CN110841109A - 使用人脐带组织来源细胞和水凝胶治疗椎间盘退变 - Google Patents

Abstract

本发明提供了治疗患有与IVD退变相关的疾病或病症的患者的方法。所述方法包括施用从人脐带组织获得的细胞或施用包含此类细胞或由此类细胞和水凝胶制备的药物组合物。在一些实施例中，施用所述细胞促进所述患者中的退变IVD组织的修复和再生。本发明还提供了用于本发明方法的药物组合物以及用于实践所述方法的试剂盒。

Description

使用人脐带组织来源细胞和水凝胶治疗椎间盘退变

本申请是申请日为2012年5月17日，申请号为201280024401.X，发明名称为“使用人脐带组织来源细胞和水凝胶治疗椎间盘退变”的发明专利的分案申请。

技术领域

本发明整体涉及基于细胞的疗法的领域。在一些方面，本发明涉及使用脐带组织来源细胞治疗与椎间盘退变相关的疾病或病症。

背景技术

本说明书通篇引用了多种出版物，包括专利、公布的专利申请、技术文献和学术文献。这些引用的出版物各自出于所有目的全文均以引用方式并入本文。

下背痛是最常见残障之一，造成患者明显的身体和情绪不适感。椎间盘(IVD)结构退化是下背痛的主要原因之一。IVD由围绕较软凝胶状髓核的纤维状外部纤维环形成。纤维环的纤维连接至脊髓的椎体的终板并包绕髓核，从而形成等压环境。在轴向载荷下，髓核压缩并将该载荷径向传递至纤维环。纤维环的层状性质为其提供了高抗拉强度，因此允许其响应于该传递的载荷而径向膨胀。

在健康的IVD中，髓核内的细胞仅形成按体积计约百分之一的椎间盘组织。这些细胞产生包含高百分比蛋白聚糖的细胞外基质(ECM)。蛋白聚糖包含保持水的硫酸化官能团，从而为髓核提供了其缓冲特性。髓核细胞还可分泌少量细胞因子和基质金属蛋白酶(MMP)，这些物质有助于调节髓核细胞的代谢。

在IVD疾病的一些情况下，IVD的逐渐退变由脊柱其他部分的机械不稳定造成。在这些情况下，增大对髓核的载荷和压力会造成椎间盘内的细胞(或侵入巨噬细胞)释放高于正常量的上述细胞因子。在IVD疾病的其他情况下，遗传因素或细胞凋亡会造成椎间盘细胞数量下降和/或释放有毒量的细胞因子和MMP。在一些情况下，椎间盘的泵送作用可能出故障(由于例如髓核内蛋白聚糖浓度降低)，从而减缓了营养物质流入椎间盘的速度以及废弃产物流出椎间盘的速度。该减小的向细胞提供营养物质并排出废物的能力可导致细胞活性和代谢降低，造成ECM进一步降解，同时积累高水平的毒素而可使神经受刺激并引起疼痛。

随着IVD退变发展，髓核中存在的细胞因子和MMP的毒素水平开始降解ECM。具体地讲，MMP(由细胞因子介导)开始切割蛋白聚糖的水保持部分，从而降低了其水保持能力。该降解导致髓核柔性减小，改变了椎间盘内的载荷模式，继而可引起纤维环分层。这些变化造成更大的机械不稳定性，可使细胞释放甚至更多细胞因子，引起MMP上调。随着该破坏级联继续且IVD退变发展，椎间盘开始膨出(“椎间盘突出”)，然后最终破裂，使得髓核接触脊髓并引起疼痛。

当前，IVD退变的主要疗法是外科手术干预，在外科手术干预过程中将退变椎间盘切除或与邻近椎间盘融合。外科手术疗法目的在于缓解疼痛或IVD退变的其他症状，但无法做到修复或再生患病IVD。治疗退变IVD细胞和组织的一种方法是采用基于细胞的疗法，其中通过施用活细胞来修复、置换和/或重塑患病组织。最近的几项研究探讨了使用基于细胞的疗法治疗退变IVD病症。例如，美国专利No.6,352,557(“Ferree”)和6,340,369(“FerreeII”)教导了从患者获取活IVD细胞，培养细胞以及将它们移植到受损IVD中。相似地，Alini,Eur.Spine J.,2002:11(Supp.2):S215-220(Alini，《欧洲脊柱杂志》，2002年，第11卷(增刊2)，第S215-220页)描述了从髓核分离和培养细胞，将细胞埋植到生物基质中，然后将埋植的细胞注射到患者体内，使受损IVD恢复功能。这些方法虽然充满前景，但在修复退变IVD时表现出效力有限，并遭受因细胞供体与受体之间的免疫不相容性引发的并发症。

替代的基于细胞的疗法的方法是使用干细胞，干细胞能够分裂并分化成构成患病组织的细胞。干细胞移植可用作重构靶组织从而恢复生理和结构功能的临床工具。干细胞技术的应用非常广泛，包括组织工程、基因治疗递送和细胞疗法，即，将生物治疗剂经由产生或包含这些药剂的外源提供的活细胞或细胞组分递送到靶位置(相关综述，请参见Tresco,P.A.et al.,Advanced Drug Delivery Reviews,2000；42:2-37(Tresco,P.A.等人，《先进药物递送综述》，2000年，第42卷，第2-37页))。干细胞的鉴定推动了以选择性生成再生药物用特定细胞类型为目的的研究。实现干细胞技术的治疗潜能的一个障碍是难以获得足够数量的干细胞。胚胎或胎儿组织是干细胞的一种来源。已从包括人类的多种哺乳动物物种分离出胚胎干细胞和祖细胞，并且已证实若干此类细胞类型能够自我更新并扩增以及分化成多种不同细胞系。然而，从胚胎和胎儿来源得到干细胞引发了许多伦理和道德问题，从而阻止了胚胎干细胞疗法的进一步发展。

因此本领域需要避开胚胎和胎儿干细胞相关问题的基于干细胞的疗法。产后组织例如脐带和胎盘用作多潜能或多能干细胞的替代来源已受到关注。例如，通过灌注胎盘或者从脐带血或组织收集来回收干细胞的方法已有所描述。由这些方法获得干细胞的局限性在于不能获得足够体积的脐带血或足够数量的细胞，以及从这些来源获得的细胞群存在异质性或尚未表征。

因此，可靠、充分表征且来源充足的能够分化成表型类似于内源IVD细胞的细胞的基本上同质的干细胞群将有利于多种诊断和治疗应用，以修复、再生和/或置换IVD细胞，并重建和/或重塑IVD组织。

发明内容

在一个方面，本文提供了用于治疗与IVD退变(IDD)相关的疾病或病症的方法。所述方法包括施用有效治疗疾病或病症的量的脐带组织来源细胞。从中获得细胞的脐带组织优选地基本上不含血。脐带组织来源细胞优选地能够在培养时自我更新和扩增并具有分化成例如IVD细胞表型的潜能；生长需要L-缬氨酸；可在至少约5％氧中生长；不会产生CD117或HLA-DR或端粒酶；表达α平滑肌肌动蛋白；并且相对于人成纤维细胞、间充质干细胞或髂嵴骨髓细胞，表达提高水平的白介素8和浆膜蛋白1。

在另一个方面，提供了用于治疗与IVD退变相关的疾病或病症的药物组合物，所述组合物包含药学上可接受的载体和有效治疗所述疾病或病症的量的脐带组织来源细胞，其中从中获得细胞的脐带组织基本上不含血，并且其中细胞能够在培养时自我更新和扩增并具有分化成例如IVD细胞表型的潜能；生长需要L-缬氨酸；可在至少约5％氧中生长；不会产生CD117或HLA-DR或端粒酶；表达α平滑肌肌动蛋白；并且相对于人成纤维细胞、间充质干细胞或髂嵴骨髓细胞，表达提高水平的白介素8和浆膜蛋白1。

根据另一个方面，提供了用于治疗患有与IVD退变相关的疾病或病症的患者的试剂盒，所述试剂盒包含在治疗与IVD退变相关的疾病或病症的方法中使用该试剂盒的使用说明、药学上可接受的载体和有效治疗所述疾病或病症的量的脐带组织来源细胞，其中从中获得细胞的脐带组织基本上不含血，并且其中细胞能够在培养时自我更新和扩增并具有分化成例如IVD细胞表型的潜能；生长需要L-缬氨酸；可在至少约5％氧中生长；不会产生CD117或HLA-DR或端粒酶；表达α平滑肌肌动蛋白；并且相对于人成纤维细胞、间充质干细胞或髂嵴骨髓细胞，表达提高水平的白介素8和浆膜蛋白1。在一些实施例中，本文所提供的试剂盒还包含用于培养细胞的至少一种试剂和/或使用说明。在一些实施例中，本文所提供的试剂盒包含用于诱导细胞使其在体外至少部分地分化成例如显示髓核细胞表型和/或纤维环细胞表型的细胞的使用说明。

在各种实施例中，本文所述的方法、组合物和/或试剂盒中使用的脐带组织来源细胞表达氧化低密度脂蛋白受体1、浆膜蛋白、趋化因子受体配体3、和/或粒细胞趋化蛋白2。在一些实施例中，本文所述的脐带组织来源细胞表达CD10、CD13、CD44、CD73和CD90。在一些实施例中，本文所述的脐带组织来源细胞能够分化成纤维环和/或髓核细胞。

在各种实施例中，与IVD退变相关的疾病或病症可由年龄、创伤、自体免疫、炎症反应、遗传缺陷、免疫复合物沉着和/或其组合造成或引起。靶向治疗的IVD可以是未受损的或处于损伤或退变的任何阶段。例如，靶向治疗的IVD可以是突出的、破裂的、分层的和/或以其他方式损伤或退变的。

在一些实施例中，本文所提供的方法包括施用未分化的脐带组织来源细胞或细胞衍生物。人脐带组织来源细胞产生有益的营养因子，包括但不限于细胞因子、生长因子、蛋白酶抑制剂、促进内源IVD祖细胞或前体细胞存活、生长和分化的细胞外基质蛋白。此处所述的营养因子可由移植的人脐带组织来源细胞直接分泌到宿主环境中。可在体外从人脐带组织来源细胞收集营养因子或其他细胞衍生物，随后将其引入患者体内。

在一些实施例中，体外诱导本文所述的脐带组织来源细胞，使其在细胞施用之前、之后或同时，分化成软骨细胞系的细胞，和/或分化成显示纤维环细胞、髓核细胞和/或另一种IVD样细胞的表型的细胞。因此，在一些实施例中，本文所提供的方法还包括诱导脐带组织来源细胞使其在体外至少部分地分化的步骤。

在一些实施例中，脐带组织来源细胞可经基因工程化以表达基因产物，例如但不限于促进IVD组织修复和/或再生的基因产物。例如，在一些实施例中，脐带组织来源细胞经基因工程化以表达营养因子或其他基因产物。在一些实施例中，所述基因产物具有营养作用或以其他方式调节脐带组织来源细胞、与脐带组织来源细胞一起施用的另外细胞类型、内源IVD细胞和/或其他内源细胞。在一些实施例中，所述基因产物为细胞外基质的组分或调节细胞外基质的药剂。在一些实施例中，所述基因产物刺激一种或多种细胞外基质蛋白的表达。

在一些实施例中，脐带组织来源细胞与至少一种其他细胞类型一起施用，例如但不限于纤维环细胞、髓核细胞、成纤维细胞、软骨细胞、间充质干细胞、脂肪组织来源细胞、或另外的多潜能或多能干细胞类型。所述至少一种其他细胞类型可在施用脐带组织来源细胞的同时、之前或之后施用。

在一些实施例中，脐带组织来源细胞与至少一种药剂一起施用。例如，在一些实施例中，脐带组织来源细胞与营养因子，例如但不限于TGF-β、GDF-5、TIMP-1和PDGF-BB一起施用。在各种实施例中，所述至少一种药剂对脐带组织来源细胞具有营养作用或以其他方式调节脐带组织来源细胞、与脐带组织来源细胞一起施用的一种或多种另外细胞类型、内源IVD细胞和/或其他内源细胞。在一些实施例中，所述至少一种药剂刺激一种或多种细胞外基质蛋白的表达。其他药剂包括但不限于抗炎剂、细胞存活剂、疼痛减轻剂和免疫调节剂。药剂可在施用脐带组织来源细胞的同时、之前或之后施用。

在各个方面，可通过注射进IVD，包括例如退变IVD的髓核和/或纤维环，来施用、定向施用或配制施用细胞。在一些实施例中，细胞被施用、定向施用或配制施用，使得细胞封装于可植入装置内，或通过植入包含细胞的装置或基质施用。

本发明的另一个实施例是治疗与椎间盘退变相关的疾病或病症的方法，所述方法包括将药物组合物以有效治疗所述疾病或病症的量施用至椎间盘，所述药物组合物包含至少(1)水凝胶和(2)从人脐带组织获得的分离的同质细胞群，其中脐带组织基本上不含血，并且其中分离的同质细胞群能够在培养时自我更新、扩增，并且具有分化的潜能，但不表达CD117和/或端粒酶。分离的同质细胞群还可具有下列特性中的任何一个：(a)表达浆膜蛋白、趋化因子受体配体3和粒细胞趋化蛋白；(b)不产生CD31、CD34和HLA-DR；(c)相对于人成纤维细胞、间充质干细胞或髂嵴骨髓细胞，表达提高水平的白介素8和浆膜蛋白1；以及(d)表达CD10、CD13、CD44、CD73和CD90。在本发明的另一个实施例中，分离的同质细胞群表达氧化低密度脂蛋白受体1、浆膜蛋白、趋化因子受体配体3和/或粒细胞趋化蛋白。组合物可通过注射来施用。在一个实施例中，组合物还包含(a)至少一种其他细胞类型，其可经工程化以表达至少一种外源基因产物(例如营养因子)和/或(b)至少一种药剂，例如营养因子(如TGF-β、GDF-5、PDGF-BB和TIMP1)。在另一个实施例中，将组合物施用至退变椎间盘例如髓核中或施用至椎间盘的纤维环中。可在施用之前至少部分地诱导分离的细胞群使其在体外分化。在本发明的一个实施例中，诱导分离的同质细胞群使其分化成显示纤维环细胞表型的细胞或分化成显示髓核细胞表型的细胞。

本发明的另一个实施例是治疗与椎间盘退变相关的疾病或病症的方法，所述方法包括将水凝胶和从人脐带组织获得的分离的同质细胞群以有效治疗所述疾病或病症的量施用至椎间盘，其中脐带组织基本上不含血，并且其中分离的同质细胞群能够在培养时自我更新、扩增，并且具有分化的潜能，但不表达CD117和/或端粒酶。分离的同质细胞群还可具有下列特性中的任何一个：(a)表达浆膜蛋白、趋化因子受体配体3和粒细胞趋化蛋白；(b)不产生CD31、CD34和HLA-DR；(c)相对于人成纤维细胞、间充质干细胞或髂嵴骨髓细胞，表达提高水平的白介素8和浆膜蛋白1；以及(d)表达CD10、CD13、CD44、CD73和CD90。在另一个实施例中，分离的同质细胞群表达氧化低密度脂蛋白受体1、浆膜蛋白、趋化因子受体配体3和粒细胞趋化蛋白。水凝胶和分离的同质细胞群可通过注射来施用。水凝胶可在施用从人脐带组织获得的分离的同质细胞群的同时或之前或之后施用。在一个实施例中，分离的同质细胞群在可植入装置内施用。在另一个实施例中，所述方法还包括在施用从人脐带组织获得的分离的同质细胞群的同时或之前或之后施用至少一种其他细胞类型。所述至少一种其他细胞类型可经工程化以表达至少一种外源基因产物(例如营养因子或调节一种或多种细胞外基质蛋白的表达的外源基因产物)。

所述方法还可包括施用至少一种药剂例如营养因子(如，TGF-β、GDF-5、PDGF-BB和TIMP1)，所述营养因子可对从人脐带组织获得的分离的同质细胞群具有营养作用。在一些实施例中，将分离的同质细胞群和水凝胶施用至退变的椎间盘例如椎间盘的髓核或椎间盘的纤维环中。在其他实施例中，诱导从人脐带组织获得的分离的同质细胞群使其在体外至少部分地分化。可诱导分离的同质细胞群使其分化成显示纤维环细胞表型的细胞或分化成显示髓核细胞表型的细胞。

本发明的另一个实施例为治疗与椎间盘退变相关的疾病或病症的方法，所述方法包括施用有效治疗所述疾病或病症的量的水凝胶。本领域已知的任何水凝胶(例如本文所公开的那些)可用于该方法。在一个实施例中，水凝胶包含纤维蛋白原和凝血酶。在另一个实施例中，水凝胶包含纤维蛋白胶例如

纤维蛋白胶(

纤维蛋白封闭剂(人)，奥姆里克斯制药公司(Omrix Pharmaceuticals,Ltd.))。

下文是附图所示的本发明优选实施例的更为具体的说明，通过这些说明，本发明的上述及其他特征和优点将显而易见。

附图说明

在结合附图阅读上述发明内容以及以下对本发明的详细说明时能够更好地进行理解。出于说明本发明的目的，附图展示了本发明的实施例。然而应当理解，本发明不局限于示出的精确布置方式、实例和工具。

图1和2示出了腰脊MRI(参见实例12)。正中矢状面T2加权MRI示出了对照组中看上去健康的椎间盘。穿刺组中的椎间盘发生退变(变暗且丢失高度)。处理组中的椎间盘发生的退变不如穿刺组中的椎间盘明显。具体地讲，图1和2示出了在时间点0(环状穿刺之前)、3周(注射外科手术之前)、6周、和12周(处死之前)时L1-2至L5-6的样品T2加权正中矢状面腰椎MRI图像。穿刺的椎间盘(L2-3、L3-4和L4-5)用方框(从上到下为L2-3、L3-4和L4-5)勾画出。未穿刺的对照椎间盘(L1-2和L5-6)未显示任何退变迹象。正如预期，对照样本的椎间盘未退变(图1A)。穿刺的椎间盘(图1B)随时间点变得越来越小，越来越暗，说明发生了退变。穿刺后用载体(图1C)、细胞+缓冲液(图2A)和细胞+载体(图2B)处理的椎间盘证实随时间点的退变不如穿刺的椎间盘(图1B)明显。

图3示出了T2加权MRI(椎间盘面积和MRI指数)(参见实例12)。具体地讲，组合每个兔子组的L2-3、L3-4和L4-5(处理的椎间盘)、表示为时间0值的百分比的平均NP MRI面积(图3A)和MRI指数(图3B)，证实穿刺的组随时间点发生最大程度的面积和指数下降，而穿刺后用载体、缓冲液中的细胞(B+C)、或载体中的细胞(C+C)处理的组发生较小程度的面积和指数下降。在图3中，

指示与对照相比的显著性，*指示与穿刺相比的显著性。另外，图3中的MRI指数按如下方式测定：

MRI指数＝NP面积×信号强度

图4示出了12周后的包埋L3-4FSU的平均归一化总位移(斜坡阶段+蠕变)曲线(参见实例12)。在恒定载荷下与时间相关的位移产生看起来不同的蠕变曲线。缓冲液+细胞行为更类似穿刺组，载体+细胞行为更类似对照，单独的载体介于两者之间的某位置。产生每种情况的平均蠕变曲线。轴向测试产生在测试早期(时间0至200秒)看起来不同的蠕变曲线。虚线边界表示测量标准偏差。穿刺组和缓冲液+细胞产生的曲线看起来相似，对照和载体+细胞的曲线也是如此。这些组中的每个组看起来都不同于载体组产生的曲线。

图5、6和7示出了每个处理组在12周时处死后获得的椎间盘L4-5的、用苏木精-伊红染色并放大20倍和100倍的组织学矢状切片(参见实例12)。图5A示出了对照组的椎间盘L4-5的组织学矢状切片。图5B示出了穿刺组的椎间盘L4-5的组织学矢状切片。图6A示出了载体组的椎间盘L4-5的组织学矢状切片。图6B示出了缓冲液和细胞组的椎间盘L4-5的组织学矢状切片。图7示出了载体和细胞组的椎间盘L4-5的组织学矢状切片。

具体实施方式

与本发明的方法和其他方面相关的各种术语在说明书和权利要求书中通篇使用。除非另外指明，否则此类术语被赋予本领域的通常含义。其他具体定义的术语应按照与本文所提供的定义相符的方式理解。

如本说明书和所附权利要求中所用，除非内容另有明确说明，否则单数形式“一个”、“一种”和“所述”包括复数含义。因此，例如，对“一个细胞”的提及包括两个或更多个细胞的组合等等。

如本文所用，术语“约”在涉及可测量值例如量、时距等等时，意指涵盖与指定值±20％或±10％，更优选地±5％，甚至更优选地±1％，还更优选地±0.1％的变化，因为此类变化适合执行本发明所公开的方法。

“衍生的”用于指示从其生物来源获得细胞并在体外生长、培养扩增、永生化或以其他方式操作。

“分离的”意指“通过人工操作”改变天然状态。如果分子或组合物天然存在，当其已从原始环境改变或移除或者两者兼有时其已被“分离”。

核酸分子或基因的术语“表达了”、“经表达”、或“表达”是指基因产物的生物合成，例如多肽的生物合成。

“营养因子”是促进细胞存活、生长、分化、增殖和/或成熟或者刺激细胞生物活性增强的物质。细胞衍生物是指可从细胞获得的任何材料并包括细胞调理培养基、细胞裂解液、细胞外基质蛋白、营养因子、细胞组分、细胞膜。

“退变”是指对IVD造成的任何身体伤害、损伤、退变或创伤。

“病变”是指与细胞、组织、器官或系统的正常状态偏离的任何结构或功能指标，如通过适合本领域的任何方法测量的。

“疾病”是大体上与细胞、组织、器官、系统或生物体的健康、状态或机能的任何偏离或其损伤，如通过适合本领域的任何方法测量的。

“治疗了”、“治疗的”或“治疗”是指在减轻或改善疾病、损伤或病症方面取得的任何成功或成功指示，包括任何客观或主观参数例如症状减轻、缓解、削弱或使患者更能耐受疾病、损伤或病症，减缓退变或衰退速率，使退变终点衰竭程度降低，或改善受试者的身体或心理健康。症状的治疗或改善可基于客观或主观参数；包括体格检查、神经学检查和/或精神鉴定的结果。

“有效量”或“治疗有效量”在本文可互换使用，并且是指如本文所述的化合物、材料或组合物有效实现特定生物结果的量，所述特定生物结果例如但不限于本文所公开的、所描述的、所列举的生物结果。此类结果可包括但不限于受试者中IVD疾病或损伤的治疗，如通过适合本领域的任何方法测定的。

“药学上可接受的”是指从药理学/毒理学视角为患者可接受的及从组成、配方、稳定性、患者接受性和生物利用率相关物理/化学视角为制药化学家可接受的那些性质和/或物质。“药学上可接受的载体”是指不影响活性成分的生物活性的效力且对所施用的宿主无毒的介质。

已发现可通过施用本文所述的脐带组织来源细胞来治疗与椎间盘(IVD)退变相关的疾病和病症。有利地，本文所提供的方法、组合物和试剂盒促进了退变的IVD的修复和再生，从而缓解与IVD退变相关联的一种或多种症状。因此，在一个方面，提供了用于治疗与IVD退变相关的疾病或病症的方法，所述方法包括将脐带组织来源细胞以充分治疗所述疾病或病症的量施用至IVD。

在各种实施例中，与IVD退变相关的疾病或病症可由年龄、创伤、自体免疫、炎症反应、遗传缺陷、免疫复合物沉着(如，形成疤痕组织)和/或其组合造成或引起。靶向治疗的IVD可以是未受损的或处于损伤或退变的任何阶段。例如，靶向治疗的IVD可以是突出的(如，其中纤维环的一部分具有膨出或其他突起)、破裂的(如，其中纤维环的至少一部分破裂，导致髓核的压力和/或体积下降)、分层的(如，其中纤维环的两层或更多层已分离)、和/或以其他方式损伤或退变(如，其中纤维环具有裂缝、裂纹、撕裂等等，和/或其中细胞外基质被降解或改变)。

在各种实施例中，例如通过注射、移植、植入、注入、作为基质-细胞复合物提供、或用于提供细胞疗法的领域中已知的任何其他方式，将脐带组织来源细胞施用至退变的IVD。在一些实施例中，将细胞直接施用至IVD的纤维环和/或髓核。在一些实施例中，将细胞间接施用至IVD。例如，细胞可在含水载体中，封装于装置中，或接种于基质中，然后将其植入退变的IVD中或附近。含水载体包括但不限于生理缓冲溶液，例如缓冲盐溶液、磷酸盐缓冲盐溶液、Hank平衡盐溶液、Tris缓冲盐溶液和Hepes缓冲盐溶液。在各种实施例中，可植入装置、基质或其他细胞储存，使得其连接到纤维环的外壁，或位于纤维环的壁之外但与壁相邻的位置，或邻近IVD周围的椎体的终板。

在一些实施例中，细胞以装置的形式例如基质-细胞复合物施用。装置材料包括但不限于可生物吸收的材料例如胶原、35/65聚(ε-己内酯)(PCL)/聚乙醇酸(PGA)、PANACRYL^TM可生物吸收的构建体、VICRYL^TM聚糖乳酸910、以及自组装肽和非吸收性材料例如含氟聚合物(如，

含氟聚合物)、塑料和金属。基质包括生物相容性支架、晶格、自组装结构等等，而不论是否为可生物吸收的、液体、凝胶或固体。此类基质是治疗性细胞治疗、外科修复、组织工程和伤口愈合领域已知的。优选地，基质用治疗性细胞预处理。更优选地，用细胞填充基质，使其与基质或其空间紧密相连。细胞可附着于基质或可包埋或容纳于基质空间内。最优选的是这样的基质-细胞复合物，其中细胞生长时与基质紧密相连，并且当用于治疗时，可刺激和支持患者自身的IVD细胞的生长、修复和/或再生，并相似地刺激或支持恰当的血管生成。可以本领域已知的任何方法将基质-细胞组合物引入到患者体内，所述方法包括但不限于用其他组织植入、注射、外科附着、移植等等。在一些实施例中，可根据本发明使用体内基质形式、或甚至更优选地原位基质形式，例如原位可聚合凝胶。此类凝胶的例子是本领域已知的。

在一个实施例中，将脐带组织来源细胞作为包含水凝胶的组合物的一部分施用至退变的IVD。在另一个实施例中，将脐带组织来源细胞连同水凝胶一起施用至退变的IVD。

还可将本文所述的细胞接种到三维基质上，例如植入体内的支架，其中接种的细胞可在框架上或框架中增殖，或在与或不与其他细胞协作的情况下帮助在体内建立置换组织。脐带组织来源细胞在三维框架上的生长优选地导致形成三维组织或其架构，可在体内利用其例如修复和/或再生损伤或患病组织。

可将细胞接种到三维框架或基质上，例如支架、泡沫、静电纺支架、非织造支架、多孔或非多孔微粒、或水凝胶，并相应施用。框架可构造成多种形状，例如基本上平的、基本上圆柱形或管状的，或可以为如考虑中的矫正结构可能要求或需要的完全自由形态。可将两个或更多个基本上平的框架放置在另一个上面，并根据需要固定在一起以产生多层框架。

在此类三维框架上，可将细胞与其他细胞类型、或其他软组织类型祖细胞(包括干细胞)共同施用。当在三维系统中生长时，增殖的细胞可成熟并正确分离而形成与体内天然存在的相应组织类似的成体组织的组分。

本文描述和列举的基质可设计成使得基质结构支持脐带组织来源细胞且随后不降解，从接种直至宿主组织重塑组织移植物的时间支持细胞，或允许接种的细胞附着、增殖和发展成具有足以在体外支持自身的机械完整性的组织结构，此时基质降解。

可将设想用于本文的基质、支架例如泡沫非织造布、静电纺结构、微粒和自组装系统与任何一种或多种细胞、生长因子、药物或其他组分，例如促进组织愈合、再生、修复或长入，或刺激其血管形成或神经支配或以其他方式增强或改善本发明治疗效果或实践的生物活性剂组合，并连同本发明的细胞一起植入。

在一些实施例中，本文所述的细胞可在培养中自由生长，从培养物取出并接种于三维框架上。以细胞浓度，如大约每毫升10⁶至5×10⁷个细胞接种三维框架优选地使得在相对较短时间段内建立三维支持材料。此外，在一些应用中，可优选地根据所需结果使用更多或更少数量的细胞。

在一些方面，可用于在培养中重建体内存在的细胞微环境，使得体内植入或体外使用之前细胞生长的程度可变化。可在形成植入所需的形状如绳状、管状、细丝状等等之前或之后将细胞接种到框架上。在将细胞接种到框架上后，优选地将框架在适当的生长培养基中孵育。在孵育期间，接种的细胞将生长并包覆框架，并且可例如桥接或部分地桥接其中的任何细胞间隙。优选地但非必需使细胞生长至适当程度，该程度反映了正修复或再生的组织的体内细胞密度。在其他实施例中，框架上存在细胞(即使数量很少)促进了内源健康细胞长入，有利于受损或损伤的细胞的例如愈合。

可用于本发明各方面的基质例如支架的例子包括垫、多孔或半多孔泡沫、自组装肽等等。非织造垫可例如使用由天然或合成聚合物构成的纤维形成。在一个优选实施例中，使用以商品名VICRYL^TM(新泽西州萨默维尔的爱惜康公司(Ethicon,Inc.,Somerville,NJ))销售的乙醇酸和乳酸的可吸收共聚物(PGA/PLA)形成垫。通过如美国专利No.6,355,699中所讨论的方法例如冷冻干燥法或冻干法形成的，由例如聚(ε-己内酯)/聚(乙醇酸)(PCL/PGA)共聚物构成的泡沫也可用作支架。

凝胶也形成如本文所用的合适基质。凝胶的例子包括可注射凝胶、原位可聚合凝胶和水凝胶；凝胶可由自组装肽构成。这些材料通常用作组织生长用支持材料。例如，当用作可注射凝胶时，凝胶可由水、盐水溶液或生理盐水溶液和胶凝材料构成。胶凝材料包括但不限于蛋白质，例如胶原、弹性蛋白、凝血酶、纤连蛋白、明胶、纤维蛋白、弹性蛋白原、多肽、层粘连蛋白、蛋白聚糖、纤维蛋白胶、纤维蛋白凝块、富血小板血浆(PRP)凝块、贫血小板血浆(PPP)凝块、自组装肽水凝胶和缺端胶原；多糖，例如果胶、纤维素、氧化纤维素、甲壳质、脱乙酰壳多糖、琼脂糖、透明质酸；多核苷酸，例如核糖核酸、脱氧核糖核酸，及其他，例如海藻酸盐、交联海藻酸盐、聚(N-异丙基丙烯酰胺)、聚(氧化烯)、聚(环氧乙烷)-聚(环氧丙烷)的共聚物、聚(乙烯醇)、聚丙烯酸酯、单硬脂酸甘油脂-共-琥珀酸/聚乙二醇(MGSA/PEG)共聚物、及其组合。在一个实施例中，胶凝材料(即，水凝胶)包含纤维蛋白原(因子I)，例如重组纤维蛋白原或从血中纯化的纤维蛋白原。在另一个实施例中，水凝胶包含纤维蛋白原和凝血酶。在另一个实施例中，凝胶为

纤维蛋白胶(

纤维蛋白封闭剂(人)，奥姆里克斯制药公司)(BAC2(纤维蛋白原)和凝血酶)。

一般而言，水凝胶为交联聚合物材料，其可吸收超过其体重20％的水，同时保持独特的三维结构。此外，水凝胶具有对氧气、营养物质和其他水溶性代谢物的高渗透性。该定义包括会在含水环境中溶胀的干燥交联聚合物以及水溶胀材料。许多亲水聚合物可交联形成水凝胶，而不论该聚合物是生物源的、半合成的或是全合成的。水凝胶可由合成聚合物材料制得。此类合成聚合物可按照一系列性质和可预测的批与批一致性专门设计，并代表通常无免疫原性担忧的可靠材料来源。在本发明的一个实施例中，水凝胶由自组装肽形成，如美国专利No.5,670,483和5,955,343、美国专利公布No.2002/0160471、PCT专利申请No.WO02/062969中讨论的那些，所述专利的公开内容全文以引用方式并入本文。

使水凝胶特别具备作为本发明的基质的价值的性质包括平衡溶胀度、吸附动力学、溶质渗透性及其体内性能特性。对化合物的渗透性部分地取决于溶胀度或含水量和生物降解率。由于凝胶的机械强度与溶胀度成正比下降，同样也在本发明设想范围内的是水凝胶可附着于基底，因此复合系统增强了机械强度。在替代实施例中，可将水凝胶浸渍于多孔基底内，以同时获得基底的机械强度以及水凝胶的有用递送性质。

原位形成的可降解网络也适用于本发明(参见如，Anseth,K.S.et al.,J.Controlled Release,2002；78:199-209(Anseth,K.S.等人，《控释杂志》，2002年，第78卷，第199-209页)；Wang,D.et al.,Biomaterials,2003；24:3969-3980(Wang,D.等人，《生物材料》，2003年，第24卷，第3969-3980页)；授予He等人的美国专利公布2002/0022676)。这些材料可配制成适合注射的流体，然后可通过多种方式(如，改变温度、pH、暴露于光)诱导其形成原位或体内形成可降解的水凝胶网络。

在一些实施例中，框架可以为毡，其可由可生物吸收材料制成的复丝纱线构成，所述可生物吸收材料如PGA、PLA、PCL共聚物或共混物、或透明质酸。使用包括卷曲、切割、梳理和针刺的标准纺织加工技术，将所述纱线制成毡。可将本发明的细胞接种到泡沫支架上，所述泡沫支架可以为复合结构。此外，可将三维框架模塑成可用形状，例如待修复、置换或增强的IVD中或附近的特定结构。

可在接种本发明细胞之前对框架进行处理，以便提高细胞附着性。例如，在接种本发明细胞之前，可用0.1摩尔醋酸处理尼龙基质，并在多聚赖氨酸、PBS和/或胶原中孵育以涂布尼龙。可相似地使用硫酸处理聚苯乙烯。

此外，可对三维框架的外表面进行改性以改善细胞的附着性或生长和组织分化，例如通过等离子涂布框架或添加一种或多种蛋白质(如，胶原、弹性纤维、网状纤维)、糖蛋白、糖胺聚糖(如，硫酸肝素、4-硫酸软骨素、6-硫酸软骨素、硫酸皮肤素、硫酸角质素)、细胞基质和/或其他材料，例如但不限于明胶、海藻酸盐、琼脂、琼脂糖和植物树胶等等。

支架由使其不形成血栓的材料构成或用该材料处理。这些处理和材料还可促进和维持内皮生长、迁移和细胞外基质沉积。这些材料和处理的例子包括但不限于天然材料例如基底膜蛋白如层粘连蛋白和IV型胶原、合成材料例如ePTFE、以及嵌段聚氨酯脲有机硅例如

(加利福尼亚州伯克利的宝莱尔科技有限公司(The Polymer TechnologyGroup,Inc.,Berkeley,CA))。还可进一步处理这些材料，使支架不形成血栓。此类处理包括抗血栓形成剂例如肝素，以及改变材料表面电荷的处理例如等离子涂布。

例如沉积在框架上的各种类型的胶原的不同比例可影响组织特异性细胞或其他细胞的生长，这些细胞可随后接种在框架上或可生长在体内结构上。或者，可用合成所需的适当胶原类型的细胞混合物接种框架。根据要培养的组织，可选择待接种于框架上或由接种于其上的细胞所产生的适当胶原类型。例如，可通过控制初始接种体中的产生胶原的细胞与产生弹性蛋白的细胞的比率，来调节框架中存在的胶原纤维和弹性纤维的相对量。

本发明的接种或注射的三维框架可用于移植或植入从基质或体内培养的基质自身获得的培养细胞。三维支架可根据本发明用于置换或增强现有组织，用于引入新组织或改变的组织，用于改造人工假体，或用于将生物组织或结构连接在一起。

在一些实施例中，可通过针例如小口径针将细胞施用(如，注射)到IVD中。在一些实施例中，针具有约22针距或更小的口径，以便减小IVD脱出的可能性。当将体积注射进髓核时，理想的是，递送的药物体积不超过约3ml，优选地不超过约1ml，更优选地在约0.1和约0.5ml之间。当以这些较小的量注射时，据信所添加的体积不会引起髓核中明显的压力增加。如果制剂的直接注射体积足够高而引起髓核超压的担忧，那么优选的是在直接注射之前去除髓核的至少一部分。在一些实施例中，去除的髓核的体积基本上类似于要注射的制剂的体积。例如，去除的髓核的体积可在要注射的制剂的体积的约80-120％内。在一些实施例中，在施用前浓缩脐带组织来源细胞。

可用于本文所提供的方法、组合物和试剂盒的细胞可来源于哺乳动物脐带，所述哺乳动物脐带可在足月或提前妊娠终止之后，例如出生后排出或剖腹产后外科移除之后，立即或马上回收。在细胞分离之前，例如通过用任何合适的介质或缓冲液洗涤，从脐带组织去除血液和碎片。

可通过机械力或通过酶消化，将细胞从脐带组织分离。优选的酶是金属蛋白酶、中性蛋白酶和粘液溶解蛋白酶。例如，胶原酶、分散酶和透明质酸酶的各种组合可用于从脐带组织离解细胞。技术人员将认识到，本领域已知用于从各种组织来源分离细胞的多种此类酶处理。例如，

Blendzyme(罗氏公司(Roche))系列酶组合适用于本发明方法。酶的其他来源是已知的，并且技术人员还可直接从其天然来源获得此类酶。技术人员也拥有齐全的设备，可评价新的或附加的酶或酶组合在分离本发明细胞方面的用途。优选的酶处理为0.5、1、1.5或2小时长或更长。

分离的细胞可用于引发细胞培养。可将分离的细胞转移到无菌组织培养瓶中，所述无菌组织培养瓶未包被或包被有细胞外基质或配体例如层粘连蛋白、胶原(天然、变性、缺端或交联)、明胶、纤连蛋白和其他细胞外基质蛋白。将脐带组织来源细胞培养于能够维持细胞生长的任何培养基中，所述培养基例如但不限于DMEM(高或低葡萄糖)、高级DMEM、DMEM/MCDB 201、Eagle’s基本培养基、Ham’s F10培养基(F10)、Ham’s F-12培养基(F12)、Hayflick’s培养基、Iscove’s改良Dulbecco’s培养基、间充质干细胞生长培养基(MSCGM)、DMEM/F12、RPMI 1640和CELL-GRO-FREE。培养基可补充有一种或多种组分，包括例如胎牛血清，优选约2-15％(体积比)；马血清；人血清；小牛血清；β-巯基乙醇，优选约0.001％(体积比)；一种或多种生长因子，例如血小板衍生生长因子(PDGF)、表皮生长因子(EGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、血管内皮生长因子(VEGF)、胰岛素样生长因子-1(IGF-1)、白细胞抑制因子(LIF)和促红细胞生成素；氨基酸，包括L-缬氨酸；以及用以控制微生物污染的单独或组合的一种或多种抗生素和/或抗真菌剂，例如青霉素G、硫酸链霉素、两性霉素B、庆大霉素和制霉菌素。

将细胞以允许细胞生长的密度接种在培养瓶中。在一个实施例中，细胞在占空气约0至约5体积％的CO₂下培养。在一些实施例中，细胞在占空气约2至约25％的O₂下，优选占空气约5至约20％的O₂下培养。细胞优选地在约25至约40℃下培养，更优选地在37℃下培养。培养瓶中的培养基可以是静止的，也可以例如用生物反应器搅动。脐带组织来源细胞优选地在低氧化应激下生长(如，添加谷胱甘肽、维生素C、过氧化氢酶、维生素E、N-乙酰半胱氨酸)，这意味着对培养细胞没有或极少自由基损伤。

可将脐带组织来源细胞传代或取出到单独的培养瓶中，该培养瓶包含与最初使用的培养基相同或不同类型的新鲜培养基，细胞群能够在该培养瓶中以有丝分裂方式扩增。本发明的细胞可在0代和衰老之间的任何时间点使用。细胞优选传代约3至约25次，更优选传代约4至约12次，并且优选传代10或11次。可进行克隆和/或亚克隆以确认已分离出无性细胞群。

在本发明的一个实施例中，细胞可在微载体上生长(扩增)。微载体是可用于培养物中的贴壁依赖性细胞的附着和生长的颗粒、小珠或小球。微载体可以为实心的、多孔的，或者为具有多孔涂层的实芯。示例性的合适微载体包括但不限于CytodexCytodex

Cytodex

(新泽西州皮斯卡特维的通用电气医疗集团生命科学部(GE Healthcare LifeSciences,Piscataway NJ))或

(密歇根安娜堡的SoloHill工程公司(SoloHillEngineering,Inc.Ann Arbor,MI))。示例性的合适微载体和微载体组分在美国专利公布No.2008/0166328中公开，所述专利的公开内容全文以引用方式并入本文。

脐带组织中存在的不同细胞类型可分离出亚群。这可使用细胞分离的标准技术来完成，所述细胞分离的标准技术包括但不限于酶处理；特定细胞类型的克隆和选择，例如但不限于基于形态学和/或生物化学标记物进行选择；所需细胞的选择性生长(阳性选择)、不需要的细胞的选择性破坏(阴性选择)；基于如例如使用大豆凝集素得出的混合群体中细胞凝集性差异进行分离；冻融步骤；混合群体中的细胞的附着性差异；过滤；常规和区带离心；离心淘洗(逆流离心)；单位重力分离；逆流分配；电泳；荧光激活细胞分选(FACS)；等等。

从脐带组织分离的细胞的例子于2004年6月10日存放于美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)，并被指定如下ATCC登录号：(1)株系名称UMB022803(P7)被指定为登录号PTA-6067；以及(2)株系名称UMB 022803(P17)被指定为登录号PTA-6068。

脐带组织来源细胞可通过例如以下表征：生长特性(如，群体倍增能力、倍增时间、至衰老的传代次数)、核型分析(如，正常核型；母本或新生儿谱系)、流式细胞术(如，FACS分析)、免疫组织化学和/或免疫细胞化学(如，用于检测表位)、基因表达谱(如，基因芯片阵列；聚合酶链反应(例如，逆转录酶PCR、实时PCR和常规PCR))、蛋白质阵列、蛋白质分泌(如，通过PDC调理培养基的血浆凝固测定或分析，例如通过酶联免疫吸附测定(ELISA))、混合淋巴细胞反应(如，作为PBMC刺激的量度)和/或本领域已知的其他方法。

在各个方面，脐带组织来源细胞具有下列生长特点中的一种或多种：在培养时生长需要L-缬氨酸；能够在包含约5％到至少约20％的氧的气氛中生长；在培养时具有在达到衰老之前经历至少约40次倍增的潜能；和/或在包被或未包被组织培养瓶上附着和扩增，其中包被的组织培养瓶包含明胶、层粘连蛋白、胶原、多鸟氨酸、玻连蛋白或纤连蛋白的涂层。

在一些实施例中，细胞具有在细胞传代时保持的正常核型。染色体核型分析特别可用于从来源于胎盘的母本细胞鉴定和区分新生儿细胞。染色体核型分析的方法是本领域技术人员可利用且已知的。

在一些实施例中，细胞可通过如下来表征：产生特定蛋白，包括产生组织因子、波形蛋白和α-平滑肌肌动蛋白中的至少一种；以及产生CD10、CD13、CD44、CD73、CD90、PDGFr-α、PD-L2和HLA-A、B、C细胞表面标记物中的至少一种，如通过例如流式细胞术检测的。在其他实施例中，细胞可通过如下来表征：不产生CD31、CD34、CD45、CD80、CD86、CD117、CD141、CD178、B7-H2、HLA-G、和HLA-DR、HLA-DP、和/或HLA-DQ细胞表面标记物中的至少一种，如通过任何合适方法例如流式细胞术检测的。在一些实施例中，优选的是产生组织因子、波形蛋白和α-平滑肌肌动蛋白中的至少两种的细胞。在一些实施例中，优选的是产生蛋白质组织因子、波形蛋白和α-平滑肌肌动蛋白中所有三种的细胞。

在一些实施例中，细胞相对于为成纤维细胞、间充质干细胞或髂嵴骨髓细胞的人细胞，具有表达量增加的编码如下至少一种的基因：白介素8；浆膜蛋白1；趋化因子(C-X-C基序)配体1(黑素瘤生长刺激活性，α)；趋化因子(C-X-C基序)配体6(粒细胞趋化蛋白2)；趋化因子(C-X-C基序)配体3；肿瘤坏死因子，α-诱导蛋白3。

在其他实施例中，细胞相对于为成纤维细胞、间充质干细胞或髂嵴骨髓细胞的人细胞，具有表达量减少的编码如下至少一种的基因：矮小同源盒2；热休克27kDa蛋白2；趋化因子(C-X-C基序)配体12(基质细胞衍生因子1)；弹性蛋白(主动脉瓣上狭窄，威廉斯-博伊伦综合征)；人(Homo sapiens)mRNA；cDNA DKFZp586M2022(来自克隆DKFZp586M2022)；间充质同源盒2(生长终止特异性同源盒)；sine oculis同源盒同源物1(果蝇属(Drosophila))；晶状体蛋白，αB；形态发生紊乱关联激活因子2；DKFZP586B2420蛋白；类似于neuralin 1；四连接素(纤溶酶原结合蛋白)；src同源3(SH3)和富含半胱氨酸的结构域；胆固醇25-羟化酶；runt相关转录因子3；白介素11受体，α；前胶原C-内肽酶增强子；卷曲同源物7(果蝇属)；假设基因BC008967；胶原，VIII型，α1；腱生蛋白C(hexabrachion)；易洛魁族同源盒蛋白5；膜铁转运辅助蛋白；整联蛋白，β8；突触小泡糖蛋白2；成神经细胞瘤，抑制瘤变蛋白1；胰岛素样生长因子结合蛋白2，36kDa；人cDNA FLJ12280fis，克隆MAMMA1001744；细胞因子受体样因子1；钾中间/小电导钙活化通道，亚家族N，成员4；整联蛋白，β7；具有PDZ结合基序的转录共激活因子(TAZ)；sine oculis同源盒同源物2(果蝇属)；KIAA1034蛋白；囊泡相关膜蛋白5(肌短蛋白)；含EGF腓骨蛋白样胞外基质蛋白1；早期生长反应因子3；远端缺失同源盒5；假定蛋白FLJ20373；醛酮还原酶家族1，成员C3(3-α羟基类固醇脱氢酶，II型)；双糖链蛋白聚糖；具有PDZ结合基序的转录共激活因子(TAZ)；纤连蛋白1；前脑啡肽；整联蛋白，β样1(具有EGF样重复结构域)；人mRNA全长插入cDNA克隆EUROIMAGE 1968422；EphA3；KIAA0367蛋白；尿钠排泄肽受体C/鸟苷酸环化酶C(利尿钠排泄肽受体C)；假定蛋白FLJ14054；人mRNA；cDNADKFZp564B222(来自DKFZp564B222)；BCL2/腺病毒E1B 19kDa相互作用蛋白3样；AE结合蛋白1；以及细胞色素c氧化酶VIIa亚基多肽1(肌肉)。

在一些实施例中，细胞可通过如下来表征：分泌MCP-1、IL-6、IL-8、GCP-2、HGF、KGF、FGF、HB-EGF、BDNF、TPO、MIP1b、RANTES和TIMP1中的至少一种。在一些实施例中，细胞可通过如下来表征：不分泌TGF-β2、ANG2、PDGFbb、MIP1a和VEGF中的至少一种，如通过ELISA检测的。

在一些优选实施例中，细胞具有上列生长、蛋白/表面标记物产生、基因表达或物质分泌特性中的两种或更多种。在一些实施例中，优选的是细胞具有所述特性中的三个、四个、或五个或更多个。在一些实施例中，优选的是细胞具有所述特性中的六个、七个、或八个或更多个。在一些实施例中，优选的是细胞具有所有上述特性。在其他实施例中，脐带来源细胞具有美国专利No.7,510,873和7,524,489中所公开的任何特性，所述专利的公开内容全文以引用方式并入本文。

优选用于本发明各方面的细胞包括具有上述特性的细胞，更具体地讲为这样的细胞：其中细胞具有正常核型并随传代进行，保持正常核型，并且另外其中细胞表达标记物CD10、CD13、CD44、CD73、CD90、PDGFr-α和HLA-A、B、C中的每种，其中细胞产生免疫学能检测的对应于所列标记物的蛋白。还优选的是这样的细胞，其除了上述之外，不产生对应于标记物CD31、CD34、CD45、CD117、CD141、或HLA-DR、DP、DQ中任何一者的蛋白，如通过适合本领域的任何方法例如流式细胞术检测的。高度优选的是不表达CD117或HLA-DR或端粒酶的细胞。

在一些优选的方面，方法包括将从人脐带组织获得或分离的细胞施用至退变的IVD，其中细胞能够在培养时自我更新和扩增，生长需要L-缬氨酸，可在至少约5％氧中生长，不会产生CD117或HLA-DR或端粒酶，表达α平滑肌肌动蛋白，并且相对于人成纤维细胞、间充质干细胞或髂嵴骨髓细胞，表达提高水平的白介素8和浆膜蛋白1。可在施用之前在培养时扩增从人脐带组织分离的细胞。在一些实施例中，从人脐带组织获得的细胞具有分化成IVD表型(例如但不限于纤维环细胞表型或髓核细胞表型)的细胞的潜能。脐带组织来源细胞可整合到患者IVD中，或者可对天然存在的IVD干细胞提供生长或刺激其分化的支持。施用的细胞的存活并非它们的使用实现改善IVD退变相关的疾病或病症和/或患者总体健康的成功或结果的决定因素。在一些实施例中，细胞优选在患者体内至少部分地整合、繁殖或存活。在一些实施例中，患者受益于该治疗，例如受益于细胞支持其他细胞(包括存在于IVD和/或周围组织的干细胞或祖细胞)生长的能力，受益于组织长入或组织的血管形成，和/或受益于存在有益细胞因子、趋化因子、细胞因子等等，但细胞不会在患者体内整合或繁殖。在一些方面，患者受益于用细胞的治疗处理，但细胞不会在患者体内长期存活。例如，在一些实施例中，细胞的数量、活力或生化活性逐渐下降。在一些实施例中，此类下降之前可以为活性期，例如生长、分裂或生化活性。在一些实施例中，衰老的、无活力的或甚至死的细胞能够具有有益的治疗效果。

某些具有沿产生各种表型的方向分化的潜能的细胞是不稳定的，因此可自发分化。因此，在一些实施例中，优选的是不会自发分化的细胞。例如，一些优选的细胞在培养于生长培养基中时，对于其表面上产生的细胞标记物而言，并且对于各种基因的表达模式而言，是基本上稳定的，例如，如使用基因表达谱通过例如核酸或多肽阵列测定的。此类细胞在传代时，经历多次群体倍增后，例如在其表面标记物特性方面仍然保持基本恒定。

在一些实施例中，本文提供的方法诱导脐带组织来源细胞，使其沿IVD细胞途径，朝IVD细胞表型、或祖细胞或前述的更原始的相关细胞分化。脐带组织来源细胞可整合到患者IVD中，或者可对天然存在的IVD干细胞提供生长或刺激其分化的支持。施用的细胞的存活并非它们的使用实现改善IVD退变相关的疾病或病症和/或患者总体健康的成功或结果的决定因素。在一些实施例中，细胞优选在患者体内至少部分地整合、繁殖或存活。在一些实施例中，患者受益于该治疗，例如受益于细胞支持其他细胞(包括存在于IVD和/或周围组织的干细胞或祖细胞)生长的能力，受益于组织长入或组织的血管形成，和/或受益于存在有益细胞因子、趋化因子、细胞因子等等，但细胞不会在患者体内整合或繁殖。在一些方面，患者受益于用细胞的治疗处理，但细胞不会在患者体内长期存活。例如，在一些实施例中，细胞的数量、活力或生化活性逐渐下降。在一些实施例中，此类下降之前可以为活性期，例如生长、分裂或生化活性。在一些实施例中，衰老的、无活力的或甚至死的细胞能够具有有益的治疗效果。

在一些方面，本发明的方法还可包括评估患者的IVD结构和/或功能的改善，和/或总体健康的改善。此类评估可根据适合本领域的任何方法进行，包括本文描述和列举的那些方法。

在一些实施例中，脐带组织来源细胞可结合一种或多种其他细胞类型施用，所述一种或多种其他细胞类型包括但不限于其他多潜能或多能细胞、或软骨细胞、成软骨细胞、骨细胞、成骨细胞、破骨细胞、骨衬细胞、或骨髓细胞。可在施用之前将不同类型的细胞与脐带组织来源细胞立即或马上混合，或可在施用之前将它们一起共培养一段时间。在一些实施例中，脐带组织来源细胞群支持结合脐带组织来源细胞施用的一种或多种其他细胞类型存活、增殖、生长、维持、成熟、分化和/或增加活性，和/或反之亦然。

在一些实施例中，脐带组织来源细胞对与其一起施用的其他细胞类型提供营养支持，和/或反之亦然。在一些实施例中，理想的是，脐带组织来源细胞与共培养的细胞接触。这可例如通过将细胞以异质细胞群接种到培养基中或接种到合适培养基底上来实现。或者，可首先使脐带组织来源细胞生长至汇合，再用作共培养细胞的基底。在其他实施例中，可将共培养细胞与脐带组织来源细胞的调理培养基、细胞外基质和/或细胞裂解液接触进行培养。

在各种实施例中，脐带组织来源细胞可结合生物活性剂例如调节增殖、分化和/或其他细胞活动的药剂一起施用。该药剂可在脐带组织来源细胞施用之前、之后或同时施用。所选择的具体药剂可以由指导患者治疗的医疗专业人员决定，并且可根据患者的具体需要或病症而变化。所选择的药剂可用于各种目的，例如但不限于方便细胞施用，改善IVD的修复和/或再生，改善患者的总体健康，减轻疼痛，降低或防止移植细胞的排斥，等等。

可与脐带组织来源细胞一起施用的药剂的例子包括但不限于维生素和其他营养补充剂；抗血栓形成剂；抗凋亡剂；抗炎剂；免疫抑制剂(如，环孢素、雷帕霉素)；抗氧化剂；激素；糖蛋白；纤连蛋白、肽和蛋白质；糖类(单糖和/或复合糖)；蛋白聚糖；寡核苷酸(正义和/或反义DNA和/或RNA)；骨形态发生蛋白(BMP)；分化因子；抗体(例如，感染源、肿瘤、药物或激素的抗体)；以及基因治疗试剂。在一些实施例中，所述药剂为减轻与IVD退变相关的疾病或病症的一种或多种症状的物质，例如镇痛、抗炎、麻醉、肌肉松弛剂或其组合。

在一些实施例中，附加药剂为对脐带组织来源细胞、对与脐带组织来源细胞一起施用的附加细胞、对内源IVD细胞(如，纤维环细胞、髓核细胞)和/或对其他内源细胞(如，结缔组织祖细胞)具有营养作用的营养因子或其他药剂。在一些实施例中，营养因子是脐带组织来源细胞分泌的营养因子，在这种情况下，其可源自此类脐带组织来源细胞群或源自另一种来源。此类因子或药剂的例子包括但不限于成纤维细胞生长因子家族的成员，包括酸性和碱性成纤维细胞生长因子(FGF-1和FGF-2)和FGF-4；血小板衍生生长因子(PDGF)家族的成员，包括PDGF-AB、PDGF-BB和PDGF-AA；EGF，胰岛素样生长因子(IGF)家族的成员，包括IGF-I和-II；TGF-β超家族，包括TGF-β1、2和3(包括MP-52)、类骨质诱导因子(OIF)、血管生成素、内皮素、肝细胞生长因子和角质细胞生长因子；骨形态发生蛋白(BMP)家族的成员，例如BMP-1、BMP-3、BMP-2、OP-1、BMP-2A、BMP-2B、BMP-4、BMP-7和BMP-14；HBGF-1和HBGF-2；生长分化因子(GDF)；刺猬蛋白家族的成员，包括印第安刺猬蛋白、音猬蛋白和沙漠刺猬蛋白；ADMP-1；GDF-5；TIMP-1及集落刺激因子(CSF)家族的成员，包括CSF-1、G-CSF和GM-CSF；及其类似物和亚型。

在一些实施例中，生长因子选自TGF-β、TGF-β1、FGF、bFGF和IGF-1。这些生长因子据信可促进髓核再生，刺激软骨细胞的增殖和/或分化，以及促进细胞外基质分泌。在一些实施例中，生长因子为TGF-β。更优选地，TGF-β以约10ng/ml和约5000ng/ml之间的量施用，例如约50ng/ml和约500ng/ml之间，如约100ng/ml和约300ng/ml之间。

在一些实施例中，血小板浓缩液作为附加治疗剂提供。在一些实施例中，血小板浓缩液是自体同源的。在一些实施例中，血小板浓缩液是富含血小板血浆(PRP)。PRP是有利的，因为其包含可再刺激ECM生长的生长因子，并且因为它的纤维蛋白基质提供了适合新组织生长的支架。在一些实施例中，附加药剂是来源于脐带组织来源细胞或其他细胞的细胞裂解液、可溶性细胞组分、富含膜的细胞组分、细胞培养基(如，调理培养基)或细胞外基质。

在一些实施例中，脐带组织来源细胞结合HMG-CoA还原酶抑制剂一起施用，所述HMG-CoA还原酶抑制剂包括但不限于辛伐他汀、普伐他汀、洛伐他汀、氟伐他汀、西立伐他汀和阿托伐他汀。

在一些实施例中，脐带组织来源细胞经基因工程化以表达一种或多种药剂，例如但不限于本文所述的一种或多种附加治疗剂。本发明的细胞可使用多种载体中的任一种进行工程化，所述载体包括但不限于整合型病毒载体，如逆转录病毒载体或腺相关病毒载体；非整合型复制载体，如乳头状瘤病毒载体、SV40载体、腺病毒载体；或复制缺陷型载体。将DNA引入细胞中的其他方法包括使用脂质体、电穿孔、粒子枪或通过直接DNA注射。

优选地使用由一种或多种适当表达控制元件和选择性标记物控制的或与其有效连接的DNA转化或转染宿主细胞，所述一种或多种适当表达控制元件例如启动子或增强子序列、转录终止子、多聚腺苷酸化位点等等。

在引入外源DNA后，可使经工程化的细胞生长于富集培养基中，然后换成选择性培养基。外源DNA中的选择性标记物赋予选择抗性，允许细胞将例如质粒上的外源DNA稳定整合到其染色体中，并长成集落，继而可将集落克隆和扩增成细胞系。该方法可有利地用于对细胞系进行工程化，使其表达基因产物。

可使用任何启动子驱动插入基因的表达。例如，病毒启动子包括但不限于CMV启动子/增强子、SV40、乳头瘤病毒、EB病毒或弹性蛋白基因启动子。优选地，用于控制所关注基因的表达的控制元件应允许基因的调控表达，使得仅在体内需要时才合成产物。如果瞬时表达是所需的，则优选地在非整合型和/或复制缺陷型载体中使用组成型启动子。或者，可使用诱导型启动子在必要时驱动插入基因的表达。诱导型启动子包括但不限于与金属硫蛋白和热休克蛋白相关的启动子。

本发明的细胞可经基因工程化而“敲除”或“敲低”促使植入位点发炎或排斥的因子的表达。下文将讨论用于降低靶基因表达水平或靶基因产物活性水平的负调节技术。如本文所用，“负调节”是指相对于不进行调节处理时的靶基因产物的水平和/或活性，靶基因产物的水平和/或活性下降。可使用多种技术降低或敲除基因的表达，包括例如使用同源重组技术使基因完全失活(通常称为“敲除”)而抑制表达。通常，在编码蛋白质重要区域的外显子(或该区域5’端的外显子)中插入阳性选择性标记物(如neo)，防止由靶基因产生正常mRNA并导致基因失活。还可通过在基因的一部分引入缺失，或通过删除整个基因，而使基因失活。通过使用具有在基因组中相距很远的与靶基因同源的两个区域的构建体，可将介于两个区域之间的序列删除(Mombaerts et al.,Proc.Nat.Acad.Sci.U.S.A.,1991；88:3084-3087(Mombaerts等人，《美国国家科学院院刊》，1991年，第88卷，第3084-3087页))。

还可根据本发明使用抑制靶基因表达的反义、小干扰RNA、DNA酶和核糖酶分子，来降低靶基因活性水平。例如，已证实抑制主要组织相容性基因复合体(HLA)的表达的反义RNA分子对于免疫反应而言是最通用的。另外，可使用三螺旋分子降低靶基因活性水平。

在如下文献中详细描述了这些和其他技术：L.G.Davis et al.(eds),BasicMethods In Molecular Biology,2nd ed.,Appleton&Lange,Norwalk,Conn.(1994)(L.G.Davis等人编辑，《分子生物学基本方法》，第2版，阿普尔顿与兰格出版，康涅狄格州诺沃克)，该文献以引用的方式并入本文。

IL-1是软骨再吸收和软骨细胞产生炎症介质的强效刺激因子(Campbell et al.,J.Immun.,1991；147(4):1238-1246(Campbell等人，《免疫学杂志》，1991年，第147卷，第4期，第1238-1246页))。使用上述技术中的任一种，可敲除或敲低本发明细胞中IL-1的表达，以降低植入软骨再吸收或本发明细胞产生炎症介质的风险。同样，可敲除或敲低MHC II类分子的表达以便降低植入组织排斥的风险。

一旦本发明的细胞经基因工程化，就可将这些细胞直接植入患者体内，以便治疗与IVD退变相关的疾病或病症，例如通过产生对所述疾病或病症的一种或多种症状具有治疗效果的产物，例如抗炎基因产物来治疗。或者，可使用经基因工程化的细胞在体外产生新组织，然后将其植入如本文所述的受试者体内。

在一些方面，提供了包含如本文所述的脐带组织来源细胞和药学上可接受的载体的药物组合物。本文所提供的药物组合物可诱导脐带组织来源细胞，使其沿IVD细胞途径或谱系分化，例如以呈现髓核细胞表型和/或纤维环细胞表型。在一些实施例中，本文所提供的药物组合物调节内源IVD细胞和/或周围组织的细胞的细胞过程，包括但不限于细胞分裂、分化和基因表达。在一些实施例中，本文所提供的药物组合物促进退变IVD的修复和再生。

根据本发明的特点还有用于实施本发明方法的试剂盒。在一个方面，提供了用于治疗具有至少一个IVD的疾病或损伤的患者的试剂盒。所述试剂盒包含药学上可接受的载体、从人脐带组织获得的有效治疗所述疾病或病症的量的细胞例如本文描述和列举的那些细胞、以及在治疗患有与IVD退变相关的疾病或病症的患者的方法中使用试剂盒的使用说明。所述试剂盒还可包含用于培养细胞的至少一种试剂和使用说明。所述试剂盒还可包含至少一种其他细胞类型的群体和/或至少一种药剂。

在一些方面，所述试剂盒包含药学上可接受的载体、裂解液、细胞外基质、或由从人脐带组织获得的细胞制备的调理培养基，所述细胞具有本文描述和列举的特性。所述试剂盒可用于促进受损或患病IVD的修复和/或再生。

提供以下实例来更详细描述本发明。这些实例旨在说明而非限制本发明。另外如以下实例和本说明书其他地方所用的，可根据美国专利No.7,510,873和7,524,489的公开内容，分离和表征可用于本发明方法的脐带组织来源细胞，这些专利由于涉及脐带组织来源细胞的描述、分离和表征，而将其全文以引用方式并入。

实例1

脐带组织来源细胞的分离

脐带得自宾夕法尼亚州费城的国家疾病研究交流会(NDRI,Philadelphia,PA)。在正常分娩后获得所述组织。在层流罩中无菌地进行细胞分离方案。为了去除血液和碎片，将脐带在抗真菌剂和抗生素(100单位/毫升青霉素、100微克/毫升链霉素、0.25微克/毫升两性霉素B)存在下的磷酸盐缓冲盐水溶液(PBS；加利福尼亚州卡尔斯巴德的英杰公司(Invitrogen,Carlsbad,CA))中洗涤。然后将组织在50毫升培养基(DMEM-低葡萄糖或DMEM-高葡萄糖；英杰公司)存在下的150cm²组织培养板中进行机械离解，直至将组织切成细浆。将切碎的组织转移到50毫升锥形管(大约每管5克组织)。然后在DMEM-低葡萄糖培养基或DMEM-高葡萄糖培养基(每种均含有如上所述的抗真菌剂和抗生素)中消化组织。在一些实验中，使用胶原酶和分散酶的酶混合物(DMEM:-低葡萄糖培养基中的“C:D”；胶原酶(密苏里州圣路易斯的西格玛公司(Sigma,St Louis,MO))，500单位/毫升；和分散酶(英杰公司)，50单位/毫升)。在其他实验中，使用胶原酶、分散酶和透明质酸酶的混合物(“C:D:H”)(DMEM:-低葡萄糖中的胶原酶，500单位/毫升；分散酶，50单位/毫升；和透明质酸酶(西格玛公司)，5单位/毫升)。含组织、培养基和消化酶的锥形管在37℃、225rpm的轨道式摇床(纽约布鲁克林的英环公司(Environ,Brooklyn,NY))中孵育2小时。

消化后，将组织在150×g下离心5分钟，吸出上清液。将沉淀物重悬于20毫升生长培养基(DMEM：低葡萄糖(英杰公司)、15％(体积比)胎牛血清(FBS；成分确定的牛血清；批号AND18475；犹他州洛根的Hyclone公司(Hyclone,Logan,UT))、0.001％(体积比)2-巯基乙醇(西格玛公司)、每100毫升1毫升的如上所述抗生素/抗真菌剂。使细胞悬液通过70微米尼龙细胞滤网(BD生物科学事业部(BD Biosciences))过滤。使另外5毫升包含生长培养基的漂洗液通过滤网。然后使细胞悬液通过40微米尼龙细胞滤网(BD生物科学事业部)，随后使另外5毫升生长培养基的漂洗液通过。

将滤液重悬于生长培养基(总体积为50毫升)中，并在150×g下离心5分钟。吸出上清液，并将细胞重悬于50毫升新鲜生长培养基中。这个过程再重复两次。

在最后一次离心后，吸出上清液，并将细胞沉淀物重悬于5毫升新鲜生长培养基中。使用台盼蓝染色确定活细胞数量。然后在标准条件下培养细胞。

将从脐带分离的细胞以5,000个细胞/cm²接种到明胶包被的T-75cm²培养瓶(纽约康宁的康宁公司(Corning Inc.,Corning,NY))的含如上所述抗生素/抗真菌剂的生长培养基中。2天后(在各实验中，细胞孵育2-4天)，从培养瓶中吸出消耗培养基。用PBS洗涤细胞三次，以去除碎片和血源性细胞。然后为细胞补充生长培养基，使细胞生长至汇合(从0代至1代需约10天)。在后续的传代中(从1代至2代，以此类推)，细胞在4-5天内达到近汇合(75-85％汇合)。对于这些后续的传代，将细胞以5000个细胞/cm²接种。将细胞在5％二氧化碳和大气氧、37℃下培养于湿化培养箱中。

实例2

通过流式细胞术评估人产后来源的细胞表面标记物

使用流式细胞术表征脐带组织，以提供用于识别从中获得的细胞的图谱。

将细胞培养于含青霉素/链霉素的生长培养基(加利福尼亚州卡尔斯巴德的Gibco公司(Gibco Carlsbad,CA))中。将细胞培养于等离子处理的T75、T150和T225组织培养瓶(纽约康宁的康宁公司)直至汇合。通过在室温下孵育2％(重量体积比)明胶(密苏里州圣路易斯的西格玛公司)20分钟，使培养瓶的生长表面包被明胶。

在PBS中洗涤培养瓶中的贴壁细胞，并用胰蛋白酶/EDTA分离。将细胞收获、离心并以每毫升1×10⁷个的细胞浓度重悬于PBS中的3％(体积比)FBS中。根据制造商说明书，将所关注的细胞表面标记物的抗体(见下)添加到100微升细胞悬液中，并将混合物在4℃下、于黑暗中孵育30分钟。孵育后，将细胞用PBS洗涤，并离心去除未结合抗体。将细胞重悬于500微升PBS中，并通过流式细胞术进行分析。用FACScalibur仪器(加利福尼亚州圣何塞的BD公司(Becton Dickinson,San Jose,CA))进行流式细胞术分析。

使用细胞表面标记物的下列抗体：

在8代、15代和20代分析细胞，并且将来自不同供体的脐带组织来源细胞彼此进行比较。此外，将培养于明胶包被培养瓶上的细胞与培养于未包被培养瓶上的细胞进行比较。

脐带组织来源细胞显示CD10、CD13、CD44、CD73、CD 90、PDGFr-α和HLA-A、B、C的阳性表达，如相对于IgG对照而言荧光值增加所指示。这些细胞对于CD31、CD34、CD45、CD117、CD141和HLA-DR、DP、DQ的可检测表达是阴性的，如与IgG对照相当的荧光值所指示。考虑了阳性曲线的荧光值的变化。阳性曲线的平均值(即CD13)和范围(即CD90)显示一些变化，但该曲线呈正态，证明是同质群体。两种曲线各自显示大于IgG对照的值。

8代、15代和20代的所有细胞都表达CD10、CD13、CD44、CD73、CD 90、PDGFr-α和HLA-A、B、C，如相对于IgG对照而言荧光增强所指示。这些细胞对于CD31、CD34、CD45、CD117、CD141和HLA-DR、DP、DQ是阴性的，如与IgG对照一致的荧光值所指示。

来自单独供体的分离株均显示CD10、CD13、CD44、CD73、CD 90、PDGFr-α和HLA-A、B、C的阳性表达，如相对于IgG对照而言荧光值增加所反映。这些细胞对于CD31、CD34、CD45、CD117、CD141和HLA-DR、DP、DQ的表达是阴性的，其中荧光值与IgG对照一致。

在明胶和未包被培养瓶上扩增的细胞对于CD10、CD13、CD44、CD73、CD 90、PDGFr-α和HLA-A、B、C的表达均是阳性的，其中相对于IgG对照而言荧光值增加。这些细胞对于CD31、CD34、CD45、CD117、CD141和HLA-DR、DP、DQ的表达是阴性的，其中荧光值与IgG对照一致。

因此，脐带组织来源细胞对于CD10、CD13、CD44、CD73、CD90、PDGFr-α、HLA-A、B、C是阳性的，并且对于CD31、CD34、CD45、CD117、CD141和HLA-DR、DP、DQ是阴性的。该特性在各变量(包括供体、传代数和培养瓶表面涂布)变化间是一致的。观察到单独荧光值直方曲线平均值和范围中的一些变化，但在所测试的所有条件下的所有阳性曲线均为正态的并且显示荧光值大于IgG对照，从而证实了细胞包含具有标记物的阳性表达的同质群体。

实例3

细胞表型的免疫组织化学表征

收获人脐带组织并在4℃下过夜浸泡固定于4％(重量体积比)多聚甲醛中。使用靶向下列表位的抗体进行免疫组织化学试验：波形蛋白(1:500；密苏里州圣路易斯的西格玛公司)、结蛋白(1:150，通过免疫兔制备；西格玛公司；或1:300，通过免疫小鼠制备；加利福尼亚州特曼库拉的Chemicon公司(Chemicon,Temecula,CA))、α-平滑肌肌动蛋白(SMA；1:400；西格玛公司)、细胞角蛋白18(CK18；1:400；西格玛公司)、血管性血友病因子(vWF；1:200；西格玛公司)和CD34(人CD34III类；1:100；加利福尼亚州卡平特里亚的DAKOCytomation公司(DAKOCytomation,Carpinteria,CA))。此外，测试了下列标记物：抗人GROα-PE(1:100；新泽西州富兰克林湖的BD公司(Becton Dickinson,Franklin Lakes,NJ))、抗人GCP-2(1:100；加利福尼亚州圣克鲁兹的圣克鲁兹生物技术公司(Santa CruzBiotech,Santa Cruz,CA))、抗人氧化LDL受体1(ox-LDL R1；1:100；圣克鲁兹生物技术公司)和抗人NOGO-A(1:100；圣克鲁兹生物技术公司)。用手术刀修剪固定的样本，然后放置于含乙醇的干冰浴上的OCT包埋化合物(Tissue-Tek OCT；加利福尼亚州托伦斯的樱花公司(Sakura,Torrance,CA))内。然后使用标准冰冻切片机(徕卡显微系统(LeicaMicrosystems))对冰冻块进行切片(10μm厚)，并安装于载玻片上进行染色。

免疫组织化学试验按照与以前研究(Messina et al.,Exper.Neurol.,2003；184:816-29(Messina等人，《实验神经学杂志》，2003年，第184卷，第816-829页))类似的方法进行。简言之，用磷酸盐缓冲盐水溶液(PBS)清洗组织切片，将其暴露于含PBS、4％(体积比)山羊血清(加利福尼亚州特曼库拉的Chemicon公司)和0.3％(体积比)Triton(Triton X-100；西格玛公司)的蛋白质阻断溶液1小时以进入细胞内抗原。在所关注表位位于细胞表面上(CD34、ox-LDL R1)的情况下，在流程的所有步骤中省略Triton以防止表位丢失。此外，在一抗通过免疫山羊制备(GCP-2、ox-LDL R1、NOGO-A)的情况下，在整个流程中使用3％(体积比)驴血清替代山羊血清。一抗在阻断溶液中稀释后，施加到切片上并在室温下保持4小时。除去一抗溶液，在施加含阻断剂和山羊抗小鼠IgG–德克萨斯红(1:250；俄勒冈州尤金的分子探针公司(Molecular Probes,Eugene,OR))和/或山羊抗兔IgG-Alexa 488(1:250；分子探针公司)或驴抗山羊IgG–FITC(1:150；圣克鲁兹生物技术公司)的二抗溶液(室温下1小时)之前，用PBS清洗培养物。清洗培养物，施加10微摩尔DAPI(分子探针公司)10分钟，使细胞核显色。

使用奥林巴斯(Olympus)倒置表面荧光显微镜(纽约梅尔维尔的奥林巴斯公司(Olympus,Melville,NY))上适当的荧光滤镜观察荧光。阳性染色表示为超过对照染色的荧光信号。使用彩色数码摄像机和

软件(加利福尼亚州卡尔斯巴德的MediaCybernetics公司(Media Cybernetics,Carlsbad,CA))采集代表性图像。对于三染样品，每幅图像每次仅用一个发射滤片拍摄。

波形蛋白、结蛋白、SMA、CK18、vWF和CD34标记物在脐带内存在的细胞亚群中表达。具体地讲，vWF和CD34表达局限于脐带内所含的血管。CD34⁺细胞位于最内层(内腔侧)。在脐带的所有基质和血管中存在波形蛋白表达。SMA局限于动脉和静脉的基质和外壁，但血管自身中不含。CK18和结蛋白仅在血管中观察到，结蛋白局限于中层和外层。脐带组织内未观察到GROα、GCP-2、ox-LDL R1和NOGO-A的表达。

实例4

寡核苷酸阵列分析

使用Affymetrix

阵列，对脐带组织来源细胞与成纤维细胞、人间充质干细胞和源自人骨髓的另一种细胞系的基因表达谱进行比较。该分析提供了产后来源的细胞和这些细胞经鉴定的独特分子标记物的表征。

经患者同意在正常足月分娩后从宾夕法尼亚州费城的国家疾病研究交流会(NDRI)获得人脐带。收到组织后，按照上述方法分离细胞。将细胞培养于明胶包被的组织培养塑料瓶上的生长培养基(使用DMEM-LG)中。将培养物在37℃和5％CO₂下孵育。

人表皮成纤维细胞购自康伯司公司(Cambrex Incorporated)(马里兰州沃克斯维尔(Walkersville,MD)；批号9F0844)和ATCC CRL-1501(CCD39SK)。将两种细胞系均培养于含10％(体积比)胎牛血清(Hyclone公司)和青霉素/链霉素(英杰公司)的DMEM/F12培养基(加利福尼亚州卡尔斯巴德的英杰公司)中。细胞生长于标准组织处理的塑料制品上。

人间充质干细胞(hMSC)购自康伯司公司(马里兰州沃克斯维尔；批号2F1655、2F1656和2F1657)并根据制造商说明书培养于MSCGM培养基(康伯司公司)中。细胞在37℃和5％CO₂下生长于标准组织培养的塑料制品上。

经患者同意，从NDRI收到人髂嵴骨髓。骨髓根据Ho等人(WO 2003/025149)所述的方法处理。以1份骨髓对20份裂解缓冲液的比率，将骨髓与裂解缓冲液(155mMNH₄Cl、10mMKHCO₃和0.1mM EDTA，pH 7.2)混合。对细胞悬液进行涡旋，在环境温度下孵育2分钟，并在500×g下离心10分钟。弃去上清液，将细胞沉淀物重悬于补充有10％(体积比)胎牛血清和4mM谷氨酰胺的极限必需培养基α(英杰公司)中。再次离心细胞，并将细胞沉淀物重悬于新鲜培养基中。使用台盼蓝染色排除法(密苏里州圣路易斯的西格玛公司)计算存活的单核细胞。将单核细胞以5×104个细胞/cm²接种于组织培养的塑料瓶中。在标准大气O₂或5％O₂下，并于37℃和5％CO₂下孵育细胞。将细胞培养5天而不更换培养基。在培养5天后，除去培养基和非贴壁细胞。在培养中维持贴壁细胞。

使用细胞刮刀将活跃生长的细胞培养物从培养瓶移除到冷PBS中。以300×g将细胞离心5分钟。除去上清液，并将细胞重悬于新鲜PBS中，再次离心。除去上清液，并将细胞沉淀物立即冻存于–80℃。提取细胞mRNA，将其转录成cDNA，再转录成cRNA并用生物素标记。将生物素标记的cRNA与HG-U133A基因芯片寡核苷酸阵列(加利福尼亚州圣克拉拉的昂飞公司(Affymetrix,Santa Clara CA))杂交。根据制造商说明书进行杂交和数据收集。使用“微阵列显著性分析”(SAM)1.21版计算机软件进行分析(Stanford University；Tusher et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,2002；98:5116-21(斯坦福大学；Tusher等人，《美国国家科学院院刊》，2002年，第98卷，第5116-5121页))。

分析十四个不同细胞群。细胞以及传代信息、培养基底和培养基列于表1。

通过主成分分析对细胞中差异表达的290个基因进行分析，从而评估数据。该分析可以对群体间相似性进行相对比较。表2示出了计算用于比较细胞对的欧氏距离。欧氏距离基于按照不同细胞类型间差异表达的290个基因得出的细胞比较结果。欧氏距离与290个基因的表达间的相似性成反比(即，距离越大，存在越小的相似性)。

下表3和4示出了脐带组织来源细胞中增加的基因表达量(表3)，以及脐带组织来源细胞中减小的基因表达量(表4)。名称为“探针组ID”的一列是指位于芯片特定位置上的若干寡核苷酸探针的组的制造商识别码，这些探针杂交于指定的基因(“基因名称”列)，所述基因包含可以指定登录号(“NCBI登录号”列)在NCBI(基因库)数据库中找到的序列。

表3：表现出与测定的其他细胞系相比在脐带组织来源细胞中具有特定增加的表 达量的基因。

表4：表现出与测定的其他细胞系相比在脐带组织来源细胞中具有减小的表达量 的基因。

表5、6和7示出了人成纤维细胞(表5)、ICBM细胞(表6)和MSC(表7)中表达量增加的基因。

前述分析包括来源于三种不同脐带和两种不同表皮成纤维细胞系、三种间充质干细胞系和三种髂嵴骨髓细胞系的细胞。使用包含22,000个基因的探针的寡核苷酸阵列分析这些细胞表达的mRNA。结果表明290个基因在这五个不同细胞类型中差异表达。这些基因包括在脐带组织来源细胞中表达量特定增加的七个基因。发现五十四个基因与其他细胞类型相比在脐带组织来源细胞中具有特定降低的表达水平。所选基因的表达通过PCR确认。这些结果证实例如与骨髓来源细胞和成纤维细胞相比，脐带组织来源细胞具有独特基因表达谱。

实例5

脐带组织来源细胞中的细胞标记物

如上所证实的，识别产后来源的细胞的“标签”基因：氧化LDL受体1、白介素-8、肾素、浆膜蛋白、趋化因子受体配体3(CXC配体3)和粒细胞趋化蛋白2(GCP-2)。这些“标签”基因在产后来源的细胞中以相对较高的水平表达。

进行该实例中所述的程序以验证微阵列数据并寻找基因和蛋白表达之间的一致/不一致，以及建立一系列可靠测定法，用于检测脐带组织来源细胞的唯一识别符。

将脐带组织来源细胞(四个分离株)和正常人表皮成纤维细胞(NHDF；新生儿和成人)生长于明胶包被的T75培养瓶中的含青霉素/链霉素的生长培养基中。将间充质干细胞(MSC)生长于间充质干细胞生长培养基套装(MSCGM；马里兰州沃克斯维尔的康伯司公司)中。

对于IL-8方案，将细胞从液氮解冻，并以5,000个细胞/cm²接种于明胶包被的培养瓶中，在生长培养基中培养48小时，再在10毫升血清饥饿培养基(DMEM–低葡萄糖(加利福尼亚州卡尔斯巴德的Gibco公司)，青霉素/链霉素(加利福尼亚州卡尔斯巴德的Gibco公司)和0.1％(重量体积比)牛血清白蛋白(BSA；密苏里州圣路易斯的西格玛公司))中培养8小时。该处理之后，提取RNA并将上清液以150×g离心5分钟以去除细胞碎片。然后将上清液在-80℃下冷冻，以进行ELISA分析。

将来源于脐带的产后细胞以及来源于人新生儿包皮的人成纤维细胞培养于明胶包被的T75培养瓶中的生长培养基中。在液氮中冷冻11代的细胞。将细胞解冻并转移到15毫升离心管中。在150×g下离心5分钟后，弃去上清液。将细胞重悬于4毫升培养基中并计数。将细胞以375,000个细胞/培养瓶在含有15毫升生长培养基的75cm²培养瓶中培养24小时。将培养基更换为血清饥饿培养基并培养8小时。在孵育结束时收集血清饥饿培养基，以14,000×g离心5分钟(并在-20℃下保存)。

为了估算每个培养瓶中细胞的数量，在每个培养瓶中添加2毫升胰蛋白酶/EDTA(加利福尼亚州卡尔斯巴德的Gibco公司)。将细胞从培养瓶中分离后，用8毫升生长培养基中和胰蛋白酶活性。将细胞转移到15毫升离心管中并以150×g离心5分钟。去除上清液，并将1毫升生长培养基添加至每管中以重悬细胞。使用血球计估算细胞数量。

使用ELISA测定法(明尼苏达州明尼阿波利斯的安迪生物(R&D Systems,Minneapolis,MN))分析由细胞分泌到血清饥饿培养基中的IL-8的量。根据制造商提供的使用说明，测试所有测定法。

从汇合脐带组织来源细胞和成纤维细胞提取RNA，或测定由如上所述处理的细胞的IL-8表达量。根据制造商使用说明(

小量提取试剂盒；加利福尼亚州瓦伦西亚的凯杰公司(Qiagen,Valencia,CA))用350微升含有β-巯基乙醇(密苏里州圣路易斯的西格玛公司)的缓冲液RLT裂解细胞。根据制造商的使用说明(

小量提取试剂盒；加利福尼亚州瓦伦西亚的凯杰公司)提取RNA并进行DNA酶处理(2.7U/样品)(密苏里州圣路易斯的西格玛公司)。用50微升经DEPC处理的水洗脱RNA并在-80℃下保存。

还从人脐带组织提取RNA。将组织(30毫克)悬浮于700微升含有2-巯基乙醇的缓冲液RLT中。将样品进行机械匀浆，并根据制造商说明书进行RNA提取。用50微升经DEPC处理的水提取RNA并在-80℃下保存。用无规六聚体引物和TaqMan逆转录试剂(加利福尼亚州福斯特城的应用生物系统公司(Applied Biosystems,Foster City,CA))将RNA进行逆转录，在25℃下保持10分钟，在37℃下保持60分钟，在95℃下保持10分钟。将样品在-20℃下保存。

使用实时和常规PCR进一步研究cDNA微阵列识别为产后细胞中独特调控的基因(标签基因–包括氧化LDL受体、白介素-8、肾素和浆膜蛋白)。

根据制造商使用说明，使Assays-on-Demand^TM基因表达产物：氧化LDL受体(Hs00234028)；肾素(Hs00166915)；浆膜蛋白(Hs00382515)；CXC配体3(Hs00171061)；GCP-2(Hs00605742)；IL-8(Hs00174103)；和GAPDH(加利福尼亚州福斯特城的应用生物系统公司)与cDNA和TaqMan通用PCR扩增预混试剂(TaqMan Universal PCR master mix)混合，使用具有ABI Prism 7000SDS软件(加利福尼亚州福斯特城的应用生物系统公司)的7000序列检测系统(加利福尼亚州福斯特城的应用生物系统公司)对cDNA样品进行PCR。热循环条件为最初50℃2分钟和95℃10分钟，接着95℃15秒和60℃1分钟进行40个循环。根据制造商说明(得自应用生物系统公司的ABI Prism 7700序列检测系统的用户手册#2)分析PCR数据。

使用ABI PRISM 7700(美国马萨诸塞州波士顿的珀金埃尔默应用生物系统公司(Perkin Elmer Applied Biosystems,Boston,Massachusetts,USA))进行常规PCR以验证实时PCR得出的结果。使用2微升的cDNA溶液、1×AmpliTaq Gold通用混合物PCR反应缓冲液(加利福尼亚州福斯特城的应用生物系统公司)和94℃5分钟的最初变性进行PCR。针对每个引物对优化扩增。对于IL-8、CXC配体3和浆膜蛋白(94℃15秒、55℃15秒和72℃30秒进行30个循环)；对于肾素(94℃15秒、53℃15秒和72℃30秒进行38个循环)；对于氧化LDL受体和GAPDH(94℃15秒、55℃15秒和72℃30秒进行33个循环)。用于扩增的引物列于表8中。最终PCR反应物中引物浓度为1微摩尔，不同的是GAPDH，其为0.5微摩尔。GAPDH引物与实时PCR相同，不同的是未将制造商的TaqMan探针添加于最终PCR反应物中。将样品在2％(重量体积比)琼脂糖凝胶上进行电泳，并用溴化乙锭(密苏里州圣路易斯的西格玛公司)染色。用667Universal Twinpack胶片(新泽西州南普莱恩菲尔德的VWR国际有限公司(VWRInternational,South Plainfield,NJ))和焦距宝丽来(Polaroid)照相机(新泽西州南普莱恩菲尔德的VWR国际有限公司)采集图像。

表8：使用的引物

使用冷4％(重量体积比)多聚甲醛(密苏里州圣路易斯的西格玛奥德里奇(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO))在室温下固定细胞10分钟。使用0代(P0)的一个分离株(分离后直接使用)和11代(P11)的两个分离株以及成纤维细胞(P11)。使用靶向下列表位的抗体进行免疫细胞化学反应：波形蛋白(1:500，密苏里州圣路易斯的西格玛公司)、结蛋白(1:150；西格玛-通过免疫兔子制备；或1:300；加利福尼亚州特曼库拉的Chemicon公司–通过免疫小鼠制备)、α-平滑肌肌动蛋白(SMA；1:400；西格玛公司)、细胞角蛋白18(CK18；1:400；西格玛公司)、血管性血友病因子(vWF；1:200；西格玛公司)以及CD34(人CD34III类；1:100；加利福尼亚州卡平特里亚的DAKOCytomation公司)。此外，测试11代产后细胞的下列标记物：抗人GROα-PE(1:100；新泽西州富兰克林湖的BD公司)、抗人GCP-2(1:100；加利福尼亚州圣克鲁兹的圣克鲁兹生物技术公司)、抗人氧化LDL受体1(ox-LDL R1；1:100；圣克鲁兹生物技术公司)以及抗人NOGA-A(1:100；圣克鲁兹生物技术公司)。

用磷酸盐缓冲盐水溶液(PBS)清洗培养物，将其暴露于含PBS、4％(体积比)山羊血清(加利福尼亚州特曼库拉的Chemicon公司)和0.3％(体积比)Triton(Triton X-100；密苏里州圣路易斯的西格玛公司)的蛋白质阻断溶液30分钟以进入细胞内抗原。在所关注表位位于细胞表面上(CD34、ox-LDL R1)的情况下，在流程的所有步骤中省略Triton X-100以防止表位丢失。此外，在一抗通过免疫山羊制备(GCP-2、ox-LDL R1、NOGO-A)的情况下，在整个过程中使用3％(体积比)驴血清替代山羊血清。一抗在阻断溶液中稀释后，加到培养物上在室温下保持1小时。除去一抗溶液，在施加含阻断剂和山羊抗小鼠IgG–德克萨斯红(1:250；俄勒冈州尤金的分子探针公司)和/或山羊抗兔IgG-Alexa 488(1:250；分子探针公司)或驴抗山羊IgG–FITC(1:150，圣克鲁兹生物技术公司)的二抗溶液(室温下1小时)之前，用PBS清洗培养物。然后清洗培养物，施加10微摩尔DAPI(分子探针公司)10分钟，使细胞核显色。

经过免疫染色后，使用适当的奥林巴斯倒置表面荧光显微镜(纽约梅尔维尔的奥林巴斯公司)观察荧光。在所有情况下，阳性染色表示超过对照染色的荧光信号，其中除了施用一抗溶液外遵循上述所有流程。使用彩色数码摄像机和软件(加利福尼亚州卡尔斯巴德的Media Cybernetics公司)采集代表性图像。对于三染样品，每幅图像每次仅用一个发射滤片拍摄。使用Adobe Photoshop软件(加利福尼亚州圣何塞的Adobe公司(Adobe,San Jose,CA))制作分层剪辑。

在磷酸盐缓冲盐水溶液(PBS)(加利福尼亚州卡尔斯巴德的Gibco公司)中洗涤培养瓶中的贴壁细胞，并用胰蛋白酶/EDTA(加利福尼亚州卡尔斯巴德的Gibco公司)分离。将细胞收获、离心并以每毫升1×10⁷个的细胞浓度重悬于PBS中的3％(体积比)FBS中。将一百微升等分试样递送至锥形管中。使用破膜/冲洗缓冲液(加利福尼亚州圣地亚哥的BDPharmingen公司)对已对细胞内抗原染色的细胞进行透化处理。根据制造商说明将抗体添加至等分试样中并在黑暗中于4℃下孵育细胞30分钟。孵育后，用PBS洗涤细胞，并离心去除多余抗体。将需要二抗的细胞重悬于100微升3％FBS中。根据制造商说明添加二抗并在黑暗中于4℃下孵育细胞30分钟。孵育后，用PBS洗涤细胞，并离心去除多余二抗。将洗涤后的细胞重悬于0.5毫升PBS中并用流式细胞术进行分析。使用下列抗体：氧化LDL受体1(sc-5813；圣克鲁兹生物技术公司)、GROa(555042；马萨诸塞州贝德福德的BD Pharmingen(BDPharmingen,Bedford,MA))、小鼠IgG1κ(P-4685和M-5284；西格玛公司)、驴抗山羊IgG(sc-3743；圣克鲁兹生物技术公司)。用FACScalibur(加利福尼亚州圣何塞的BD公司)进行流式细胞术分析。

通过ΔΔCT方法分析得自实时PCR的数据并以对数尺度表示。浆膜蛋白和氧化LDL受体表达的水平在脐带组织来源细胞中比其他细胞中更高。在产后来源的细胞与对照之间未发现CXC配体3和GCP-2的表达水平的显著差异。通过常规PCR验证实时PCR的结果。PCR产物的测序进一步验证了这些观察结果。使用上列的常规PCR CXC配体3引物时在产后来源的细胞与对照之间未发现CXC配体3的表达水平的显著差异。

产后细胞中细胞因子IL-8的产量在生长培养基培养的和血清饥饿的产后来源细胞中升高。所有实时PCR数据用常规PCR并通过测序PCR产物进行验证。

当在无血清培养基中生长的细胞的上清液中检测IL-8的存在性时，在来源于脐带细胞和胎盘细胞的一些分离株的培养基中检测到最高量(表9)。在来源于人表皮成纤维细胞的培养基中未检测到IL-8。

通过免疫细胞化学分析，对0代的来源于人脐带组织的细胞是否产生所选蛋白质进行探测。紧随分离后(0代)，将细胞用4％多聚甲醛固定并暴露于如下六种蛋白的抗体：血管性血友病因子、CD34、细胞角蛋白18、结蛋白、α-平滑肌肌动蛋白和波形蛋白。脐带组织来源细胞对于a-平滑肌肌动蛋白和波形蛋白是阳性的，并且染色模式在整个11代是一致的。

通过微阵列和PCR(实时和常规两种)已确定如下四种基因的基因表达水平之间的一致性：氧化LDL受体1、肾素、浆膜蛋白和IL-8。这些基因的表达在PPDC的mRNA水平受到差异调控，且IL-8在蛋白水平也受到差异调控。对0代来源于人脐带组织的细胞是否表达α-平滑肌肌动蛋白和波形蛋白进行探测，并且这些细胞对于这两者均是阳性的。染色模式在整个11代均得以保持。

实例6

产后来源细胞的体外免疫学评价

体外评价产后来源细胞(PPDC)的免疫学特性，以便预测在体内移植时这些细胞是否会引发任何免疫反应。通过流式细胞术分析PPDC是否存在HLA-DR、HLA-DP、HLA-DQ、CD80、CD86和B7-H2。这些蛋白由抗原递呈细胞(APC)表达并且是初始CD4⁺T细胞直接刺激所需的(Abbas&Lichtman,Cellular and Molecular Immunology,5th Ed.(Saunders,Philadelphia,2003；p.171)(Abbas和Lichtman，《细胞与分子免疫学》，第5版，(桑德斯公司，费城，2003年；第171页))。还通过流式细胞术分析细胞系是否表达HLA-G(Abbas和Lichtman，2003年，出处同上)、CD 178(Coumans,et al.,Journal of ImmunologicalMethods,1999；224:185-196(Coumans等人，《免疫学方法杂志》，1999年，第224卷，第185-196页))和PD-L2(Abbas和Lichtman，2003年，出处同上；Brown,et.al.,The Journal ofImmunology,2003；170:1257-1266(Brown等人，《免疫学杂志》，2003年，第170卷，第1257-1266页))。存在于胎盘组织中的细胞对这些蛋白的表达被认为介导子宫内胎盘组织的免疫豁免状态。为了预测胎盘和脐带组织来源细胞系引发体内免疫反应的程度，在单向混合淋巴细胞反应(MLR)中测试所述细胞系。

在包被有2％明胶(密苏里州圣路易斯的西格玛公司)的T75培养瓶(纽约康宁的康宁公司)中的含有青霉素/链霉素的生长培养基中，将细胞培养至汇合。

在磷酸盐缓冲盐水溶液(PBS)(加利福尼亚州卡尔斯巴德的Gibco公司)中洗涤细胞，并用胰蛋白酶/EDTA(密苏里州卡尔斯巴德的Gibco公司)分离。将细胞收获、离心并以每毫升1×10⁷个的细胞浓度重悬于PBS中的3％(体积比)FBS中。根据制造商说明将抗体(表10)添加至100微升细胞悬液中，并在4℃下在黑暗中孵育30分钟。孵育后，将细胞用PBS洗涤，并离心去除未结合抗体。将细胞重悬于500微升PBS中，并使用FACSCalibur仪器(加利福尼亚州圣何塞的BD公司)通过流式细胞术进行分析。

将标记为细胞系A的10代脐带组织来源细胞的冻存小瓶放在干冰上运送至魁北克省塞讷维尔的CTBR公司(CTBR(Senneville,Quebec))，以使用CTBR SOP No.CAC-031进行混合淋巴细胞反应。从多个男性和女性志愿捐献者收集多个外周血单核细胞(PBMC)。用丝裂霉素C处理刺激因子(供体)变应性PBMC、自体PBMC和产后细胞系。将自体和丝裂霉素C处理的刺激细胞添加至应答(受体)PBMC并培养4天。孵育后，将[³H]胸苷添加至每种样品并培养18小时。收获细胞后，提取放射性标记的DNA并使用闪烁计数器测定[³H]-胸苷结合。

将异源供体(SIAD)的刺激指数计算为接受者加丝裂霉素C处理的异源供体的平均增殖率再除以接受者的基线增殖率。将PPDC的刺激指数计算为接受者加丝裂霉素C处理的产后细胞系的平均增殖率再除以接受者的基线增殖率。

筛查六名人志愿献血者，以鉴定出在与其他五名献血者的混合淋巴细胞反应中将表现稳健增殖反应的单个异源供体。将该供体选择为异源阳性对照供体。将剩余的五名献血者选择为受体。将异源阳性对照供体和胎盘细胞系用丝裂霉素处理并培养于混合淋巴细胞反应物中使其与五种单独的异源接受者反应。使用每板有三种接受者的两个细胞培养板，以一式三份进行反应(表11)。平均刺激指数在6.5(板1)至9(板2)的范围内并且异源供体阳性对照在42.75(板1)至70(板2)的范围内(表12)。

表11：混合淋巴细胞反应数据-细胞系A(脐带)

增殖测定法的DPM

板ID：板1

板ID：板2

表12：在与五种单独的异源接受者的混合淋巴细胞反应中脐带组织来源细胞和异 源供体的平均刺激指数。

平均刺激指数

	受体	脐带
			板1(接受者1-4)	42.75	6.5
板2(接受者5)	70	9

流式细胞术分析所得的脐带组织来源细胞的直方图说明了HLA-DR、DP、DQ、CD80、CD86和B7-H2的阴性表达，如与IgG对照一致的荧光值所指出的，这表明脐带细胞系缺少直接刺激CD4⁺T细胞所需的细胞表面分子。流式细胞术分析所得的脐带组织来源细胞的直方图说明了PD-L2的阳性表达，如相对于IgG对照荧光值增加所指出的，并说明了CD178和HLA-G的阴性表达，如与IgG对照一致的荧光值所指出的。

在与脐带组织来源细胞系进行的混合淋巴细胞反应中，平均刺激指数在6.5至9的范围内，并且异源阳性对照的平均刺激指数在42.75至70的范围内。脐带组织来源细胞系对于刺激蛋白HLA-DR、HLA-DP、HLA-DQ、CD80、CD86和B7-H2的表达是阴性的，如通过流式细胞术所测定的。脐带组织来源细胞系对于免疫调节蛋白HLA-G和CD178的表达是阴性的，并且对于PD-L2的表达是阳性的，如通过流式细胞术所测定的。异源供体PBMC包含表达HLA-DR、DQ、CD8、CD86和B7-H2的抗原递呈细胞，从而允许刺激初始CD4⁺T细胞。胎盘和脐带组织来源细胞上缺少初始CD4⁺T细胞直接刺激所需的抗原递呈细胞表面分子以及存在免疫调节蛋白PD-L2，可导致与异源对照相比这些细胞在MLR中表现出低刺激指数。

实例7

脐带组织来源细胞对营养因子的分泌

测定所选营养因子从脐带组织来源细胞的分泌量。选择用于检测的因子包括：(1)已知具有血管生成活性的那些，例如肝细胞生长因子(HGF)(Rosen et al.,CibaFound.Symp.,1997；212:215-26(Rosen等人，《Ciba基金会座谈会》，1997年，第212卷，第215-226页))、单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)(Salcedo et al.,Blood,(2000；96:34-40(Salcedo等人，《血液》，2000年，第94卷，第34-40页))、白介素-8(IL-8)(Li et al.,J.Immunol.,2003；170:3369-76(Li等人，《免疫学杂志》，2003年，第170卷，第3369-3376页))、角质细胞生长因子(KGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、血管内皮生长因子(VEGF)(Hughes et al.,Ann.Thorac.Surg.,2004；77:812-8(Hughes等人，《胸外科学纪事》，2004年，第77卷，第812-818页))、基质金属蛋白酶1(TIMP1)、促血管生成素2(ANG2)、血小板衍生生长因子(PDGF-bb)、促血小板生成素(TPO)、肝素结合表皮生长因子(HB-EGF)、基质细胞衍生因子1α(SDF-1α)；(2)已知具有神经营养/神经保护活性的那些，例如脑源性神经营养因子(BDNF)(Cheng et al.,Dev.Biol.,2003；258:319-33(Cheng等人，《发育生物学》，2003年，第258卷，第319-333页))、白介素-6(IL-6)、粒细胞趋化蛋白-2(GCP-2)、转化生长因子β2(TGFβ2)；以及(3)已知具有趋化因子活性的那些，例如巨噬细胞炎性蛋白1α(MIP1a)、巨噬细胞炎性蛋白1β(MIP1b)、单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)、Rantes(调节激活正常T细胞表达和分泌)、I309、胸腺活化调节趋化因子(TARC)、嗜酸细胞活化趋化因子、巨噬细胞衍生趋化因子(MDC)、IL-8。

将来自脐带的细胞以及来源于人新生儿包皮的人成纤维细胞培养于明胶包被的T75培养瓶中的含有青霉素/链霉素的生长培养基中。冻存11代的细胞并保存在液氮中。细胞解冻后，将生长培养基添加至所述细胞，接着转移到15毫升离心管中并以150×g将细胞离心5分钟。弃去上清液。将细胞沉淀物重悬于4毫升生长培养基中，并对细胞进行计数。以375,000个细胞/75cm²含有15毫升生长培养基的培养瓶接种细胞，并培养24小时。将培养基更换为无血清培养基(DMEM-低葡萄糖(Gibco)，0.1％(重量体积比)牛血清白蛋白(西格玛公司)，青霉素/链霉素(Gibco))并培养8小时。在孵育结束时通过以14,000×g离心5分钟收集调理过的无血清培养基，并保存于–20℃下。为了估算每个培养瓶中的细胞数量，用PBS洗涤细胞，并使用2毫升胰蛋白酶/EDTA分离。通过添加8毫升生长培养基来抑制胰蛋白酶活性。以150×g将细胞离心5分钟。去除上清液，并将细胞重悬于1毫升生长培养基中。使用血球计估算细胞数量。

在37℃下于5％二氧化碳和大气氧中培养细胞。也将胎盘来源细胞(批号101503)培养于5％氧气或β-巯基乙醇(BME)中。通过ELISA测定法(明尼苏达州明尼阿波利斯的安迪生物)测定每个细胞样品产生的MCP-1、IL-6、VEGF、SDF-1α、GCP-2、IL-8和TGF-β2的量。所有测定法均根据制造商使用说明进行。

使用

蛋白质组阵列(Pierce生物技术公司(PierceBiotechnology Inc.))测定趋化因子(MIP1a、MIP1b、MCP-1、Rantes、I309、TARC、嗜酸细胞活化趋化因子、MDC、IL8)、BDNF和血管生成因子(HGF、KGF、bFGF、VEGF、TIMP1、ANG2、PDGF-bb、TPO、HBF-EGF)。蛋白质组阵列为用于定量测定每孔2至16种蛋白的多重夹心ELISA。通过以2×2、3×3或4×4的模式将4至16种不同捕获抗体点样于96孔板的每孔中，来产生阵列。夹心ELISA流程后，对整块板拍照以采集板的每孔内每个点样处产生的化学发光信号。每个点样中产生的信号量与原标准品或样品中的靶蛋白的量成比例。

MCP-1和IL-6由脐带组织来源细胞和表皮成纤维细胞分泌(表13)。SDF-1α由成纤维细胞分泌。GCP-2和IL-8由在BME或5％O₂存在下所培养的脐带组织来源细胞分泌。GCP-2也由人成纤维细胞分泌。ELISA测定法不可检出TGF-β2。

由脐带组织来源细胞分泌TIMP1、TPO、KGF、HGF、FGF、HBEGF、BDNF、MIP1b、MCP1、RANTES、I309、TARC、MDC和IL-8(表14和15)。未检测到Ang2、VEGF或PDGF-bb。

脐带组织来源细胞分泌多种非常有益的营养因子。这些营养因子中的一些，例如分解代谢抑制剂TIMP1在防止基质金属蛋白酶降解细胞外基质起着关键作用。HGF、bFGF、MCP-1和IL-8在细胞存活和细胞分化功能方面起着重要作用。其他营养因子例如BDNF和IL-6在神经再生方面具有重要作用。

实例8

HMG-CoA还原酶抑制剂对扩增的人脐带组织来源细胞上的HLA-DR、DP、DQ的IFN- γ-诱导表达的抑制

将培养扩增的人脐带组织来源细胞(022803P4)接种于6孔组织培养板中并培养于Dulbecco’s改良Eagles培养基(DMEM)-低葡萄糖、15％胎牛血清(FBS)、青霉素/链霉素(P/S)、β巯基乙醇(BME)中生长至大约70％汇合度。然后用含有10μM各自的HMG-CoA还原酶抑制剂(辛伐他汀酸(瑞士劳森的亚历克西斯生物化学公司(Alexis Biochemicals,Lausen,Switzerland)))配制成10mM储备试剂(DMSO中)或DMSO溶媒–0.1％(密苏里州圣路易斯的西格玛公司)的培养基处理细胞并孵育过夜。通过吸出除去培养基，并用含500U/ml rhIFN-γ(新泽西州富兰克林湖的BD Pharmingen)和10μM各自的HMG-CoA还原酶抑制剂的培养基代替，并孵育3天。在第三天时，用胰蛋白酶收获细胞。

将所收获的细胞用PBS洗涤一次，并重悬于含20μl FITC-标记的HLA-DR、DP、DQ(新泽西州富兰克林湖的BD生物科学事业部)或FITC-标记的IgG抗体(新泽西州富兰克林湖的BD生物科学事业部)的100μl于PBS中的3％FBS中，并孵育1小时。将细胞用PBS洗涤一次，并重悬于500μlPBS中，并在FACSCalibur流式细胞仪(新泽西州富兰克林湖的BS生物科学公司(BS Biosciences,Franklin Lakes,NJ))上进行分析。

如表16中所显示的，采用炎症细胞因子IFN-γ孵育的未处理的和0.1％DMSO溶媒对照人脐带组织来源的细胞显示HLA-DR、DP、DQ表达的增加，如通过流式细胞术检测到的增加的荧光所看到的。采用HMG-CoA还原酶抑制剂预处理并随后采用IFN-γ孵育的人脐带组织来源的细胞显示与未处理的和溶媒对照相似的HLA-DR、DP、DQ表达。

该数据表明，在人脐带组织来源的细胞中HMG-CoA还原酶抑制炎症细胞因子介导的HLA-DR、DP、DQ的表达。

实例9

椎间盘退变的兔模型中人脐带组织来源细胞(hUTC)的功效

进行研究以确定人脐带组织来源细胞(hUTC)在椎间盘(IVD)退变的兔模型中是否有效。在受损部位注射细胞并通过X射线成像评估椎间盘尺寸。尸检时进行组织分析。

为了评估人脐带组织来源细胞(hUTC)对椎间盘(IVD)退变的效果，将hUTC注射进穿刺的IVD中。每两周一次获取X-射线图像，并分析与损伤的溶媒处理对照相比椎间盘高度的变化。用hUTC处理导致与溶媒对照相比椎间盘高度增加以及恢复速率加快。

椎间盘退变模型的构建：在没有任何系统性偏差的情况下选择6月龄的雌性NZW兔子。在选用之前及紧接尸检之前给动物贴上标签并称重。兔子在镇静之前接受甘罗溴铵(皮下注射0.01至0.02mg/kg)以减少口气管分泌物并减轻与麻醉相关的心动过缓。术前给予作为预先镇痛剂的丁丙诺啡(盐酸丁丙诺啡0.03mg/kg)。通过施用盐酸氯胺酮(25mg/kg)和乙酰丙嗪马来酸酯(1mg/kg,10mg/ml)将兔子麻醉，以便进行气管内插管。拍摄术前X射线图像作为基线对照。术前照片完成后皮下或肌内给予5mg/kg剂量的甲苯噻嗪。用异氟烷吸入剂(在2-3％下诱导并在0.5-2％下维持)维持动物。

使兔子(重3.5kg)处于侧卧姿势。消毒和铺巾之后，通过腰大肌的钝性分离，经后外侧腹膜后入路暴露腰IVD。暴露三个连续腰IVD(L2/3、L3/4和L4/5)的前表面。使用具有允许针穿行5mm深的阻挡装置的18G针，在L2/3和L4/5段在腹侧面穿刺纤维环进入髓核。将血管缝钉和缝合线置于L3/4段的腰大肌上作为标记。分层修复形成的外科手术伤口。使用缝钉闭合皮肤。

手术后，拍摄术后X射线图像以验证穿刺水平。口服1.5mg美洛昔康(外科手术之前一天和术后2-3天)。在咨询兽医人员的情况下可根据需要每天最多给予两次镇痛剂(盐酸丁丙诺啡0.01–0.03mg/kg)并持续2-3天。从麻醉复苏后，将兔子放回其笼中并让其随意活动。在兔子上使用兔外套以防止它们接触和干扰/撕裂外科手术切口及移除缝钉。

处理评估：初始外科手术(环状穿刺)后四周，从相对侧进行相似外科手术以避免从由第一次手术形成的伤疤流血。当通过X射线和视觉观察确认了外科手术退变的椎间盘，使用采用28G针的微量注射器在每只兔子的L2/3和L4/5段将PBS、1,000,000或100,000个细胞经椎间盘注射进髓核区。L3/4作为不穿刺、未处理对照而留下来。在外科手术伤口修复后，将兔子放回其笼子并密切监测。如前文所述，施用抗生素和镇痛剂三天。每只兔子经口接受1.5mg美洛昔康(外科手术之前一天和术后2-3天)。密切监测行为、食欲和体重变化，并且兽医人员和研究人员监测术后应激。

所有注射材料均在无菌条件下制备。本研究中使用已评估无菌性、支原体、核型和病原体的研究等级hUTC(批号Q030306)。将低温保存的细胞迅速解冻并在PBS中稀释。将细胞离心并去除上清液。将细胞重悬于PBS中并计数以获得每微升100,000或10,000个细胞的最终细胞浓度。使用台盼蓝评价活力。将10微升细胞加载到预先灭菌的微量注射器中并如上所述注射进IVD中。

在穿刺后2、4、6、8、10、12、14和16周及穿刺后16周处死时，在施用盐酸氯胺酮(25mg/kg)和乙酰丙嗪马来酸酯(1mg/kg)后拍摄测量IVD高度的X射线图像。

初始环状穿刺后16周时(对应于注射(细胞)后12周)，用盐酸氯胺酮(25mg/kg)和乙酰丙嗪马来酸酯(1mg/kg)麻醉每组中的八只兔子，并用过量剂量的戊巴比妥(90mg/kg，安乐死B溶液：纽约梅尔维尔的汉瑞祥公司(Henry Schein Inc.,Melville,NY))施行安乐死。

将穿刺之前、穿刺后的每个时间点及在安乐死时获得的X-射线胶片数字化，并测量椎体高度和椎间盘高度。根据已公布的方法将IVD高度表示为DHI(Chujo et al.,Spine,2006；31:2909-17(Chujo等人，《脊柱》，2006年，第31卷，第2909-2917页)；Masuda et al.,Spine,2006；31:742-54(Masuda等人，《脊柱》，2006年，第31卷，第742-754页))。一名骨科研究人员在不清楚处理组的情况下，独立地解读所有X射线图像。使用MATLAB软件(马萨诸塞州纳蒂克(Natick,MA))的定制程序分析数字化X射线、测量值，包括椎体高度和IVD高度。将数据传输至Excel软件，并根据略作修改的Lu et al.,Spine,22:1828-34(1997)(Lu等人，《脊柱》，第22卷，第1828-1834页，1997年)的方法将IVD高度表示为椎间盘高度指数(DHI＝IVD高度/相邻IVD体高)。通过将从IVD前部、中部和后部获得的测量值平均，再除以相邻椎体高度的平均值，来计算平均IVD高度(DHI)。％DHI表示为(术后DHI/术前DHI)×100。此外，使用L3/4段作为对照段将％DHI归一化。归一化的％DHI＝(实验段％DHI/L3/4％DHI)×100。恢复速率也按照如下计算：(％DHI(时间点)-％DHI(4W[穿刺]))/(100-％DHI(4W[穿刺]))。

通过双向重复测量ANOVA或单向ANOVA和Fisher’s PLSD作为事后检验，来分析X射线测量值相关数据的平均值之间的差异显著性。所有数据表示为平均值±标准偏差。使用Statview(版本5.0，SPSS，伊利诺伊州芝加哥)程序包用p<0.05的显著性水平进行统计分析。

如上所述每两周评估一次椎间盘高度指数。具有小于10％缺陷的椎间盘从该研究中排除。数据(表17中所示)表明，如与移植后2-12周(穿刺后6-16周)之间的对照相比，用100,000个细胞的hUTC剂量增加了椎间盘高度，而用1,000,000个细胞的剂量减小了椎间盘高度(p<0.05，hUTC(1,000,000)相对hUTC(100,000)移植后2、4、6和14周；p<0.01，移植后8周)。

如上所述测定恢复速率。具有小于10％缺陷的椎间盘从该研究中排除。数据(表18所示)表明，如与移植后2-12周(穿刺后6-16周)之间的对照相比，用100,000个细胞的hUTC剂量增加了恢复速率，而用1,000,000的剂量减小了恢复速率。(p<0.05，对照相对hUTC(100,000个细胞)移植后2和14周；p<0.01，移植后12周)。

因此，通过将hUTC以1,000,000和100,000个细胞/注射的剂量注射进穿刺的IVD，在IVD退变的兔模型中评估hUTC对IVD退变的影响。每两周一次获取X-射线图像，并分析与未处理的穿刺对照相比椎间盘高度的变化。数据表明，如与PBS处理的对照相比，用100,000浓度的hUTC处理导致椎间盘高度增加，而用1,000,000浓度进行处理使椎间盘高度降低(表17)。数据的进一步分析表明，用hUTC(100,000)处理的椎间盘的恢复速率(归一化％DHI的恢复量/降低总量)高于对照(表18)。

实例10

人脐带组织来源细胞在体外对细胞外基质蛋白的表达

进行研究以确定hUTC在体外对三种细胞外基质蛋白即聚集蛋白聚糖、胶原I和胶原II表达的程度。单独测试细胞，并在用营养因子、TGF-β、GDF-5和PDGF-BB刺激后测试细胞。

在标准条件下培养维持人脐带组织来源细胞(hUTC；批号120304)的培养物。简言之，将细胞以每平方厘米5000个细胞接种于T-培养瓶中，并每3-4天进行传代和重新接种。将用于营养因子实验的细胞包封于藻酸盐微球中并用标准生长培养基中的因子处理。向培养物中补充100μg/ml的抗坏血酸。测试的因子为10ng/ml的PDGF-BB、5ng/ml的TGFβ-1和200ng/ml的GDF-5。建立如下五个处理组：单独的hUTC、hUTC与GDF-5、hUTC与TGF–β1、hUTC与PDGF-BB以及hUTC与TGF-β1和GDF-5。

培养2周后，将细胞从藻酸盐释放、洗涤、沉淀并冷冻。分离RNA并进行逆转录以产生cDNA。通过实时PCR分析样品是否表达聚集蛋白聚糖、胶原I型和II型。

实时PCR分析所得的结果显示了在五种不同培养条件下的表达。结果示于表19中并表示为没有生长因子处理的情况下相对hUTC的表达。用PDGF-BB及GDF-5与TGF-β1处理的培养物表现出相当表达量的聚集蛋白聚糖、胶原I和胶原II。用TGF-β1处理的细胞表现出胶原I和胶原II和聚集蛋白聚糖大约10-20倍的一定诱导水平。用GDF-5处理时观察到最高诱导水平。细胞表现出聚集蛋白聚糖和胶原I型大约50倍的增加以及胶原II型表达超过300倍的增加。

实例11

脐带来源细胞中的端粒酶表达

端粒酶的作用是合成端粒重复序列，端粒重复序列用于保护染色体完整性并延长细胞的复制寿命(Liu,K,et al.,PNAS,1999；96:5147-5152(Liu,K等人，《美国国家科学院院刊》，1999年，第96卷，第5147-5152页))。端粒酶由两个组分组成，即端粒酶RNA模板(hTER)和端粒酶逆转录酶(hTERT)。端粒酶的调控通过hTER而非hTERT的转录进行确定。因此hTERT mRNA的实时聚合酶链反应(PCR)为确定细胞的端粒酶活性的可接受方法。

细胞分离。进行实时PCR实验以确定人脐带组织来源细胞的端粒酶产量。根据上述实验制备人脐带组织来源细胞。一般来讲，洗涤在正常分娩后从宾夕法尼亚州费城的国家疾病研究交流会获得的脐带以去除血液和细胞碎片，并进行机械离解。然后将组织与消化酶(包括胶原酶、分散酶和透明质酸酶)在培养基中在37℃下孵育。根据以上实例中所述的方法培养人脐带组织来源细胞。间充质干细胞和正常表皮成纤维细胞(cc-2509批号9F0844)得自马里兰州沃克斯维尔的康伯司公司。多能人睾丸胚胎癌(畸胎瘤)细胞系nTera-2细胞(NTERA-2cl.Dl)(参见，Plaia et al.,Stem Cells,2006；24(3):531-546(Plaia等人，《干细胞》，2006年，第24卷，第3期，第531-546页))购自弗吉尼亚州马纳萨斯的美国典型培养物保藏中心(ATCC(Manassas,Va.))并根据如上所述方法进行培养。

总RNA的分离。使用

试剂盒(加利福尼亚州瓦伦西亚的凯杰公司)从细胞提取RNA。RNA用50微升经DEPC处理的水洗脱并保存于-80℃下。使用随机六聚体和

逆转录试剂(加利福尼亚州福斯特城的应用生物系统公司)以25℃10分钟、37℃60分钟和95℃10分钟，对RNA进行逆转录。将样品在-20℃下保存。

实时PCR。根据制造商说明(应用生物系统公司)使用应用生物系统公司的(也称为

基因表达测定法)对cDNA样品进行PCR。这种商业试剂盒广泛用于测定人细胞中的端粒酶。简言之，使用具有ABI prism 7000SDS软件(应用生物系统公司)的7000序列检测系统，将hTERT(人端粒酶基因)(HSOO162669)和人GAPDH(内对照)与cDNA和

通用PCR扩增预混试剂混合。热循环条件为最初50℃2分钟和95℃10分钟，接着95℃15秒和60℃1分钟进行40个循环。根据制造商说明分析PCR数据。

测定人脐带组织来源细胞(ATCC登录号PTA-6067)、成纤维细胞和间充质干细胞的hTERT和18S RNA。如表20中所示，hTERT进而端粒酶未在人脐带组织来源细胞中检测到。

测定人脐带组织来源细胞(分离株022803，ATCC登录号PTA-6067)和nTera-2细胞并且结果表明两个批次人脐带组织来源细胞中均未表达端粒酶而畸胎瘤细胞系显示高水平的表达(表21)。

因此，可得出如下结论：本发明的人脐带组织来源细胞不表达端粒酶。

实例12

将人脐带组织来源细胞注射进髓核改变了体内椎间盘退变的过程

本实例研究了在IVD退变的外科体内模型中将人脐带组织来源细胞(hUTC)直接注射进髓核(NP)的效用。在有和没有水凝胶载体的情况下注射hUTC。该研究率先研究对该退变模型中处理的MRI和生物力学响应。

方法

如下文将更详细描述的，在之前验证的椎间盘退变的兔环切开术模型中，使用三十只骨骼成熟的新西兰白兔(对照n＝6，穿刺n＝6，水凝胶载体n＝6，细胞+PBS缓冲液n＝6，细胞+水凝胶载体n＝6)(参见Sobajima et al.Spine.2005；30(1):15-24(Sobajima等人，《脊柱》，2005年，第30卷，第1期，第15-24页))。用16G针穿刺椎间盘L2-3、L3-4和L4-5以诱导退变，然后在有或没有水凝胶载体的情况下用人脐带组织来源细胞处理。根据之前验证的方法分析使用3T膝部线圈在0、3、6和12周获得的连续脊柱MRI以证实退变。在12周时处死兔子，并在组织学上分析椎间盘L4-5。使用单轴载荷归一化的位移测试分析L3-4椎间盘的粘弹性。根据之前验证的两相指数模型，对蠕变曲线进行数学建模。

兔子

在本研究中使用三十只健康的骨骼成熟的新西兰白兔(雌性，1年龄，体重5kg)。将它们划分成非穿刺对照(n＝6)、穿刺组(n＝6)、注射单独的载体后的穿刺组(n＝6)、注射PBS缓冲液中的细胞后的穿刺组(n＝6)以及注射载体中的细胞后的穿刺组(n＝6)。

样品制备

人脐带组织得自同意的进行阴道分娩或剖腹产分娩的捐赠者。从单个捐赠者的脐带分离和扩增人脐带组织来源细胞(hUTC)。简言之，将脐带人工切碎并用0.5单位/ml胶原酶(诺德马克公司(Nordmark))、5.0单位/ml分散酶(罗氏诊断(Roche Diagnostics))和2单位/ml透明质酸酶(伊斯塔制药(ISTA Pharmaceuticals))的混合物消化直至接近完全消化。将细胞悬液通过筛以去除未消化的组织，并将细胞离心并以每cm²5,000个细胞接种于猪明胶包被的培养瓶上的生长培养基1(DMEM-低葡萄糖(康伯司公司/SAFC生物科学公司(SAFC Biosciences))、15％(体积比)成分确定的胎牛血清(FBS；犹他州洛根的Hyclone公司)、0.001％β巯基乙醇(西格玛公司)、50U/ml青霉素和50μg/ml链霉素(龙沙公司(Lonza)))中。使细胞在标准组织培养条件下于大气氧、5％二氧化碳和37°下在静置T培养瓶中扩增，直到达到五次群体倍增(PD)并储存。然后使细胞在静置T培养瓶中的生长培养基2(DMEM-低葡萄糖，15％(体积比)成分确定的胎牛血清(FBS；HyClone)、100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素(英杰公司))中扩增至大约12次累积PD并储存。然后使细胞在转瓶(纽约的康宁公司)中的生长培养基2中在

II微载体(SoloHill工程公司(SoloHillEngineering))上进一步扩增。将含有细胞的转瓶放置于设定为60rpm的转板上，并将细胞在标准条件下于大气氧、5％二氧化碳和37℃下培养直到它们达到大约总计25-30次累积群体倍增。使用TrypLE^TM(英杰公司)从微载体收获细胞，在制冷温度下冻存并保存。使等分试样的细胞库解冻以进行表征测试，包括活力、恢复、无菌、内毒素、支原体、细胞核学和细胞表面标记物免疫表型分型，从而确保安全和身份。在传代早期通过基于PCR的方法测试细胞的病毒病原体，以检测HIV-1、HIV-2、CMV、HBV、HCV、HTLV和EBV所特有的核酸序列。将细胞保存于制冷温度直到使用，并做好准备在递送之前立即注射。在注射到动物之前，立即将细胞小瓶在37℃水浴中解冻，然后用PBS洗涤。取出细胞悬液的等分试样，与台盼蓝混合，并用血球计进行计数。将细胞浓度调整为适当的递送密度。载体溶液为PBS或从纤维蛋白胶(

纤维蛋白封闭剂(人)，奥姆里克斯制药公司)的组分衍生的原位形成水凝胶载体。为了将细胞加载到水凝胶中，将细胞与PBS中的人纤维蛋白原(6.8-10.6mg/ml)混合。将该试剂与PBS中的人凝血酶(0.4-0.6U/ml)混合。在混合后很快发生胶凝。

穿刺外科手术

在兽医手术室中，在无菌外科条件和全身麻醉下，使兔子的腰脊柱从左前外侧入路暴露。L4-5椎间盘根据其相对于髂嵴的位置而确定，并用16针距针穿刺5mm的深度，使得针尖处于椎间盘的中心。针以平行于终板的方向进入椎间盘，同时斜角指向头侧。随后通过直接观察和触诊确定椎间盘L3-4和L2-3，并如上穿刺。外科手术后，将兔子关在大的独立笼子中，使其活动不受限制。通过该方法对兔子IVD的环切开术诱导了缓慢、可靠、可重复的退变级联，这可通过连续T2加权MRI证实(参见Masuda et al.Spine.2005；30(1):5-14(Masuda等人，《脊柱》，2005年，第30卷，第1期，第5-14页))。

注射外科手术

处理组中的兔子在初始穿刺外科手术后3周又进行外科手术。使脊柱从右前外侧入路(之前穿刺外科手术的对侧)暴露。汉密尔顿(Hamilton)100微升注射器(1710TPLT；产品号81041)和具有塑料毂座的汉密尔顿30针距锐利尖端针(KF 730NDL 6/包装，30G/2”；产品号90130)用于治疗注射进行NP的中心。对于载体组，在注射器中吸入15微升水凝胶，然后缓慢注射进每个椎间盘(在小于4.5分钟内注射以有利于液体在胶凝前注射)。对于细胞+缓冲液(磷酸盐缓冲盐水溶液)组，将15微升无菌PBS中的10⁵个细胞注射进每个椎间盘。对于载体组中的细胞，注射15微升水凝胶载体中的10⁵个细胞。在c臂引导下进行注射以确定针处于椎间盘中心。所有注射在刻意缓慢和恒定的速率下在一分钟的过程中进行以避免椎间盘压力迅速增大及随后的材料脱出。按照针对穿刺外科手术所述的方法缝合、复苏和照料兔子。

磁共振成像

在时间0(环状穿刺之前)、3周(注射外科手术之前)、6周和12周(处死之前)时获得矢状MRI。使用3特斯拉西门子(Siemens)磁体和标准人膝部线圈获得T1加权图像(TR＝650ms，TE＝14ms，层厚＝0.6mm)和T2加权图像(TR＝3800ms，TE＝114ms，层厚＝0.6mm)。对兔子进行镇静并将其以仰卧姿势放置在膝部线圈中。T1加权图像用于定性检查脊柱中的任何骨异常。T2加权图像用于对椎间盘中的退变量进行定量。T2加权序列的正中矢状层由受过训练的医师根据椎体、脊髓和棘突的宽度确定。使用以前验证的自动分割方法来确定作为所关注区域的NP(参见Bechara et al.Am J Neuroradiology.2010；31(9):1640-1644(Bechara等人，《美国神经放射学杂志》，2010年，第31卷，第9期，第1640-1644页))。将MRI指数计算为所关注区域内的每个像素的像素面积之和乘以像素强度。相对于0周时的对照值，对三个所关注的椎间盘的NP面积百分比和MRI指数进行平均，并对时间点绘图。用学生T检验(p<0.05)计算统计学显著性。

处死和样品加工

所有兔子在初始穿刺外科手术后12周处死(在获得最终MRI之后)。死亡后，立即将脊柱整块切下来。制备椎间盘L4-5以用于组织学分析。将椎间盘固定并用DECALCIFIER(色基帕斯医药工业有限公司(Surgipath Medical Indus.,Inc.))脱钙两周，然后在组织学组织处理器中脱水，并包埋于石蜡中。接下来，将椎间盘在矢状面切成5μm的厚度。按照标准组织学方案将切片用苏木精-伊红(H&E)(西格玛公司)染色，并使用尼康(Nikon)E800显微镜拍摄。

生物力学

处死后，将椎间盘L3-4切割为功能脊柱单元(FSU，骨-椎间盘-骨)以进行生物力学分析。去除掉样品的后部结构，将样品包埋于环氧树脂中，并装上用Matlab(MatlabR2008a，麻萨诸塞州内蒂克的迈斯沃克公司(The Mathworks,Inc.,Natick,MA))模糊逻辑程序控制的轴向测试机中的定制固定装置。所有椎间盘包裹于盐水溶液浸泡的纱布中以最大程度减小脱水，并在处死同一天进行测试。采用20个循环的压缩载荷(0至1.0MPa，0.1mm/s)然后进行恒定压缩(1.0MPa)1100秒，来预处理样本。选择该载荷目标是因为其相当于日常生活活动中人IVD体验的压力(针对兔椎间盘的较小尺寸进行调节)(Wilke etal.Spine.1999；24(8):755-762(Wilke等人，《脊柱》，1999年，第24卷，第8期，第755-762页))。初始斜坡阶段被定义为测试最开始的200微秒，而蠕变阶段被定义为测试的余下部分。测试之后，用如下两相指数模型拟合蠕变曲线：

其中d(t)为随时间推移的轴向位移，L₀为施加的轴向载荷，S₁和S₂为弹性阻尼系数(N/mm)，并且η₁和η₂为粘性阻尼系数(Ns/mm)。产生平均曲线并用每种条件的指数模型拟合。

结果

兔子

在任何组中均未观察到处理造成的不利影响。

MRI

L2-3、L3-4和L4-5椎间盘的T1加权正中矢状面MRI表明没有显著变化或骨赘形成。与未穿刺对照相比，穿刺组中的椎间盘的T2加权正中矢状面MRI退变(ROI变暗且从0到12周发生塌缩)。如图1和2所示，与穿刺组相比，所有三个处理组定性地显示较小程度的退变。穿刺的(及未处理的)椎间盘显示最大程度的退变，其中随时间点增加，NP面积下降59％，MRI指数下降64％。根据总NP面积和MRI指数，与穿刺组相比，所有三个处理组显示较小程度的退变。在处理组中，载体+细胞组具有最小程度的面积和MRI指数下降，并最类似于对照组(图3)。在0和3周时，对照与三个处理组和穿刺组中任一者之间、或穿刺组与处理组之间的MRI指数或面积没有统计意义上的显著差异。在6和12周时，对照与穿刺组之间的MRI指数和面积差异具有统计意义上的显著性，这是有效退变模型所期望的。对照和载体组在6和12周时显示MRI指数的统计意义上的显著差异，并在12周时显示面积的统计意义上的显著差异。对照和缓冲液+细胞组在12周时的MRI指数具有统计意义上的显著差异。对照和载体+细胞组在6和12周时的MRI指数和面积均具有统计意义上的显著差异。穿刺组和载体组显示随时间点增加MRI定量没有统计意义上的显著差异。穿刺组和缓冲液+细胞组在6和12周时的MRI指数和面积均具有统计意义上的显著差异。穿刺组和载体+细胞组在12周时的MRI指数和面积具有显著差异。

生物力学

图4中给出了代表总载荷归一化位移的曲线(初始斜坡阶段和随后蠕变阶段)。不同组之间存在差异趋势。具体地讲，对照组产生的曲线类似于载体+细胞组，穿刺组类似于缓冲液+细胞组，并且载体组处于这些组之间。这些组之间的大多数可变性来自初始斜坡阶段。尽管具有这些趋势，当曲线的蠕变阶段用两相指数模型拟合时，早期和晚期的粘性和弹性阻尼系数未产生任何统计意义上的显著差异(数据未示出)。

组织学

椎间盘L4-5的代表性矢状切片用苏木精-伊红(H&E)染色并在20×和100×放大倍率下观察(图5、6和7)。对照椎间盘保持其架构。可以预知，穿刺的椎间盘显示丧失细胞结构和NP中纤维变性，表明发生了退变。用水凝胶载体处理的穿刺的椎间盘导致细胞结构的一定程度丧失，但保持稳健的细胞外基质。用细胞+缓冲液处理显示NP面积的相对保留，但观察到明显的纤维变性。用细胞+载体处理导致与穿刺的椎间盘相比，细胞结构和架构得以改善。

讨论

本实例包含广泛且多样的结果指标，包括新型MRI技术和生物力学，以便不仅能定量椎间盘退变(IDD)，而且能显示对椎间盘退变的靶向处理的响应。如本实例详细讨论的，处理组显示与对照和穿刺组值不同的粘弹性。

根据MRI、组织学和生物力学标准，与单独的载体或单独的细胞+缓冲液相比，用载体中的hUTC注射经历IDD的兔腰椎间盘(IVD)具有有益效果。与未处理的穿刺的椎间盘相比，所有三个处理均显示出有益效果。所有三个处理组的MRI上的髓核(NP)面积和指数均处于对照(未退变)和穿刺组(最大程度退变)条件之间，表明该处理有助于部分地延迟椎间盘高度和信号强度变化。轴向载荷产生对于每种条件似乎不同的位移曲线。组织学显示了处理使椎间盘架构和细胞结构可变的恢复。

细胞+PBS组产生落在对照与穿刺组值之间的MRI数据，并且看起来非常类似于载体组的MRI数据。然而，该组的位移曲线最类似于穿刺的状态，说明虽然该处理有助于部分地恢复MRI上的NP面积和信号强度，但不能非常有效地恢复椎间盘的天然机械性能。

单独的载体组产生落在穿刺组和未穿刺组值之间的MRI数据。在本实例中，水凝胶组的位移曲线也落在穿刺和未穿刺状态之间，表明水凝胶载体能够使椎间盘恢复一些机械性能，而与天然或移植细胞的任何细胞外基质合成无关。载体组的组织结构具有比预期从非细胞处理所得更多的细胞结构，可能表明水凝胶提供了天然细胞可旺盛生长的安全港。

细胞+载体组结合了另外两个组的细胞移植和水凝胶注射。该组具有一致但不明显的朝好于其他两个处理组的MRI退变指标的趋势(最类似于对照状态，但仍然与对照值显著不同)。该组还具有最类似于对照曲线的位移曲线，说明具有最佳力学响应。该组的组织结构具有与穿刺组相比明显增加的细胞结构和相对保留的架构，但存在纤维变性的迹象。

没有组织学迹象表明将人细胞移植到兔椎间盘中会产生免疫反应。处理的兔子均未表现出患病征兆，并且没有组织学的炎性反应迹象。

人产后脐带组织是富有吸引力的治疗细胞来源，因为供体组织易得并且细胞易于收获，同时不存在与胚胎干细胞或胎儿细胞相关的伦理冲突。

总之，可以预知，与未穿刺对照相比，穿刺组发生了MRI和组织学的退变迹象。与穿刺组相比，处理组发生了较低程度的MRI和组织学的退变迹象。处理组显示与对照和穿刺组值不同的粘弹性。该研究表明用(a)hUTC和(b)水凝胶注射经历退变的穿刺兔腰IVD减缓了IVD退变的过程。与(a)单独的hUTC或(b)单独的水凝胶相比，注射水凝胶中的细胞更大程度减缓了退变的进程。因此，该研究表明在有或没有水凝胶载体溶液的情况下用人脐带组织来源细胞(hUTC)治疗穿刺的兔椎间盘有助于将MRI、组织学和生物力学特性恢复到接近未穿刺对照的那些值的值。

<110> 德普伊新特斯产品公司

<120> 使用人脐带组织来源细胞和水凝胶治疗椎间盘退变

<130> 18668-332000 (0244C1WO)

<140>

<141> 2012-5-18

<150> 13/111,933

<151> 2011-5-19

<150> 12/337,439

<151> 2008-12-17

<150> 61/016,849

<151> 2007-12-27

<160> 10

<170> PatentIn 版本 3.5

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的说明：合成引物

<400> 1

gagaaatcca aagagcaaat gg 22

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的说明：合成引物

<400> 2

agaatggaaa actggaatag g 21

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的说明：合成引物

<400> 3

tcttcgatgc ttcggattcc 20

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的说明：合成引物

<400> 4

gaattctcgg aatctctgtt g 21

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的说明：合成引物

<400> 5

ttacaagcag tgcagaaaac c 21

<210> 6

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的说明：合成引物

<400> 6

agtaaacatt gaaaccacag cc 22

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的说明：合成引物

<400> 7

tctgcagctc tgtgtgaagg 20

<210> 8

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的说明：合成引物

<400> 8

cttcaaaaac ttctccacaa cc 22

<210> 9

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的说明：合成引物

<400> 9

cccacgccac gctctcc 17

<210> 10

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的说明：合成引物

<400> 10

tcctgtcagt tggtgctcc 19

3727711

Claims (32)

1.包含纤维蛋白原、凝血酶和从人脐带组织获得的分离的同质细胞群的药物组合物在制备用于在患有椎间盘退变的患者中改善椎间盘的细胞结构和架构的药物中的用途，其中所述脐带组织基本上不含血，并且其中所述分离的同质细胞群能够在培养时自我更新和扩增，并且具有分化的潜能，但不表达CD117或端粒酶。

2.根据权利要求1所述的用途，其中所述分离的细胞群具有下列特性中的一个或多个：

(a) 表达浆膜蛋白、趋化因子受体配体3和/或粒细胞趋化蛋白；

(b) 不产生CD31、CD34和HLA-DR；

(c) 相对于人成纤维细胞、间充质干细胞或髂嵴骨髓细胞，表达提高水平的氧化白介素8和浆膜蛋白1；以及

(d) 表达CD10、CD13、CD44、CD73和CD90。

3.根据权利要求1或2所述的用途，其中所述药物组合物被配制用于通过注射施用。

4.根据权利要求1或2所述的用途，其中所述药物组合物还包含至少一种其他细胞类型和/或至少一种药剂。

5.根据权利要求4所述的用途，其中所述至少一种药剂为营养因子。

6.根据权利要求5所述的用途，其中所述营养因子选自TGF-β、GDF-5、PDGF-BB和TIMP1。

7.根据权利要求4所述的用途，其中所述至少一种其他细胞类型经工程化以表达至少一种外源基因产物。

8.根据权利要求4所述的用途，其中所述外源基因产物为营养因子。

9.根据权利要求1或2所述的用途，其中将所述药物组合物是用于施用至退变的椎间盘中的制剂。

10.根据权利要求9所述的用途，其中将所述药物组合物是用于施用至所述椎间盘的髓核中或施用至所述椎间盘的纤维环中的制剂。

11.根据权利要求1或2所述的用途，还包括诱导从人脐带组织获得的所述分离的同质细胞群以使其在体外至少部分地分化。

12.根据权利要求11所述的用途，其中所述分离的同质细胞群经诱导以分化成显示纤维环细胞表型的细胞或分化成显示髓核细胞表型的细胞。

13.根据权利要求1所述的用途，其中所述组合物包含6.8-10.6mg/ml纤维蛋白原和0.4-0.6U/ml凝血酶。

14.纤维蛋白原、凝血酶和从人脐带组织获得的分离的同质细胞群在制备用于在患有椎间盘退变的患者中改善椎间盘的细胞结构和架构的药物中的用途，其中所述脐带组织基本上不含血，并且其中所述分离的同质细胞群能够在培养时自我更新和扩增，并且具有分化的潜能，但不表达CD117或端粒酶。

15.根据权利要求14所述的用途，其中所述分离的细胞群具有下列特性中的一个或多个：

(a) 表达浆膜蛋白、趋化因子受体配体3和粒细胞趋化蛋白；

(b) 不产生CD31、CD34和HLA-DR；

(c) 相对于人成纤维细胞、间充质干细胞或髂嵴骨髓细胞，表达提高水平的白介素8和浆膜蛋白1；以及

(d) 表达CD10、CD13、CD44、CD73和CD90。

16.根据权利要求14或15所述的用途，其中所述分离的同质细胞群和水凝胶被配制用于通过注射施用。

17.根据权利要求14或15所述的用途，其中水凝胶和从人脐带组织获得的所述分离的同质细胞群作为试剂盒提供。

18.根据权利要求14或15所述的用途，其中所述分离的同质细胞群在可植入装置内。

19.根据权利要求14或15所述的用途，还包括至少一种其他细胞类型。

20.根据权利要求19所述的用途，其中所述至少一种其他细胞类型经工程化以表达至少一种外源基因产物。

21.根据权利要求20所述的用途，其中所述外源基因产物为营养因子。

22.根据权利要求21所述的用途，其中所述外源基因产物调节一种或多种细胞外基质蛋白的表达。

23.根据权利要求14或15所述的用途，还包括至少一种药剂。

24.根据权利要求23所述的用途，其中所述至少一种药剂为营养因子。

25.根据权利要求24所述的用途，其中所述营养因子选自TGF-β、GDF-5、PDGF-BB和TIMP1。

26.根据权利要求25所述的用途，其中所述营养因子对从人脐带组织获得的所述分离的同质细胞群具有营养作用。

27.根据权利要求14或15所述的用途，其中将所述分离的同质细胞群和水凝胶施用至退变的椎间盘中。

28.根据权利要求27所述的用途，其中将所述分离的同质细胞群和水凝胶配制用于施用至所述椎间盘的髓核中。

29.根据权利要求27所述的用途，其中将所述分离的同质细胞群和水凝胶配制用于施用至所述椎间盘的纤维环中。

30.根据权利要求14或15所述的用途，其中从人脐带组织获得的所述分离的同质细胞群被诱导以使其在体外至少部分地分化。

31.根据权利要求30所述的用途，其中所述分离的同质细胞群经诱导以分化成显示纤维环细胞表型的细胞或分化成显示髓核细胞表型的细胞。

32.根据权利要求14所述的用途，其中所述用途包括6.8-10.6mg/ml纤维蛋白原和0.4-0.6U/ml凝血酶。

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