CN107177561A - 兼具谷胱甘肽过氧化物酶和超氧化物歧化酶活性的双功能抗氧化酶及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
一种兼具谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)和超氧化物歧化酶(SOD)活性的双功能抗氧化酶及其制备方法，属于生物技术领域。涉及序列SEQ ID No:1～26，其由GPX和SOD两种酶的氨基酸序列组成，既能分解SOD的底物，又能分解GPX的底物。先用基因合成法获得杂合tRNA基因，再合成或扩增GPX和SOD基因，将两者组装到同一个能够表达杂合tRNA的分泌型原核表达载体上，转化TAG工程菌，在亚硒酸钠存在下诱导表达，通过常规氨基酸进入肽链的方式将GPX的催化基团Sec引入到蛋白的底物结合部位，赋予其高的GPX和SOD活性。本发明方法简单，酶蛋白活力和产量高、稳定性好，具有高效的抗氧化功能。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种兼具谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)和超氧化物歧化酶(SOD)活性的双功能抗氧化酶及其制备方法。
背景技术
活性氧(ROS)是机体氧代谢的副产物，正常生理状态下，ROS的产生和消除处于动态平衡状态，从而维持机体氧化和抗氧化的相对平衡。然而，随着生态恶化、环境污染及现代化生活不规律的程度日趋加深，多种内在及外在因素导致ROS的过量产生，当过多的ROS不能及时清除，与之相伴的疾病也愈加严重和高发，对人类的健康造成严重威胁。
机体针对活性氧的酶学防御系统主要包括超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)和谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)。GPX在该体系中发挥着重要的作用，它以底物GSH为还原剂，分解体内的过氧化氢和各类氢过氧化物，因而能清除体内多种活性氧(ROS)，防止脂质过氧化，治疗由活性氧引起的各种疾病，如衰老、紫外线辐射、心脑血管疾病、白内障、肿瘤等。与其它抗氧化酶不同，GPX除了能清除ROS外，还能降解脂质过氧化物，防止细胞过氧化损伤，这种独特的保护细胞的功能使它在抗氧化酶体系中占有特别重要的位置。然而，由于天然GPX的催化基团是硒代半胱氨酸(SeCys)，而且来源有限、稳定性差，致使它的人工产物及其模拟物的研究备受关注。SOD是超氧阴离子(O2 ·-)的唯一清除剂，能转化O2 ·-为过氧化氢(H2O2)，继而被CAT、GPX等将其分解为水(H2O)，从而使有害的O2 ·-和H2O2转化为无害的水分子。如果抗氧化酶的协同作用被破坏，可将ROS的损伤效应放大，从而引发多种疾病。根据这些酶在清除ROS时的协同作用，获得兼具GPX和SOD两种抗氧化功能于一体的双功能抗氧化酶，相比单一抗氧化酶，更有利于清除活性氧，发挥其巨大的应用价值。
中国专利201110287018.0公开的方法是制备一种兼具SOD和GPX活性的65肽，是将SOD和GPX活性中心的结构域整合而形成的小分子双功能模拟酶，正象其说明书中显示的那样，其GPX活力831U/umol远低于天然GPX 57801U/umol的活力。中国专利201310302778.3、201310142866.1和201510431360.1公开的方法在活力上取得了突破性进展，但其只能用于制备高活力的各型单功能GPX及其突变体，不包括双功能抗氧化酶及其制备方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种兼具谷胱甘肽过氧化物酶和超氧化物歧化酶活性的双功能抗氧化酶的氨基酸序列并用中国专利201510431360.1公开的人工合成的能通读UAG为硒代半胱氨酸的杂合tRNA和特殊的工程菌制备该双功能抗氧化酶。本发明涉及序列SEQID No:1～26，其由GPX和SOD两种酶的氨基酸序列组成，既能分解SOD的底物，又能分解GPX的底物。先用基因合成法获得杂合tRNA基因，再合成或扩增GPX和SOD基因，将两者组装到同一个能够表达杂合tRNA的分泌型原核表达载体上，转化TAG工程菌，在亚硒酸钠存在下诱导表达，通过常规氨基酸进入肽链的方式将GPX的催化基团Sec引入到蛋白的底物结合部位，赋予其高的GPX和SOD活性。本发明方法简单，酶蛋白活力和产量高、稳定性好，具有高效的抗氧化功能。
本发明应用基因工程技术、原核细胞培养技术，以基因组中所有UAG终止密码子被UAA终止密码子替代及删除释放因子RF 1的大肠杆菌为表达系统，利用人工合成的杂合tRNA编码UAG终止密码子为硒代半胱氨酸(硒代半胱氨酸)，从而通过常规氨基酸进入肽链的方式实现硒代半胱氨酸在谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)的活性中心定点插入和高活力兼具GPX和SOD活性的双功能抗氧化酶的高效表达。本方法可以在避开原核生物编码硒代半胱氨酸的复杂机制及低效率等缺点，发挥原核生物便于基因操作、高效表达外源基因和培养成本低等优点，为兼具GPX和SOD活性的双功能酶等具有药用价值的硒蛋白提供简单、高效的制备方法。本发明方法在日化品生产和生物制药方面具有广阔的应用前景。
本发明使用中国专利201510431360.1公开的杂合tRNA作为搬运RNA，制备高活力兼具GPX和SOD活性的双功能抗氧化酶。这些杂合tRNA是以大肠杆菌丝氨酸的tRNA的编码序列serT(参见NCBI，Gene ID:944826，编码tRNAser UGA)和硒代半胱氨酸的tRNA编码序列SelC(参见NCBI，Gene ID:948167，编码tRNAsec)为模板，通过计算机辅助的序列分析和基因合成，得到一种能够编码琥珀型终止密码子UAG为硒代半胱氨酸的杂合tRNAUA CUA，其由90个碱基组成，与大肠杆菌tRNAsec相比较，其既能够作为硒代半胱氨酸合成的底物tRNA，又能够被大肠杆菌自身的延伸因子EF-Tu识别，从而通过常规氨基酸进入肽链的方式实现硒代半胱氨酸在UAG密码子处的定点编码与插入。利用此杂合tRNA在UAG通读表达系统中能高效表达高活力兼具GPX和SOD活性的双功能抗氧化酶，所述的杂合tRNAUA CUA的一级核苷酸序列如SEQID No：1所示：
进一步，所述的杂合tRNA的具体核苷酸序列还包括将序列1(SEQ ID No：1)第72位碱基A突变为其它三种碱基C、U、G中的任何一个所形成的新型杂合tRNA，其序列如SEQ IDNo：2、SEQ ID No：3、SEQ ID No：4所示。
进一步，所述的杂合tRNA的具体碱基序列还包括，将序列1-4(SEQ ID No：1、SEQID No：2、SEQ ID No：3、SEQ ID No：4)中第8位碱基G突变为C、第79位碱基C突变为G所形成的任何一种新型杂合tRNA，其序列如SEQ ID No：5、SEQ ID No：6、SEQ ID No：7、SEQ ID No：8所示。
进一步，所述的杂合tRNA的具体碱基序列还包括，将序列1-8(SEQ ID No：1、SEQID No：2、SEQ ID No：3、SEQ ID No：4、SEQ ID No：5、SEQ ID No：6、SEQ ID No：7、SEQ IDNo：8)中第62位碱基G突变为U、第78位碱基U突变为A和第64位碱基A突变为C、第76位碱基U突变为G所形成的任何一种新型杂合tRNA，其序列如SEQ ID No：9、SEQ ID No：10、SEQ IDNo：11、SEQ ID No：12、SEQ ID No：13、SEQ ID No：14、SEQ ID No：15、SEQ ID No：16所示。
本发明所述的兼具GPX和SOD活性的双功能抗氧化酶是将GPX和SOD的氨基酸序列中间插入一段特殊的连接短肽而形成的具有新的氨基酸序列与组成的新型抗氧化酶GPX-L-SOD，其氨基酸序列如SEQ ID No：17所示(实施例1-17)。
进一步，所述的兼具GPX和SOD活性的双功能抗氧化酶的具体氨基酸序列还包括，将SEQ ID No：17中SOD的氨基酸序列提前，而GPX的氨基酸序列移到连接肽之后所形成的SOD-L-GPX，其氨基酸序列如SEQ ID No：18所示(实施例18)。
进一步，所述的兼具GPX和SOD活性的双功能抗氧化酶的具体氨基酸序列还包括，将SEQ ID No：17中第204-229位氨基酸中的任何一个或几个去掉或替换后所形成的新氨基酸序列。比如将第229位氨基酸去掉所形成的新序列如SEQ ID No：19所示(实施例19)。
进一步，所述的兼具GPX和SOD活性的双功能抗氧化酶的具体氨基酸序列还包括，将SEQ ID No：17中第2-13位氨基酸中的任何一个或几个去掉后所形成的新氨基酸序列。比如将第2-13位氨基酸全部去掉所形成的新序列如SEQ ID No：20所示(实施例20)。
进一步，所述的兼具GPX和SOD活性的双功能抗氧化酶的具体氨基酸序列还包括，将SEQ ID No：18中第181-192位氨基酸中的任何一个或几个去掉后所形成的新氨基酸序列。比如将第181-192位氨基酸全部去掉所形成的新序列如SEQ ID No：21所示(实施例21)。
进一步，所述的兼具GPX和SOD活性的双功能抗氧化酶的具体氨基酸序列还包括，由于使用了便于靶蛋白纯化的pColdI(TAKARA公司)等分泌型原核或真核表达载体而在上述氨基酸序列的氨基端或羧基端引入该载体上的组氨酸纯化标签和其它的氨基酸等所形成的任何一个新型GPX-L-SOD或SOD-L-GPX。比如在序列SEQ ID No：17、SEQ ID No：18、SEQID No：19、SEQ ID No：20、SEQ ID No：21的氨基端引入pColdI(TAKARA公司)原核表达载体的组氨酸纯化标签和凝血因子Xa切割位点的氨基酸后所形成的序列如SEQ ID No：22、SEQID No：23和SEQ ID No：24、SEQ ID No：25、SEQ ID No：26所示(实施例22-26)。
本发明所述的用中国专利201510431360.1公开的杂合tRNA制备高活力兼具GPX和SOD活性的双功能抗氧化酶，包括如下2种方法：
方法1：
先合成杂合tRNA及其上下游的启动子和终止子对应的基因序列，组装到分泌型原核表达载体的多克隆位点以外的合适位置，再合成需要表达的靶基因并组装到该分泌型原核表达载体的多克隆位点上，转化UAG通读工程菌(或普通表达工程菌)，通过杂合tRNA通读UAG为硒代半胱氨酸，从而用常规氨基酸进入肽链的方式将GPX的催化基团硒代半胱氨酸引入到底物结合部位，所表达蛋白上既有GPX和SOD的底物结合部位，又有GPX和SOD的催化基团和催中心，结果同时赋予其极高的GPX和SOD活性，就产生了高活力的兼具GPX和SOD活性的双功能抗氧化酶。
方法2：
先合成杂合tRNA及其上下游的启动子和终止子对应的基因序列，组装到分泌型原核表达载体的多克隆位点以外的合适位置，再用PCR法扩增需要表达的GPX和SOD基因及其两者中间的连接短肽L，组装到该分泌型原核表达载体的多克隆位点上，并用基因突变法将GPX中硒代半胱氨酸的编码序列突变为TAG，转化UAG通读工程菌(或普通表达工程菌)，通过杂合tRNA通读UAG为硒代半胱氨酸，从而用常规氨基酸进入肽链的方式将GPX的催化基团硒代半胱氨酸引入到底物结合部位，所表达蛋白上既有GPX和SOD的底物结合部位，又有GPX和SOD的催化基团和催中心，结果同时赋予其极高的GPX和SOD活性，就产生了高活力的兼具GPX和SOD活性的双功能抗氧化酶。
本发明的第一种方法是先在生物公司用DNA合成仪人工合成本发明所述的tRNA的编码基因和GPX-L-SOD或SOD-L-GPX基因，构建至能表达tRNA和GPX-L-SOD或SOD-L-GPX基因的原核分泌型表达载体上，在UAG通读工程菌C321.ΔA.exp(Addgene Cat.#49018)菌株中合成并携带Sec至UAG密码子处，实现GPX-L-SOD或SOD-L-GPX的直接通读表达。
1)、载体的构建：根据中国专利201510431360.1公开的杂合tRNA的碱基序列SEQID No：1、SEQ ID No：2、SEQ ID No：3、SEQ ID No：4、SEQ ID No：5、SEQ ID No：6、SEQ IDNo：7、SEQ ID No：8、SEQ ID No：9、SEQ ID No：10、SEQ ID No：11、SEQ ID No：12、SEQ IDNo：13、SEQ ID No：14、SEQ ID No：15或SEQ ID No：16，在生物公司用DNA合成仪人工合成对应的编码基因，确保杂合tRNA基因的5′端含有lpp启动子序列和特定的酶切位点，3′端含有rrnc终止子序列和特定酶切位点；用相同的限制性核酸内切酶切割两端含特定酶切位点的杂合tRNA基因和用来表达该杂合tRNA的分泌型原核表达载体(如pCold系列等)，再用DNA连接酶通过特定的酶切位点将杂合tRNA基因组装到分泌型原核表达载体的多克隆位点以外，得到含有杂合tRNA的分泌型原核表达载体(如pCold-tRNA等)；所述的特定的酶切位点可以是表达载体的多克隆位点以外序列含有的而杂合tRNA基因中不存在的任何一个酶切位点，是载体上固有的由限制性核酸内切酶识别的碱基组成的DNA序列；
目的基因序列是将GPX-L-SOD或SOD-L-GPX(氨基酸序列如SEQ ID No：17、SEQ IDNo：18、SEQ ID No：19、SEQ ID No：20、SEQ ID No：21或SEQ ID No：22、SEQ ID No：23、SEQID No：24、SEQ ID No：25、SEQ ID No：26)基因中硒代半胱氨酸的编码序列替换为琥珀型终止密码子TAG后的基因，在生物公司用DNA合成仪人工合成该目的基因序列对应的编码基因，确保两端都含有特定的酶切位点；用相同的限制性核酸内切酶切割两端含特定酶切位点的GPX-L-SOD或SOD-L-GPX基因和上步获得的含有杂合tRNA的分泌型原核表达载体(如pCold-tRNA等)，再用DNA连接酶通过特定的酶切位点将GPX-L-SOD或SOD-L-GPX基因组装到该分泌型原核表达载体的多克隆位点上；所述的特定的酶切位点可以是表达载体的多克隆位点中含有的而GPX-L-SOD或SOD-L-GPX基因中不存在的任何一个酶切位点，是载体上固有的由限制性核酸内切酶识别的碱基组成的DNA序列；
2)、阳性转化子的筛选及蛋白的表达与纯化：
用步骤1)中构建的含有杂合tRNA基因的和编码序列中含TAG的目的基因的表达载体转化UAG通读工程菌-C321.ΔA.exp(Addgene Cat.#49018)的感受态细胞，涂含氨苄抗性的营养琼脂平板，筛选阳性菌株；将阳性转化子扩大培养后，在含有亚硒酸钠的营养琼脂培养基中，经IPTG低温4～25℃诱导表达，在杂合tRNA的识别下，将UAG编码为硒代半胱氨酸，直接表达出在底物GSH的结合部位含有硒代半胱氨酸的GPX突变体，酶蛋白以可溶性形式表达并分泌到菌体的周质腔里；抗性筛选获得的菌株经37℃扩大培养后，转至4～25℃诱导表达；收集、洗涤、冰浴下超声破碎菌体、释放酶蛋白，将液体低温离心，去除菌体沉淀、获得上清液；用谷胱甘肽(GSH)亲和层析纯化GPX-L-SOD或SOD-L-GPX蛋白，透析冻干后即得本发明所述的高活力GPX-L-SOD或SOD-L-GPX蛋白纯品。用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和蛋白印迹(Western blot)鉴定目标蛋白。
该方法在UAG通读原核表达系统中，通过杂合tRNA携带Sec到UAG密码子处，在重组GPX的底物结合部位引入了催化基团，因而产生高活力的兼具GPX和SOD活性的双功能抗氧化酶蛋白。
所述的用谷胱甘肽(GSH)亲和层析纯化GPX-L-SOD或SOD-L-GPX蛋白，是用pH7.5、50mmol/L Tris-Cl平衡并洗脱杂蛋白，用含10mmol/L GSH的缓冲液洗脱目的蛋白。
所述的将液体低温离心，是在4℃、8000～12000g条件下离心15～30min。
本发明的第二种方法是先在生物公司用DNA合成仪人工合成本发明所述的tRNA的编码基因，再利用PCR扩增法获取GPX、L和SOD编码基因，构建至能表达tRNA和GPX-L-SOD或SOD-L-GPX基因的原核分泌型表达载体上之后，再通过定点突变将GPX-L-SOD或SOD-L-GPX基因中硒代半胱氨酸的编码序列突变为TAG，最后在UAG通读工程菌C321.ΔA.exp(AddgeneCat.#49018)菌株中合成并携带Sec至UAG密码子处，实现GPX-L-SOD或SOD-L-GPX的直接通读表达。
1)、表达载体的构建：
根据中国专利201510431360.1公开的杂合tRNA的碱基序列SEQ ID No：1、SEQ IDNo：2、SEQ ID No：3、SEQ ID No：4、SEQ ID No：5、SEQ ID No：6、SEQ ID No：7、SEQ ID No：8、SEQ ID No：9、SEQ ID No：10、SEQ ID No：11、SEQ ID No：12、SEQ ID No：13、SEQ ID No：14、SEQ ID No：15或SEQ ID No：16，在生物公司用DNA合成仪人工合成对应的编码基因，确保杂合tRNA基因的5′端含有lpp启动子序列和特定的酶切位点，3′端含有rrnc终止子序列和特定酶切位点；用相同的限制性核酸内切酶切割两端含特定酶切位点的杂合tRNA基因和用来表达该杂合tRNA的分泌型原核表达载体(如pCold系列等)，再用DNA连接酶通过特定的酶切位点将杂合tRNA基因组装到分泌型原核表达载体的多克隆位点以外，得到含有杂合tRNA的分泌型原核表达载体(如pCold-tRNA等)；所述的特定的酶切位点可以是表达载体的多克隆位点以外序列含有的而杂合tRNA基因中不存在的任何一个酶切位点，是载体上固有的由限制性核酸内切酶识别的碱基组成的DNA序列；
根据基因文库中公开的GPX和SOD的基因序列(参见NCBI,NM_000581.2、NM_002083.3、NM_002084.3、NM_002085.3、EU178106.1等)设计引物，扩增其编码基因，在设计引物时，确保GPX基因的5′端含有起始密码子(ATG)，3′端不含终止密码子，但含有GPX-L-SOD中间的连接肽基因序列，SOD基因的5′端引物有一部分与GPX基因的3′端引物重合，SOD基因的3′端含终止密码子，且GPX-L-SOD基因两端都含有特定的酶切位点，其它氨基酸序列不变；用重叠PCR扩增GPX-L-SOD基因，回收分子量最大的产物片段即为GPX-L-SOD基因；同理可获得SOD-L-GPX基因；用相同的限制性核酸内切酶切割GPX-L-SOD或SOD-L-GPX基因和上步获得的含有杂合tRNA的分泌型原核表达载体(如pCold-tRNA等)，再用DNA连接酶通过特定的酶切位点将GPX-L-SOD或SOD-L-GPX基因组装到该分泌型原核表达载体的多克隆位点上；在保持其它氨基酸序列不变的前提下，根据GPX中唯一的硒代半胱氨酸和它比邻的氨基酸的基因序列设计完全等长互补的两条定点突变引物，以硒代半胱氨酸的密码子为中心，引物长25-50bp，用定点突变引物和快速定点突变试剂盒，将构建在原核表达载体上的GPX-L-SOD或SOD-L-GPX基因中的硒代半胱氨酸的编码序列突变为TAG，且无其它意外基因突变发生，确保突变后的基因能在UAG通读工程菌株中表达本发明所述的GPX-L-SOD或SOD-L-GPX酶蛋白；所述的特定的酶切位点可以是表达载体的多克隆位点中含有的而GPX-L-SOD或SOD-L-GPX基因中不存在的任何一个酶切位点，是载体上固有的由限制性核酸内切酶识别的碱基组成的DNA序列；
2)、阳性转化子的筛选及蛋白的表达与纯化：
用步骤1)中构建的含有杂合tRNA基因的和编码序列中含TAG的目的基因的表达载体转化UAG通读工程菌-C321.ΔA.exp(Addgene Cat.#49018)的感受态细胞，涂含氨苄抗性的营养琼脂平板，筛选阳性菌株；将阳性转化子扩大培养后，在含有亚硒酸钠的营养琼脂培养基中，经IPTG低温4～25℃诱导表达，UAG通读工程菌无法终止UAG密码子，在杂合tRNA的识别下，将UAG编码为硒代半胱氨酸，直接表达出在底物GSH的结合部位含有硒代半胱氨酸的GPX-L-SOD或SOD-L-GPX，酶蛋白以可溶性形式表达并分泌到菌体的周质腔里；抗性筛选获得的菌株经37℃扩大培养后，转至4～25℃诱导表达；收集、洗涤、冰浴下超声破碎菌体、释放酶蛋白，将液体低温离心，去除菌体沉淀、获得上清液；用谷胱甘肽(GSH)亲和层析纯化GPX-L-SOD或SOD-L-GPX蛋白，透析冻干后即得GPX-L-SOD或SOD-L-GPX蛋白纯品。用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和蛋白印迹(Western blot)鉴定目标蛋白。
该方法在UAG通读原核表达系统中，通过杂合tRNA携带Sec到UAG密码子处，在重组GPX-L-SOD或SOD-L-GPX的底物结合部位引入了催化基团，因而产生高活力的GPX-L-SOD或SOD-L-GPX酶蛋白。
所述的用谷胱甘肽(GSH)亲和层析纯化GPX-L-SOD或SOD-L-GPX蛋白，是用pH7.5、50mmol/L Tris-Cl平衡并洗脱杂蛋白，用含10mmol/L GSH的缓冲液洗脱目的蛋白。
所述的将液体低温离心，是在4℃、8000～-12000g条件下离心15-30min。
本发明具有以下特点：
(1)本发明方法制备的GPX-L-SOD或SOD-L-GPX双功能酶蛋白活力高，解决了SOD分解超氧阴离子过程中，由于局部产生的过氧化氢浓度过高而导致的蛋白、DNA和细胞膜损伤，细胞生物学实验已证实其对过氧化氢和紫外线损伤的皮肤和心肌细胞有更强的保护作用。
(2)本发明使用简单的基因合成或扩增、基因突变和原核表达等基因工程技术，实现了与20种常规氨基酸相同的方式将硒代半胱氨酸插入到GPX-L-SOD或SOD-L-GPX的活性部位，不仅制备方法简单，而且解决了双功能抗氧化酶来源有限的问题。
(3)本发明所述的GPX-L-SOD或SOD-L-GPX的抗氧化能力显著高于以往报道的单功能GPX、SOD和兼具两者活性的双功能模拟酶。
(4)本发明使用的分泌型表达载体，能将GPX-L-SOD或SOD-L-GPX酶蛋白以可溶性形式表达并分泌到大肠杆菌的周质腔，引导蛋白分泌表达的前导信号肽由菌体自动切除，所表达的蛋白为可溶性，具有天然蛋白的空间构象和更高的活性，不需复性，可避免包涵体复性过程造成的产率下降和失活，因而生产周期短。
(5)本发明通过新型杂合tRNA与UAG通读工程菌联合应用，通过常规氨基酸进入肽链的方式实现硒代半胱氨酸在UAG密码子处的定点编码与插入，从而提高通读效率和产率，因此具有高效高产的双重优势。
这些优点均有利于大规模生产，为今后的实际应用打下了坚实的基础，解决了天然双功能抗氧化酶来源不足、性质不稳定和活力低的问题，在生物制药方面有广阔的应用前景。
附图说明：
图1：实施例1-13制备的GPX1的SDS-PAGE和(上)和Western blot(下)结果：其中M是蛋白分子量Marker，1-13泳道是实施例1-13制备的靶蛋白。
图2：实施例14-26制备的GPX1的SDS-PAGE和(上)和Western blot(下)结果：其中M是蛋白分子量Marker，14-26泳道是实施例14-26制备的靶蛋白。
具体实施方式
实施例1：用合成的杂合tRNA序列1和靶基因联合UAG通读原核表达系统制备基因工程人GPX1-L-ApSOD蛋白
根据中国专利201510431360.1公开的杂合tRNA序列1(SEQ ID No：1)所述的tRNA碱基序列，在生物公司用DNA合成仪人工合成能在UAG通读工程菌株中表达序列1(SEQ IDNo：1)所述杂合tRNA的基因序列，确保杂合tRNA基因的5′端含有lpp启动子序列和ClaI酶切位点，3′端含有rrnc终止子序列和ClaI酶切位点，合成杂合tRNA序列1(SEQ ID No：1)的基因序列如下：
CCATCGATCCCATCAAAAAAATATTCTCAACATAAAAAACTTTGTGTAATACTTGTAACGCTGAATTCGGAAGATGTGGCCGAGCGGTTGAAGGCACCGGTCTCTAAAACCGGCGACCCGAAAGGGTTCGCAGGTTCGAATCCTGTCATCTTCCGCCAGGATCCTCTAGAGTCGACCTGCAGATCCTTAGCGAAAGCTAAGGATTTTTTTT ATCGATGG；用限制性核酸内切酶ClaI单酶切杂合tRNA的基因后，连接到同样用ClaI单酶切的pCold III载体上(TAKARA,Cat.#3369，ClaI为pCold III多克隆位点以外的单独存在酶切位点，在该处插入外源序列不影响载体本身其他功能)，所获得的载体为pCold III-tRNA。
在生物公司用DNA合成仪人工合成能在UAG通读工程菌株(C321.ΔA.exp)中通读表达的GPX1-L-APSOD基因(SEQ ID No：17)，确保其5′端含有起始密码子(ATG)和EcoR I酶切位点，3′端含有终止密码子和Hind III酶切位点，其第49位Sec的编码序列TGA替换为琥珀型终止密码子(TAG)，用限制性核酸内切酶EcoR I和Hind III双酶切后，连接到同样用限制性核酸内切酶EcoR I和Hind III双酶切的pCold III-tRNA载体上，构建的质粒为pColdIII-tRNA-GPX1-L-APSOD。
用装有杂合tRNA和GPX1-L-APSOD基因的载体(pCold III-tRNA-GPX1-L-APSOD)转化UAG通读工程菌C321.ΔA.exp的感受态细胞，涂含有100μg/mL Amp的营养琼脂平板，筛选阳性菌株。将阳性转化子接种于1.2L营养琼脂培养基(含100μg/mL氨苄青霉素和50uM亚硒酸钠)中，在37℃空气浴中160rpm震荡培养至OD600为0.5。将菌液置于30℃低温摇床中80rpm震荡培养5h，之后加入终浓度为0.1mmol/L IPTG，30℃振荡培养5h，使GPX1-L-APSOD蛋白以可溶性形式表达在菌体的周质腔里。收集菌体(6000rpm，10min)并用等体积的缓冲液T(50mM Tris，pH7.5，含1mM EDTA)洗涤两次。用缓冲液T重悬菌体沉淀，加入终浓度1mM的PMSF(苯甲基磺酰氟)，超声破碎菌体，4℃，12000rpm离心30min，收集上清。按说明书处理GSH亲合柱，应用缓冲液(50mmol/L Tris含5mmol/L Cu2+和Zn2+，pH7.5)平衡，将上清液加入GSH亲合柱上，用平衡缓冲液洗脱杂蛋白，用10mmol/L GSH洗脱目的蛋白。将洗脱液透析并冻干，即得GPX1-L-APSOD蛋白。用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和蛋白印迹(Western blot)鉴定靶蛋白，其分子量为41.8kDa，且与抗GPX1抗体特异性结合，证明成功获得了目标蛋白，见图1的第1泳道。其GPX和SOD活力分别为9896和8996U/umol蛋白，显著高于以往报道的双功能酶的GPX活力。高活力的GPX活性可避免因局部过氧化氢浓度过高导致的SOD酶失活，同时GPX对底物过氧化氢的分解可以促进SOD催化的超氧阴离子分解为过氧化氢的反应加速。实施例2-16：
用合成的杂合tRNA序列2-16和靶基因联合UAG通读原核表达系统制备基因工程GPX1-L-APSOD蛋白。具体方法与实施例1完全相同，只是分别根据中国专利201510431360.1公开的杂合tRNA的碱基序列2-16(SEQ ID No：2-16)所述的tRNA碱基序列，在生物公司用DNA合成仪人工合成能在UAG通读工程菌株中表达序列2-16(SEQ ID No：2-16)所述杂合tRNA的基因，确保杂合tRNA基因的5′端含有lpp启动子序列和ClaI酶切位点，3′端含有rrnc终止子序列和ClaI酶切位点，合成的具体基因序列序列分别是：
实施例2合成的能表达SEQ ID No：2所述的tRNA碱基序列的基因序列为：
CCATCGATCCCATCAAAAAAATATTCTCAACATAAAAAACTTTGTGTAATACTTGTAACGCTGAATTCGGAAGATGTGGCCGAGCGGTTGAAGGCACCGGTCTCTAAAACCGGCGACCCGAAAGGGTTCGCAGGTTCGACTCCTGTCATCTTCCGCCAGGATCCTCTAGAGTCGACCTGCAGATCCTTAGCGAAAGCTAAGGATTTTTTTT ATCGATGG；
实施例3合成的能表达SEQ ID No：3所述的tRNA碱基序列的基因序列为：
CCATCGATCCCATCAAAAAAATATTCTCAACATAAAAAACTTTGTGTAATACTTGTAACGCTGAATTCGGAAGATGTGGCCGAGCGGTTGAAGGCACCGGTCTCTAAAACCGGCGACCCGAAAGGGTTCGCAGGTTCGATTCCTGTCATCTTCCGCCAGGATCCTCTAGAGTCGACCTGCAGATCCTTAGCGAAAGCTAAGGATTTTTTTT ATCGATGG；
实施例4合成的能表达SEQ ID No：4所述的tRNA碱基序列的基因序列为：
CCATCGATCCCATCAAAAAAATATTCTCAACATAAAAAACTTTGTGTAATACTTGTAACGCTGAATTCGGAAGATGTGGCCGAGCGGTTGAAGGCACCGGTCTCTAAAACCGGCGACCCGAAAGGGTTCGCAGGTTCGAGTCCTGTCATCTTCCGCCAGGATCCTCTAGAGTCGACCTGCAGATCCTTAGCGAAAGCTAAGGATTTTTTTT ATCGATGG；
实施例5合成的能表达SEQ ID No：5所述的tRNA碱基序列的基因序列为：
CCATCGATCCCATCAAAAAAATATTCTCAACATAAAAAACTTTGTGTAATACTTGTAACGCTGAATTCGGAAGATCTGGCCGAGCGGTTGAAGGCACCGGTCTCTAAAACCGGCGACCCGAAAGGGTTCGCAGGTTCGAATCCTGTGATCTTCCGCCAGGATCCTCTAGAGTCGACCTGCAGATCCTTAGCGAAAGCTAAGGATTTTTTTT ATCGATGG；
实施例6合成的能表达SEQ ID No：6所述的tRNA碱基序列的基因序列为：
CCATCGATCCCATCAAAAAAATATTCTCAACATAAAAAACTTTGTGTAATACTTGTAACGCTGAATTCGGAAGATCTGGCCGAGCGGTTGAAGGCACCGGTCTCTAAAACCGGCGACCCGAAAGGGTTCGCAGGTTCGACTCCTGTGATCTTCCGCCAGGATCCTCTAGAGTCGACCTGCAGATCCTTAGCGAAAGCTAAGGATTTTTTTTATCGATGG；
实施例7合成的能表达SEQ ID No：7所述的tRNA碱基序列的基因序列为：
CCATCGATCCCATCAAAAAAATATTCTCAACATAAAAAACTTTGTGTAATACTTGTAACGCTGAATTCGGAAGATCTGGCCGAGCGGTTGAAGGCACCGGTCTCTAAAACCGGCGACCCGAAAGGGTTCGCAGGTTCGATTCCTGTGATCTTCCGCCAGGATCCTCTAGAGTCGACCTGCAGATCCTTAGCGAAAGCTAAGGATTTTTTTT ATCGATGG；
实施例8合成的能表达SEQ ID No：8所述的tRNA碱基序列的基因序列为：
CCATCGATCCCATCAAAAAAATATTCTCAACATAAAAAACTTTGTGTAATACTTGTAACGCTGAATTCGGAAGATCTGGCCGAGCGGTTGAAGGCACCGGTCTCTAAAACCGGCGACCCGAAAGGGTTCGCAGGTTCGAGTCCTGTGATCTTCCGCCAGGATCCTCTAGAGTCGACCTGCAGATCCTTAGCGAAAGCTAAGGATTTTTTTT ATCGATGG；
实施例9合成的能表达SEQ ID No：9所述的tRNA碱基序列的基因序列为：
CCATCGATCCCATCAAAAAAATATTCTCAACATAAAAAACTTTGTGTAATACTTGTAACGCTGAATTCGGAAGATGTGGCCGAGCGGTTGAAGGCACCGGTCTCTAAAACCGGCGACCCGAAAGGGTTCTCCGGTTCGAATCCGGACATCTTCCGCCAGGATCCTCTAGAGTCGACCTGCAGATCCTTAGCGAAAGCTAAGGATTTTTTTT ATCGATGG；
实施例10合成的能表达SEQ ID No：10所述的tRNA碱基序列的基因序列为：
CCATCGATCCCATCAAAAAAATATTCTCAACATAAAAAACTTTGTGTAATACTTGTAACGCTGAATTCGGAAGATGTGGCCGAGCGGTTGAAGGCACCGGTCTCTAAAACCGGCGACCCGAAAGGGTTCTCCGGTTCGACTCCGGACATCTTCCGCCAGGATCCTCTAGAGTCGACCTGCAGATCCTTAGCGAAAGCTAAGGATTTTTTTT ATCGATGG；
实施例11合成的能表达SEQ ID No：11所述的tRNA碱基序列的基因序列为：
CCATCGATCCCATCAAAAAAATATTCTCAACATAAAAAACTTTGTGTAATACTTGTAACGCTGAATTCGGAAGATGTGGCCGAGCGGTTGAAGGCACCGGTCTCTAAAACCGGCGACCCGAAAGGGTTCTCCGGTTCGATTCCGGACATCTTCCGCCAGGATCCTCTAGAGTCGACCTGCAGATCCTTAGCGAAAGCTAAGGATTTTTTTT ATCGATGG；
实施例12合成的能表达SEQ ID No：12所述的tRNA碱基序列的基因序列为：
CCATCGATCCCATCAAAAAAATATTCTCAACATAAAAAACTTTGTGTAATACTTGTAACGCTGAATTCGGAAGATGTGGCCGAGCGGTTGAAGGCACCGGTCTCTAAAACCGGCGACCCGAAAGGGTTCTCCGGTTCGAGTCCGGACATCTTCCGCCAGGATCCTCTAGAGTCGACCTGCAGATCCTTAGCGAAAGCTAAGGATTTTTTTT ATCGATGG；
实施例13合成的能表达SEQ ID No：13所述的tRNA碱基序列的基因序列为：
CCATCGATCCCATCAAAAAAATATTCTCAACATAAAAAACTTTGTGTAATACTTGTAACGCTGAATTCGGAAGATCTGGCCGAGCGGTTGAAGGCACCGGTCTCTAAAACCGGCGACCCGAAAGGGTTCTCCGGTTCGAATCCGGAGATCTTCCGCCAGGATCCTCTAGAGTCGACCTGCAGA TCCTTAGCGAAAGCTAAGGATTTTTTTT ATCGATGG；
实施例14合成的能表达SEQ ID No：14所述的tRNA碱基序列的基因序列为：
CCATCGATCCCATCAAAAAAATATTCTCAACATAAAAAACTTTGTGTAATACTTGTAACGCTGAATTCGGAAGATCTGGCCGAGCGGTTGAAGGCACCGGTCTCTAAAACCGGCGACCCGAAAGGGTTCTCCGGTTCGACTCCGGAGATCTTCCGCCAGGATCCTCTAGAGTCGACCTGCAGATCCTTAGCGAAAGCTAAGGATTTTTTTT ATCGATGG；
实施例15合成的能表达SEQ ID No：15所述的tRNA碱基序列的基因序列为：
CCATCGATCCCATCAAAAAAATATTCTCAACATAAAAAACTTTGTGTAATACTTGTAACGCTGAATTCGGAAGATCTGGCCGAGCGGTTGAAGGCACCGGTCTCTAAAACCGGCGACCCGAAAGGGTTCTCCGGTTCGATTCCGGAGATCTTCCGCCAGGATCCTCTAGAGTCGACCTGCAGATCCTTAGCGAAAGCTAAGGATTTTTTTT ATCGATGG；
实施例16合成的能表达SEQ ID No：16所述的tRNA碱基序列的基因序列为：
CCATCGATCCCATCAAAAAAATATTCTCAACATAAAAAACTTTGTGTAATACTTGTAACGCTGAATTCGGAAGATCTGGCCGAGCGGTTGAAGGCACCGGTCTCTAAAACCGGCGACCCGAAAGGGTTCTCCGGTTCGAGTCCGGAGATCTTCCGCCAGGATCCTCTAGAGTCGACCTGCAGATCCTTAGCGAAAGCTAAGGATTTTTTTT ATCGATGG；
实施例2-16制备的GPX1-L-APSOD蛋白见图1和图2的第2-16泳道。其GPX活力分别为8715、7935、8713、8687、8696、8537、8332、8298、8205、8167、8215、8197、8186、8237、8359U/umol，SOD活力分别为8802、8798、8991、8923、8857、8912、8884、8759、8925、8829、8906、8793、8869、8895、8972U/umol，显著高于以往报道的双功能酶的GPX活力。高活力的GPX活性可避免因局部过氧化氢浓度过高导致的SOD酶失活，同时GPX对底物过氧化氢的分解可以促进SOD催化的超氧阴离子分解为过氧化氢的反应加速。
实施例17：用合成的杂合tRNA和PCR法扩增的靶基因联合UAG通读原核表达系统制备基因工程人GPX1蛋白。
根据中国专利201510431360.1公开的杂合tRNA序列1(SEQ ID No：1)所述的tRNA碱基序列，在生物公司用DNA合成仪人工合成能在UAG通读工程菌株中表达序列1(SEQ IDNo：1)所述杂合tRNA的基因，确保杂合tRNA基因的5′端含有lpp启动子序列和ClaI酶切位点，3′端含有rrnc终止子序列和ClaI酶切位点(序列如下)
CCATCGATCCCATCAAAAAAATATTCTCAACATAAAAAACTTTGTGTAATACTTGTAACGCTGAATTCGGAAGATGTGGCCGAGCGGTTGAAGGCACCGGTCTCTAAAACCGGCGACCCGAAAGGGTTCGCAGGTTCGAATCCTGTCATCTTCCGCCAGGATCCTCTAGAGTCGACCTGCAGATCCTTAGCGAAAGCTAAGGATTTTTTTT ATCGATGG；
用限制性核酸内切酶ClaI单酶切后，连接到同样ClaI单酶切的pCold III载体上(TAKARA,Cat.#3369，ClaI为pCold III多克隆位点以外的单独存在酶切位点，在该处插入外源序列不影响载体本身其他功能)，所获得的载体为pCold III-tRNA。
用mRNA小量提取试剂盒(Sigma,Cat#MRN-10)从人HepG-2(DSMZ#ACC 180)肝癌细胞中提取mRNA，在逆转录酶(AMV RT,Promega,Cat#M5101)和oligo(dT)存在下，通过RT-PCR(逆转录聚合酶链反应)将其转录成cDNA。根据基因文库中公开的人GPX1和庞贝蠕虫的SOD(APSOD)的基因(参见NCBI,NM_000581.2，EU178106.1)序列设计引物扩增其编码基因，确保GPX基因的5′端引物含有起始密码子(ATG)和Nde I酶切位点，3′端引物不含终止密码子，但含有部分连接肽基因，APSOD基因的5′端引物含有部分引导肽基因，APSOD基因的3′端引物含有终止密码子和Hind III酶切位点；具体的GPX的5′端引物是5’-GGAATTCCATATGGCTGCTGCTCGGC-3’，3′端引物是5’-GAGCCACCTCCGCCTGAACCGCCTCCACCTGAGCCACCTCCGCCTGAGGCACAGCTGGGCCCTTG-3’；具体的SOD的5′端引物是5’-TCAGGCGGAGGTGGCTCAGGCGGTGGCGGCTCA+ATGGCTATCCACGCT-3’，3′端引物是5’-GGAATTC+CATATG+TTACTCCTTGGTAAT-3’。利用重叠PCR扩增目的基因，回收分子量最大的基因片段，用限制性核酸内切酶Nde I和Hind III双酶切后，用DNA连接酶连接到同样酶切的pCold III(TAKARA,Cat.#3369)载体上，记为pCold III-tRNA-GPX1。在保持其它氨基酸序列不变的前提下，根据GPX1中49号Sec比邻的氨基酸的基因序列设计完全等长互补的两条定点突变引物，引物长25-50bp，以49号Sec的密码子(TGA)为中心。用这两条完全互补的引物和快速定点突变试剂盒(Invitrogen公司，按试剂盒说明书操作)，将构建在原核表达载体pCold III上的GPX1基因的第49号Sec的编码序列TGA突变为琥珀密码子(TAG)，通过DNA测序确定突变成功，且无其它意外基因突变发生。
用装有杂合tRNA和GPX1-L-APSOD基因的载体(pCold III-tRNA-GPX1)转化UAG通读工程菌C321.ΔA.exp的感受态细胞，涂含有100μg/mL Amp的营养琼脂平板，筛选阳性菌株。将阳性转化子接种于1.2L营养琼脂培养基(含100μg/mL氨苄青霉素和50uM亚硒酸钠)中，在37℃空气浴中160rpm震荡培养至OD600为0.6。将菌液置于30℃低温摇床中80rpm震荡培养5h，之后加入终浓度为0.1mmol/L IPTG，30℃振荡培养5h，使GPX1蛋白以可溶性形式表达在菌体的周质腔里。收集菌体(6000rpm，10min)并用等体积的缓冲液T(50mM Tris，pH7.5，含1mM EDTA)洗涤两次。用缓冲液T重悬菌体沉淀，加入终浓度1mM的PMSF(苯甲基磺酰氟)，超声破碎菌体，4℃，12000rpm离心30min，收集上清。按说明书处理GSH亲合柱，应用缓冲液(50mmol/L Tris含5mmol/L Cu2+和Zn2+，pH7.5)平衡,将上清液加入GSH亲合柱上,用平衡缓冲液洗脱杂蛋白，用10mmol/L GSH洗脱目的蛋白。将洗脱液透析并冻干，即得GPX1-L-APSOD蛋白。用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和蛋白印迹(Western blot)鉴定靶蛋白，其分子量为41.8kDa，且与抗GPX1抗体特异性结合，证明成功获得了目标蛋白，见图2的第17泳道。其GPX和SOD活力分别为9768和8912U/umol，显著高于以往报道的双功能酶的GPX活力。高活力的GPX活性可避免因局部过氧化氢浓度过高导致的SOD酶失活，同时GPX对底物过氧化氢的分解可以促进SOD催化的超氧阴离子分解为过氧化氢的反应加速。
实施例18：
除将实施例1所用的靶基因换成SEQ ID No：18外，其余与实施例1完全相同，即最终将获得APSOD-L-GPX1蛋白，即SEQ ID No：18。该蛋白与GPX1-L-APSOD具有相同的分子量，在SDS-PAGE和Western Blot结果上可以看到，见图2的第18泳道。其GPX和SOD活力分别为10115和8607U/umol，其GPX活力略高于实施例1，显著高于以往报道的双功能酶的GPX活力。高活力的GPX活性可避免因局部过氧化氢浓度过高导致的SOD酶失活，同时GPX对底物过氧化氢的分解可以促进SOD催化的超氧阴离子分解为过氧化氢的反应加速
实施例19：
除将实施例1所用的靶基因换成SEQ ID No：19外，其余与实施例1完全相同，即最终将获得GPX1-L1-APSOD蛋白，即SEQ ID No：19。该蛋白较GPX1-L-APSOD少一个第224位的丝氨酸，分子量仅差约0.11kDa，在SDS-PAGE和Western Blot结果上无明显差异，见图2的第19泳道。其GPX和SOD活力分别为9205和8182U/umol，其GPX活力略低于实施例1，显著高于以往报道的双功能酶的GPX活力。高活力的GPX活性可避免因局部过氧化氢浓度过高导致的SOD酶失活，同时GPX对底物过氧化氢的分解可以促进SOD催化的超氧阴离子分解为过氧化氢的反应加速。
实施例20：
除将实施例1所用的靶基因换成SEQ ID No：20外，其余与实施例1完全相同，即最终将获得GPX1-1-L-APSOD蛋白，即SEQ ID No：20。该蛋白较GPX1-L-APSOD少第2-13位的12个氨基酸，分子量仅差约1.23kDa，在SDS-PAGE和Western Blot上结果上略低于实施例1，见图2的第20泳道。其GPX和SOD活力分别为9706和8892U/umol，其GPX活力略低于实施例1，显著高于以往报道的双功能酶的GPX活力。高活力的GPX活性可避免因局部过氧化氢浓度过高导致的SOD酶失活，同时GPX对底物过氧化氢的分解可以促进SOD催化的超氧阴离子分解为过氧化氢的反应加速。
实施例21：
除将实施例18所用的靶基因换成SEQ ID No：21外，其余与实施例18完全相同，即最终将获得APSOD-L-GPX1-1蛋白，即SEQ ID No：21。该蛋白较APSOD-L-GPX1少第181-192位的12个氨基酸，分子量仅差约1.23kDa，在SDS-PAGE和Western Blot上结果上略低于实施例18，见图2的第21泳道。其GPX和SOD活力分别为9996和8592U/umol，其GPX活力略低于实施例18，显著高于以往报道的双功能酶的GPX活力。高活力的GPX活性可避免因局部过氧化氢浓度过高导致的SOD酶失活，同时GPX对底物过氧化氢的分解可以促进SOD催化的超氧阴离子分解为过氧化氢的反应加速。
实施例22：
除将实施例1所用的表达载体pCold III(TAKARA,Cat.#3369)换成带组氨酸纯化标签的pCold I(TAKARA,Cat.#3367)，其余与实施例1完全相同，即最终将获得带标签的GPX1-L-APSOD蛋白，即SEQ ID No：22。该蛋白在氨基端引入了载体上包括6个组氨酸签和凝血因子Xa切割位点在内的16个外源氨基酸，因此分子量较实施例1有所增加，在SDS-PAGE和Western Blot结果上可以看到，见图2的第22泳道，其优点是也可以用镍亲和层析纯化靶蛋白。其GPX和SOD活力分别为9585和8782，略低于实施例1，证明纯化标签对蛋白的活力没有明显影响，活力仍显著高于以往报道的双功能酶的GPX活力。高活力的GPX活性可避免因局部过氧化氢浓度过高导致的SOD酶失活，同时GPX对底物过氧化氢的分解可以促进SOD催化的超氧阴离子分解为过氧化氢的反应加速。
实施例23：
除将实施例18所用的表达载体pCold III(TAKARA,Cat.#3369)换成带组氨酸纯化标签的pCold I(TAKARA,Cat.#3367)，其余与实施例18完全相同，即最终将获得带标签的APSOD-L-GPX1蛋白，即SEQ ID No：23。该蛋白在氨基端引入了载体上包括6个组氨酸签和凝血因子Xa切割位点在内的16个外源氨基酸，因此分子量较实施例1有所增加，在SDS-PAGE和Western Blot结果上可以看到，见图2的第23泳道，其优点是也可以用镍亲和层析纯化靶蛋白。其GPX和SOD活力分别为9785和8592，略低于实施例18，证明纯化标签对蛋白的活力没有明显影响，活力仍显著高于以往报道的双功能酶的GPX活力。
实施例24：
除将实施例19所用的表达载体pCold III(TAKARA,Cat.#3369)换成带组氨酸纯化标签的pCold I(TAKARA,Cat.#3367)，其余与实施例19完全相同，即最终将获得带标签的GPX1-L1-APSOD蛋白，即SEQ ID No：24。该蛋白在氨基端引入了载体上包括6个组氨酸签和凝血因子Xa切割位点在内的16个外源氨基酸，因此分子量较实施例19有所增加，在SDS-PAGE和Western Blot结果上可以看到，见图2的第24泳道，其优点是也可以用镍亲和层析纯化靶蛋白。其GPX和SOD活力分别为9103和8007，略低于实施例19，证明纯化标签对蛋白的活力没有明显影响，活力仍显著高于以往报道的双功能酶的GPX活力。
实施例25：
除将实施例20所用的表达载体pCold III(TAKARA,Cat.#3369)换成带组氨酸纯化标签的pCold I(TAKARA,Cat.#3367)，其余与实施例20完全相同，即最终将获得带标签的GPX1-1-L-APSOD蛋白，即SEQ ID No：25。该蛋白在氨基端引入了载体上包括6个组氨酸签和凝血因子Xa切割位点在内的16个外源氨基酸，因此分子量较实施例20有所增加，在SDS-PAGE和Western Blot结果上可以看到，见图2的第25泳道，其优点是也可以用镍亲和层析纯化靶蛋白。其GPX和SOD活力分别为9625和8632，略低于实施例20，证明纯化标签对蛋白的活力没有明显影响，活力仍显著高于以往报道的双功能酶的GPX活力。高活力的GPX活性可避免因局部过氧化氢浓度过高导致的SOD酶失活，同时GPX对底物过氧化氢的分解可以促进SOD催化的超氧阴离子分解为过氧化氢的反应加速。
实施例26：
除将实施例21所用的表达载体pCold III(TAKARA,Cat.#3369)换成带组氨酸纯化标签的pCold I(TAKARA,Cat.#3367)，其余与实施例21完全相同，即最终将获得带标签的APSOD-L-GPX1-1蛋白，即SEQ ID No：26。该蛋白在氨基端引入了载体上包括6个组氨酸签和凝血因子Xa切割位点在内的16个外源氨基酸，因此分子量较实施例21有所增加，在SDS-PAGE和Western Blot结果上可以看到，见图2的第26泳道，其优点是也可以用镍亲和层析纯化靶蛋白。其GPX和SOD活力分别为9865和8192，略低于实施例21，证明纯化标签对蛋白的活力没有明显影响，活力仍显著高于以往报道的双功能酶的GPX活力。
〈110〉吉林大学
〈120〉兼具谷胱甘肽过氧化物酶和超氧化物歧化酶活性的双功能抗氧化酶及其制备方法
〈160〉26
〈210〉1
〈211〉90
〈212〉RNA
〈213〉人工序列
〈220〉
〈221〉tRNA
〈222〉(1)...(90)
〈223〉由大肠杆菌SerT碱基序列和SelC碱基序列杂合得到，用于搬运Sec
〈220〉
〈221〉misc_feature
〈222〉（36）...(38)
〈223〉反密码子
〈220〉
〈221〉stem_loop
〈222〉(62)...(78)
〈223〉形成tRNA的T-arm和T-loop
〈400〉1
GGAAGAUGUG GCCGAGCGGU UGAAGGCACC GGUCUCUAAA ACCGGCGACC CGAAAGGGUU 60
CGCAGGUUCG AAUCCUGUCA UCUUCCGCCA 90
〈210〉2
〈211〉90
〈212〉RNA
〈213〉人工序列
〈220〉
〈221〉tRNA
〈222〉(1)...(90)
〈223〉由大肠杆菌SerT碱基序列和SelC碱基序列杂合得到，用于搬运Sec
〈220〉
〈221〉misc_feature
〈222〉（36）...(38)
〈223〉反密码子
〈220〉
〈221〉stem_loop
〈222〉(62)...(78)
〈223〉形成tRNA的T-arm和T-loop
〈400〉2
GGAAGAUGUG GCCGAGCGGU UGAAGGCACC GGUCUCUAAA ACCGGCGACC CGAAAGGGUU 60
CGCAGGUUCG ACUCCUGUCA UCUUCCGCCA 90
〈210〉3
〈211〉90
〈212〉RNA
〈213〉人工序列
〈220〉
〈221〉tRNA
〈222〉(1)...(90)
〈223〉由大肠杆菌SerT碱基序列和SelC碱基序列杂合得到，用于搬运Sec
〈220〉
〈221〉misc_feature
〈222〉（36）...(38)
〈223〉反密码子
〈220〉
〈221〉stem_loop
〈222〉(62)...(78)
〈223〉形成tRNA的T-arm和T-loop
〈400〉3
GGAAGAUGUG GCCGAGCGGU UGAAGGCACC GGUCUCUAAA ACCGGCGACC CGAAAGGGUU 60
CGCAGGUUCG AUUCCUGUCA UCUUCCGCCA 90
〈210〉4
〈211〉90
〈212〉RNA
〈213〉人工序列
〈220〉
〈221〉tRNA
〈222〉(1)...(90)
〈223〉由大肠杆菌SerT碱基序列和SelC碱基序列杂合得到，用于搬运Sec
〈220〉
〈221〉misc_feature
〈222〉（36）...(38)
〈223〉反密码子
〈220〉
〈221〉stem_loop
〈222〉(62)...(78)
〈223〉形成tRNA的T-arm和T-loop
〈400〉4
GGAAGAUGUG GCCGAGCGGU UGAAGGCACC GGUCUCUAAA ACCGGCGACC CGAAAGGGUU 60
CGCAGGUUCG AGUCCUGUCA UCUUCCGCCA 90
〈210〉5
〈211〉90
〈212〉RNA
〈213〉人工序列
〈220〉
〈221〉tRNA
〈222〉(1)...(90)
〈223〉由大肠杆菌SerT碱基序列和SelC碱基序列杂合得到，用于搬运Sec
〈220〉
〈221〉misc_feature
〈222〉（36）...(38)
〈223〉反密码子
〈220〉
〈221〉stem_loop
〈222〉(62)...(78)
〈223〉形成tRNA的T-arm和T-loop
〈400〉5
GGAAGAUCUG GCCGAGCGGU UGAAGGCACC GGUCUCUAAA ACCGGCGACC CGAAAGGGUU 60
CGCAGGUUCG AAUCCUGUGA UCUUCCGCCA 90
〈210〉6
〈211〉90
〈212〉RNA
〈213〉人工序列
〈220〉
〈221〉tRNA
〈222〉(1)...(90)
〈223〉由大肠杆菌SerT碱基序列和SelC碱基序列杂合得到，用于搬运Sec
〈220〉
〈221〉misc_feature
〈222〉（36）...(38)
〈223〉反密码子
〈220〉
〈221〉stem_loop
〈222〉(62)...(78)
〈223〉形成tRNA的T-arm和T-loop
〈400〉6
GGAAGAUCUG GCCGAGCGGU UGAAGGCACC GGUCUCUAAA ACCGGCGACC CGAAAGGGUU 60
CGCAGGUUCG ACUCCUGUGA UCUUCCGCCA 90
〈210〉7
〈211〉90
〈212〉RNA
〈213〉人工序列
〈220〉
〈221〉tRNA
〈222〉(1)...(90)
〈223〉由大肠杆菌SerT碱基序列和SelC碱基序列杂合得到，用于搬运Sec
〈220〉
〈221〉misc_feature
〈222〉（36）...(38)
〈223〉反密码子
〈220〉
〈221〉stem_loop
〈222〉(62)...(78)
〈223〉形成tRNA的T-arm和T-loop
〈400〉7
GGAAGAUCUG GCCGAGCGGU UGAAGGCACC GGUCUCUAAA ACCGGCGACC CGAAAGGGUU 60
CGCAGGUUCG AUUCCUGUGA UCUUCCGCCA 90
〈210〉8
〈211〉90
〈212〉RNA
〈213〉人工序列
〈220〉
〈221〉tRNA
〈222〉(1)...(90)
〈223〉由大肠杆菌SerT碱基序列和SelC碱基序列杂合得到，用于搬运Sec
〈220〉
〈221〉misc_feature
〈222〉（36）...(38)
〈223〉反密码子
〈220〉
〈221〉stem_loop
〈222〉(62)...(78)
〈223〉形成tRNA的T-arm和T-loop
〈400〉8
GGAAGAUCUG GCCGAGCGGU UGAAGGCACC GGUCUCUAAA ACCGGCGACC CGAAAGGGUU 60
CGCAGGUUCG AGUCCUGUGA UCUUCCGCCA 90
210〉9
〈211〉90
〈212〉RNA
〈213〉人工序列
〈220〉
〈221〉tRNA
〈222〉(1)...(90)
〈223〉由大肠杆菌SerT碱基序列和SelC碱基序列杂合得到，用于搬运Sec
〈220〉
〈221〉misc_feature
〈222〉（36）...(38)
〈223〉反密码子
〈220〉
〈221〉stem_loop
〈222〉(62)...(78)
〈223〉形成tRNA的T-arm和T-loop
〈400〉9
GGAAGAUGUG GCCGAGCGGU UGAAGGCACC GGUCUCUAAA ACCGGCGACC CGAAAGGGUU 60
CUCCGGUUCG AAUCCGGACA UCUUCCGCCA 90
〈210〉10
〈211〉90
〈212〉RNA
〈213〉人工序列
〈220〉
〈221〉tRNA
〈222〉(1)...(90)
〈223〉由大肠杆菌SerT碱基序列和SelC碱基序列杂合得到，用于搬运Sec
〈220〉
〈221〉misc_feature
〈222〉（36）...(38)
〈223〉反密码子
〈220〉
〈221〉stem_loop
〈222〉(62)...(78)
〈223〉形成tRNA的T-arm和T-loop
〈400〉10
GGAAGAUGUG GCCGAGCGGU UGAAGGCACC GGUCUCUAAA ACCGGCGACC CGAAAGGGUU 60
CUCCGGUUCG ACUCCGGACA UCUUCCGCCA 90
〈210〉11
〈211〉90
〈212〉RNA
〈213〉人工序列
〈220〉
〈221〉tRNA
〈222〉(1)...(90)
〈223〉由大肠杆菌SerT碱基序列和SelC碱基序列杂合得到，用于搬运Sec
〈220〉
〈221〉misc_feature
〈222〉（36）...(38)
〈223〉反密码子
〈220〉
〈221〉stem_loop
〈222〉(62)...(78)
〈223〉形成tRNA的T-arm和T-loop
〈400〉11
GGAAGAUGUG GCCGAGCGGU UGAAGGCACC GGUCUCUAAA ACCGGCGACC CGAAAGGGUU 60
CUCCGGUUCG AUUCCGGACA UCUUCCGCCA 90
〈210〉12
〈211〉90
〈212〉RNA
〈213〉人工序列
〈220〉
〈221〉tRNA
〈222〉(1)...(90)
〈223〉由大肠杆菌SerT碱基序列和SelC碱基序列杂合得到，用于搬运Sec
〈220〉
〈221〉misc_feature
〈222〉（36）...(38)
〈223〉反密码子
〈220〉
〈221〉stem_loop
〈222〉(62)...(78)
〈223〉形成tRNA的T-arm和T-loop
〈400〉12
GGAAGAUGUG GCCGAGCGGU UGAAGGCACC GGUCUCUAAA ACCGGCGACC CGAAAGGGUU 60
CUCCGGUUCG AGUCCGGACA UCUUCCGCCA 90
〈210〉13
〈211〉90
〈212〉RNA
〈213〉人工序列
〈220〉
〈221〉tRNA
〈222〉(1)...(90)
〈223〉由大肠杆菌SerT碱基序列和SelC碱基序列杂合得到，用于搬运Sec
〈220〉
〈221〉misc_feature
〈222〉（36）...(38)
〈223〉反密码子
〈220〉
〈221〉stem_loop
〈222〉(62)...(78)
〈223〉形成tRNA的T-arm和T-loop
〈400〉13
GGAAGAUCUG GCCGAGCGGU UGAAGGCACC GGUCUCUAAA ACCGGCGACC CGAAAGGGUU 60
CUCCGGUUCG AAUCCGGAGA UCUUCCGCCA 90
〈210〉14
〈211〉90
〈212〉RNA
〈213〉人工序列
〈220〉
〈221〉tRNA
〈222〉(1)...(90)
〈223〉由大肠杆菌SerT碱基序列和SelC碱基序列杂合得到，用于搬运Sec
〈220〉
〈221〉misc_feature
〈222〉（36）...(38)
〈223〉反密码子
〈220〉
〈221〉stem_loop
〈222〉(62)...(78)
〈223〉形成tRNA的T-arm和T-loop
〈400〉14
GGAAGAUCUG GCCGAGCGGU UGAAGGCACC GGUCUCUAAA ACCGGCGACC CGAAAGGGUU 60
CUCCGGUUCG ACUCCGGAGA UCUUCCGCCA 90
〈210〉15
〈211〉90
〈212〉RNA
〈213〉人工序列
〈220〉
〈221〉tRNA
〈222〉(1)...(90)
〈223〉由大肠杆菌SerT碱基序列和SelC碱基序列杂合得到，用于搬运Sec
〈220〉
〈221〉misc_feature
〈222〉（36）...(38)
〈223〉反密码子
〈220〉
〈221〉stem_loop
〈222〉(62)...(78)
〈223〉形成tRNA的T-arm和T-loop
〈400〉15
GGAAGAUCUG GCCGAGCGGU UGAAGGCACC GGUCUCUAAA ACCGGCGACC CGAAAGGGUU 60
CUCCGGUUCG AUUCCGGAGA UCUUCCGCCA 90
〈210〉16
〈211〉90
〈212〉RNA
〈213〉人工序列
〈220〉
〈221〉tRNA
〈222〉(1)...(90)
〈223〉由大肠杆菌SerT碱基序列和SelC碱基序列杂合得到，用于搬运Sec
〈220〉
〈221〉misc_feature
〈222〉（36）...(38)
〈223〉反密码子
〈220〉
〈221〉stem_loop
〈222〉(62)...(78)
〈223〉形成tRNA的T-arm和T-loop
〈400〉16
GGAAGAUCUG GCCGAGCGGU UGAAGGCACC GGUCUCUAAA ACCGGCGACC CGAAAGGGUU 60
CUCCGGUUCG AGUCCGGAGA UCUUCCGCCA 90
〈210〉17
〈211〉382
〈212〉PRT
〈213〉人工序列
〈220〉
〈221〉CHAIN
〈222〉（1)...(382）
〈223〉将人GPx1和庞贝蠕虫SOD的氨基酸序列经短肽连接而成，作为高活力及超稳定的双功能抗氧化酶
〈220〉
〈221〉连接肽
〈222〉（204-229）
〈223〉由甘氨酸和丝氨酸组成
〈220〉
〈221〉ACT_SITE
〈222〉（49）
〈223〉硒代半胱氨酸
〈400〉17
Met Cys Ala Ala Arg Leu Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gln Ser
1 5 10 15
Val Tyr Ala Phe Ser Ala Arg Pro Leu Ala Gly Gly Glu Pro Val
20 25 30
Ser Leu Gly Ser Leu Arg Gly Lys Val Leu Leu Ile Glu Asn Val
35 40 45
Ala Ser Leu Xaa Gly Thr Thr Val Arg Asp Tyr Thr Gln Met Asn
50 55 60
Glu Leu Gln Arg Arg Leu Gly Pro Arg Gly Leu Val Val Leu Gly
65 70 75
Phe Pro Cys Asn Gln Phe Gly His Gln Glu Asn Ala Lys Asn Glu
80 85 90
Glu Ile Leu Asn Ser Leu Lys Tyr Val Arg Pro Gly Gly Gly Phe
95 100 105
Glu Pro Asn Phe Met Leu Phe Glu Lys Cys Glu Val Asn Gly Ala
110 115 120
Gly Ala His Pro Leu Phe Ala Phe Leu Arg Glu Ala Leu Pro Ala
125 130 135
Pro Ser Asp Asp Ala Thr Ala Leu Met Thr Asp Pro Lys Leu Ile
140 145 150
Thr Trp Ser Pro Val Cys Arg Asn Asp Val Ala Trp Asn Phe Glu
155 160 165
Lys Phe Leu Val Gly Pro Asp Gly Val Pro Leu Arg Arg Tyr Ser
170 175 180
Arg Arg Phe Gln Thr Ile Asp Ile Glu Pro Asp Ile Glu Ala Leu
185 190 195
Leu Ser Gln Gly Pro Ser Cys Ala Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
200 205 210
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
215 220 225
Gly Gly Gly Ser Met Ala Ile His Ala Val Cys Val Leu Lys Gly
230 235 240
Asp Ser Pro Val Thr Gly Thr Ile His Leu Lys Glu Glu Gly Asp
245 250 255
Met Val Thr Val Thr Gly Glu Ile Thr Gly Leu Thr Pro Gly Lys
260 265 270
His Gly Phe His Val His Glu Phe Gly Asp Asn Thr Asn Gly Cys
275 280 285
Thr Ser Ala Gly Gly His Phe Asn Pro His Gly Lys Glu His Gly
290 295 300
Ala Pro Glu Asp Glu Asn Arg His Ala Gly Asp Leu Gly Asn Val
305 310 315
Val Ala Gly Glu Asp Gly Lys Ala Val Ile Asn Met Lys Asp Lys
320 325 330
Leu Val Lys Leu Thr Gly Pro Asp Ser Val Ile Gly Arg Thr Leu
335 340 345
Val Val His Val Asp Glu Asp Asp Leu Gly Arg Gly Gly His Glu
350 355 360
Gln Ser Lys Ile Thr Gly Asn Ala Gly Gly Arg Leu Ala Cys Gly
365 370 375
Val Ile Gly Ile Thr Lys Glu
380
〈210〉18
〈211〉382
〈212〉PRT
〈213〉人工序列
〈220〉
〈221〉CHAIN
〈222〉（1)...(382）
〈223〉将庞贝蠕虫SOD和人GPx1的氨基酸序列经短肽连接而成，作为高活力及超稳定的双功能抗氧化酶
〈220〉
〈221〉连接肽
〈222〉（154-179）
〈223〉由甘氨酸和丝氨酸组成
〈220〉
〈221〉ACT_SITE
〈222〉（228）
〈223〉硒代半胱氨酸
〈400〉18
Met Ala Ile His Ala Val Cys Val Leu Lys Gly Asp Ser Pro Val
1 5 10 15
Thr Gly Thr Ile His Leu Lys Glu Glu Gly Asp Met Val Thr Val
20 25 30
Thr Gly Glu Ile Thr Gly Leu Thr Pro Gly Lys His Gly Phe His
35 40 45
Val His Glu Phe Gly Asp Asn Thr Asn Gly Cys Thr Ser Ala Gly
50 55 60
Gly His Phe Asn Pro His Gly Lys Glu His Gly Ala Pro Glu Asp
65 70 75
Glu Asn Arg His Ala Gly Asp Leu Gly Asn Val Val Ala Gly Glu
80 85 90
Asp Gly Lys Ala Val Ile Asn Met Lys Asp Lys Leu Val Lys Leu
95 100 105
Thr Gly Pro Asp Ser Val Ile Gly Arg Thr Leu Val Val His Val
110 115 120
Asp Glu Asp Asp Leu Gly Arg Gly Gly His Glu Gln Ser Lys Ile
125 130 135
Thr Gly Asn Ala Gly Gly Arg Leu Ala Cys Gly Val Ile Gly Ile
140 145 150
Thr Lys Glu Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
155 160 165
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Met
170 175 180
Cys Ala Ala Arg Leu Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gln Ser Val
185 190 195
Tyr Ala Phe Ser Ala Arg Pro Leu Ala Gly Gly Glu Pro Val Ser
200 205 210
Leu Gly Ser Leu Arg Gly Lys Val Leu Leu Ile Glu Asn Val Ala
215 220 225
Ser Leu Xaa Gly Thr Thr Val Arg Asp Tyr Thr Gln Met Asn Glu
230 235 240
Leu Gln Arg Arg Leu Gly Pro Arg Gly Leu Val Val Leu Gly Phe
245 250 255
Pro Cys Asn Gln Phe Gly His Gln Glu Asn Ala Lys Asn Glu Glu
260 265 270
Ile Leu Asn Ser Leu Lys Tyr Val Arg Pro Gly Gly Gly Phe Glu
275 280 285
Pro Asn Phe Met Leu Phe Glu Lys Cys Glu Val Asn Gly Ala Gly
290 295 300
Ala His Pro Leu Phe Ala Phe Leu Arg Glu Ala Leu Pro Ala Pro
305 310 315
Ser Asp Asp Ala Thr Ala Leu Met Thr Asp Pro Lys Leu Ile Thr
320 325 330
Trp Ser Pro Val Cys Arg Asn Asp Val Ala Trp Asn Phe Glu Lys
335 340 345
Phe Leu Val Gly Pro Asp Gly Val Pro Leu Arg Arg Tyr Ser Arg
350 355 360
Arg Phe Gln Thr Ile Asp Ile Glu Pro Asp Ile Glu Ala Leu Leu
365 370 375
Ser Gln Gly Pro Ser Cys Ala
380
〈210〉19
〈211〉376
〈212〉PRT
〈213〉人工序列
〈220〉
〈221〉CHAIN
〈222〉（1)...(381）
〈223〉将人GPx1和庞贝蠕虫SOD的氨基酸序列经短肽连接而成，作为高活力及超稳定的双功能抗氧化酶
〈220〉
〈221〉连接肽
〈222〉（204-228）
〈223〉由甘氨酸和丝氨酸组成
〈220〉
〈221〉ACT_SITE
〈222〉（49）
〈223〉硒代半胱氨酸
〈400〉19
Met Cys Ala Ala Arg Leu Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gln Ser
1 5 10 15
Val Tyr Ala Phe Ser Ala Arg Pro Leu Ala Gly Gly Glu Pro Val
20 25 30
Ser Leu Gly Ser Leu Arg Gly Lys Val Leu Leu Ile Glu Asn Val
35 40 45
Ala Ser Leu Xaa Gly Thr Thr Val Arg Asp Tyr Thr Gln Met Asn
50 55 60
Glu Leu Gln Arg Arg Leu Gly Pro Arg Gly Leu Val Val Leu Gly
65 70 75
Phe Pro Cys Asn Gln Phe Gly His Gln Glu Asn Ala Lys Asn Glu
80 85 90
Glu Ile Leu Asn Ser Leu Lys Tyr Val Arg Pro Gly Gly Gly Phe
95 100 105
Glu Pro Asn Phe Met Leu Phe Glu Lys Cys Glu Val Asn Gly Ala
110 115 120
Gly Ala His Pro Leu Phe Ala Phe Leu Arg Glu Ala Leu Pro Ala
125 130 135
Pro Ser Asp Asp Ala Thr Ala Leu Met Thr Asp Pro Lys Leu Ile
140 145 150
Thr Trp Ser Pro Val Cys Arg Asn Asp Val Ala Trp Asn Phe Glu
155 160 165
Lys Phe Leu Val Gly Pro Asp Gly Val Pro Leu Arg Arg Tyr Ser
170 175 180
Arg Arg Phe Gln Thr Ile Asp Ile Glu Pro Asp Ile Glu Ala Leu
185 190 195
Leu Ser Gln Gly Pro Ser Cys Ala Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
200 205 210
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
215 220 225
Gly Gly Gly Met Ala Ile His Ala Val Cys Val Leu Lys Gly Asp
230 235 240
Ser Pro Val Thr Gly Thr Ile His Leu Lys Glu Glu Gly Asp Met
245 250 255
Val Thr Val Thr Gly Glu Ile Thr Gly Leu Thr Pro Gly Lys His
260 265 270
Gly Phe His Val His Glu Phe Gly Asp Asn Thr Asn Gly Cys Thr
275 280 285
Ser Ala Gly Gly His Phe Asn Pro His Gly Lys Glu His Gly Ala
290 295 300
Pro Glu Asp Glu Asn Arg His Ala Gly Asp Leu Gly Asn Val Val
305 310 315
Ala Gly Glu Asp Gly Lys Ala Val Ile Asn Met Lys Asp Lys Leu
320 325 330
Val Lys Leu Thr Gly Pro Asp Ser Val Ile Gly Arg Thr Leu Val
335 340 345
Val His Val Asp Glu Asp Asp Leu Gly Arg Gly Gly His Glu Gln
350 355 360
Ser Lys Ile Thr Gly Asn Ala Gly Gly Arg Leu Ala Cys Gly Val
365 370 375
Ile Gly Ile Thr Lys Glu
380
〈210〉20
〈211〉370
〈212〉PRT
〈213〉人工序列
〈220〉
〈221〉CHAIN
〈222〉（1)...(370）
〈223〉将人GPx1和庞贝蠕虫SOD的氨基酸序列经短肽连接而成，作为高活力及超稳定的双功能抗氧化酶
〈220〉
〈221〉连接肽
〈222〉（192-217）
〈223〉由甘氨酸和丝氨酸组成
〈220〉
〈221〉ACT_SITE
〈222〉（37）
〈223〉硒代半胱氨酸
〈400〉20
Met Gln Ser Val Tyr Ala Phe Ser Ala Arg Pro Leu Ala Gly Gly
1 5 10 15
Glu Pro Val Ser Leu Gly Ser Leu Arg Gly Lys Val Leu Leu Ile
20 20 30
Glu Asn Val Ala Ser Leu Xaa Gly Thr Thr Val Arg Asp Tyr Thr
35 40 45
Gln Met Asn Glu Leu Gln Arg Arg Leu Gly Pro Arg Gly Leu Val
50 55 60
Val Leu Gly Phe Pro Cys Asn Gln Phe Gly His Gln Glu Asn Ala
65 70 75
Lys Asn Glu Glu Ile Leu Asn Ser Leu Lys Tyr Val Arg Pro Gly
80 85 90
Gly Gly Phe Glu Pro Asn Phe Met Leu Phe Glu Lys Cys Glu Val
95 100 105
Asn Gly Ala Gly Ala His Pro Leu Phe Ala Phe Leu Arg Glu Ala
110 115 120
Leu Pro Ala Pro Ser Asp Asp Ala Thr Ala Leu Met Thr Asp Pro
125 130 135
Lys Leu Ile Thr Trp Ser Pro Val Cys Arg Asn Asp Val Ala Trp
140 145 150
Asn Phe Glu Lys Phe Leu Val Gly Pro Asp Gly Val Pro Leu Arg
155 160 165
Arg Tyr Ser Arg Arg Phe Gln Thr Ile Asp Ile Glu Pro Asp Ile
170 175 180
Glu Ala Leu Leu Ser Gln Gly Pro Ser Cys Ala Ser Gly Gly Gly
185 190 195
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
200 205 210
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Met Ala Ile His Ala Val Cys Val
215 220 225
Leu Lys Gly Asp Ser Pro Val Thr Gly Thr Ile His Leu Lys Glu
230 235 240
Glu Gly Asp Met Val Thr Val Thr Gly Glu Ile Thr Gly Leu Thr
245 250 255
Pro Gly Lys His Gly Phe His Val His Glu Phe Gly Asp Asn Thr
260 265 270
Asn Gly Cys Thr Ser Ala Gly Gly His Phe Asn Pro His Gly Lys
275 280 285
Glu His Gly Ala Pro Glu Asp Glu Asn Arg His Ala Gly Asp Leu
290 295 300
Gly Asn Val Val Ala Gly Glu Asp Gly Lys Ala Val Ile Asn Met
305 310 315
Lys Asp Lys Leu Val Lys Leu Thr Gly Pro Asp Ser Val Ile Gly
320 325 330
Arg Thr Leu Val Val His Val Asp Glu Asp Asp Leu Gly Arg Gly
335 340 345
Gly His Glu Gln Ser Lys Ile Thr Gly Asn Ala Gly Gly Arg Leu
350 355 360
Ala Cys Gly Val Ile Gly Ile Thr Lys Glu
365 370
〈210〉21
〈211〉370
〈212〉PRT
〈213〉人工序列
〈220〉
〈221〉CHAIN
〈222〉（1)...(370）
〈223〉将庞贝蠕虫SOD和人GPx1的氨基酸序列经短肽连接而成，作为高活力及超稳定的双功能抗氧化酶
〈220〉
〈221〉连接肽
〈222〉（154-179）
〈223〉由甘氨酸和丝氨酸组成
〈220〉
〈221〉ACT_SITE
〈222〉（216）
〈223〉硒代半胱氨酸
〈400〉21
Met Ala Ile His Ala Val Cys Val Leu Lys Gly Asp Ser Pro Val
1 5 10 15
Thr Gly Thr Ile His Leu Lys Glu Glu Gly Asp Met Val Thr Val
20 25 30
Thr Gly Glu Ile Thr Gly Leu Thr Pro Gly Lys His Gly Phe His
35 40 45
Val His Glu Phe Gly Asp Asn Thr Asn Gly Cys Thr Ser Ala Gly
50 55 60
Gly His Phe Asn Pro His Gly Lys Glu His Gly Ala Pro Glu Asp
65 70 75
Glu Asn Arg His Ala Gly Asp Leu Gly Asn Val Val Ala Gly Glu
80 85 90
Asp Gly Lys Ala Val Ile Asn Met Lys Asp Lys Leu Val Lys Leu
95 100 105
Thr Gly Pro Asp Ser Val Ile Gly Arg Thr Leu Val Val His Val
110 115 120
Asp Glu Asp Asp Leu Gly Arg Gly Gly His Glu Gln Ser Lys Ile
125 130 135
Thr Gly Asn Ala Gly Gly Arg Leu Ala Cys Gly Val Ile Gly Ile
140 145 150
Thr Lys Glu Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
155 160 165
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Met
170 175 180
Gln Ser Val Tyr Ala Phe Ser Ala Arg Pro Leu Ala Gly Gly Glu
185 190 195
Pro Val Ser Leu Gly Ser Leu Arg Gly Lys Val Leu Leu Ile Glu
200 205 210
Asn Val Ala Ser Leu Xaa Gly Thr Thr Val Arg Asp Tyr Thr Gln
215 220 225
Met Asn Glu Leu Gln Arg Arg Leu Gly Pro Arg Gly Leu Val Val
230 235 240
Leu Gly Phe Pro Cys Asn Gln Phe Gly His Gln Glu Asn Ala Lys
245 250 255
Asn Glu Glu Ile Leu Asn Ser Leu Lys Tyr Val Arg Pro Gly Gly
260 265 270
Gly Phe Glu Pro Asn Phe Met Leu Phe Glu Lys Cys Glu Val Asn
275 280 285
Gly Ala Gly Ala His Pro Leu Phe Ala Phe Leu Arg Glu Ala Leu
290 295 300
Pro Ala Pro Ser Asp Asp Ala Thr Ala Leu Met Thr Asp Pro Lys
305 310 315
Leu Ile Thr Trp Ser Pro Val Cys Arg Asn Asp Val Ala Trp Asn
320 325 330
Phe Glu Lys Phe Leu Val Gly Pro Asp Gly Val Pro Leu Arg Arg
335 340 345
Tyr Ser Arg Arg Phe Gln Thr Ile Asp Ile Glu Pro Asp Ile Glu
350 355 360
Ala Leu Leu Ser Gln Gly Pro Ser Cys Ala
365 370
〈210〉22
〈211〉398
〈212〉PRT
〈213〉人工序列
〈220〉
〈221〉CHAIN
〈222〉（-15)...(382）
〈223〉将人GPx1和庞贝蠕虫SOD的氨基酸序列经短肽连接而成，作为高活力及超稳定的双功能抗氧化酶
〈220〉
〈221〉连接肽
〈222〉（204-229）
〈223〉由甘氨酸和丝氨酸组成
〈220〉
〈221〉ACT_SITE
〈222〉（49）
〈223〉硒代半胱氨酸
〈400〉22
Met Asn His Lys Val His His His His His His Ile Glu Gly Arg His
-15 -10 -5
Met Cys Ala Ala Arg Leu Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gln Ser
1 5 10 15
Val Tyr Ala Phe Ser Ala Arg Pro Leu Ala Gly Gly Glu Pro Val
20 25 30
Ser Leu Gly Ser Leu Arg Gly Lys Val Leu Leu Ile Glu Asn Val
35 40 45
Ala Ser Leu Xaa Gly Thr Thr Val Arg Asp Tyr Thr Gln Met Asn
50 55 60
Glu Leu Gln Arg Arg Leu Gly Pro Arg Gly Leu Val Val Leu Gly
65 70 75
Phe Pro Cys Asn Gln Phe Gly His Gln Glu Asn Ala Lys Asn Glu
80 85 90
Glu Ile Leu Asn Ser Leu Lys Tyr Val Arg Pro Gly Gly Gly Phe
95 100 105
Glu Pro Asn Phe Met Leu Phe Glu Lys Cys Glu Val Asn Gly Ala
110 115 120
Gly Ala His Pro Leu Phe Ala Phe Leu Arg Glu Ala Leu Pro Ala
125 130 135
Pro Ser Asp Asp Ala Thr Ala Leu Met Thr Asp Pro Lys Leu Ile
140 145 150
Thr Trp Ser Pro Val Cys Arg Asn Asp Val Ala Trp Asn Phe Glu
155 160 165
Lys Phe Leu Val Gly Pro Asp Gly Val Pro Leu Arg Arg Tyr Ser
170 175 180
Arg Arg Phe Gln Thr Ile Asp Ile Glu Pro Asp Ile Glu Ala Leu
185 190 195
Leu Ser Gln Gly Pro Ser Cys Ala Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
200 205 210
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
215 220 225
Gly Gly Gly Ser Met Ala Ile His Ala Val Cys Val Leu Lys Gly
230 235 240
Asp Ser Pro Val Thr Gly Thr Ile His Leu Lys Glu Glu Gly Asp
245 250 255
Met Val Thr Val Thr Gly Glu Ile Thr Gly Leu Thr Pro Gly Lys
260 265 270
His Gly Phe His Val His Glu Phe Gly Asp Asn Thr Asn Gly Cys
275 280 285
Thr Ser Ala Gly Gly His Phe Asn Pro His Gly Lys Glu His Gly
290 295 300
Ala Pro Glu Asp Glu Asn Arg His Ala Gly Asp Leu Gly Asn Val
305 310 315
Val Ala Gly Glu Asp Gly Lys Ala Val Ile Asn Met Lys Asp Lys
320 325 330
Leu Val Lys Leu Thr Gly Pro Asp Ser Val Ile Gly Arg Thr Leu
335 340 345
Val Val His Val Asp Glu Asp Asp Leu Gly Arg Gly Gly His Glu
350 355 360
Gln Ser Lys Ile Thr Gly Asn Ala Gly Gly Arg Leu Ala Cys Gly
365 370 375
Val Ile Gly Ile Thr Lys Glu
380
〈210〉23
〈211〉398
〈212〉PRT
〈213〉人工序列
〈220〉
〈221〉CHAIN
〈222〉（-15)...(382）
〈223〉将庞贝蠕虫SOD和人GPx1的氨基酸序列经短肽连接而成，作为高活力及超稳定的双功能抗氧化酶
〈220〉
〈221〉连接肽
〈222〉（154-179）
〈223〉由甘氨酸和丝氨酸组成
〈220〉
〈221〉ACT_SITE
〈222〉（228）
〈223〉硒代半胱氨酸
〈400〉23
Met Asn His Lys Val His His His His His His Ile Glu Gly Arg His
-15 -10 -5
Met Ala Ile His Ala Val Cys Val Leu Lys Gly Asp Ser Pro Val
1 5 10 15
Thr Gly Thr Ile His Leu Lys Glu Glu Gly Asp Met Val Thr Val
20 25 30
Thr Gly Glu Ile Thr Gly Leu Thr Pro Gly Lys His Gly Phe His
35 40 45
Val His Glu Phe Gly Asp Asn Thr Asn Gly Cys Thr Ser Ala Gly
50 55 60
Gly His Phe Asn Pro His Gly Lys Glu His Gly Ala Pro Glu Asp
65 70 75
Glu Asn Arg His Ala Gly Asp Leu Gly Asn Val Val Ala Gly Glu
80 85 90
Asp Gly Lys Ala Val Ile Asn Met Lys Asp Lys Leu Val Lys Leu
95 100 105
Thr Gly Pro Asp Ser Val Ile Gly Arg Thr Leu Val Val His Val
110 115 120
Asp Glu Asp Asp Leu Gly Arg Gly Gly His Glu Gln Ser Lys Ile
125 130 135
Thr Gly Asn Ala Gly Gly Arg Leu Ala Cys Gly Val Ile Gly Ile
140 145 150
Thr Lys Glu Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
155 160 165
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Met
170 175 180
Cys Ala Ala Arg Leu Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gln Ser Val
185 190 195
Tyr Ala Phe Ser Ala Arg Pro Leu Ala Gly Gly Glu Pro Val Ser
200 205 210
Leu Gly Ser Leu Arg Gly Lys Val Leu Leu Ile Glu Asn Val Ala
215 220 225
Ser Leu Xaa Gly Thr Thr Val Arg Asp Tyr Thr Gln Met Asn Glu
230 235 240
Leu Gln Arg Arg Leu Gly Pro Arg Gly Leu Val Val Leu Gly Phe
245 250 255
Pro Cys Asn Gln Phe Gly His Gln Glu Asn Ala Lys Asn Glu Glu
260 265 270
Ile Leu Asn Ser Leu Lys Tyr Val Arg Pro Gly Gly Gly Phe Glu
275 280 285
Pro Asn Phe Met Leu Phe Glu Lys Cys Glu Val Asn Gly Ala Gly
290 295 300
Ala His Pro Leu Phe Ala Phe Leu Arg Glu Ala Leu Pro Ala Pro
305 310 315
Ser Asp Asp Ala Thr Ala Leu Met Thr Asp Pro Lys Leu Ile Thr
320 325 330
Trp Ser Pro Val Cys Arg Asn Asp Val Ala Trp Asn Phe Glu Lys
335 340 345
Phe Leu Val Gly Pro Asp Gly Val Pro Leu Arg Arg Tyr Ser Arg
350 355 360
Arg Phe Gln Thr Ile Asp Ile Glu Pro Asp Ile Glu Ala Leu Leu
365 370 375
Ser Gln Gly Pro Ser Cys Ala
380
〈210〉24
〈211〉397
〈212〉PRT
〈213〉人工序列
〈220〉
〈221〉CHAIN
〈222〉（-15)...(381）
〈223〉将人GPx1和庞贝蠕虫SOD的氨基酸序列经短肽连接而成，作为高活力及超稳定的双功能抗氧化酶
〈220〉
〈221〉连接肽
〈222〉（204-228）
〈223〉由甘氨酸和丝氨酸组成
〈220〉
〈221〉ACT_SITE
〈222〉（49）
〈223〉硒代半胱氨酸
〈400〉24
Met Asn His Lys Val His His His His His His Ile Glu Gly Arg His
-15 -10 -5
Met Cys Ala Ala Arg Leu Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gln Ser
1 5 10 15
Val Tyr Ala Phe Ser Ala Arg Pro Leu Ala Gly Gly Glu Pro Val
20 25 30
Ser Leu Gly Ser Leu Arg Gly Lys Val Leu Leu Ile Glu Asn Val
35 40 45
Ala Ser Leu Xaa Gly Thr Thr Val Arg Asp Tyr Thr Gln Met Asn
50 55 60
Glu Leu Gln Arg Arg Leu Gly Pro Arg Gly Leu Val Val Leu Gly
65 70 75
Phe Pro Cys Asn Gln Phe Gly His Gln Glu Asn Ala Lys Asn Glu
80 85 90
Glu Ile Leu Asn Ser Leu Lys Tyr Val Arg Pro Gly Gly Gly Phe
95 100 105
Glu Pro Asn Phe Met Leu Phe Glu Lys Cys Glu Val Asn Gly Ala
110 115 120
Gly Ala His Pro Leu Phe Ala Phe Leu Arg Glu Ala Leu Pro Ala
125 130 135
Pro Ser Asp Asp Ala Thr Ala Leu Met Thr Asp Pro Lys Leu Ile
140 145 150
Thr Trp Ser Pro Val Cys Arg Asn Asp Val Ala Trp Asn Phe Glu
155 160 165
Lys Phe Leu Val Gly Pro Asp Gly Val Pro Leu Arg Arg Tyr Ser
170 175 180
Arg Arg Phe Gln Thr Ile Asp Ile Glu Pro Asp Ile Glu Ala Leu
185 190 195
Leu Ser Gln Gly Pro Ser Cys Ala Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
200 205 210
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
215 220 225
Gly Gly Gly Met Ala Ile His Ala Val Cys Val Leu Lys Gly Asp
230 235 240
Ser Pro Val Thr Gly Thr Ile His Leu Lys Glu Glu Gly Asp Met
245 250 255
Val Thr Val Thr Gly Glu Ile Thr Gly Leu Thr Pro Gly Lys His
260 265 270
Gly Phe His Val His Glu Phe Gly Asp Asn Thr Asn Gly Cys Thr
275 280 285
Ser Ala Gly Gly His Phe Asn Pro His Gly Lys Glu His Gly Ala
290 295 300
Pro Glu Asp Glu Asn Arg His Ala Gly Asp Leu Gly Asn Val Val
305 310 315
Ala Gly Glu Asp Gly Lys Ala Val Ile Asn Met Lys Asp Lys Leu
320 325 330
Val Lys Leu Thr Gly Pro Asp Ser Val Ile Gly Arg Thr Leu Val
335 340 345
Val His Val Asp Glu Asp Asp Leu Gly Arg Gly Gly His Glu Gln
350 355 360
Ser Lys Ile Thr Gly Asn Ala Gly Gly Arg Leu Ala Cys Gly Val
365 370 375
Ile Gly Ile Thr Lys Glu
380
〈210〉25
〈211〉386
〈212〉PRT
〈213〉人工序列
〈220〉
〈221〉CHAIN
〈222〉（-15)...(370）
〈223〉将人GPx1和庞贝蠕虫SOD的氨基酸序列经短肽连接而成，作为高活力及超稳定的双功能抗氧化酶
〈220〉
〈221〉连接肽
〈222〉（192-217）
〈223〉由甘氨酸和丝氨酸组成
〈220〉
〈221〉ACT_SITE
〈222〉（37）
〈223〉硒代半胱氨酸
〈400〉25
Met Asn His Lys Val His His His His His His Ile Glu Gly Arg His
-15 -10 -5
Met Gln Ser Val Tyr Ala Phe Ser Ala Arg Pro Leu Ala Gly Gly
1 5 10 15
Glu Pro Val Ser Leu Gly Ser Leu Arg Gly Lys Val Leu Leu Ile
20 20 30
Glu Asn Val Ala Ser Leu Xaa Gly Thr Thr Val Arg Asp Tyr Thr
35 40 45
Gln Met Asn Glu Leu Gln Arg Arg Leu Gly Pro Arg Gly Leu Val
50 55 60
Val Leu Gly Phe Pro Cys Asn Gln Phe Gly His Gln Glu Asn Ala
65 70 75
Lys Asn Glu Glu Ile Leu Asn Ser Leu Lys Tyr Val Arg Pro Gly
80 85 90
Gly Gly Phe Glu Pro Asn Phe Met Leu Phe Glu Lys Cys Glu Val
95 100 105
Asn Gly Ala Gly Ala His Pro Leu Phe Ala Phe Leu Arg Glu Ala
110 115 120
Leu Pro Ala Pro Ser Asp Asp Ala Thr Ala Leu Met Thr Asp Pro
125 130 135
Lys Leu Ile Thr Trp Ser Pro Val Cys Arg Asn Asp Val Ala Trp
140 145 150
Asn Phe Glu Lys Phe Leu Val Gly Pro Asp Gly Val Pro Leu Arg
155 160 165
Arg Tyr Ser Arg Arg Phe Gln Thr Ile Asp Ile Glu Pro Asp Ile
170 175 180
Glu Ala Leu Leu Ser Gln Gly Pro Ser Cys Ala Ser Gly Gly Gly
185 190 195
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
200 205 210
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Met Ala Ile His Ala Val Cys Val
215 220 225
Leu Lys Gly Asp Ser Pro Val Thr Gly Thr Ile His Leu Lys Glu
230 235 240
Glu Gly Asp Met Val Thr Val Thr Gly Glu Ile Thr Gly Leu Thr
245 250 255
Pro Gly Lys His Gly Phe His Val His Glu Phe Gly Asp Asn Thr
260 265 270
Asn Gly Cys Thr Ser Ala Gly Gly His Phe Asn Pro His Gly Lys
275 280 285
Glu His Gly Ala Pro Glu Asp Glu Asn Arg His Ala Gly Asp Leu
290 295 300
Gly Asn Val Val Ala Gly Glu Asp Gly Lys Ala Val Ile Asn Met
305 310 315
Lys Asp Lys Leu Val Lys Leu Thr Gly Pro Asp Ser Val Ile Gly
320 325 330
Arg Thr Leu Val Val His Val Asp Glu Asp Asp Leu Gly Arg Gly
335 340 345
Gly His Glu Gln Ser Lys Ile Thr Gly Asn Ala Gly Gly Arg Leu
350 355 360
Ala Cys Gly Val Ile Gly Ile Thr Lys Glu
365 370
〈210〉26
〈211〉386
〈212〉PRT
〈213〉人工序列
〈220〉
〈221〉CHAIN
〈222〉（-15)...(370）
〈223〉将庞贝蠕虫SOD和人GPx1的氨基酸序列经短肽连接而成，作为高活力及超稳定的双功能抗氧化酶
〈220〉
〈221〉连接肽
〈222〉（154-179）
〈223〉由甘氨酸和丝氨酸组成
〈220〉
〈221〉ACT_SITE
〈222〉（216）
〈223〉硒代半胱氨酸
〈400〉26
Met Asn His Lys Val His His His His His His Ile Glu Gly Arg His
-15 -10 -5
Met Ala Ile His Ala Val Cys Val Leu Lys Gly Asp Ser Pro Val
1 5 10 15
Thr Gly Thr Ile His Leu Lys Glu Glu Gly Asp Met Val Thr Val
20 25 30
Thr Gly Glu Ile Thr Gly Leu Thr Pro Gly Lys His Gly Phe His
35 40 45
Val His Glu Phe Gly Asp Asn Thr Asn Gly Cys Thr Ser Ala Gly
50 55 60
Gly His Phe Asn Pro His Gly Lys Glu His Gly Ala Pro Glu Asp
65 70 75
Glu Asn Arg His Ala Gly Asp Leu Gly Asn Val Val Ala Gly Glu
80 85 90
Asp Gly Lys Ala Val Ile Asn Met Lys Asp Lys Leu Val Lys Leu
95 100 105
Thr Gly Pro Asp Ser Val Ile Gly Arg Thr Leu Val Val His Val
110 115 120
Asp Glu Asp Asp Leu Gly Arg Gly Gly His Glu Gln Ser Lys Ile
125 130 135
Thr Gly Asn Ala Gly Gly Arg Leu Ala Cys Gly Val Ile Gly Ile
140 145 150
Thr Lys Glu Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
155 160 165
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Met
170 175 180
Gln Ser Val Tyr Ala Phe Ser Ala Arg Pro Leu Ala Gly Gly Glu
185 190 195
Pro Val Ser Leu Gly Ser Leu Arg Gly Lys Val Leu Leu Ile Glu
200 205 210
Asn Val Ala Ser Leu Xaa Gly Thr Thr Val Arg Asp Tyr Thr Gln
215 220 225
Met Asn Glu Leu Gln Arg Arg Leu Gly Pro Arg Gly Leu Val Val
230 235 240
Leu Gly Phe Pro Cys Asn Gln Phe Gly His Gln Glu Asn Ala Lys
245 250 255
Asn Glu Glu Ile Leu Asn Ser Leu Lys Tyr Val Arg Pro Gly Gly
260 265 270
Gly Phe Glu Pro Asn Phe Met Leu Phe Glu Lys Cys Glu Val Asn
275 280 285
Gly Ala Gly Ala His Pro Leu Phe Ala Phe Leu Arg Glu Ala Leu
290 295 300
Pro Ala Pro Ser Asp Asp Ala Thr Ala Leu Met Thr Asp Pro Lys
305 310 315
Leu Ile Thr Trp Ser Pro Val Cys Arg Asn Asp Val Ala Trp Asn
320 325 330
Phe Glu Lys Phe Leu Val Gly Pro Asp Gly Val Pro Leu Arg Arg
335 340 345
Tyr Ser Arg Arg Phe Gln Thr Ile Asp Ile Glu Pro Asp Ile Glu
350 355 360
Ala Leu Leu Ser Gln Gly Pro Ser Cys Ala
365 370
Claims (5)
1.一种兼具谷胱甘肽过氧化物酶和超氧化物歧化酶活性的双功能抗氧化酶，其特征在于：其氨基酸序列如SEQ ID No：17、SEQ ID No：18、SEQ ID No：19、SEQ ID No：20、SEQ IDNo：21、SEQ ID No：22、SEQ ID No：23、SEQ ID No：24、SEQ ID No：25或SEQ ID No：26所示。
2.权利要求1所述的一种兼具谷胱甘肽过氧化物酶和超氧化物歧化酶活性的双功能抗氧化酶的制备方法，其步骤如下：
1)、载体的构建：根据中国专利201510431360.1公开的杂合tRNA的碱基序列SEQ IDNo：1、SEQ ID No：2、SEQ ID No：3、SEQ ID No：4、SEQ ID No：5、SEQ ID No：6、SEQ ID No：7、SEQ ID No：8、SEQ ID No：9、SEQ ID No：10、SEQ ID No：11、SEQ ID No：12、SEQ ID No：13、SEQ ID No：14、SEQ ID No：15或SEQ ID No：16，在生物公司用DNA合成仪人工合成对应的编码基因，确保杂合tRNA基因的5′端含有lpp启动子序列和特定的酶切位点，3′端含有rrnc终止子序列和特定酶切位点；用相同的限制性核酸内切酶切割两端含特定酶切位点的杂合tRNA基因和用来表达该杂合tRNA的分泌型原核表达载体，再用DNA连接酶通过特定的酶切位点将杂合tRNA基因组装到分泌型原核表达载体的多克隆位点以外，得到含有杂合tRNA的分泌型原核表达载体；所述的特定的酶切位点可以是表达载体的多克隆位点以外序列含有的而杂合tRNA基因中不存在的任何一个酶切位点，是载体上固有的由限制性核酸内切酶识别的碱基组成的DNA序列；
目的基因序列是将氨基酸序列如SEQ ID No：17、SEQ ID No：18、SEQ ID No：19、SEQ IDNo：20、SEQ ID No：21或SEQ ID No：22、SEQ ID No：23、SEQ ID No：24、SEQ ID No：25、SEQID No：26所示的GPX-L-SOD或SOD-L-GPX基因中硒代半胱氨酸的编码序列替换为琥珀型终止密码子TAG后的基因，在生物公司用DNA合成仪人工合成该目的基因序列对应的编码基因，确保两端都含有特定的酶切位点；用相同的限制性核酸内切酶切割两端含特定酶切位点的GPX-L-SOD或SOD-L-GPX基因和上步获得的含有杂合tRNA的分泌型原核表达载体，再用DNA连接酶通过特定的酶切位点将GPX-L-SOD或SOD-L-GPX基因组装到该分泌型原核表达载体的多克隆位点上；所述的特定的酶切位点可以是表达载体的多克隆位点中含有的而GPX-L-SOD或SOD-L-GPX基因中不存在的任何一个酶切位点，是载体上固有的由限制性核酸内切酶识别的碱基组成的DNA序列；
2)、阳性转化子的筛选及蛋白的表达与纯化：
用步骤1)中构建的含有杂合tRNA基因的和编码序列中含TAG的目的基因的表达载体转化UAG通读工程菌-C321.ΔA.exp的感受态细胞，涂含氨苄抗性的营养琼脂平板，筛选阳性菌株；将阳性转化子扩大培养后，在含有亚硒酸钠的营养琼脂培养基中，经IPTG低温4～25℃诱导表达，在杂合tRNA的识别下，将UAG编码为硒代半胱氨酸，直接表达出在底物GSH的结合部位含有硒代半胱氨酸的GPX-L-SOD或SOD-L-GPX，酶蛋白以可溶性形式表达并分泌到菌体的周质腔里；抗性筛选获得的菌株经37℃扩大培养后，转至4～25℃诱导表达；收集、洗涤、冰浴下超声破碎菌体、释放酶蛋白，将液体低温离心，去除菌体沉淀、获得上清液；用谷胱甘肽(GSH)亲和层析纯化GPX-L-SOD或SOD-L-GPX蛋白，透析冻干后即得到高活力兼具谷胱甘肽过氧化物酶和超氧化物歧化酶活性的双功能抗氧化酶GPX-L-SOD或SOD-L-GPX蛋白纯品。
3.权利要求1所述的一种兼具谷胱甘肽过氧化物酶和超氧化物歧化酶活性的双功能抗氧化酶的制备方法，其步骤如下：
1)、表达载体的构建：
根据中国专利201510431360.1公开的杂合tRNA的碱基序列SEQ ID No：1、SEQ ID No：2、SEQ ID No：3、SEQ ID No：4、SEQ ID No：5、SEQ ID No：6、SEQ ID No：7、SEQ ID No：8、SEQID No：9、SEQ ID No：10、SEQ ID No：11、SEQ ID No：12、SEQ ID No：13、SEQ ID No：14、SEQID No：15或SEQ ID No：16，在生物公司用DNA合成仪人工合成对应的编码基因，确保杂合tRNA基因的5′端含有lpp启动子序列和特定的酶切位点，3′端含有rrnc终止子序列和特定酶切位点；用相同的限制性核酸内切酶切割两端含特定酶切位点的杂合tRNA基因和用来表达该杂合tRNA的分泌型原核表达载体，再用DNA连接酶通过特定的酶切位点将杂合tRNA基因组装到分泌型原核表达载体的多克隆位点以外，得到含有杂合tRNA的分泌型原核表达载体；所述的特定的酶切位点可以是表达载体的多克隆位点以外序列含有的而杂合tRNA基因中不存在的任何一个酶切位点，是载体上固有的由限制性核酸内切酶识别的碱基组成的DNA序列；
根据基因文库中公开的GPX和SOD的基因序列设计引物，扩增其编码基因，在设计引物时，确保GPX基因的5′端含有起始密码子(ATG)，3′端不含终止密码子，但含有GPX-L-SOD中间的连接肽基因序列，SOD基因的5′端引物有一部分与GPX基因的3′端引物重合，SOD基因的3′端含终止密码子，且GPX-L-SOD基因两端都含有特定的酶切位点，其它氨基酸序列不变；用重叠PCR扩增GPX-L-SOD基因，回收分子量最大的产物片段即为GPX-L-SOD基因；同理可获得SOD-L-GPX基因；用相同的限制性核酸内切酶切割GPX-L-SOD或SOD-L-GPX基因和上步获得的含有杂合tRNA的分泌型原核表达载体(如pCold-tRNA等)，再用DNA连接酶通过特定的酶切位点将GPX-L-SOD或SOD-L-GPX基因组装到该分泌型原核表达载体的多克隆位点上；在保持其它氨基酸序列不变的前提下，根据GPX中唯一的硒代半胱氨酸和它比邻的氨基酸的基因序列设计完全等长互补的两条定点突变引物，以硒代半胱氨酸的密码子为中心，引物长25-50bp，用定点突变引物和快速定点突变试剂盒，将构建在原核表达载体上的GPX-L-SOD或SOD-L-GPX基因中的硒代半胱氨酸的编码序列突变为TAG，且无其它意外基因突变发生，确保突变后的基因能在UAG通读工程菌株中表达本发明所述的GPX-L-SOD或SOD-L-GPX酶蛋白；所述的特定的酶切位点可以是表达载体的多克隆位点中含有的而GPX-L-SOD或SOD-L-GPX基因中不存在的任何一个酶切位点，是载体上固有的由限制性核酸内切酶识别的碱基组成的DNA序列；
2)、阳性转化子的筛选及蛋白的表达与纯化：
用步骤1)中构建的含有杂合tRNA基因的和编码序列中含TAG的目的基因的表达载体转化UAG通读工程菌-C321.ΔA.exp的感受态细胞，涂含氨苄抗性的营养琼脂平板，筛选阳性菌株；将阳性转化子扩大培养后，在含有亚硒酸钠的营养琼脂培养基中，经IPTG低温4～25℃诱导表达，UAG通读工程菌无法终止UAG密码子，在杂合tRNA的识别下，将UAG编码为硒代半胱氨酸，直接表达出在底物GSH的结合部位含有硒代半胱氨酸的GPX-L-SOD或SOD-L-GPX，酶蛋白以可溶性形式表达并分泌到菌体的周质腔里；抗性筛选获得的菌株经37℃扩大培养后，转至4～25℃诱导表达；收集、洗涤、冰浴下超声破碎菌体、释放酶蛋白，将液体低温离心，去除菌体沉淀、获得上清液；用谷胱甘肽(GSH)亲和层析纯化GPX-L-SOD或SOD-L-GPX蛋白，透析冻干后即得到高活力兼具谷胱甘肽过氧化物酶和超氧化物歧化酶活性的双功能抗氧化酶GPX-L-SOD或SOD-L-GPX蛋白纯品。
4.如权利要求2或3所述的一种兼具谷胱甘肽过氧化物酶和超氧化物歧化酶活性的双功能抗氧化酶的制备方法，其特征在于：所述的用谷胱甘肽(GSH)亲和层析纯化GPX-L-SOD或SOD-L-GPX蛋白，是用pH7.5、50mmol/L Tris-Cl平衡并洗脱杂蛋白，用含10mmol/L GSH的缓冲液洗脱目的蛋白。
5.如权利要求2或3所述的一种兼具谷胱甘肽过氧化物酶和超氧化物歧化酶活性的双功能抗氧化酶的制备方法，其特征在于：所述的将液体低温离心，是在4℃、8000～12000g条件下离心15～30min。
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|---|---|---|---|
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|---|---|---|---|
| CN201710583460.5A CN107177561A (zh) | 2017-07-18 | 2017-07-18 | 兼具谷胱甘肽过氧化物酶和超氧化物歧化酶活性的双功能抗氧化酶及其制备方法 |
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Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN109402129A (zh) * | 2018-09-30 | 2019-03-01 | 中山大学 | 一种广州管圆线虫Acsod3基因及其在治疗或缓解广州管圆线虫病中的应用 |
| CN111728890A (zh) * | 2020-08-10 | 2020-10-02 | 吉林大学 | 重组谷胱甘肽过氧化物酶及其双功能抗氧化酶在抗氧化抗衰老方面的应用 |
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-
2017
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