背部置于距紫外光光源垂直距离为5cm的地方进行照射,照射功率为1000μW/cm2,照射时间为2分钟,最终产生120mJ/cm2的能量,一周照射三次共四周。GPX1治疗组在每次UVB照射后1小时涂抹2μg/cm2的GPX1(浓度为0.1μg/μL的GPX1每平方厘米涂抹20μL);在实验结束后,通过断颈法处死小鼠,之后得到小鼠皮肤组织并将皮肤组织制备成组织匀浆。通过南京建成公司丙二醛测定试剂盒(A003-4-1),按照说明书所述步骤对皮肤组织中丙二醛进行测定并用丙二醛含量表示。
如图30所示,在120mJ/cm2 UVB诱导的小鼠皮肤光老化模型中,对照组小鼠皮肤中丙二醛(MDA)的含量为1.89±0.81(nmol/mg);GPX1组小鼠皮肤中丙二醛(MDA)的含量为1.77±0.99(nmol/mg);光老化模型组小鼠皮肤中丙二醛(MDA)的含量为6.73±1.21(nmol/mg);含2μg/cm2GPX1的GPX1治疗组小鼠皮肤中丙二醛(MDA)的含量为3.99±0.99(nmol/mg);相比于光老化模型组,GPX1治疗组小鼠皮肤中丙二醛(MDA)的含量显著降低,这表明GPX1能有效治疗紫外线照射引起的皮肤氧化脂质化。
实施例32.GPX1对UVB诱导的小鼠皮肤胶原蛋白流失的治疗作用
将五周龄(20-25g)的BALB/c小鼠随机分组饲养在温度适宜的环境中,光照/黑暗周期为12h,小鼠可以自由接触食物和水,先让其适应环境7天。之后将小鼠分为4组,即对照组,GPX1组,光老化模型组及GPX1治疗组。将各组小鼠背部进行脱毛处理,直至皮肤完全暴露,脱毛面积为6~8cm2。对照组每次在UVB照射时,不进行UVB照射直接涂抹生理盐水(20μL/cm2);GPX1组每次在UVB照射时,不进行UVB照射直接涂抹2μg/cm2的GPX1(浓度为0.1μg/μL的GPX1每平方厘米涂抹20μL);光老化模型组利用UVB灯(PL-S 9W/01;荷兰皇家飞利浦电子有限公司,波长范围:300-320nm;峰值:311nm)将脱毛后的小鼠背部置于距紫外光光源垂直距离为5cm的地方进行照射,照射功率为1000μW/cm2,照射时间为2分钟,最终产生120mJ/cm2的能量,一周照射三次共四周。GPX1治疗组在每次UVB照射后1小时涂抹2μg/cm2的GPX1(浓度为0.1μg/μL的GPX1每平方厘米涂抹20μL);在实验结束后,通过断颈法处死小鼠,之后得到小鼠皮肤组织并浸泡在4%多聚甲醛中过夜,之后包埋在石蜡中以形成组织块。然后使用石蜡切片机将其切成5μm的组织切片。最后用天狼星红染色液对组织切片进行染色,并在光学显微镜下对皮肤组织中胶原纤维进行观察,使用ImageJ 1.52软件测量各组图片的胶原密度比率。
如图31所示,在120mJ/cm2 UVB诱导的小鼠皮肤光老化模型中,对照组小鼠皮肤中胶原密度比率为99.8±5.13%;GPX1组小鼠皮肤中胶原密度比率为100.02±7.99%;光老化模型组小鼠皮肤中胶原密度比率为59.79±6.08%;含2μg/cm2GPX1的GPX1治疗组小鼠皮肤中胶原密度比率为82.94±6.13%;相比于光老化模型组,GPX1治疗组小鼠皮肤中胶原密度明显增加,这表明GPX1能有效治疗紫外线照射引起的皮肤胶原蛋白流失。
实施例33.GPX1-L-ApSOD对UVB诱导的小鼠皮肤损伤的预防作用
将五周龄(20-25g)的BALB/c小鼠随机分组饲养在温度适宜的环境中,光照/黑暗周期为12h,小鼠可以自由接触食物和水,先让其适应环境7天。之后将小鼠分为4组,即对照组,GPX1-L-ApSOD组,光老化模型组及GPX1-L-ApSOD预防组(已与图32中的名称一致)。将各组小鼠背部进行脱毛处理,直至皮肤完全暴露,脱毛面积为6~8cm2。对照组每次在UVB照射时,不进行UVB照射直接涂抹生理盐水(20μL/cm2);GPX1-L-ApSOD组每次在UVB照射时,不进行UVB照射直接涂抹2μg/cm2的GPX1-L-ApSOD(浓度为0.1μg/μL的GPX1-L-ApSOD每平方厘米涂抹20μL);光老化模型组利用UVB灯(PL-S 9W/01;荷兰皇家飞利浦电子有限公司,波长范围:300-320nm;峰值:311nm)将脱毛后的小鼠背部置于距紫外光光源垂直距离为5cm的地方进行照射,照射功率为1000μW/cm2,照射时间为2分钟,最终产生120mJ/cm2的能量,一周照射三次共四周。GPX1-L-ApSOD预防组在每次UVB照射前1小时涂抹2μg/cm2的GPX1-L-ApSOD(浓度为0.1μg/μL的GPX1-L-ApSOD每平方厘米涂抹20μL);在实验结束后,利用数码相机对各组小鼠背部的皮肤进行拍照,观察并分析小鼠背部皮肤的损伤程度。
如图32所示,在120mJ/cm2 UVB诱导的小鼠皮肤光老化模型中,对照组与GPX1-L-ApSOD组小鼠皮肤光滑,无损伤,无褶皱且富有弹性。光老化模型组小鼠皮肤干燥粗糙,有褶皱,无弹性且出现红斑炎症。相比于光老化模型组,含2μg/cm2GPX1-L-ApSOD的GPX1-L-ApSOD预防组小鼠皮肤损伤现象明显减轻,皮肤褶皱明显减少且恢复弹性,这表明GPX1-L-ApSOD能有效预防紫外线照射引起的皮肤损伤。
实施例34.GPX1-L-ApSOD对UVB诱导的小鼠皮肤表皮增厚的预防作用
将五周龄(20-25g)的BALB/c小鼠随机分组饲养在温度适宜的环境中,光照/黑暗周期为12h,小鼠可以自由接触食物和水,先让其适应环境7天。之后将小鼠分为4组,即对照组,GPX1-L-ApSOD组,光老化模型组及GPX1-L-ApSOD预防组。将各组小鼠背部进行脱毛处理,直至皮肤完全暴露,脱毛面积为6~8cm2。对照组每次在UVB照射时,不进行UVB照射直接涂抹生理盐水(20μL/cm2);GPX1-L-ApSOD组每次在UVB照射时,不进行UVB照射直接涂抹2μg/cm2的GPX1-L-ApSOD(浓度为0.1μg/μL的GPX1-L-ApSOD每平方厘米涂抹20μL);光老化模型组利用UVB灯(PL-S 9W/01;荷兰皇家飞利浦电子有限公司,波长范围:300-320nm;峰值:311nm)将脱毛后的小鼠背部置于距紫外光光源垂直距离为5cm的地方进行照射,照射功率为1000μW/cm2,照射时间为2分钟,最终产生120mJ/cm2的能量,一周照射三次共四周。GPX1-L-ApSOD预防组在每次UVB照射前1小时涂抹2μg/cm2的GPX1-L-ApSOD(浓度为0.1μg/μL的GPX1-L-ApSOD每平方厘米涂抹20μL);在实验结束后,通过断颈法处死小鼠,之后得到小鼠皮肤组织并浸泡在4%多聚甲醛中过夜,之后包埋在石蜡中以形成组织块。然后使用石蜡切片机将其切成5μm的组织切片。最后用苏木精—伊红(HE)对组织切片进行染色,并在光学显微镜下对皮肤表皮进行观察,采用AxioVision Rel.4.8软件测量皮肤表皮厚度,每组选择3张照片,每组照片在表皮厚度无明显变化处连续测量6个不重叠的表皮厚度,取平均值作为表皮厚度的量化指标。
如图33所示,在120mJ/cm2 UVB诱导的小鼠皮肤光老化模型中,对照组小鼠皮肤表皮厚度为20.06±3.79μm;GPX1-L-ApSOD组小鼠皮肤表皮厚度为21.12±5.55μm;光老化模型组小鼠皮肤表皮厚度为158.7±12.12μm;含2μg/cm2GPX1-L-ApSOD的GPX1-L-ApSOD预防组小鼠皮肤表皮厚度为76.49±11.01μm;相比于光老化模型组,GPX1-L-ApSOD预防组小鼠皮肤表皮厚度显著降低,这表明GPX1-L-ApSOD能有效预防紫外线照射引起的表皮增厚。
实施例35.GPX1-L-ApSOD对UVB诱导的小鼠皮肤氧化应激的预防作用
将五周龄(20-25g)的BALB/c小鼠随机分组饲养在温度适宜的环境中,光照/黑暗周期为12h,小鼠可以自由接触食物和水,先让其适应环境7天。之后将小鼠分为4组,即对照组,GPX1-L-ApSOD组,光老化模型组及GPX1-L-ApSOD预防组。将各组小鼠背部进行脱毛处理,直至皮肤完全暴露,脱毛面积为6~8cm2。对照组每次在UVB照射时,不进行UVB照射直接涂抹生理盐水(20μL/cm2);GPX1-L-ApSOD组每次在UVB照射时,不进行UVB照射直接涂抹2μg/cm2的GPX1-L-ApSOD(浓度为0.1μg/μL的GPX1-L-ApSOD每平方厘米涂抹20μL);光老化模型组利用UVB灯(PL-S 9W/01;荷兰皇家飞利浦电子有限公司,波长范围:300-320nm;峰值:311nm)将脱毛后的小鼠背部置于距紫外光光源垂直距离为5cm的地方进行照射,照射功率为1000μW/cm2,照射时间为2分钟,最终产生120mJ/cm2的能量,一周照射三次共四周。GPX1-L-ApSOD预防组在每次UVB照射前1小时涂抹2μg/cm2的GPX1-L-ApSOD(浓度为0.1μg/μL的GPX1-L-ApSOD每平方厘米涂抹20μL);在实验结束后,通过断颈法处死小鼠,之后得到小鼠皮肤组织并将皮肤组织制备成组织匀浆。通过索莱宝生物公司的过氧化氢测定试剂盒(BC3590),按照说明书所述步骤对小鼠皮肤组织中过氧化氢进行测定。
如图34所示,在120mJ/cm2 UVB诱导的小鼠皮肤光老化模型中,对照组小鼠皮肤中过氧化氢的含量为11.22±1.38(μmol/mg);GPX1-L-ApSOD组小鼠皮肤中过氧化氢的含量为13.77±0.97(μmol/mg);光老化模型组小鼠皮肤中过氧化氢的含量为30.47±1.15(μmol/mg);含2μg/cm2GPX1-L-ApSOD的GPX1-L-ApSOD预防组小鼠皮肤中过氧化氢的含量为17.88±2.07(μmol/mg);相比于光老化模型组,GPX1-L-ApSOD预防组小鼠皮肤中过氧化氢的含量显著降低,这表明GPX1-L-ApSOD能有效预防紫外线照射引起的皮肤氧化应激。
实施例36.GPX1-L-ApSOD对UVB诱导的小鼠皮肤氧化脂质化的预防作用
将五周龄(20-25g)的BALB/c小鼠随机分组饲养在温度适宜的环境中,光照/黑暗周期为12h,小鼠可以自由接触食物和水,先让其适应环境7天。之后将小鼠分为4组,即对照组,GPX1-L-ApSOD组,光老化模型组及GPX1-L-ApSOD预防组。将各组小鼠背部进行脱毛处理,直至皮肤完全暴露,脱毛面积为6~8cm2。对照组每次在UVB照射时,不进行UVB照射直接涂抹生理盐水(20μL/cm2);GPX1-L-ApSOD组每次在UVB照射时,不进行UVB照射直接涂抹2μg/cm2的GPX1-L-ApSOD(浓度为0.1μg/μL的GPX1-L-ApSOD每平方厘米涂抹20μL);光老化模型组利用UVB灯(PL-S 9W/01;荷兰皇家飞利浦电子有限公司,波长范围:300-320nm;峰值:311nm)将脱毛后的小鼠背部置于距紫外光光源垂直距离为5cm的地方进行照射,照射功率为1000μW/cm2,照射时间为2分钟,最终产生120mJ/cm2的能量,一周照射三次共四周。GPX1-L-ApSOD预防组在每次UVB照射前1小时涂抹2μg/cm2的GPX1-L-ApSOD(浓度为0.1μg/μL的GPX1-L-ApSOD每平方厘米涂抹20μL);在实验结束后,通过断颈法处死小鼠,之后得到小鼠皮肤组织并将皮肤组织制备成组织匀浆。通过南京建成公司丙二醛测定试剂盒(A003-4-1),按照说明书所述步骤对皮肤组织中丙二醛进行测定并用丙二醛含量表示。
如图35所示,在120mJ/cm2 UVB诱导的小鼠皮肤光老化模型中,对照组小鼠皮肤中丙二醛(MDA)的含量为2.17±0.75(nmol/mg);GPX1-L-ApSOD组小鼠皮肤中丙二醛(MDA)的含量为2.28±0.85(nmol/mg);光老化模型组小鼠皮肤中丙二醛(MDA)的含量为7.51±1.26(nmol/mg);含2μg/cm2GPX1-L-ApSOD的GPX1-L-ApSOD预防组小鼠皮肤中丙二醛(MDA)的含量为4.68±0.86(nmol/mg);相比于光老化模型组,GPX1-L-ApSOD预防组小鼠皮肤中丙二醛(MDA)的含量显著降低,这表明GPX1-L-ApSOD能有效预防紫外线照射引起的皮肤氧化脂质化。
实施例37.GPX1-L-ApSOD对UVB诱导的小鼠皮肤胶原蛋白流失的预防作用
将五周龄(20-25g)的BALB/c小鼠随机分组饲养在温度适宜的环境中,光照/黑暗周期为12h,小鼠可以自由接触食物和水,先让其适应环境7天。之后将小鼠分为4组,即对照组,GPX1-L-ApSOD组,光老化模型组及GPX1-L-ApSOD预防组。将各组小鼠背部进行脱毛处理,直至皮肤完全暴露,脱毛面积为6~8cm2。对照组每次在UVB照射时,不进行UVB照射直接涂抹生理盐水(20μL/cm2);GPX1-L-ApSOD组每次在UVB照射时,不进行UVB照射直接涂抹2μg/cm2的GPX1-L-ApSOD(浓度为0.1μg/μL的GPX1-L-ApSOD每平方厘米涂抹20μL);光老化模型组利用UVB灯(PL-S 9W/01;荷兰皇家飞利浦电子有限公司,波长范围:300-320nm;峰值:311nm)将脱毛后的小鼠背部置于距紫外光光源垂直距离为5cm的地方进行照射,照射功率为1000μW/cm2,照射时间为2分钟,最终产生120mJ/cm2的能量,一周照射三次共四周。GPX1-L-ApSOD预防组在每次UVB照射前1小时涂抹2μg/cm2的GPX1-L-ApSOD(浓度为0.1μg/μL的GPX1-L-ApSOD每平方厘米涂抹20μL);在实验结束后,通过断颈法处死小鼠,之后得到小鼠皮肤组织并浸泡在4%多聚甲醛中过夜,之后包埋在石蜡中以形成组织块。然后使用石蜡切片机将其切成5μm的组织切片。最后用天狼星红染色液对组织切片进行染色,并在光学显微镜下对皮肤组织中胶原纤维进行观察,使用ImageJ 1.52软件测量各组图片的胶原密度比率。
如图36所示,在120mJ/cm2 UVB诱导的小鼠皮肤光老化模型中,对照组小鼠皮肤中胶原密度比率为100±4.77%;GPX1-L-ApSOD组小鼠皮肤中胶原密度比率为99.68±7.06%;光老化模型组小鼠皮肤中胶原密度比率为58.06±8.13%;含2μg/cm2GPX1-L-ApSOD的GPX1-L-ApSOD预防组小鼠皮肤中胶原密度比率为83.57±7.88%;相比于光老化模型组,GPX1-L-ApSOD预防组小鼠皮肤中胶原密度明显增加,这表明GPX1-L-ApSOD能有效预防紫外线照射引起的皮肤胶原蛋白流失。
实施例38.GPX1-L-ApSOD对UVB诱导的小鼠皮肤损伤的治疗作用
将五周龄(20-25g)的BALB/c小鼠随机分组饲养在温度适宜的环境中,光照/黑暗周期为12h,小鼠可以自由接触食物和水,先让其适应环境7天。之后将小鼠分为4组,即对照组,GPX1-L-ApSOD组,光老化模型组及GPX1-L-ApSOD治疗组(已与图37中的名称一致)。将各组小鼠背部进行脱毛处理,直至皮肤完全暴露,脱毛面积为6~8cm2。对照组每次在UVB照射时,不进行UVB照射直接涂抹生理盐水(20μL/cm2);GPX1-L-ApSOD组每次在UVB照射时,不进行UVB照射直接涂抹2μg/cm2的GPX1-L-ApSOD(浓度为0.1μg/μL的GPX1-L-ApSOD每平方厘米涂抹20μL);光老化模型组利用UVB灯(PL-S 9W/01;荷兰皇家飞利浦电子有限公司,波长范围:300-320nm;峰值:311nm)将脱毛后的小鼠背部置于距紫外光光源垂直距离为5cm的地方进行照射,照射功率为1000μW/cm2,照射时间为2分钟,最终产生120mJ/cm2的能量,一周照射三次共四周。GPX1-L-ApSOD治疗组在每次UVB照射后1小时涂抹2μg/cm2的GPX1-L-ApSOD(浓度为0.1μg/μL的GPX1-L-ApSOD每平方厘米涂抹20μL);在实验结束后,利用数码相机对各组小鼠背部的皮肤进行拍照,观察并分析小鼠背部皮肤的损伤程度。
如图37所示,在120mJ/cm2 UVB诱导的小鼠皮肤光老化模型中,对照组与GPX1-L-ApSOD组小鼠皮肤光滑,无损伤,无褶皱且富有弹性。光老化模型组小鼠皮肤干燥粗糙,有褶皱,无弹性且出现红斑炎症。相比于光老化模型组,含2μg/cm2GPX1-L-ApSOD的GPX1-L-ApSOD治疗组小鼠皮肤损伤现象明显减轻,皮肤褶皱明显减少且恢复弹性,这表明GPX1-L-ApSOD能有效治疗紫外线照射引起的皮肤损伤。
实施例39.GPX1-L-ApSOD对UVB诱导的小鼠皮肤表皮增厚的治疗作用
将五周龄(20-25g)的BALB/c小鼠随机分组饲养在温度适宜的环境中,光照/黑暗周期为12h,小鼠可以自由接触食物和水,先让其适应环境7天。之后将小鼠分为4组,即对照组,GPX1-L-ApSOD组,光老化模型组及GPX1-L-ApSOD治疗组。将各组小鼠背部进行脱毛处理,直至皮肤完全暴露,脱毛面积为6~8cm2。对照组每次在UVB照射时,不进行UVB照射直接涂抹生理盐水(20μL/cm2);GPX1-L-ApSOD组每次在UVB照射时,不进行UVB照射直接涂抹2μg/cm2的GPX1-L-ApSOD(浓度为0.1μg/μL的GPX1-L-ApSOD每平方厘米涂抹20μL);光老化模型组利用UVB灯(PL-S 9W/01;荷兰皇家飞利浦电子有限公司,波长范围:300-320nm;峰值:311nm)将脱毛后的小鼠背部置于距紫外光光源垂直距离为5cm的地方进行照射,照射功率为1000μW/cm2,照射时间为2分钟,最终产生120mJ/cm2的能量,一周照射三次共四周。GPX1-L-ApSOD治疗组在每次UVB照射后1小时涂抹2μg/cm2的GPX1-L-ApSOD(浓度为0.1μg/μL的GPX1-L-ApSOD每平方厘米涂抹20μL);在实验结束后,通过断颈法处死小鼠,之后得到小鼠皮肤组织并浸泡在4%多聚甲醛中过夜,之后包埋在石蜡中以形成组织块。然后使用石蜡切片机将其切成5μm的组织切片。最后用苏木精—伊红(HE)对组织切片进行染色,并在光学显微镜下对皮肤表皮进行观察,采用AxioVision Rel.4.8软件测量皮肤表皮厚度,每组选择3张照片,每组照片在表皮厚度无明显变化处连续测量6个不重叠的表皮厚度,取平均值作为表皮厚度的量化指标。
如图38所示,在120mJ/cm2 UVB诱导的小鼠皮肤光老化模型中,对照组小鼠皮肤表皮厚度为19.46±2.89μm;GPX1-L-ApSOD组小鼠皮肤表皮厚度为22.88±6.06μm;光老化模型组小鼠皮肤表皮厚度为146.5±8.79μm;含2μg/cm2GPX1-L-ApSOD的GPX1-L-ApSOD治疗组小鼠皮肤表皮厚度为80.6±9.76μm;相比于光老化模型组,GPX1-L-ApSOD治疗组小鼠皮肤表皮厚度显著降低,这表明GPX1-L-ApSOD能有效治疗紫外线照射引起的表皮增厚。
实施例40.GPX1-L-ApSOD对UVB诱导的小鼠皮肤氧化应激的治疗作用
将五周龄(20-25g)的BALB/c小鼠随机分组饲养在温度适宜的环境中,光照/黑暗周期为12h,小鼠可以自由接触食物和水,先让其适应环境7天。之后将小鼠分为4组,即对照组,GPX1-L-ApSOD组,光老化模型组及GPX1-L-ApSOD治疗组。将各组小鼠背部进行脱毛处理,直至皮肤完全暴露,脱毛面积为6~8cm2。对照组每次在UVB照射时,不进行UVB照射直接涂抹生理盐水(20μL/cm2);GPX1-L-ApSOD组每次在UVB照射时,不进行UVB照射直接涂抹2μg/cm2的GPX1-L-ApSOD(浓度为0.1μg/μL的GPX1-L-ApSOD每平方厘米涂抹20μL);光老化模型组利用UVB灯(PL-S 9W/01;荷兰皇家飞利浦电子有限公司,波长范围:300-320nm;峰值:311nm)将脱毛后的小鼠背部置于距紫外光光源垂直距离为5cm的地方进行照射,照射功率为1000μW/cm2,照射时间为2分钟,最终产生120mJ/cm2的能量,一周照射三次共四周。GPX1-L-ApSOD治疗组在每次UVB照射后1小时涂抹2μg/cm2的GPX1-L-ApSOD(浓度为0.1μg/μL的GPX1-L-ApSOD每平方厘米涂抹20μL);在实验结束后,通过断颈法处死小鼠,之后得到小鼠皮肤组织并将皮肤组织制备成组织匀浆。通过索莱宝生物公司的过氧化氢测定试剂盒(BC3590),按照说明书所述步骤对小鼠皮肤组织中过氧化氢进行测定。
如图39所示,在120mJ/cm2 UVB诱导的小鼠皮肤光老化模型中,对照组小鼠皮肤中过氧化氢的含量为10.97±1.08(μmol/mg);GPX1-L-ApSOD组小鼠皮肤中过氧化氢的含量为12.79±0.86(μmol/mg);光老化模型组小鼠皮肤中过氧化氢的含量为33.77±6.05(μmol/mg);含2μg/cm2GPX1-L-ApSOD的GPX1-L-ApSOD治疗组小鼠皮肤中过氧化氢的含量为21.76±2.01(μmol/mg);相比于光老化模型组,GPX1-L-ApSOD治疗组小鼠皮肤中过氧化氢的含量显著降低,这表明GPX1-L-ApSOD能有效治疗紫外线照射引起的皮肤氧化应激。
实施例41.GPX1-L-ApSOD对UVB诱导的小鼠皮肤氧化脂质化的治疗作用
将五周龄(20-25g)的BALB/c小鼠随机分组饲养在温度适宜的环境中,光照/黑暗周期为12h,小鼠可以自由接触食物和水,先让其适应环境7天。之后将小鼠分为4组,即对照组,GPX1-L-ApSOD组,光老化模型组及GPX1-L-ApSOD治疗组。将各组小鼠背部进行脱毛处理,直至皮肤完全暴露,脱毛面积为6~8cm2。对照组每次在UVB照射时,不进行UVB照射直接涂抹生理盐水(20μL/cm2);GPX1-L-ApSOD组每次在UVB照射时,不进行UVB照射直接涂抹2μg/cm2的GPX1-L-ApSOD(浓度为0.1μg/μL的GPX1-L-ApSOD每平方厘米涂抹20μL);光老化模型组利用UVB灯(PL-S 9W/01;荷兰皇家飞利浦电子有限公司,波长范围:300-320nm;峰值:311nm)将脱毛后的小鼠背部置于距紫外光光源垂直距离为5cm的地方进行照射,照射功率为1000μW/cm2,照射时间为2分钟,最终产生120mJ/cm2的能量,一周照射三次共四周。GPX1-L-ApSOD治疗组在每次UVB照射后1小时涂抹2μg/cm2的GPX1-L-ApSOD(浓度为0.1μg/μL的GPX1-L-ApSOD每平方厘米涂抹20μL);在实验结束后,通过断颈法处死小鼠,之后得到小鼠皮肤组织并将皮肤组织制备成组织匀浆。通过南京建成公司丙二醛测定试剂盒(A003-4-1),按照说明书所述步骤对皮肤组织中丙二醛进行测定并用丙二醛含量表示。
如图40所示,在120mJ/cm2 UVB诱导的小鼠皮肤光老化模型中,对照组小鼠皮肤中丙二醛(MDA)的含量为2.29±0.99(nmol/mg);GPX1-L-ApSOD组小鼠皮肤中丙二醛(MDA)的含量为2.56±0.88(nmol/mg);光老化模型组小鼠皮肤中丙二醛(MDA)的含量为8.66±1.08(nmol/mg);含2μg/cm2GPX1-L-ApSOD的GPX1-L-ApSOD治疗组小鼠皮肤中丙二醛(MDA)的含量为6.07±0.79(nmol/mg);相比于光老化模型组,GPX1-L-ApSOD治疗组小鼠皮肤中丙二醛(MDA)的含量显著降低,这表明GPX1-L-ApSOD能有效治疗紫外线照射引起的皮肤氧化脂质化。
实施例42.GPX1-L-ApSOD对UVB诱导的小鼠皮肤胶原蛋白流失的治疗作用
将五周龄(20-25g)的BALB/c小鼠随机分组饲养在温度适宜的环境中,光照/黑暗周期为12h,小鼠可以自由接触食物和水,先让其适应环境7天。之后将小鼠分为4组,即对照组,GPX1-L-ApSOD组,光老化模型组及GPX1-L-ApSOD治疗组。将各组小鼠背部进行脱毛处理,直至皮肤完全暴露,脱毛面积为6~8cm2。对照组每次在UVB照射时,不进行UVB照射直接涂抹生理盐水(20μL/cm2);GPX1-L-ApSOD组每次在UVB照射时,不进行UVB照射直接涂抹2μg/cm2的GPX1-L-ApSOD(浓度为0.1μg/μL的GPX1-L-ApSOD每平方厘米涂抹20μL);光老化模型组利用UVB灯(PL-S 9W/01;荷兰皇家飞利浦电子有限公司,波长范围:300-320nm;峰值:311nm)将脱毛后的小鼠背部置于距紫外光光源垂直距离为5cm的地方进行照射,照射功率为1000μW/cm2,照射时间为2分钟,最终产生120mJ/cm2的能量,一周照射三次共四周。GPX1-L-ApSOD治疗组在每次UVB照射后1小时涂抹2μg/cm2的GPX1-L-ApSOD(浓度为0.1μg/μL的GPX1-L-ApSOD每平方厘米涂抹20μL);在实验结束后,通过断颈法处死小鼠,之后得到小鼠皮肤组织并浸泡在4%多聚甲醛中过夜,之后包埋在石蜡中以形成组织块。然后使用石蜡切片机将其切成5μm的组织切片。最后用天狼星红染色液对组织切片进行染色,并在光学显微镜下对皮肤组织中胶原纤维进行观察,使用ImageJ 1.52软件测量各组图片的胶原密度比率。
如图41所示,在120mJ/cm2 UVB诱导的小鼠皮肤光老化模型中,对照组小鼠皮肤中胶原密度比率为100±6.17%;GPX1-L-ApSOD组小鼠皮肤中胶原密度比率为101.02±5.99%;光老化模型组小鼠皮肤中胶原密度比率为59.99±5.1%;含2μg/cm2GPX1-L-ApSOD的GPX1-L-ApSOD治疗组小鼠皮肤中胶原密度比率为79.88±5.79%;相比于光老化模型组,GPX1-L-ApSOD治疗组小鼠皮肤中胶原密度明显增加,这表明GPX1-L-ApSOD能有效治疗紫外线照射引起的皮肤胶原蛋白流失。
Claims (8)
1.重组谷胱甘肽过氧化物酶在制备预防皮肤表皮细胞损伤的防晒剂中的应用。
2.重组谷胱甘肽过氧化物酶在制备治疗皮肤表皮细胞损伤的晒后修复剂中的应用。
3.重组兼备谷胱甘肽过氧化物酶和超氧化物歧化酶活性的双功能抗氧化酶在制备预防皮肤表皮细胞损伤的防晒剂中的应用。
4.重组兼备谷胱甘肽过氧化物酶和超氧化物歧化酶活性的双功能抗氧化酶在制备治疗皮肤表皮细胞损伤的晒后修复剂中的应用。
5.重组谷胱甘肽过氧化物酶在制备预防皮肤老化的防晒剂或抗衰老化妆品中的应用。
6.重组谷胱甘肽过氧化物酶在制备治疗皮肤老化的晒后修复剂或抗衰老化妆品中的应用。
7.重组兼备谷胱甘肽过氧化物酶和超氧化物歧化酶活性的双功能抗氧化酶在制备预防皮肤老化的防晒剂或抗衰老化妆品中的应用。
8.重组兼备谷胱甘肽过氧化物酶和超氧化物歧化酶活性的双功能抗氧化酶在制备治疗皮肤老化的晒后修复剂或抗衰老化妆品中的应用。
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