BR112021005697A2

BR112021005697A2 - métodos para obter células derivadas de células-tronco mesenquimais (msc) de linhagem condro-osteoblástica a partir de msc, populações de células derivadas de msc de linhagem condro-osteoblástica e formulação farmacêutica

Info

Publication number: BR112021005697A2
Application number: BR112021005697-1A
Authority: BR
Inventors: Benoît Champluvier; Pierre-Yves Laruelle; Sandra Pietri; Sylvain Normand; Delphine De Troy; Carmen Brenner; Anne-Sophie Lebrun; Bahia Tchamekh; Alexandra Ionescu; Laure Hertzog
Original assignee: Bone Therapeutics Sa
Priority date: 2018-09-25
Filing date: 2019-09-25
Publication date: 2021-06-22
Also published as: CA3112636A1; KR20210074303A; WO2020064791A1; BE1026595A1; US20210395686A1; EP3856894B1; MX2021003383A; SG11202102689UA; CN113056557A; EP3856894A1; IL281751A; JP2022501053A; BE1026595B1; AU2019345976A1; BE1026595B9; EP3856894C0

Abstract

MÉTODOSPARA OBTER CÉLULAS DERIVADAS DE CÉLULAS-TRONCO MESENQUIMAIS (MSC) DE LINHAGEM CONDRO-OSTEOBLÁSTICA A PARTIR DE MSC, POPULAÇÕESDE CÉLULAS DERIVADAS DE MSC DE LINHAGEM CONDRO- OSTEOBLÁSTICAE FORMULAÇÃO FARMACÊUTICA. A presente invenção fornece métodos para obter células derivadas de células-tronco mesenquimais (MSC) de linhagem condro-osteoblástica a partir de MCS. A invenção também se refere a uma população de células derivadas de MSC de linhagem condro-osteoblástica obtida pelos métodos, uma formulação farmacêutica que compreende a população de células derivadas de MSC de linhagem condro-osteoblástica e seu uso no tratamento de um sujeito com necessidade de transplante de células de linhagem condro-osteoblástica.

Description

MÉTODOS PARA OBTER CÉLULAS DERIVADAS DE CÉLULAS-TRONCO MESENQUIMAIS (MSC) DE LINHAGEM CONDRO-OSTEOBLÁSTICA A PARTIR DE MSC, POPULAÇÕES DE CÉLULAS DERIVADAS DE MSC DE LINHAGEM CONDRO-OSTEOBLÁSTICA E FORMULAÇÃO

FARMACÊUTICA Campo da Invenção

[001] A presente invenção está situada no campo de terapia regenerativa, em particular, no campo de produtos para terapia celular óssea administrável através de técnicas minimamente invasivas. Em particular, a invenção refere-se a métodos para obter células derivadas de células-tronco mesenquimais (MSC) de linhagem condro-osteoblástica a partir de MSC, para células derivadas de MSC de linhagem condro-osteoblástica e populações celulares, e para produtos que compreendem essas células e populações celulares, métodos e usos. Antecedentes da Invenção

[002] O transplante de células-tronco capazes de sofrer diferenciação osteogênica, de células que estão comprometidas na diferenciação osteogênica ou de células com capacidade para formação óssea, é uma via promissora para o tratamento de doenças ósseas, em particular quando o tratamento necessita da produção de novos tecidos ósseos.

[003] Foram usadas anteriormente células-tronco mesenquimais (MSC) para tratar disfunções ósseas (Gangji et al., 2005 Expert Opin Biol Ther 5: 437-42). No entanto, embora essas células-tronco relativamente indiferenciadas possam ser transplantadas, elas não estão comprometidas com uma linhagem osteoblástica e, portanto, uma proporção considerável dessas células-tronco transplantadas eventualmente pode não contribuir para a formação do tecido ósseo desejado. Além disso, a quantidade dessas células- tronco é frequentemente insatisfatória.

[004] Processos de produção para gerar células de formação óssea ex vivo sem a modificação genética de células têm sido descritos na técnica.

[005] O documento WO 2007/093431 refere-se a um método para a expansão in vitro de MSC isoladas, que produziu células que exibiam um fenótipo osteoblástico. No dito método, foram cultivadas MSC humanas na presença de soro ou plasma e fator de crescimento de fibroblastos básico (FGF- 2).

[006] O documento WO 2009/087213 refere-se a um método para obter células osteoprogenitoras, osteoblastos ou fenótipos osteoblásticos a partir de MSC humanas in vitro ou ex vivo, que compreende colocar as ditas MSC em contato com plasma ou soro humano, FGF-2 e fator de crescimento transformador beta (TGF-β).

[007] No entanto, permanece um grande interesse em relação ao desenvolvimento de um produto alogênico de células de formação óssea, como o volume de produção, isto é, o número de doses distribuídas a partir de uma doação de medula óssea, disponibilidade e eficácia em termos de custo do produto. Além disso, com a produtividade do processo de produção, dezenas de medulas ósseas precisarão ser qualificadas anualmente para garantir a capacidade de produção. Portanto, continua a haver uma necessidade para aumentar a produtividade obtida a partir de uma doação de medula óssea e, mais em geral, para métodos adicionais e/ou aprimorados para obter células derivadas de MSC e produtos celulares úteis na terapia regenerativa. Descrição Resumida da Invenção

[008] Como corroborado pela seção experimental, a qual ilustra certas realizações representativas da invenção, os inventores perceberam que o volume de produção de células derivadas de células-tronco mesenquimais (MSC) de linhagem condro-osteoblástica pode ser consideravelmente melhorado quando as ditas células são obtidas por um método de produção que compreende uma cultura terciária (e, então, a adição de uma celular intermediária “P2”) e o controle de uma ou mais configurações dentre o tempo de duração de cultura da cultura secundária, o tempo de duração de cultura da cultura terciária, a adição de uma etapa de criopreservação no final da cultura terciária ou a densidade de distribuição em placas.

[009] Então, em um aspecto, a invenção fornece um método para obter, como diferenciar e/ou expandir, células derivadas de MSC de linhagem condro-osteoblástica a partir de MSC, sendo que o método compreende: (a) cultivar as MSC recuperadas a partir de uma amostra biológica de um sujeito em um meio de cultura que compreende fator de crescimento de fibroblastos 2 (FGF-2), fator de crescimento transformador beta (TGFβ) e heparina ou um derivado ou análogo da mesma a uma concentração de pelo menos 0,01 UI/mL, obtendo assim as células derivadas de células-tronco mesenquimais (MSC); (b) passar as células derivadas de MSC por um primeiro período de tempo e ainda cultivar as células derivadas de MSC em um meio conforme definido em (a); e (c) passar as células derivadas de MSC por um segundo período de tempo e ainda cultivar as células derivadas de MSC em um meio conforme definido em (a), obtendo assim as células derivadas de MSC de linhagem condro-osteoblástica, em que as células derivadas de MSC são cultivadas na etapa (b) por um período de x dias, em que o dia x é último dia no qual pelo menos 20% das células derivadas de MSC estão se proliferando (por exemplo, na fase S, na fase G2 ou na fase M do ciclo celular).

[010] Em um aspecto adicional, a invenção fornece um método para obter células derivadas de MSC de linhagem condro-osteoblástica a partir de MSC, sendo que o método compreende: (a) cultivar MSC recuperadas a partir de uma amostra biológica de um sujeito em um meio de cultura que compreende FGF-2, TGFβ e heparina ou um derivado ou análogo da mesma a uma concentração de pelo menos 0,01 UI/mL; obtendo assim as células derivadas de MSC; (b) passar as células derivadas de MSC por um primeiro período de tempo e ainda cultivar as células derivadas de MSC em um meio conforme definido em (a); e (c) passar as células derivadas de MSC por um segundo período de tempo e ainda cultivar as células derivadas de MSC em um meio conforme definido em (a), obtendo assim as células derivadas de MSC de linhagem condro-osteoblástica, em que as células derivadas de MSC são plaqueadas para a cultura adicional na etapa (b) a uma densidade de 3 x 10 2 a 1 x 103 células/cm2, preferencialmente a uma densidade de 3 x 102 a 8 x 102 células/cm2.

[011] Em um aspecto adicional, a invenção fornece um método para obter células derivadas de MSC de linhagem condro-osteoblástica a partir de MSC, sendo que o método compreende: (a) cultivar MSC recuperadas a partir de uma amostra biológica de um sujeito em um meio de cultura que compreende FGF-2, TGFβ e heparina ou um derivado ou análogo da mesma a uma concentração de pelo menos 0,01 UI/mL; obtendo assim as células derivadas de MSC; (b) passar as células derivadas de MSC por um primeiro período tempo e ainda cultivar as células derivadas de MSC em um meio conforme definido em (a); (c) passar as células derivadas de MSC por um segundo período de tempo e ainda cultivar as células derivadas de MSC em um meio conforme definido em (a), obtendo assim as células derivadas de MSC de linhagem condro-osteoblástica; (d) ressuspender as células derivadas de MSC de linhagem condro- osteoblástica em um meio de criopreservação adequado para a administração a um sujeito; e (e) criopreservar as células derivadas de MSC de linhagem condro- osteoblástica.

[012] Em um aspecto adicional, a invenção refere-se a uma população de células derivadas de MSC de linhagem condro-osteoblástica obtida ou que pode ser obtida pelos métodos conforme definidos no presente pedido.

[013] Em outro aspecto, a invenção fornece uma população de células derivadas de MSC de linhagem condro-osteoblástica que pode ser obtida ou é obtida por expansão in vitro ou ex vivo de MSC, através da qual pelo menos 90% das células derivadas de MSC de linhagem condro-osteoblástica em suspensão têm um diâmetro igual ou menor que 25 µm (D90 ≤ 25 µm) e em que no máximo 1% das células derivadas de MSC de linhagem condro-osteoblástica em suspensão têm um diâmetro maior que 35 µM.

[014] Em um aspecto adicional, a invenção fornece uma formulação farmacêutica que compreende a população de células derivadas de MSC de linhagem condro-osteoblástica, conforme definido no presente pedido.

[015] Em outro aspecto, a invenção fornece a população de células derivadas de MSC de linhagem condro-osteoblástica, conforme definido no presente pedido, ou a formulação farmacêutica, conforme definido no presente pedido, para uso como um medicamento, preferencialmente para uso no tratamento de um sujeito com necessidade de transplante de células de linhagem condro-osteoblástica.

[016] Os inventores descobriram que os presentes métodos podem fornecer uma ou mais vantagens, como discutido abaixo. Os presentes métodos permitem aumentar substancialmente os rendimentos e a produtividade da cultura de células derivadas de MSC de linhagem condro-osteoblástica obtidas a partir de uma amostra de medula óssea. Como resultado, uma doação de medula óssea é suficiente para cobrir volumes satisfatórios de produção. Além disso, os presentes métodos aumentam a disponibilidade de células derivadas de MSC de linhagem condro-osteoblástica para uso clínico. Além disso, a crioconservação das células derivadas de MSC de linhagem condro- osteoblástica obtidas pelos presentes métodos leva a um produto celular que é administrável diretamente a um sujeito com necessidade de transplante de células de linhagem condro-osteoblástica. A criopreservação das células derivadas de MSC de linhagem condro-osteoblástica obtidas pelos presentes métodos permite a distribuição direta e a entrega do produto celular mediante solicitação e, então, o tratamento imediato de um sujeito com necessidade de transplante de células de linhagem condro-osteoblástica. Além disso, a criopreservação das células derivadas de MSC de linhagem condro- osteoblástica obtidas pelos presentes métodos permite realizar todos os testes de liberação do produto celular e obter os resultados antes da administração do produto celular. Além disso, as células derivadas de MSC de linhagem condro- osteoblástica obtidas pelos métodos conforme definidos no presente pedido têm vantajosamente tanto o potencial osteoindutor como osteogênico.

[017] Estes e outros aspectos e as realizações preferenciais da invenção são descritos nas seções a seguir e nas reivindicações anexas. A matéria em questão das reivindicações anexas é especificamente incorporada neste relatório descritivo. Descrição das Figuras

[018] A Figura 1 representa gráficos que ilustram os níveis de expressão de CD73 (Figura 1A) e CD44 (Figura 1B) analisados por citometria de fluxo em A: MSC; B: produto celular A; C: produto celular B; D: produto celular C - fresco (N = 12, 6, 22, 15 (CD73) e N = 22, 8, 22, 18 (CD44) para MSC, produto celular A, B e C, respectivamente).

[019] A Figura 2 representa gráficos que ilustram o tamanho celular de produtos celulares comparativos de acordo com a técnica anterior e produtos celulares que ilustram a invenção: A: MSC; B: produto celular A; C: produto celular B; D: produto celular C - fresco; E: produto celular C - crio CS10; F: produto celular C - crio CS10 diluído em HSA 1:1; G: produto celular C - crio CS10 em 5% de HSA; H: produto celular C - crio HTS em 10% de HSA 10% de DMSO.

[020] A Figura 3 representa um gráfico que ilustra a densidade celular de acordo com a duração da cultura. As células foram contadas: A Figura 3A: manualmente (método azul de tripano com câmara de Bürker) ou Figura 3B: por citometria (BD TrucountTM).

[021] A Figura 4 representa um gráfico ilustrando a análise do ciclo celular com os eventos/fases (G0/G1, S e G2/M) das células em cultura secundária em diferentes durações de cultura. Em D24, 42% das células ainda estão se proliferando (11% em S e 31% em G2/M), enquanto que a partir de D25, as células estão principalmente saindo do ciclo celular.

[022] A Figura 5 representa gráficos ilustrando o nível de expressão de marcadores de diferenciação celular (BMP2, RUNX2, ZNFS21, SPARC, MMP13, CHI3L1) em diferentes durações de cultura (N = 8 para pontos no tempo D34 a D38 e N = 6 para D42).

[023] A Figura 6 representa um gráfico ilustrando a densidade celular das populações celulares em diferentes períodos de tempo de cultura (N = 8).

[024] A Figura 7 representa um gráfico ilustrando a média do diâmetro celular de duas populações celulares em diferentes durações de cultura (N = 2).

[025] A Figura 8 ilustra a osteoindução e a osteogenia avaliada por análise de raios-X. A: A osteoindução (A, painel esquerdo) é avaliada medindo a intensidade de cinza que está diretamente correlacionada com a opacidade do osso e, portanto, a espessura do osso. A osteogenia (A, painel direito) é avaliada medindo a superfície do nódulo que aparece mais refringente por imageamento de raios-X. B: A opacidade do osso é significativamente mais alta para as células C de formação óssea criopreservadas (“células B-F C”), em comparação ao excipiente (n = 20 (excipiente) e n = 34 (B-F células C de 5 lotes diferentes). C: A superfície de osteogenia é significativamente mais alta em comparação ao excipiente no qual não foram observados nódulos mineralizados (n = 20 (excipiente) e n = 34 (células B-F C de 5 lotes diferentes). D-E: A osteoindução com (Figura 8D) ou sem (Figura 8E) osteogenia (representada pela formação óssea absoluta) é significativamente mais alta para as células de formação óssea C criopreservadas (“células B-F C”), em comparação ao excipiente. O teste U de Mann Whitney: ***p < 0,001. F: em adição às atividades de osteoindução, as células de formação óssea C criopreservadas (“B-F células C”) promovem uma alta atividade osteogênica indicada pela presença de pelo menos um nódulo mineralizado em 4/5 dos doadores de medula óssea (ou produção em lote) e

65% dos camundongos (n = 20 (excipiente) e n = 34 (células B-F C de 5 lotes diferentes).

[026] A Figura 9 ilustra o corte histológico coronal 4 semanas após uma administração única de células de formação óssea C criopreservadas ou excipiente. As células de formação óssea C criopreservadas exibem atividade através de dois mecanismos: (i) “osteoindução”: estimulação de formação óssea do hospedeiro através de secreção parácrina levando à ossificação intramembranosa e (ii) “osteogenia”: promoção de formação óssea direta (de doador/origem humana) por ossificação endocondral.

[027] A Figura 10 ilustra a avaliação histológica da calvária de camundongos 4 semanas depois de ter recebido uma injeção única de células de formação óssea C criopreservadas. As células de formação óssea C criopreservadas exibiram propriedades de osteoindução e osteogênicas (“fluo”). A formação óssea humana (“colágeno tipo I humano”) foi destacada em nódulos mineralizados (osteogenia). As atividades de osteoblastos (“ALP”, indicado por setas pretas no 3º painel) e osteoclastos (“TRAP”, indicado por setas pretas no 4º painel) foram detectadas principalmente em nódulos mineralizados, mostrando que o processo de remodelação óssea nos nódulos estava ainda em curso 4 semanas pós-administração. Nenhum osteoide (coloração tricrômica de Masson-Goldner) foi destacada indicando que o processo de formação óssea está completo.

[028] A Figura 11 ilustra o efeito de células de formação óssea C criopreservadas (“células C B-F”) em um modelo de defeito de tamanho subcrítico femoral segmentar. As imagens de raios X representam defeitos femorais segmentares no Dia 0 até a semana10 após a administração do excipiente isoladamente ou de células de formação óssea C criopreservadas.

[029] A Figura 12 ilustra o efeito de células de formação óssea C criopreservadas em um modelo de defeito de tamanho subcrítico femoral segmentar (modelo sub-CSD). O gráfico representa a porcentagem de reparação óssea em imagens de raios X no dia do procedimento cirúrgico/item administração (“Dia 0”) e ao longo do tempo até 10 semanas (“Semana 10”) após a administração do excipiente isoladamente, ou de células de formação óssea C criopreservadas (“células C B-F”); média ± EPM, *** p < 0,001 (ANOVA de dois fatores com medidas repetidas).

[030] A Figura 13 ilustra o efeito de células de formação óssea C criopreservadas em um modelo de defeito de tamanho subcrítico femoral segmentar (modelo sub-CSD). O gráfico representa o escore RUS determinado a partir de imagens de raios X no dia do procedimento cirúrgico/item administração (“Dia 0”) e ao longo do tempo até 10 semanas (“Semana 10”) após a administração do excipiente isoladamente, ou de células de formação óssea C criopreservadas (células B-F C); média ± EPM, ** p < 0,01, *** p < 0,001 (ANOVA de dois fatores com medidas repetidas). Descrição Detalhada das Realizações Preferenciais

[031] Como usado no presente pedido, as formas singulares “um”, “uma” e “o/a” incluem tanto o singular com os referentes plurais, a menos que o contexto claramente dite de outra forma.

[032] Os termos “que compreende”, “compreende” e “compreendido de” como usado no presente pedido são sinônimos com “que inclui”, “inclui” ou “que contém”, “contém”, e são inclusivos ou abertos e não excluem, membros não recitados, elementos ou etapas de método adicionais. Os termos também englobam “que consiste em” e “que consiste essencialmente em”, que gozam de significados bem estabelecidos na terminologia de patentes.

[033] A citação de faixas numéricas por desfechos primários inclui todos os números e frações incluídas dentro das respectivas faixas, bem como os desfechos primários citados.

[034] Os termos “cerca de” ou “aproximadamente”, como usado no presente pedido, ao se referirem a um valor mensurável como um parâmetro, uma quantidade, uma duração temporária, e similares, significam englobar variações de e do valor especificado, como variações de ± 10% ou menos, preferencialmente ± 5% ou menos, mais preferencialmente± 1% ou menos, e ainda mais preferencialmente ± 0,1% ou menos e do valor especificado, na medida em que essas variações são apropriadas para realizar na invenção divulgada. Entende-se que o valor ao qual o modificador “cerca de” refere-se a sim mesmo, também é especificamente, e preferencialmente, divulgado.

[035] Enquanto que os termos “um ou mais” ou “pelo menos um”, como um ou mais membros ou pelo menos um membro de um grupo de membros, é claro por si mesmo, por meio de exemplificação adicional, o termo engloba entre outras coisas uma referência a qualquer um dos ditos membros, ou a qualquer dois ou mais dos ditos membros como, por exemplo, qualquer um ≥ 3, ≥ 4, ≥ 5, ≥ 6 ou ≥ 7 etc. dos ditos membros, e até todos os ditos membros. Em outro exemplo, “um ou mais” ou “pelo menos um” pode se referir a 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou mais.

[036] A discussão dos antecedentes da invenção no presente pedido é incluída para explicar o contexto da invenção. Isso não deve ser considerado como uma admissão de que qualquer material citado foi publicado, conhecido ou parte dos conhecimentos gerais comuns em qualquer país na data de prioridade de qualquer uma das reivindicações.

[037] Ao longo desta divulgação, várias publicações, patentes e relatórios descritivos de patentes publicadas são referenciadas por uma citação de identificação. Todas os documentos citados no presente relatório descritivo são incorporados ao presente pedido como referência em sua totalidade. Em particular, os ensinamentos ou seções desses documentos no presente pedido citados especificamente são incorporados como referência.

[038] A menos que definido de outra forma, todos os termos usados na divulgação da invenção, incluindo termos técnicos e científicos, têm o mesmo significado como comumente entendido por um técnico no assunto para o qual esta invenção pertence. Por meio de orientação adicional, são incluídas definições de termos para melhor apreciar o ensinamento da invenção. Quando termos específicos são definidos em conexão com um aspecto particular da invenção ou uma realização particular da invenção, essa conotação é destinada a se aplicar por todo o relatório descritivo, isto é, também no contexto de outros aspectos ou realizações da invenção, a menos que definido de outra forma.

[039] Nas passagens a seguir, diferentes aspectos ou realizações da invenção são definidos em mais detalhes. Cada aspecto ou realização então definido pode ser combinado com qualquer outro aspecto(s) ou realização(ões), a menos que claramente indicado ao contrário. Em particular, qualquer característica indicada como sendo preferencial ou vantajosa pode ser combinada com qualquer outra característica ou características indicadas como sendo preferenciais ou vantajosas.

[040] Referir-se ao longo deste relatório descritivo a “uma realização” significa que um recurso, estrutura ou característica específica descritos em conjunto com a realização está incluída em pelo menos uma realização da presente invenção. Dessa forma, aspectos da expressão “em uma realização” em vários lugares ao longo deste relatório descritivo não necessariamente todo referem-se à mesma realização, mas podem. Além disso, os recursos específicos, estruturas ou características podem ser combinados de qualquer maneira conveniente, como seria aparente para um técnico no assunto a partir desta divulgação, em uma ou mais realizações. Além disso, embora algumas realizações descritas no presente pedido incluam algumas, mas não outras características incluídas em outras realizações, combinações de características de diferentes realizações têm a intenção de estar dentro do escopo da invenção e formar diferentes realizações, como seria entendido pelos técnicos no assunto. Por exemplo, nas reivindicações anexas, qualquer uma das realizações reivindicadas pode ser usada em qualquer combinação.

[041] Em um aspecto, a invenção fornece um método para obter células derivadas de MSC de linhagem condro-osteoblástica a partir de MSC, sendo que o método compreende: (a) cultivar MSC recuperadas a partir de uma amostra biológica de um sujeito em um meio de cultura que compreende FGF-2, TGFβ e heparina ou um derivado ou análogo da mesma a uma concentração de pelo menos 0,01 UI/mL;

obtendo assim as células derivadas de MSC; (b) passar as células derivadas de MSC por um primeiro período de tempo e ainda cultivar as células derivadas de MSC em um meio conforme definido em (a); e (c) passar as células derivadas de MSC por um segundo período de tempo e ainda cultivar as células derivadas de MSC em um meio conforme definido em (a), obtendo assim as células derivadas de MSC de linhagem condro-osteoblástica.

[042] O termo “célula-tronco mesenquimal” ou “MSC”, como usado no presente pedido, refere-se a uma célula-tronco adulta derivada do mesoderma que é capaz de gerar células de linhagens mesenquimais, tipicamente duas ou mais linhagens mesenquimais, mais tipicamente três ou mais linhagens mesenquimais, por exemplo, linhagem condro-osteoblástica (cartilagem e ósso), osteoblástica (osso), condroblástica (cartilagem), miocítica (músculo), tenocítica (tendão), fibroblástica (tecido conjuntivo), adipocítica (gordura) e estromal (estroma da medula). MSC pode ser isolada de uma amostra biológica, preferencialmente uma amostra biológica de um sujeito humano, por exemplo, medula óssea osso trabecular, sangue, cordão umbilical, placenta, saco vitelino fetal, pele (derme), especificamente pele fetal e adolescente, periósteo, polpa dentária, tendão e tecido adiposo.

[043] O termo “amostra biológica” ou “amostra”, como usado no presente pedido, refere-se a uma amostra obtida a partir de uma fonte biológica, por exemplo, a partir de um organismo, como um animal ou sujeito humano, cultura celular, amostra de tecido, etc. Uma amostra biológica de um animal ou de um sujeito humano refere-se a uma amostra retirada de um animal ou de um sujeito humano e que compreende células do mesmo. A amostra biológica de um animal ou de um sujeito humano pode compreender um ou mais tipos de tecidos e pode compreender células de um ou mais tipos de tecidos. Métodos para obter amostras biológicas de um animal ou sujeito humano são bem conhecidos na técnica, por exemplo, biópsia de tecido ou sangue de coleta. MSC humana, seu isolamento, expansão in vitro e diferenciação foram descritos, por exemplo, na patente US 5.486.359, patente US 5.811.094, patente US

5.736.396, patente US 5.837.539 ou patente US 5.827.740. Qualquer MSC descrita na técnica e isolada por qualquer método descrito na técnica pode ser adequada no presente método. Em particular, MSC pode ser definida como exibindo a capacidade de diferenciação mesenquimal de trilinhagem in vitro para osteoblastos, adipócitos e condroblastos (Dominici et al, 2006, vol. 8, 315).

[044] O termo “MSC” também engloba a progênie de MSC, por exemplo, progênie obtida por proliferação in vitro ou ex vivo (propagação/expansão) de MSC obtida de uma amostra biológica de um animal ou sujeito humano.

[045] O termo “célula-tronco” refere-se geralmente a uma célula não especializada ou relativamente menos especializada e competente para proliferação, que é capaz de se autorrenovar, isto é, pode proliferar sem diferenciação, e as quais ou a progênie das quais pode dar origem a pelo menos um tipo de célula relativamente mais especializado. O termo abrange células- tronco com capacidade de autorrenovação substancialmente ilimitada, isto é em que a progênie de uma célula-tronco ou pelo menos parte da mesma substancialmente mantém o fenótipo não especializado ou relativamente menos especializado, o potencial de diferenciação e a capacidade de proliferação da célula-tronco mãe, bem como células-tronco que apresentam autorrenovação limitada, isto é, em que a capacidade da progênie ou parte da mesma para proliferação e/ou diferenciação adicional é comprovadamente reduzida em comparação à célula-mãe. Por meio de exemplo e não de limitação, uma célula- tronco pode dar origem a descendentes que podem se diferenciar em uma ou mais linhagens para produzir células relativamente cada vez mais especializadas, em que esses descendentes e/ou células relativamente cada vez mais especializadas podem ser elas próprias células-tronco, conforme definido no presente pedido, ou mesmo para produzir células terminalmente diferenciadas, isto é, células totalmente especializadas, que podem ser pós-

mitóticas.

[046] O termo “célula-tronco adulta”, como usado no presente pedido, refere-se a uma célula-tronco presente ou obtida a partir de (como isolada a partir de) um organismo no estágio fetal ou preferencialmente após o nascimento (por exemplo, particularmente mas sem limitação a um organismo humano, pelo menos um mês de idade após o nascimento, por exemplo, pelo menos 2 meses, pelo menos 3 meses, por exemplo, pelo menos 4 meses, pelo menos 5 meses, por exemplo, pelo menos 6 meses de idade após o nascimento como, por exemplo, 1 ano ou mais, 5 anos ou mais, pelo menos 10 anos ou mais, 15 anos ou mais, 20 anos ou mais, ou 25 anos ou mais de idade após o nascimento) como, por exemplo, após atingir a idade adulta. Por meio de exemplos, células- tronco adultas podem ser obtidas a partir de sujeitos humanos que, de outro modo, seriam descritos nos termos convencionais “lactente”, “criança”, “jovem”, “adolescente” ou “adulto”.

[047] As MSC têm preferencialmente o potencial para gerar células pelo menos da linhagem condro-osteoblástica como células da linhagem osteoblástica, como condroprogenitoras e/ou osteoprogenitoras e/ou pré- osteoblastos e/ou osteoblastos e/ou osteócitos, e/ou da linhagem condroblástica como condro-osteoprogenitoras e/ou condroprogenitoras e/ou pré-condroblastos e/ou condroblastos e/ou condrócitos.

[048] Além disso, as MSC têm preferencialmente o potencial para gerar células pelo menos da linhagem osteoblástica (osso) como, por exemplo, condro-osteoprogenitoras e/ou osteoprogenitoras e/ou pré-osteoblastos e/ou osteoblastos e/ou osteócitos, etc.; ou pelo menos da linhagem condroblástica (cartilagem) como, por exemplo, condro-osteoprogenitoras e/ou condroprogenitoras e/ou pré-condroblastos e/ou condroblastos e/ou condrócitos; linhagem fibroblástica (tecido conjuntivo) como, por exemplo, fibroblastos, fibrócitos; ou pelo menos sinoviócitos (fluido sinovial); ou tenócitos etc.

[049] Exceto quando observado, “sujeito” ou “paciente” são usados de forma intercambiável e se referem a animais, preferencialmente vertebrados,

mais preferencialmente mamíferos, e incluem especificamente pacientes humanos e mamíferos não humanos. Pacientes preferenciais são sujeitos humanos. Sujeitos animais incluem formas pré-natal de animais como, por exemplo, fetos. Sujeitos humanos podem incluir fetos, e não embriões.

[050] Em certas realizações dos métodos, usos ou produtos celulares, conforme ensinado no presente pedido, o sujeito pode ser um sujeito humano.

[051] O termo “produto celular”, como usado no presente pedido, refere-se a células derivadas de MSC, células derivadas de MSC de linhagem condro-osteoblástica, conforme ensinado no presente pedido, uma população de células derivadas de MSC de linhagem condro-osteoblástica, conforme ensinado no presente pedido, ou uma formulação farmacêutica que compreende as células derivadas de MSC de linhagem condro-osteoblástica, conforme ensinado no presente pedido, ou uma população de células derivadas de MSC de linhagem condro-osteoblástica, conforme ensinado no presente pedido, como produtos celulares adequados para a administração (por exemplo, as células derivadas de MSC de linhagem condro-osteoblástica em um meio de criopreservação).

[052] Em uma realização, MSC podem ser obtidas a partir de um sujeito saudável, o que pode ajudar a garantir a funcionalidade das células derivadas de MSC obtidas a partir das ditas MSC.

[053] Em outra realização, MSC são obtidas a partir de um sujeito humano que necessita de transplante de células derivadas de MSC. Alogênico - Autólogo

[054] Em certas realizações dos usos, métodos ou produtos celulares, conforme ensinado no presente pedido, as MSC ou células derivadas de MSC de linhagem condro-osteoblástica podem ser alogênicas para o sujeito a ser tratado. Os termos “alogênico” ou “homólogo”, com referência às MSC ou células derivadas de MSC, denotam que as MSC ou células derivadas de MSC de linhagem condro-osteoblástica são obtidas a partir de um ou mais sujeitos (agrupados), exceto o sujeito a ser colocado em contato ou tratado com as células derivadas de MSC.

[055] Em certas realizações dos usos, métodos ou produtos celulares, conforme ensinado no presente pedido, as MSC ou células derivadas de MSC de linhagem condro-osteoblástica podem ser autólogas para o sujeito a ser tratado. O termo “autólogo” com referência às MSC ou células derivadas de MSC de linhagem condro-osteoblástica denota que as MSC ou células derivadas de MSC de linhagem condro-osteoblástica são obtidas a partir do mesmo sujeito a ser colocado em contato ou tratado com as células derivadas de MSC de linhagem condro-osteoblástica.

[056] Em certas realizações dos usos, métodos ou produtos celulares, conforme ensinado no presente pedido, as MSC ou células derivadas de MSC de linhagem condro-osteoblástica podem compreender uma mistura de MSC ou células derivadas de MSC de linhagem condro-osteoblástica autólogas e alogênicas (isto é homólogas). Preferencialmente, as MSC ou células derivadas de MSC de linhagem condro-osteoblástica são alogênicas para o sujeito a ser tratado.

[057] O termo “células derivadas de célula-tronco mesenquimal” ou “células derivadas de MSC”, como usado no presente pedido, refere-se a células de linhagem mesenquimal (por exemplo, linhagem condro-osteoblástica (osso e cartilagem), osteoblástica (osso), condroblástica (cartilagem), miocítica (músculo), tenocítica (tendão), fibroblástica (tecido conjuntivo), adipocítica (gordura) ou estromal (estroma da medula)), obtidas por diferenciação de MSC, em particular, obtidas por diferenciação de MSC in vitro (incluindo ex vivo).

[058] A diferenciação de MSC pode envolver o cultivo de MSC sob condições capazes de induzir a diferenciação de MSC para o tipo celular desejado, mais tipicamente o cultivo de MSC em um meio que compreende um ou mais agentes (por exemplo, fatores de crescimento) capazes de induzir a diferenciação de MSC para o tipo celular desejado. Os protocolos para diferenciação de MSC são conhecidos por si mesmo (consulte, entre outros, documento WO 2007/093431; e ainda REGER, R.L. et al. “Differentiation and

Characterization of Human MSCs”. Em: Mesenchymal Stem Cells: Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology), Editado por D.J. Prockop et al. Humana Press, 2008, Vol. 449, págs. 93-107; VERMURI, M.C. et al. (Eds.). Mesenchymal Stem Cell Assays and Applications (Methods in Molecular Biology). Humana Press, 2011, Vol. 698, especialmente págs. 201 a 352).

[059] O termo “fator de crescimento”, como usado no presente pedido, refere-se a uma substância biologicamente ativa que influencia na proliferação, crescimento, diferenciação, sobrevivência e/ou migração de vários tipos de células, e pode afetar alterações de desenvolvimento, morfológicas e funcionais em um organismo, tanto isoladamente como quando modulada por outras substâncias. Um fator de crescimento pode agir tipicamente por ligação, como um ligante, a um receptor (por exemplo, receptor de superfície ou intracelular) presente nas células responsivas ao fator de crescimento. Um fator de crescimento no presente pedido pode ser particularmente uma entidade proteica, que compreende uma ou mais cadeias polipeptídicas. Por meio de exemplo e sem limitação, o termo “fator de crescimento” engloba os membros da família do fator de crescimento de fibroblastos (FGF), família da proteína morfogênica óssea (BMP), família do fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGF), família do fator de crescimento transformador beta (TGFβ), família do fator de crescimento do nervo (NGF), família do fator de crescimento epidérmico (EGF), família do fator de crescimento relacionado à insulina (IGF), família do fator de diferenciação do crescimento (GDF), família do fator de crescimento do hepatócito (HGF), fatores de crescimento hematopoiéticos (HeGFs), fator de crescimento celular endotelial derivado de plaquetas (PD-ECGF), angiopoietina, família do fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) glicocorticoides, e similares. O técnico no assunto entenderá que o fator de crescimento ou combinação de fatores de crescimento podem ser qualquer fator de crescimento ou combinação de fatores de crescimento conhecidos por serem capazes de induzir diferenciação de MSC em direção a um tipo de célula desejada. O técnico no assunto irá considerar que os métodos in vitro para induzir a diferenciação de

MSC para um tipo celular desejado (por exemplo, para células de linhagem condro-osteoblástica) podem resultar em uma população celular substancialmente pura (isto é composta principalmente) do tipo celular desejado. Sem limitação, a população celular assim derivada pode conter pelo menos 90% (em número) do tipo celular desejado como, por exemplo, ≥ 91%, ≥ 92%, ≥ 93%, ≥ 94%, ≥ 95%, ≥ 96%, ≥ 97%, ≥ 98%, ≥ 99% ou 100% do tipo celular desejado.

[060] Em realizações específicas, as células derivadas de MSC são de linhagem condro-osteoblástica (cartilagem e osso). Células Derivadas de MSC de Linhagem Condro-Osteoblástica

[061] A citação de “células derivadas de MSC de linhagem condro- osteoblástica”, como usado no presente pedido, pode se referir a células progenitoras que têm a capacidade para se diferenciar em células da linhagem osteoblástica, como condro-osteoprogenitoras, osteoprogenitoras e/ou pré- osteoblastos e/ou osteoblastos e/ou osteócitos, etc., ou em células da linhagem condroblástica, como condro-osteoprogenitoras, condroprogenitoras e/ou pré- condroblastos e/ou condroblastos e/ou condrócitos. O técnico no assunto entenderá que as células progenitoras irão se diferenciar tanto em células da linhagem osteoblástica (por exemplo, pré-osteoblastos como osteoblastos) como em células da linhagem condroblástica (por exemplo, pré-condroblastos ou condroblastos), dependendo das condições em que são expostas in vitro ou in vivo, como fatores físicos e/ou componentes químicos ou biológicos, como fatores de crescimento. Células de Linhagem Osteoblástica

[062] Em certas realizações, a citação “células da linhagem osteoblástica” ou “células derivadas de MSC da linhagem osteoblástica” podem se referir a tipos celulares que têm um fenótipo osteoblástico, e que podem contribuir, ou são capazes de se desenvolver para células que possam contribuir para a formação de material ósseo ou matriz óssea, como condro- osteoprogenitoras, osteoprogenitoras, pré-osteoblastos, osteoblastos ou osteócitos, ou misturas das mesmas. Como usado no presente pedido,

“osteoprogenitoras” pode compreender particularmente osteoprogenitoras precoces e tardias. Preferencialmente, “células da linhagem osteoblástica” ou “células derivadas de MSC de linhagem osteoblástica” podem se referir igualmente às condro-osteoprogenitoras, osteoprogenitoras, pré-osteoblastos ou osteoblastos, ou misturas das mesmas, ainda mais preferencialmente a expressão pode se referir às condro-osteoprogenitoras ou pré-osteoblastos ou osteoblastos, ou misturas das mesmas como, em certos exemplos, a expressão pode se referir a pré-osteoblastos ou, em outros exemplos, a expressão pode se referir a osteoblastos. Todos estes termos são bem conhecidos por si mesmos.

[063] Por meio de orientação adicional e não limitação, osteoprogenitoras, pré-osteoblastos e osteoblastos, bem como populações celulares que compreendem osteoprogenitoras pré-osteoblastos e/ou osteoblastos podem exibir as seguintes características: a) as células compreendem expressão de fator de transcrição 2 relacionado a Runt (Runx2), um fator de transcrição multifuncional que regula a diferenciação de osteoblastos e a expressão de muitos genes de proteínas da matriz extracelular durante a diferenciação de osteoblastos; b) as células compreendem a expressão de pelo menos uma das seguintes: fosfatase alcalina (ALP), mais especificamente ALP do tipo osso- fígado-rim; e mais preferencialmente também compreende expressão de um ou mais marcadores ósseos adicionais, como osteocalcina (OCN, BGLAP), propeptídeo aminoterminal do procolágeno tipo 1 (P1NP), osteonectina (ON, SPARC), osteopontina (OPST, SPP1, OPN) e/ou sialoproteína óssea (BSP) e/ou uma ou mais proteínas adicionais da matriz óssea como decorina e/ou osteoprotegerina (OPG); c) as células substancialmente não expressam CD45 (por exemplo, menos que cerca de 10%, preferencialmente menos que cerca de 5%, mais preferencialmente menos que cerca de 2% das células podem expressar CD45); d) as células mostram evidências da capacidade para mineralizar o entorno externo, ou sintetizar a matriz extracelular contendo cálcio (por exemplo,

quando exposta ao meio osteogênico; consulte Jaiswal et al. J Cell Biochem, 1997, vol. 64, 295-312). O acúmulo de cálcio dentro das células e a deposição nas proteínas da matriz pode ser convencionalmente medido, por exemplo, por cultivo em 45Ca2+, lavagem e recultura e, em seguida, determinar qualquer radioatividade presente dentro da célula ou depositada na matriz extracelular (patente US 5.972.703), ou usar um ensaio de mineralização à base de vermelho de alizarina (consulte, por exemplo, Gregory et al. Analytical Biochemistry, 2004, vol. 329, 77-84); e) as células substancialmente não se diferenciam para células de linhagem adipocítica (por exemplo, adipócitos) nem linhagem condroblástica (por exemplo, condroblastos, condrócitos). A ausência de diferenciação em relação a essas linhagens celulares pode ser testada usando condições de indução de diferenciação padrão estabelecidas na técnica (por exemplo, consulte Pittenger et al. Science, 1999, vol. 284, 143-7), e métodos de avaliação (por exemplo, quando induzidos, os adipócitos tipicamente coram com óleo vermelho O, mostrando o acúmulo de lipídeos; os condrócitos tipicamente coram com azul alcian ou laranja safranina). A falta substancial de propensão à diferenciação adipogênica e/ou condrogênica pode tipicamente significar que menos de 20%, menos de 10%, menos de 5% ou menos de 1% das células testadas mostrariam sinais de diferenciação adipogênica ou condrogênica quando aplicadas ao respectivo teste. Células da Linhagem Condroblástica (Cartilagem)

[064] Em certas realizações, as citações “células da linhagem condroblástica (cartilagem)” ou “células derivadas de MSC da linhagem condroblástica (cartilagem)” podem se referir a tipos celulares que têm fenótipo condroblástico e que podem contribuir ou serem capazes de se desenvolver para células que podem contribuir para a formação de cartilagem ou matriz cartilaginosa. Como usado no presente pedido, “condroprogenitoras” pode compreender particularmente condroprogenitoras precoces e tardias. Ainda mais preferencialmente, “células da linhagem condroblástica (cartilagem)” ou “células derivadas de MSC da linhagem condroblástica (cartilagem)” podem se referir a condro-osteoprogenitoras, condroprogenitoras, pré-condroblastos ou condroblastos, ou misturas das mesmas, ainda mais preferencialmente a expressão pode se referir a pré-condroblastos ou condroblastos, ou misturas das mesmas, como em certos exemplos, a expressão pode se referir a pré- condroblastos, ou em outros exemplos a expressão pode se referir a condroblastos. Todos estes termos são bem conhecidos por si mesmos.

[065] Por meio de orientação adicional e não limitação, células de linhagem condro-osteoblástica e/ou condroblástica, como condro- osteoprogenitoras, condroprogenitoras, pré-condroblastos e condroblastos, bem como populações celulares que compreendem condro-osteoprogenitoras, condroprogenitoras, pré-condroblastos e/ou condroblastos podem exibir as seguintes características: a) as células compreendem a expressão de SOX9, um fator de transcrição que desempenha um papel central durante a diferenciação de condroblastos e a formação de cartilagem; b) as células compreendem a expressão de pelo menos um dos seguintes: agrecano (ACAN), colágeno tipo II ou CD90; c) as células substancialmente não expressam CD45 (por exemplo, menos que cerca de 10%, preferencialmente menos que cerca de 5%, mais preferencialmente menos que cerca de 2% das células podem expressar CD45); d) as células mostram evidências da capacidade para produzir alto nível de colágeno tipo II, IX e XI e proteoglicanos, os principais constituintes da matriz extracelular hialina (ECM) in situ. A formação da cartilagem pode ser convencionalmente medida, por exemplo, com o uso de um ensaio de laranja safranina/verde rápido para corar proteoglicanos e proteínas não colagenosas, respectivamente (consulte, por exemplo, Lee et al. Tissue Engineering, 2011, vol. 18, 484-98); e) condrócitos articulares humanos podem exibir características de expressão celular, conforme resumido em Diaz-Romero et al. 2005 (J Cell

Physiol, vol. 202(3), 731-42), por exemplo, eles podem expressar integrinas e outras moléculas de adesão (CD49a, CD49b, CD49c, CD49e, CD49f, CD51/61, CD54, CD106, CD166, CD58, CD44), tetraspaninas (CD9, CD63, CD81, CD82, CD151), receptores (CD105, CD119, CD130, CD140a, CD221, CD95, CD120a, CD71, CD14), ectoenzimas (CD10, CD26), e outras moléculas de superfície (CD90, CD99). Durante a cultura em monocamada, os condrócitos podem suprarregular certos marcadores considerados distintos para células-tronco mesenquimais (CD10, CD90, CD105, CD166). Esses marcadores também podem ser assim expressos pelos pré-condroblastos ou condroblastos menos maduros. f) as células substancialmente não se diferenciam nem para células de linhagem adipocítica (por exemplo, adipócitos) nem para linhagem osteoblástica (por exemplo, osteoblastos, osteócitos). A ausência de diferenciação em relação a essas linhagens celulares pode ser testada usando condições de indução de diferenciação padrão estabelecidas na técnica (por exemplo, consulte Pittenger et al. Science, 1999, vol. 284, 1437), e métodos de avaliação (por exemplo, quando induzidos, os adipócitos tipicamente coram com óleo vermelho O, mostrando acúmulo de lipídeos; os pré-osteoblastos e osteoblastos tipicamente coram para ALP). A falta substancial de propensão à diferenciação adipogênica e/ou osteoblástica pode tipicamente significar que menos de 20%, menos de 10%, menos de 5% ou menos de 1% das células testadas mostrariam sinais de diferenciação adipogênica ou osteoblástica quando aplicadas ao respectivo teste. Definição Adicional de Células Derivadas de MSC de Linhagem Condro- Osteoblástica

[066] Em certas realizações, as células derivadas de MSC de linhagem condro-osteoblástica podem ter propriedades osteogênicas.

[067] O termo “propriedades osteogênicas”, “potencial osteogênico” atividade osteogênica, como usado no presente pedido, refere-se à capacidade das células para se (trans)diferenciar em células secretoras da matriz óssea ou à capacidade das células para secretar matriz óssea (isto é, sem a necessidade de uma etapa de (trans)diferenciação), in vivo e, opcionalmente, in vitro. O termo engloba a capacidade das células para formar tecido ósseo por ossificação intramembranosa ou ossificação endocondral. A capacidade das células para formar tecido ósseo por ossificação intramembranosa tipicamente representa a capacidade das células para formar tecido ósseo sem a necessidade de uma matriz de cartilagem calcificada como molde. A capacidade das células para formar tecido ósseo por ossificação endocondral tipicamente representa a capacidade das células para formar tecido ósseo formando primeiro uma matriz de cartilagem calcificada e, subsequentemente, usando a dita matriz de cartilagem calcificada como molde para a formação de tecido ósseo. O termo não abrange o potencial osteoindutor de células.

[068] Por exemplo, a potência celular de células derivadas de MSC de linhagem condro-osteoblástica pode ser determinada por medição da atividade osteogênica dessas células. A atividade osteogênica de células humanas derivadas de MSC de linhagem condro-osteoblástica pode ser medida in vivo, por exemplo, determinando a presença de pelo menos um nódulo mineralizado (por exemplo, de origem humana ou humana-murina mista) após a administração das células aos camundongos por injeção subcutânea através da calvária. A atividade osteogênica de células derivadas de MSC de linhagem condro-osteoblásticapode pode ser medida in vivo, por exemplo, avaliando a espessura de nódulos recém-mineralizados (por exemplo, de origem humana ou humana-murina mista) após a administração das células aos camundongos por injeção subcutânea através da calvária, ou avaliando o grau de reparação óssea em um modelo de camundongo de defeito de tamanho subcrítico segmentar femoral (modelo sub-CSD).

[069] Por exemplo, as células humanas derivadas de MSC de linhagem condro-osteoblástica, como de 2,5 x 106 células formuladas em 100 µL de excipiente, podem ser administradas a camundongos nude por uma única administração subcutânea através do osso da calvária. Para marcar a neoformação óssea ao longo do tempo, os fluorocromos de ligação ao cálcio como (vermelho de alizarina), calceína (verde), calceína (azul) e a tetraciclina (amarelo) podem ser administrados sequencialmente aos camundongos por injeção intraperitoneal, 3 dias antes e 4, 8 e 12 dias após a administração das células derivadas de MSC de linhagem condro-osteoblástica, respectivamente. Os camundongos podem ser eutanasiados 2 semanas após a administração das células, e a calvária de cada camundongo pode ser coletada para avaliar as propriedades de formação óssea por histomorfometria (por exemplo, a quantificação de formação óssea). A espessura inicial e final da calvária pode ser usada para calcular a percentagem de neoformação óssea após a administração das células. Além disso, as propriedades de formação óssea também podem ser avaliadas por imunofluorescência (por exemplo, origem murina ou humana da formação óssea). A atividade osteoblástica pode ser avaliada nos cortes de calvária com o uso do método de detecção de atividade enzimática de ALP. A atividade osteoclástica pode ser avaliada nos cortes de calvária com o uso dos métodos de detecção de atividade enzimática TRAP. O estado de mineralização do osso neoformado pode ser avaliado com o uso de coloração tricrômica de Masson-Goldner nos cortes de calvária corados com ALP, por exemplo, com o uso de kits comercialmente disponíveis (por exemplo, Bio-Optica®). A formação da cartilagem pode ser avaliada com o uso de coloração laranja safranina em cortes sagitais de parafina da calvária.

[070] Em um exemplo adicional, as células humanas derivadas de MSC de linhagem condro-osteoblástica, como de 1,25 x 106 células formuladas em 50 µL de excipiente, podem ser administradas aos camundongos localmente no local do defeito ósseo por injeção percutânea um dia após eles terem sido submetidos ao defeito de tamanho subcrítico segmentar femoral. A reparação óssea pode ser quantificada por imageamento de raios-X. O tamanho do defeito ósseo pode ser quantificado por medição da distância entre as duas bordas do defeito ósseo.

[071] Em certas realizações, as células derivadas de MSC de linhagem condro-osteoblástica podem ter propriedades osteoindutoras.

[072] Os termos “propriedades osteoindutoras”, “potencial osteoindutor” ou “atividade osteoindutora”, como usado no presente pedido, refere-se à capacidade das células para atrair outras células secretoras da matriz óssea e/ou para induzir a (trans)diferenciação de outras células para as células secretoras da matriz óssea.

[073] Por exemplo, a potência celular de células derivadas de MSC de linhagem condro-osteoblástica pode ser determinada por medição da atividade osteoindutora dessas células. A capacidade de células derivadas de MSC de linhagem condro-osteoblástica induzirem a formação óssea pode ser medida in vivo, por exemplo, avaliando a espessura de nódulos recém-mineralizados após a administração das células aos camundongos por injeção subcutânea através da calvária, ou avaliando o grau de reparação óssea em um modelo de camundongo de defeito de tamanho subcrítico segmentar femoral (modelo sub- CSD). A capacidade de células derivadas de MSC de linhagem condro- osteoblástica para induzir a formação óssea também podem ser medida, por exemplo, através da avaliação da atividade da fosfatase alcalina (ALP) por uma coloração de substrato de ALP.

[074] Em certas realizações, as células derivadas de MSC de linhagem- osteoblástica podem ter tanto propriedades osteoindutoras como osteogênicas. Vantajosamente, as células derivadas de MSC de linhagem condro-osteoblástica, conforme ensinado no presente pedido, mediante transplante para um sujeito com necessidade das mesmas, permite que a neoformação óssea exceda a neoformação óssea comparada ao transplante com MSCs ou células derivadas de MSC obtidas pelos métodos da técnica anterior.

[075] Por meio de exemplo, mas sem limitação, marcadores de superfície celular adequados para avaliar a identidade celular de células derivadas de MSC de linhagem condro-osteoblástica podem incluir CD73, CD105, CD10 e CD44. Estes marcadores de superfície celular podem ser, por exemplo, detectados por anticorpos monoclonais comercialmente disponíveis, como anticorpos monoclonais marcados com fluorocromo, que permitem detecção de células por citometria de fluxo. Em particular, CD73 e CD105 são marcadores mesenquimais; CD44 é um marcador de adesão; e CD10 é um marcador osteocondroblástico, os quais são normalmente expressos por uma alta fração de células derivadas de MSC de linhagem condro-osteoblástica. A quantidade de CD73 na superfície celular de células derivadas de MSC de linhagem condro-osteoblástica é tipicamente alta; a quantidade de CD105 na superfície celular de células derivadas de MSC de linhagem condro- osteoblástica é tipicamente baixa; e a quantidade de CD44 na superfície celular de células derivadas de MSC de linhagem condro-osteoblástica é tipicamente alta.

[076] Em realizações específicas, substancialmente todas (por exemplo, pelo menos 90% (em número) como, por exemplo, ≥ 91%, ≥ 92%, ≥ 93%, ≥ 94%, ≥ 95%, ≥ 96%, ≥ 97%, ≥ 98%, ≥ 99% ou 100%) as células derivadas de MSC de linhagem condro-osteoblástica são positivas para CD73, CD105, CD44 e CD10.

[077] Em realizações específicas, substancialmente todas (por exemplo, pelo menos 90% (em número), como, por exemplo ≥ 91%, ≥ 92%, ≥ 93%, ≥ 94%, ≥ 95%, ≥ 96%, ≥ 97%, ≥ 98%, ≥ 99% ou 100%) as células derivadas de MSC de linhagem condro-osteoblástica são negativas para CD34.

[078] Em realizações específicas, substancialmente todas (por exemplo, pelo menos 90% (em número) como, por exemplo, ≥ 91%, ≥ 92%, ≥ 93%, ≥ 94%, ≥ 95%, ≥ 96%, ≥ 97%, ≥ 98%, ≥ 99% ou 100%) as células derivadas de MSC de linhagem condro-osteoblástica são positivas para CD73, CD105, CD44 e CD10; substancialmente todas (por exemplo, pelo menos 90% (em número) como, por exemplo, ≥ 91%, ≥ 92%, ≥ 93%, ≥ 94%, ≥ 95%, ≥ 96%, ≥ 97%, ≥ 98%, ≥ 99% ou 100%) as células derivadas de MSC de linhagem condro- osteoblástica são negativas para CD34.

[079] Em realizações específicas, substancialmente todas (por exemplo, pelo menos 90% (em número) como, por exemplo ≥ 91%, ≥ 92%, ≥ 93%, ≥ 94%, ≥ 95%, ≥ 96%, ≥ 97%, ≥ 98%, ≥ 99% ou 100%) as células derivadas de MSC de linhagem condro-osteoblástica são negativas para CD45, CD34 e CD3.

[080] Em realizações específicas, substancialmente todas (por exemplo, pelo menos 90% (em número) como, por exemplo, ≥ 91%, ≥ 92%, ≥ 93%, ≥ 94%, ≥ 95%, ≥ 96%, ≥ 97%, ≥ 98%, ≥ 99% ou 100%) as células derivadas de MSC de linhagem condro-osteoblástica são positivas para CD73, CD105, CD44 e CD10; e substancialmente todas (por exemplo, pelo menos 90% (em número) como, por exemplo, ≥ 91%, ≥ 92%, ≥ 93%, ≥ 94%, ≥ 95%, ≥ 96%, ≥ 97%, ≥ 98%, ≥ 99% ou 100%) as células derivadas de MSC de linhagem condro- osteoblástica são negativas para CD45, CD34 e CD3.

[081] Em realizações particulares, células derivadas de MSC de linhagem condro-osteoblástica têm qualquer uma ou mais dentre uma mediana normalizada de intensidade de fluorescência (nMFI) para CD73 (nMFI CD73) de pelo menos 500, uma nMFI para CD44 (nMFICD44) de pelo menos 100 ou uma nMFI para CD105 (nMFICD105) de no máximo 150. Por exemplo, as células derivadas de MSC de linhagem condro-osteoblástica têm uma ou mais dentre uma nMFICD73 de pelo menos 550, pelo menos 600, pelo menos 650, pelo menos 700, pelo menos 750, pelo menos 800, pelo menos 850 ou pelo menos 900; a nMFICD44 de pelo menos 110, pelo menos 120, pelo menos 130, pelo menos 140, pelo menos 150, pelo menos 200, pelo menos 250, pelo menos 300 ou pelo menos 350; ou uma nMFICD105 de no máximo 180, no máximo 170, no máximo 160, no máximo 150, no máximo 140, no máximo 130, no máximo 120, no máximo 110 ou no máximo 100. Preferencialmente, as células derivadas de MSC de linhagem condro-osteoblástica têm uma nMFICD73 de pelo menos 500, um nMFICD44 de pelo menos 100, e uma nMFICD 105 de no máximo 150.

[082] Em realizações específicas, substancialmente todas (por exemplo, pelo menos 90% (em número) como, por exemplo, ≥ 91%, ≥ 92%, ≥ 93%, ≥ 94%, ≥ 95%, ≥ 96%, ≥ 97%, ≥ 98%, ≥ 99% ou 100%) as células derivadas de MSC de linhagem condro-osteoblástica são positivas para CD73, CD105, CD10 e CD44 (isto é, expressam CD73, CD105, CD10 e CD44 na superfície celular), e as células derivadas de MSC de linhagem condro-osteoblástica têm qualquer uma ou mais dentre uma nMFICD73 de pelo menos 500, uma nMFICD44 de pelo menos 100 ou uma nMFICD105 de no máximo 150. Por exemplo, substancialmente todas (por exemplo, pelo menos 90% (em número), como, por exemplo, ≥ 91%, ≥ 92%, ≥ 93%, ≥ 94%, ≥ 95%, ≥ 96%, ≥ 97%, ≥ 98%, ≥ 99% ou 100%) as células derivadas de MSC de linhagem condro-osteoblástica são positivas para CD73, CD105, CD10 e CD44 (isto é, expressam CD73, CD105, CD10 e CD44 na superfície celular), e as células derivadas de MSC de linhagem condro-osteoblástica têm qualquer uma ou mais dentre uma nMFICD73 de pelo menos 550, pelo menos 600, pelo menos 650, pelo menos 700, pelo menos 750, pelo menos 800, pelo menos 850 ou pelo menos 900; uma nMFI CD44 de pelo menos 110, pelo menos 120, pelo menos 130, pelo menos 140, pelo menos 150, pelo menos 200, pelo menos 250, pelo menos 300 ou pelo menos 350; ou uma nMFICD105 de no máximo 180, no máximo 170, no máximo 160, no máximo 150, no máximo 140, no máximo 130, no máximo 120, no máximo 110 ou no máximo

100. Preferencialmente, substancialmente todas (por exemplo, pelo menos 90% (em número), como, por exemplo, ≥ 91%, ≥ 92%, ≥ 93%, ≥ 94%, ≥ 95%, ≥ 96%, ≥ 97%, ≥ 98%, ≥ 99% ou 100%) as células derivadas de MSC de linhagem condro-osteoblástica são positivas para CD73, CD105, CD10 e CD44 (isto é, expressam CD73, CD105, CD10 e CD44 na superfície celular), e as células derivadas de MSC de linhagem condro-osteoblástica ou osteoblástica obtidas pelos métodos para obter células derivadas de MSC de linhagem condro- osteoblástica têm uma nMFICD73 de pelo menos 500, uma nMFICD44 de pelo menos 100 e uma nMFICD105 de no máximo 150.

[083] A “mediana normalizada da intensidade de fluorescência” ou “nMFI”, como usado no presente pedido, refere-se à razão da MFI da população inteira de células analisadas marcadas com um ou mais anticorpos conjugados com fluorocromo (MFImarcador_canal) para a MFI da população celular marcada com um ou mais anticorpos de controle de isotipo conjugados com fluorocromo (MFIisotipo_canal), como controle de imunoglobulina G (IgG) conjugado com um fluorocromo, como isotiocianato de fluoresceína (FITC), aloficocianina (APC) ou ficoertrina (PE). Os resultados de nMFI são proporcionais à quantidade de marcadores presentes na superfície celular de uma população de interesse. A (n)MFI é tipicamente ligado ao comprimento de onda no qual a emissão do sinal fluorescente é medido.

[084] As citações “uma nMFI para CD73” ou “nMFICD73”, como usado no presente pedido, referem-se à razão da MFI da população inteira de células analisadas marcadas com um anticorpo conjugado com APC contra CD73 (por exemplo, BD Biosciences®, Cat nº: 560847) para a MFI da população celular marcada com IgG de controle conjugada com APC (por exemplo BD Biosciences®, Cat nº: 555751). Preferencialmente, a nMFICD73 é medida com um comprimento de onda de excitação de 633 nm e um comprimento de onda de emissão de 660 nm para APC.

[085] As citações “uma nMFI para CD44” ou “nMFICD44”, como usado presente pedido, refere-se à razão da MFI da população inteira de células analisadas marcadas com anticorpo conjugado a PE contra CD44 (por exemplo BD Biosciences®, Cat nº: 550989) para a MFI da população de células marcada com IgG de controle conjugada com PE (por exemplo, BD Biosciences®, Cat nº: 556650). Preferencialmente, a nMFICD44 é medida com um comprimento de onda de excitação de 488 nm e um comprimento de onda de emissão de 580 nm para PE.

[086] A citação “uma nMFI para CD105” ou “nMFICD105”, como usado presente pedido, refere-se à razão da MFI da população inteira de células analisadas marcadas com anticorpos conjugados a APC contra CD105 (por exemplo, BD Biosciences®, Cat nº: 562408) para a MFI da população de células marcada com IgG de controle conjugada com APC (por exemplo, BD Biosciences®, Cat nº: 555751). Preferencialmente, a nMFICD105 é medida com um comprimento de onda de excitação de 633 nm e um comprimento de onda de emissão de 660 nm para APC.

[087] As citações “uma nMFI para CD10” ou “nMFICD10”, como usado presente pedido, refere-se à razão da MFI da população inteira de células analisadas marcadas com anticorpo conjugado a PE contra CD10 (por exemplo, BD Biosciences®, Cat nº: 555375) para a MFI da população de células marcada com IgG de controle conjugada com PE (por exemplo, BD Biosciences®, Cat nº: 556650). Preferencialmente, a nMFICD10 é medida com um comprimento de onda de excitação de 488 nm e um comprimento de onda de emissão de 580 nm para PE.

[088] Conforme descrito anteriormente, os métodos detalhados acima podem produzir células derivadas de MSC de linhagem condro-osteoblástica ou populações das mesmas, com características superiores como, em particular, (i) alta expressão de ALP, o que representa o comprometimento da célula para a linhagem condro-osteoblástica ou osteoblástica, e (ii) baixa expressão de HLA- DR, o que representa a imunogenicidade limitada das células derivadas de MSC de linhagem condro-osteoblástica ou osteoblástica, indicando que as células são mais adequadas para transplante de células, por exemplo, para sujeitos alogênicos.

[089] Consequentemente, em realizações específicas, pelo menos 70% (em número) (por exemplo, pelo menos 75% (em número), como, por exemplo, ≥ 80%, ≥ 85%, ≥ 90%, ≥ 95%, ≥ 96%, ≥ 97%, ≥ 98%, ≥ 99% ou 100%) das células derivadas de MSC de linhagem condro-osteoblástica são positivas para a fosfatase alcalina (ALP); e menos de 10% (em número) (por exemplo, menos de 5% (em número), como, por exemplo, menos de 3%, menos de 2% ou menos de 1%) das células derivadas de MSC de linhagem condro-osteoblástica são positivos para HLA-DR.

[090] Em realizações específicas, substancialmente todas (por exemplo, pelo menos 90% (em número) como, por exemplo, ≥ 91%, ≥ 92%, ≥ 93%, ≥ 94%, ≥ 95%, ≥ 96%, ≥ 97%, ≥ 98%, ≥ 99% ou 100%) as células derivadas de MSC de linhagem condro-osteoblástica são positivas para CD73, CD105,

CD10 e CD44; substancialmente todas (por exemplo, pelo menos 90% (em número) como, por exemplo, ≥ 91%, ≥ 92%, ≥ 93%, ≥ 94%, ≥ 95%, ≥ 96%, ≥ 97%, ≥ 98%, ≥ 99% ou 100%) as células derivadas de MSC de linhagem condro- osteoblástica são negativas para CD34; pelo menos 70% (por exemplo, pelo menos 75% (em número) como, por exemplo, ≥ 80%, ≥ 85%, ≥ 90%, ≥ 95%, ≥ 96%, ≥ 97%, ≥ 98%, ≥ 99% ou 100%) das células derivadas de MSC de linhagem condro-osteoblástica são positivas para a fosfatase alcalina (ALP); e menos de 10% (em número) (por exemplo, menos de 5% (em número) como, por exemplo, menos de 3%, menos de 2% ou menos de 1%) das células derivadas de MSC de linhagem condro-osteoblástica são positivas para HLA-DR.

[091] Em realizações específicas, substancialmente todas (por exemplo, pelo menos 90% (em número) como, por exemplo, ≥ 91%, ≥ 92%, ≥ 93%, ≥ 94%, ≥ 95%, ≥ 96%, ≥ 97%, ≥ 98%, ≥ 99% ou 100%) as células derivadas de MSC de linhagem condro-osteoblástica são positivas para CD73, CD105, CD10 e CD44; substancialmente todas (por exemplo, pelo menos 90% (em número) como, por exemplo, ≥ 91%, ≥ 92%, ≥ 93%, ≥ 94%, ≥ 95%, ≥ 96%, ≥ 97%, ≥ 98%, ≥ 99% ou 100%) as células derivadas de MSC de linhagem condro- osteoblástica são negativas para CD45, CD34 e CD3; pelo menos 70% (por exemplo, pelo menos 75% (em número) como, por exemplo, ≥ 80%, ≥ 85%, ≥ 90%, ≥ 95%, ≥ 96%, ≥ 97%, ≥ 98%, ≥ 99% ou 100%) das células derivadas de MSC de linhagem condro-osteoblástica são positivas para a fosfatase alcalina (ALP); e menos de 10% (por exemplo, menos de 5% (em número) como, por exemplo, menos de 3%, menos de 2% ou menos de 1%) das células derivadas de MSC de linhagem condro-osteoblástica são positivas para HLA-DR.

[092] Quando se diz que uma célula é positiva para (ou expressa ou compreende a expressão de) um marcador específico, isso significa que um técnico no assunto concluirá a presença ou evidência de um sinal distinto por exemplo, detectável por anticorpo ou detecção por reação em cadeia da polimerase de transcrição reversa, para esse marcador ao realizar a medição apropriada, em comparação aos controles adequados. Quando o método permite a avaliação quantitativa do marcador, as células positivas podem, em média, gerar um sinal que é significativo diferente do controle, por exemplo, mas sem limitação, pelo menos 1,5 vez mais alto do que esse sinal gerado por células de controle, por exemplo pelo menos 2 vezes, pelo menos 4 vezes, pelo menos 10 vezes, pelo menos 20 vezes, pelo menos 30 vezes, pelo menos 40 vezes, pelo menos 50 vezes mais alto ou até mais alto.

[093] A expressão dos marcadores específicos das células acima pode ser detectado com o uso de qualquer técnica imunológica adequada conhecida, como imuno-histoquímica ou adsorção por afinidade, análise Western blot, citometria de fluxo, ELISA, etc., ou por qualquer ensaio bioquímico adequado de atividade enzimática (por exemplo, para ALP), ou por qualquer técnica adequada de medição da quantidade do mRNA marcador, por exemplo, Northern blot, RT-PCR semi-quantitativa ou quantitativa, etc. Dados de sequência para marcadores listados nesta divulgação são conhecidos e podem ser obtidos a partir de banco de dados públicos como o GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/).

[094] Em certas realizações, as células derivadas de MSC de linhagem condro-osteoblástica podem ser células de animais, preferencialmente células de animais de sangue quente, mais preferencialmente células de mamíferos, como células de mamíferos humanos ou células de mamíferos não humanos, e com a máxima preferência células humanas.

[095] O termo “in vitro”, como usado no presente pedido, é para denotar fora ou externamente ao corpo animal ou humano. O termo “in vitro”, como usado no presente pedido, deve ser entendido como incluindo “ex vivo”. O termo “ex vivo” tipicamente se refere a tecidos ou células removidas de um corpo animal ou humano e mantidos ou propagados fora do corpo, por exemplo, em um recipiente de cultura. Aderente

[096] As células derivadas de MSC de linhagem condro-osteoblástica, como pretendido no presente pedido, são preferencialmente aderentes, isto é,

necessitam de uma superfície para crescer e tipicamente crescem como uma monocamada aderente na dita superfície (isto é, cultura de células aderentes), ao invés de células de flutuação livre em um meio de cultura (cultura em suspensão). A adesão de células a uma superfície, como a superfície de um recipiente de plástico de cultura de tecidos, pode ser facilmente examinada por inspeção visual sob microscópio invertido. As células cultivadas em cultura aderente necessitam de passagem periódica, em que as células podem ser removidas da superfície enzimaticamente (por exemplo com o uso de tripsina), suspensas em meio de cultura e replaqueadas no(s) novo(s) recipiente(s) de cultura. Em geral, uma superfície ou substrato que permita a adesão de células a este pode ser qualquer substrato substancialmente hidrofílico. Como é conhecido na técnica, os recipientes de cultura de tecidos, por exemplo, frascos de cultura, placas de poços, pratos ou similares, podem ser usualmente fabricados de uma grande variedade de materiais poliméricos, adequadamente tratados na superfície ou revestidos após moldagem, a fim de fornecer superfícies de substrato hidrofílico. O termo “colocar em contato”, como usado no presente pedido, significa reunir, tanto direta como indiretamente, uma ou mais moléculas, componentes ou materiais, com outra, facilitando assim as interações entre elas. Tipicamente, um ou mais agentes capazes de induzir expansão e/ou diferenciação de MSC ou células derivadas de MSC podem ser colocados em contato com MSC ou células derivadas de MSC ou por meio de sua inclusão no meio, no qual as MSC ou células derivadas de MSC são cultivadas. Etapa (a)

[097] Em certas realizações, os métodos, conforme ensinado no presente pedido, podem compreender (a) cultivar as MSC recuperadas a partir de uma amostra biológica de um sujeito em um meio de cultura que compreende FGF-2, TGFβ e heparina ou um derivado ou análogo da mesma a uma concentração de pelo menos 0,01 UI/mL; obtendo assim as células derivadas de MSC. A etapa (A) também pode ser citada no presente pedido como “cultura primária”.

[098] O termo “fator de crescimento de fibroblastos 2 (FGF-2)”, “FGF básico”, “FGF-b”, “FGFB”, “BFGF”, “fator de crescimento de ligação de heparina 2 (HBGF-2)” ou “prostatropina”, pode ser usado de forma intercambiável e se refere ao conhecido membro da família de fator de crescimento de fibroblastos. Os inventores constataram que o FGF-2 é particularmente efetivo no método da presente invenção.

[099] O termo “fator de crescimento transformador beta (TGFβ)”, “TGFB” ou “TGFbeta”, conforme usado no presente pedido, refere-se a um membro da família do fator de crescimento transformador beta (TGFβ). Os inventores perceberam que o TGFβ é particularmente efetivo no método da presente invenção. Em uma realização adicional, o dito membro da família TGFβ é escolhido a partir do grupo que consiste em TGF-beta-1, TGF-beta-2, TGF- beta-3, TGF-beta-4, GDF1 (Fator de diferenciação de crescimento 1), GDF-2, GDF-3, GDF-5, GDF-6, GDF-7, GDF-8, GDF-9, GDF-11, GDF-15, INHA (cadeia alfa da inibina), INHBA (cadeia beta A da inibina), INHBB (cadeia beta B da inibina), INHBC (cadeia beta C da inibina), INHBE (cadeia beta E da inibina), MIS (fator inibidor Muelleriano), e membros adicionais da subfamília GDNF, incluindo GDNF (fator neurotrófico derivado de linhagem celular glial), NRTN (neurturina), PSPN (persefina), e misturas dos mesmos.

[0100] Em certas realizações dos métodos, usos ou produtos celulares, conforme ensinado no presente pedido, TGFβ pode ser selecionado a partir do grupo que consiste em TGFβ1, TGFβ2, TGFβ3, e misturas dos mesmos. Preferencialmente, TGFβ é TGFβ1.

[0101] Em uma realização adicional, as MSC ou células derivadas de MSC podem ser colocadas em contato, além de FGF-2 e TGFβ, com um ou mais fatores de crescimento adicionais, adicionados de maneira exógena, exceto FGF-2 e TGFβ. Em outra realização, FGF-2 e TGFβ podem ser os únicos fatores de crescimento exógenos com os quais as MSC ou células derivadas de MSC são colocadas em contato.

[0102] Em uma realização preferencial, o fator de crescimento usado no presente método é um fator de crescimento humano. Como usado no presente pedido, o termo “fator de crescimento humano” refere-se a um fator de crescimento substancialmente o mesmo que um fator de crescimento humano que ocorre naturalmente. Por exemplo, quando o fator de crescimento é uma entidade proteinácea, o(s) peptídeo(s) constituinte(s) ou polipeptídeo(s) do mesmo podem ter uma sequência principal de aminoácidos idêntica a um fator de crescimento humano que ocorre naturalmente. O uso de fatores de crescimento humano no presente método é preferencial, pois espera-se que esses fatores de crescimento provoquem um efeito desejável na função celular.

[0103] O termo “que ocorre naturalmente” é usado para descrever um objeto ou entidade que pode ser encontrada na natureza como diferente daquela sendo produzida artificialmente pelo homem. Por exemplo, uma sequência de polipeptídeos presente em um organismo, que pode ser isolada a partir de uma fonte na natureza e que não tenha sido intencionalmente modificada pelo homem em laboratório, é de ocorrência natural. Ao se referir a uma entidade particular, por exemplo, a um polipeptídeo ou proteína, o termo abrange todas as formas e variantes da mesma que ocorrem na natureza, por exemplo, devido a uma variação normal entre os indivíduos. Por exemplo, ao se referir a um fator de crescimento proteináceo, o termo “que ocorre naturalmente” engloba fatores de crescimento que têm diferenças na sequência primária de seus peptídeos ou polipeptídeos constituintes devido à variação alélica normal entre os indivíduos.

[0104] O presente método pode empregar uma variante biologicamente ativa ou fragmento de um fator de crescimento. No método da invenção, variantes “biologicamente ativas” ou fragmento de um fator de crescimento alcançam pelo menos aproximadamente o mesmo grau de obtenção de células derivadas de MSC de linhagem condro-osteoblástica, conforme ensinado no presente pedido, a partir das MSCs com o respectivo fator de crescimento, quando outras condições são substancialmente as mesmas.

[0105] Uma “variante” de um polipeptídeo tem uma sequência de aminoácidos que é substancialmente idêntica (isto é, em grande parte, mas não totalmente idêntica) à sequência de aminoácidos do polipeptídeo. No presente pedido, “substancialmente idêntica” refere-se a pelo menos 85% idêntica, por exemplo, pelo menos 90% idêntica, preferencialmente pelo menos 95% idêntica, por exemplo, pelo menos 99% idêntica. Diferenças de sequência podem resultar de inserção (adição), deleção e/ou substituição de um ou mais aminoácidos.

[0106] Em outra realização, os fatores de crescimento usados no presente método, especialmente pelo menos FGF-2 e TGFβ, podem ser fatores de crescimento animais não humanos, e particularmente fatores de crescimento de mamíferos não humanos, ou variantes biologicamente ativas ou derivados dos mesmos. Como usado no presente pedido, os termos “fator de crescimento animal não humano” e “fator de crescimento de mamífero não humano” referem- se a um fator de crescimento substancialmente idêntico, respectivamente, a um fator de crescimento animal não humano ou fator de crescimento de mamífero não humano que ocorre naturalmente. Por exemplo, quando o fator de crescimento é uma entidade proteinácea, o(s) peptídeo(s) constituinte(s) ou polipeptídeo(s) do mesmo podem ter uma sequência principal de aminoácidos idêntica a um fator de crescimento animal não humano ou fator de crescimento de mamífero não humano que ocorre naturalmente. Um técnico no assunto entenderá que os fatores de crescimento animal não humano ou de mamífero não humano podem ser aplicáveis no presente método, embora em menor medida que os fatores de crescimento animais humanos, uma vez que estes são da mesma origem que as células MSC. Em particular, fatores de crescimento de animal não humano ou de mamífero não humano podem ser úteis se eles provocarem o efeito desejado, por exemplo, um efeito similar a um fator de crescimento humano (análogo).

[0107] Em uma realização preferencial, os fatores de crescimento ou as variantes biologicamente ativas ou os derivados dos mesmos são recombinantes, isto é, produzidos por um organismo hospedeiro através da expressão de uma molécula de ácido nucleico recombinante, que foi introduzida no organismo hospedeiro ou em um ancestral do mesmo, e que compreende uma sequência que codifica o dito polipeptídeo. O termo “molécula de ácido nucleico recombinante”, conforme usado no presente pedido, refere-se a uma molécula de ácido nucleico (por exemplo, uma molécula de DNA ou cDNA) que é composta de segmentos unidos em conjunto com o uso da tecnologia de DNA recombinante.

[0108] Em certas realizações dos métodos, dos usos ou dos produtos celulares, conforme ensinado no presente pedido, as MSC ou células derivadas de MSC são adicionalmente colocadas em contato com o meio, em que adicionalmente compreende um ou mais dentre plasma, soro ou um substituto dos mesmos.

[0109] O termo “plasma” é convencionalmente definido e compreende plasma fresco, plasma congelado descongelado, plasma tratado com solvente/detergente, plasma processado (por exemplo, PRP), ou uma mistura de quaisquer dois ou mais dos mesmos. O plasma é geralmente obtido a partir de uma amostra de sangue total, fornecido ou colocado em contato com um anticoagulante (por exemplo, heparina (em concentrações muito baixas, tipicamente cerca de 15 x10-5 UI/mL, citrato, oxalato ou EDTA). Subsequentemente, componentes celulares da amostra de sangue são separados do componente líquido (plasma) por uma técnica apropriada, tipicamente por centrifugação. Por meio de um exemplo específico, mas não de limitação, para obter plasma adequado para uso na presente invenção, uma amostra de sangue pode ser coletada em um tubo Vacutainer contendo o anticoagulante EDTA (ácido etilenodiamino tetra-acético) (por exemplo, tubo BD Vacutainer de plástico com EDTA, 10 mL, 1,8 mg/mL). A amostra é suavemente agitada e então centrifugada por 10 min à temperatura ambiente a 1.000 a 2.000 g para separar o plasma dos glóbulos vermelhos. O sobrenadante (plasma) é coletado, opcionalmente agrupado (se uma pluralidade de amostras de sangue for usada) e aliquotado em criofrascos que são armazenados a -80ºC até o uso. O termo “plasma” refere-se a uma composição que não forma parte de um corpo humano ou animal. O termo “plasma” pode, em certas realizações, incluir especificamente o plasma processado, isto é, o plasma submetido após sua separação do sangue total a uma ou mais etapas de processamento que alteram sua composição, especificamente sua composição química, bioquímica ou celular. Consequentemente, o termo “plasma”, como pretendido no presente pedido, pode incluir plasma rico em plaquetas (PRP), isto é, plasma que foi enriquecido com plaquetas. Tipicamente, o PRP pode conter cerca de 1,0 x 10 6 plaquetas/µL, enquanto que a concentração de plaquetas no sangue total pode ser de cerca de 1,5 x 105 a 3,5 x 105/µL.

[0110] O plasma pode ser tratado com solvente/detergente. Os termos “plasma tratado com solvente/detergente”, “plasma tratado com S/D” ou “plasma S/D” referem-se geralmente ao plasma descelularizado obtido ou que pode ser obtido por um método que compreende as etapas de: (a) tratar o plasma com um solvente e um detergente e (b) filtrar o plasma tratado com solvente/detergente. Solventes adequados para esse tratamento são solventes como di- ou trialquilfosfatos e detergentes que são descritos na patente US

4.764.369. O detergente usado para preparar o plasma S/D preferencialmente é um detergente não tóxico (por exemplo, Tween® 20 ou Tween® 80).

[0111] O termo “soro” é conforme convencionalmente definido e compreende soro fresco, soro congelado descongelado ou soro preparado a partir de plasma, ou uma mistura de quaisquer dois ou mais dos mesmos. Soro geralmente pode ser obtido a partir de uma amostra de sangue total permitindo primeiro que ocorra coagulação na amostra e, subsequentemente, separando o coágulo então formado e componentes celulares da amostra de sangue do componente líquido (soro) por uma técnica apropriada, tipicamente por centrifugação. A coagulação pode ser facilitada por um catalisador inerte, por exemplo, microesferas ou pó de vidro. Alternativamente, o soro pode ser obtido a partir de plasma removendo o anticoagulante e fibrina. Por meio de um exemplo específico, mas não de limitação, para obter soro adequado para uso na presente invenção, uma amostra de sangue pode ser coletada em um tubo

Vacutainer sem anticoagulante (por exemplo, tubo de soro de plástico BD Vacutainer Plus, 10 mL) e incubada durante 30 a 45 minutos à temperatura ambiente para permitir a coagulação. O tubo é então centrifugado por 15 min à temperatura ambiente a 1.000 a 2.000 g para separar o soro dos glóbulos vermelhos. O sobrenadante (soro) é coletado, opcionalmente agrupado (se uma pluralidade de amostras de sangue for usada) e aliquotado em criofrascos que são armazenados a -80ºC até o uso. O termo “soro” refere-se então a uma composição acelular que não forma parte de um corpo humano ou animal. O soro, conforme pretendido no presente pedido, é soro humano, isto é, obtido a partir de um único sujeito humano ou de uma pluralidade de sujeitos humanos (por exemplo, pool de soro misto). O soro pode ser soro não processado, isto é, soro derivado por separação do sangue total e não submetido a etapas de processamento a jusante que alteram sua composição química, bioquímica ou celular, exceto inativação por calor opcional, armazenamento (criogênico ou não criogênico), esterilização, liofilização e/ou filtração. Em certas realizações, o soro pode ser obtido a partir de plasma tratado com solvente/detergente.

[0112] O plasma isolado, soro ou substituto do mesmo pode ser usado diretamente no método da presente invenção. Eles podem ser armazenados de maneira apropriada para uso posterior (por exemplo, por períodos de tempo mais curtos, por exemplo, até cerca de 1 a 2 semanas, a uma temperatura acima dos respectivos pontos de congelamento do plasma, soro ou dos substitutos dos mesmos, mas abaixo da temperatura ambiente, esta temperatura será geralmente cerca de 4 ºC a 5 ºC; ou por períodos mais longos para armazenamento congelado, geralmente entre cerca de -70 ºC e cerca de -80 ºC).

[0113] O plasma isolado, soro ou substituto dos mesmos pode ser inativado por calor conforme conhecido na técnica, particularmente para remover o complemento. Quando o presente método emprega plasma, soro ou substitutos dos mesmos autólogos para as células cultivadas na presença dos mesmos, pode ser desnecessário inativar por calor o plasma, soro ou substituto dos mesmos. Se o plasma, o soro ou substituto dos mesmos são pelo menos parcialmente alogênicos para as células cultivadas, pode ser vantajoso inativar por calor o plasma, soro ou substituto dos mesmos. Opcionalmente, o plasma, soro ou substituto dos mesmos também podem ser esterilizados antes do armazenamento ou uso, usando filtros microbiológicos convencionais, preferencialmente com tamanho de poros de 0,2 μm ou menores.

[0114] Em uma realização, o presente método pode empregar plasma humano, soro ou substituto dos mesmos, que é autólogo para MSC humanas ou células derivadas de MSC colocadas em contato com este. O termo “autólogo” com referência ao plasma, soro ou substituto dos mesmos denota que o plasma, soro ou substituto dos mesmos é obtido do mesmo indivíduo que as MSC ou células derivadas de MSC a serem colocadas em contato com o dito plasma, soro ou substituto dos mesmos. O uso de plasma, soro autólogo ou substituto dos mesmos pode garantir ótima aceitação das células pelo sujeito e/ou evitar a transmissão acidental de agentes infecciosos, por exemplo, de outros soros.

[0115] Em outra realização, o método pode empregar plasma, soro humano ou substituto dos mesmos, que é “homólogo” ou “alogênico” para MSC humanas ou células derivadas de MSC colocadas em contato com este, isto é, obtidas a partir de um ou mais sujeitos humanos (agrupados), exceto o sujeito a partir do qual as MSC são obtidas.

[0116] Em uma realização adicional, o método pode empregar uma mistura de plasma, soro autólogo e alogênico (isto é homólogo) ou substituto dos mesmos, conforme definido acima. A expressão “substituto de soro ou plasma”, como usado no presente pedido, refere-se a uma composição não tóxica natural ou artificial que tem uma ou mais das funções do plasma e/ou do soro, como composições capazes de induzir crescimento e/ou expansão de MSC ou células derivadas de MSC. Exemplos não limitantes de substitutos de soro ou plasma incluem lisados plaquetários e composições para cultura celular que compreendem um ou mais componentes fracionados de plasma ou soro, como albumina de soro humano. Um técnico no assunto considera que o plasma humano, soro e substitutos dos mesmos são composições biológicas complexas,

que podem incluir um ou mais fatores de crescimento, citocinas ou hormônios.

[0117] Pretende-se que os fatores de crescimento FGF-2 e TGFβ ou suas respectivas variantes biologicamente ativas ou derivados sejam fornecidos em adição, isto é, de maneira exógena ou em complemento a um ou mais dentre plasma, soro ou um substituto dos mesmos.

[0118] O termo “heparina”, como usado no presente pedido, refere-se a um polímero da família glicosaminoglicano de carboidratos com peso molecular variando de 3 a 30 kDa, caracterizado por seus efeitos anticoagulantes. A potência de heparina ou de um derivado ou análogo pode ser determinada in vitro por um ensaio biológico em que a concentração de heparina necessária para prevenir a coagulação de plasma de ovelhas, cabras ou humano é comparada à concentração de um padrão de referência internacionalmente aceito e um padrão internacional de referência aceito com base em unidades de atividade de heparina por miligrama. Um mg de heparina é tipicamente igual a 140 a 180 unidades internacionais (UI).

[0119] O termo “UI” ou “unidades internacionais” é uma medida padrão da quantidade de uma substância biológica expressa como a atividade biológica ou efeito da dita substância biológica. Para cada substância a que esta unidade é atribuída, existe uma atividade biológica internacionalmente aceita ou um efeito esperado com uma dose de 1 UI quando testada de acordo com um procedimento biológico internacionalmente aceito.

[0120] Em certas realizações, a heparina ou derivado de heparina ou análogo da mesma pode ser selecionado a partir do grupo que consiste em heparina não fracionada (HNF); heparina de baixo peso molecular (LMWH), como enoxaparina, dalteparina, nadroparina, tinzaparina, certoparina, reviparina, ardeparina, parnaparina, bemiparina, ou misturas das mesmas; um heparinoide, como sulfato de heparano, sulfato de dermatano, sulfato de condroitina, sulfato de acarano, sulfato de queratano, ou misturas dos mesmos, como danaparoide; um sal de heparina; um sal de heparinoide; um fragmento de heparina; um fragmento de heparinoide; e misturas dos mesmos.

Preferencialmente, a heparina ou o derivado ou análogo de heparina é selecionado a partir do grupo que consiste em HNF, dalteparina, danaparoide e sulfato de heparano.

[0121] Em realizações específicas, o dito FGF-2, o dito TGFβ, a dita heparina ou um derivado ou análogo da mesma e, opcionalmente, um ou mais dentre plasma, soro ou substituto dos mesmos, são incluídos em um meio, comumente um meio líquido de cultura celular. Tipicamente, o meio compreenderá uma formulação de meio basal, como conhecido na técnica. Muitas formulações de meios basais (disponíveis, por exemplo, junto à Coleção Americana de Culturas, ATCC; ou junto à Invitrogen, Carlsbad, Califórnia) também podem ser usadas para a cultura das células no presente pedido, incluindo, mas não se limitam a meio essencial mínimo de Eagle (MEM), meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM), meio essencial mínimo alfa modificado (alfa-MEM), meio essencial basal (BME), BGJb, mistura de nutrientes F-12 (HAM), meio de Dulbecco modificado por Iscove (IMDM), ou meio isento de soro X-VIVOTM (grau clínico), disponível junto à Invitrogen ou Cambrex (New Jersey), e modificações e/ou combinações dos mesmos. As composições dos meios basais acima são geralmente conhecidas, e está dentro das habilidades de um técnico no assunto modificar ou modular as concentrações dos meios e/ou os suplementos dos meios conforme necessário para as células cultivadas. Essas formulações de meios basais contêm ingredientes necessários para o desenvolvimento de células de mamíferos, que são por si conhecidos. A título de ilustração e não de limitação, esses ingredientes podem incluir sais inorgânicos (em particular, sais contendo Na, K, Mg, Ca, Cl, P e, possivelmente, Cu, Fe, Se e Zn), tampões fisiológicos (ex. HEPES, bicarbonato), nucleotídeos, nucleosídeos e/ou bases de ácido nucleico, ribose e desoxirribose, aminoácidos livres, vitaminas, antioxidantes (por exemplo, glutationa) e fontes de carbono (por exemplo, glicose, piruvato de sódio, acetato de sódio), etc.

[0122] Para uso em cultura, os meios basais podem ser fornecidos com uma ou mais componentes adicionais. Por exemplo, suplementos adicionais também podem ser usados para suprir as células com os oligoelementos necessários e substâncias para ótimo crescimento e expansão. Esses suplementos incluem insulina, transferrina, sais de selênio e combinações dos mesmos. Estes componentes podem ser incluídos em uma solução salina como, mas não se limitando a, Solução Salina Balanceada de Hanks (HBSS), Solução Salina de Earle. Suplementos antioxidantes adicionais podem ser adicionados, por exemplo, Β-mercaptoetanol. Embora muitos meios basais já contenham aminoácidos, alguns aminoácidos podem ser suplementados posteriormente, por exemplo, L-glutamina, que é conhecida por ser menos estável quando em solução. Um meio pode ser ainda fornecido com compostos antibióticos e/ou antimicóticos, como, tipicamente, misturas de penicilina e estreptomicina e/ou outros compostos, exemplificados mas não limitados a anfotericina, ampicilina, gentamicina, bleomicina, higromicina, canamicina, mitomicina, ácido micofenólico, ácido nalidíxico, neomicina, nistatina, paromomicina, polimixina, puromicina, rifampicina, espectinomicina, tetraciclina, tilosina e zeocina. Lipídeos e carreadores de lipídeos também podem ser usados para suplementar o meio de cultura celular. Esses lipídeos e carreadores de lipídeos podem incluir, mas não se limitam a ciclodextrina, colesterol, ácido linoleico conjugado à albumina, ácido linoleico e ácido oleico conjugado à albumina, ácido linoleico não conjugado, ácido linoleico-oleico-araquidônico conjugado à albumina, ácido oleico não conjugado e conjugado à albumina, entre outros. A albumina pode ser, de maneira similar, usada em formulações livres de ácido graxo.

[0123] Em realizações específicas, um ou mais dentre plasma humano, soro ou um substituto dos mesmos podem estar compreendidos nos ditos meios em uma proporção (volume de um ou mais dentre plasma, soro ou um substituto dos mesmos / volume de meio) entre cerca de 0,5% e cerca de 30%, preferencialmente entre cerca de 1% e cerca de 15%, mais preferencialmente entre 2% e 10%. Os presentes métodos podem ser realizados satisfatoriamente com quantidades relativamente baixas de um ou mais dentre plasma, soro ou um substituto dos mesmos, por exemplo cerca de 5 ou 10%, em volume, ou abaixo, por exemplo, cerca de 1%, cerca de 2%, cerca de 3% ou cerca de 4%, em volume, permitindo diminuir o volume de um ou mais dentre plasma, soro ou um substituto dos mesmos que necessita ser obtido a fim de cultivar as MSC ou células derivadas de MSC.

[0124] Ainda em realizações adicionais, podem ser empregados um ou mais produtos de plasma concentrado (por exemplo, concentrados de plasma como concentrados a partir de plasma congelado), produtos de soro concentrado ou produtos de um substituto concentrado de plasma ou soro. Esses produtos concentrados podem ser incluídos na composição a uma concentração menor que a concentração desejada de um ou mais dentre plasma, soro ou um substituto dos mesmos, como para compensar (contrabalançar, equilibrar) o fator de concentração.

[0125] Em realizações específicas, podem ser usadas combinações ou misturas de quaisquer dois ou mais dentre plasma, soro e/ou um substituto do mesmo.

[0126] Em realizações específicas, FGF-2 e TGFβ estão compreendidos no dito meio a concentrações suficientes para induzir diferenciação em relação a um tipo de célula desejado.

[0127] Em realizações específicas, FGF-2 e TGFβ estão compreendidos no dito meio em concentrações suficientes para induzir a diferenciação de MSC em células derivadas de MSC de uma linhagem condro- osteoblástica. Tipicamente, FGF-2 ou uma variante biologicamente ativa ou fragmento do mesmo podem ser incluídos no meio a uma concentração entre 0,1 e 100 ng/mL, preferencialmente entre 0,5 e 20 ng/mL, por exemplo, em cerca de 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7 ou 6 ng/mL, ou em cerca de 5 ng/mL ou menos, por exemplo, em cerca de 4, 3, 2, 1 ou 0,5 ng/mL. Tipicamente, TGFβ, como TGFβ1, ou uma variante biologicamente ativa ou fragmentos do mesmo podem ser incluídos no meio a uma concentração entre 0,1 e 100 ng/mL, preferencialmente entre 0,25 e 20 ng/mL, por exemplo, em cerca de 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7 ou 6 ng/mL, ou em cerca de 5 ng/mL ou menos,

por exemplo, em cerca de 4, 3, 2, 1 ou 0,5 ng/mL. Estes valores destinam-se a se referir às concentrações dos respectivos fatores de crescimento ou a variantes biologicamente ativas ou fragmentos dos mesmos, como exogenamente suplementados aos meios.

[0128] Em realizações específicas, a heparina ou um derivado ou análogo da mesma está compreendido no dito meio a uma concentração de pelo menos 0,01 UI/mL, pelo menos 0,02 UI/mL, pelo menos 0,03 UI/mL, pelo menos 0,04 UI/mL, pelo menos 0,05 UI/mL, pelo menos 0,06 UI/mL, pelo menos 0,07 UI/mL, pelo menos 0,08 UI/mL, pelo menos 0,09 UI/mL, pelo menos 0,1 UI/mL, pelo menos 0,5 UI/mL, pelo menos 1 UI/mL, pelo menos 5 UI/mL, pelo menos 10 UI/mL, pelo menos 20 UI/mL, pelo menos 30 UI/mL, pelo menos 40 UI/mL, pelo menos 50 UI/mL, pelo menos 60 UI/mL, pelo menos 70 UI/mL, pelo menos 80 UI/mL, pelo menos 90 UI/mL ou pelo menos 100 UI/mL. Em realizações específicas, a heparina ou um derivado ou análogo da mesma está compreendido no dito meio a uma concentração de pelo menos 0,10 UI/mL. Em certas realizações preferenciais, heparina ou um derivado ou análogo da mesma está compreendido no dito meio a uma concentração de cerca de 0,1 UI/mL. Em certas realizações, a heparina ou um derivado ou análogo da mesma pode estar compreendido no dito meio a uma concentração de cerca de 0,10 UI/mL, 0,20 UI/mL, 0,30 UI/mL, 0,40 UI/mL, 0,50 UI/mL, 0,60 UI/mL, 0,70 UI/mL, 0,80 UI/mL, 0,90 UI/mL ou 1,0 UI/mL.

[0129] Em certas realizações dos métodos ou usos, conforme ensinado no presente pedido, a concentração de heparina ou derivado ou análogo da mesma pode ser pelo menos 0,05 UI/mL, preferencialmente cerca de 0,1 UI/mL.

[0130] Em uma realização, as concentrações acima podem se referir à concentração total de fatores de crescimento ou variantes biologicamente ativas ou fragmentos dos mesmos ou da dita heparina ou do derivado ou análogo da mesma no meio, isto é, a concentração da soma dos ditos fatores de crescimento ou variantes biologicamente ativas ou fragmentos dos mesmos ou da dita heparina ou do derivado ou análogo da mesma, conforme contribuído pelo plasma, soro ou substituto dos mesmos e conforme fornecido em adição aos mesmos.

[0131] Em certas realizações, as concentrações acima podem se referir à concentração dos ditos fatores de crescimento ou das variantes biologicamente ativas ou dos fragmentos dos mesmos ou da dita heparina ou do derivado ou análogo da mesma, conforme fornecidos em adição ao que já contribuiu pelo plasma ou soro. Compreensivelmente, se os fatores de crescimento ou heparina ou derivado ou análogo da mesma a serem adicionados normalmente não estiverem presentes (não detectáveis) no plasma, soro ou substituto dos mesmos, a concentração total e adicionada dos fatores de crescimento ou heparina ou derivado ou análogo da mesma será (substancialmente) a mesma.

[0132] Em uma realização preferencial, as MSC recuperadas a partir de uma amostra biológica de um sujeito, conforme definido em outra parte no presente pedido, são cultivadas em um recipiente de cultura. O recipiente de cultura pode fornecer uma superfície de plástico para permitir a aderência das células. Em outra realização, a superfície pode ser uma superfície de vidro. Ainda em outra realização, a superfície pode ser revestida com um material apropriado que permite a aderência e o crescimento de células, por exemplo, Matrigel ®, laminina ou colágeno.

[0133] Em realizações específicas, as MSC podem ser recuperadas a partir da medula óssea (ou de outras fontes) selecionando essas células (mononucleares) que podem aderir a uma superfície de substrato, por exemplo, superfície de plástico.

[0134] Em certas realizações, o método conforme ensinado no presente pedido, pode incluir (por exemplo, como parte da etapa (a)) remover matéria não aderente e ainda cultivar células aderentes no meio conforme definido em (a).

[0135] Em realizações específicas, permite-se que as células se fixem por cerca de 1 e 8 dias, mais tipicamente entre cerca de 2 e 6 dias, mais tipicamente cerca de 4 dias, antes de remover a matéria não aderente. De outro modo, a remoção da matéria não aderente pode ser realizada no máximo em 8 dias, no máximo 6 dias, no máximo 4 dias, preferencialmente no máximo 4 dias, após a etapa inicial (a).

[0136] Em certas realizações, o método conforme ensinado no presente pedido pode compreender (por exemplo, como parte da etapa (a)) substituir parte ou todo o meio de cultura por um meio conforme definido em (a). Vantajosamente, isto permite renovar os fatores de crescimento. Em certas realizações, a substituição pode ser feita pelo menos uma vez, como uma, duas ou três vezes, durante a cultura primária.

[0137] Em certas realizações dos métodos, usos ou produtos celulares, conforme ensinado no presente pedido, as células derivadas de MSC podem ser cultivadas na etapa (a) por um período de cerca de 13 dias a cerca de 15 dias. Preferencialmente, as células derivadas de MSC são cultivadas na etapa (a) por um período de cerca de 14 dias. Etapa (b)

[0138] Em certas realizações, os métodos, conforme ensinado no presente pedido, podem compreender (b) passar as células derivadas de MSC por um primeiro período de tempo (“passagem 1” ou “P1”) e ainda cultivar as células derivadas de MSC em um meio conforme definido em (a). A etapa (A) também pode ser citada no presente pedido como “cultura secundária”.

[0139] Em uma realização, a etapa (b) pode compreender coletar as células derivadas de MSC obtidas na etapa (a).

[0140] Em uma realização, a etapa (b) pode compreender destacar, replaquear e ainda cultivar as células derivadas de MSC em um meio conforme definido em (a) (isto é, um meio que compreende FGF-2, TGFβ e heparina ou um derivado ou análogo da mesma, preferencialmente a uma concentração de pelo menos 0,01 UI/mL.

[0141] Em certas realizações dos métodos, usos ou produtos celulares, conforme ensinado no presente pedido, as células derivadas de MSC são cultivadas na etapa (a) por um período de cerca de 8 dias a cerca de 12 dias. Em certas realizações, as células derivadas MSC são cultivadas na etapa (b) por um período de cerca de 9 dias a cerca 11 dias. Preferencialmente, as células derivadas de MSC são cultivadas na etapa (b) por um período de cerca de 10 dias.

[0142] Em certas realizações, as células derivadas de MSC podem ser cultivadas na etapa (b) por um período de x dias, em que o dia x é último dia no qual pelo menos 20% das células derivadas de MSC estão se proliferando.

[0143] Então, um aspecto refere-se a um método para obter células derivadas de células-tronco mesenquimais (MSC) de linhagem condro- osteoblástica a partir de MSC, sendo que o método compreende: (a) cultivar as MSC recuperadas a partir de uma amostra biológica de um sujeito em um meio de cultura que compreende FGF-2, TGFβ e heparina ou um derivado ou análogo da mesma a uma concentração de pelo menos 0,01 UI/mL; obtendo assim as células derivadas de MSC; (b) passar as células derivadas de MSC por um primeiro período de tempo e ainda cultivar as células derivadas de MSC em um meio conforme definido em (a); e (c) passar as células derivadas de MSC por um segundo período de tempo e ainda cultivar as células derivadas de MSC em um meio conforme definido em (a), obtendo assim as células derivadas de MSC de linhagem condro-osteoblástica, em que as células derivadas de MSC são cultivadas na etapa (b) por um período de x dias, em que o dia x é último dia no qual pelo menos 20% das células derivadas de MSC estão se proliferando.

[0144] Em certas realizações, as células derivadas de MSC podem ser cultivadas na etapa (b) por um período de x dias, em que o dia x é último dia no qual pelo menos 25% das células derivadas de MSC estão se proliferando (por exemplo, nas fases S e G2/M). Por exemplo, as células derivadas de MSC podem ser cultivadas na etapa (b) por um período de x dias, em que x é o último dia no qual pelo menos 30%, pelo menos 35%, pelo menos 40%, pelo menos 45, pelo menos 50%, pelo menos 55 ou de pelo menos 60% das células derivadas de MSC estão se proliferando (por exemplo, nas fases S e G2/M).

[0145] Em certas realizações dos métodos, usos ou produtos celulares, conforme ensinado no presente pedido, as células derivadas de MSC que estão se proliferando estão na fase S, na fase G2 ou na fase M do ciclo celular. A análise do ciclo celular com os eventos/fases (fases G0/G1, S e G2/M) pode ser realizada por citometria de fluxo, como por separação de células ativadas por fluorescência (FACS).

[0146] Em certas realizações, as células derivadas de MSC podem ser cultivadas na etapa (b) por um período de x dias, em que o dia x é último dia no qual o número de células derivadas de MSC é maior que no dia x-1. Por exemplo, a fim de determinar o dia x como o último dia no qual o número de células derivadas de MSC é maior que no dia x-1, as células derivadas de MSC podem ser cultivadas durante a cultura secundária por um período de 28 dias (de acordo com métodos da técnica anterior), as amostras podem ser coletadas todos os dias, e o número de células ou d densidade celular (por exemplo, expressa como o nº de células/cm2) pode ser determinado para cada uma amostra, por exemplo, contando manualmente (por exemplo, câmara de Bürker) ou por citometria de fluxo (por exemplo, BD TrucountTM). Com base nos números de células, pode- se determinar o último dia (isto é, dia x) no qual o número de células derivadas de MSC é maior que no dia anterior (isto é, dia x-1).

[0147] Em certas realizações, as células derivadas de MSC podem ser cultivadas na etapa (b) por um período de x dias, em que o dia x é último dia no qual pelo menos 20% das células derivadas de MSC estão se proliferando, e o número de células derivadas de MSC é maior que no dia x-1.

[0148] Em certas realizações, as células derivadas de MSC podem ser plaqueadas para a cultura adicional na etapa (b) a uma densidade de 3 x 10 2 a 1 x 103 células/cm2. Em certas realizações, as células derivadas de MSC podem ser plaqueadas para a cultura adicional na etapa (b) a uma densidade de 5 x 102 a 1 x 103 células/cm2. Preferencialmente, as células derivadas de MSC podem ser plaqueadas para a cultura adicional na etapa (b) a uma densidade de 3 x 10 2 a 8 x 102 células/cm2.

[0149] Consequentemente, em um aspecto adicional, a invenção fornece um método para obter células derivadas de MSC de linhagem condro- osteoblástica a partir de MSC, sendo que o método compreende: (a) cultivar MSC recuperadas a partir de uma amostra biológica de um sujeito em um meio de cultura que compreende FGF-2, TGFβ e heparina ou um derivado ou análogo da mesma a uma concentração de pelo menos 0,01 UI/mL; obtendo assim as células derivadas de MSC; (b) passar as células derivadas de MSC por um primeiro período de tempo e ainda cultivar as células derivadas de MSC em um meio conforme definido em (a); e (c) passar as células derivadas de MSC por um segundo período de tempo e ainda cultivar as células derivadas de MSC em um meio conforme definido em (a), obtendo assim as células derivadas de MSC de linhagem condro-osteoblástica, em que as células derivadas de MSC são plaqueadas para a cultura adicional na etapa (b) a uma densidade de 3 x 10 2 a 1 x 103 células/cm2, preferencialmente a uma densidade de 3 x 102 a 8 x 102 células/cm2.

[0150] Os termos “densidade” e “densidade celular” podem ser usados de forma intercambiável no presente pedido e referem-se ao número de células por unidade de superfície (por exemplo, expresso em células/cm 2). Etapa (c)

[0151] Em certas realizações, os métodos, conforme ensinado no presente pedido, podem compreender (c) passar as células derivadas de MSC por um segundo período de tempo (“passagem 2” ou “P2”) e ainda cultivar as células derivadas de MSC em um meio conforme definido em (a), obtendo assim as células derivadas de MSC de linhagem condro-osteoblástica. A etapa (c) também pode ser citada no presente pedido como “cultura terciária”.

[0152] As células derivadas de MSC de linhagem condro-osteoblástica obtidas na etapa (c) podem ser consideradas células de “passagem P3” ou “P3”.

[0153] Em certas realizações dos métodos, usos ou produtos celulares, conforme ensinado no presente pedido, as células derivadas de MSC são cultivadas na etapa (c) por um período de cerca de 10 dias a cerca de 14 dias. Em certas realizações, as células derivadas MSC são cultivadas na etapa (c) por um período de cerca de 11 dias a cerca 13 dias. Preferencialmente, as células derivadas de MSC são cultivadas na etapa (c) por um período de cerca de 12 dias.

[0154] Em certas realizações dos métodos, usos ou produtos celulares, conforme ensinado no presente pedido, as células derivadas de MSC podem ser plaqueadas para a cultura adicional na etapa (c) a uma densidade de 3 x 10 2 a 1 x 103 células/cm2. Em certas realizações, as células derivadas de MSC podem ser plaqueadas para a cultura adicional na etapa (c) a uma densidade de 5 x 102 a 1 x 103 células/cm2. Preferencialmente, as células derivadas de MSC podem ser plaqueadas para a cultura adicional na etapa (c) a uma densidade de 2 x 102 a 1 x 103 células/cm2.

[0155] Consequentemente, em um aspecto adicional, a invenção fornece um método para obter células derivadas de MSC de linhagem condro- osteoblástica a partir de MSC, sendo que o método compreende: (a) cultivar MSC recuperadas a partir de uma amostra biológica de um sujeito em um meio de cultura que compreende FGF-2, TGFβ e heparina ou um derivado ou análogo da mesma a uma concentração de pelo menos 0,01 UI/mL; obtendo assim as células derivadas de MSC; (b) passar as células derivadas de MSC por um primeiro período de tempo e ainda cultivar as células derivadas de MSC em um meio conforme definido em (a); e (c) passar as células derivadas de MSC por um segundo período de tempo e ainda cultivar as células derivadas de MSC em um meio conforme definido em (a), obtendo assim as células derivadas de MSC de linhagem condro-osteoblástica, em que as células derivadas de MSC são plaqueadas para a cultura adicional na etapa (c) a uma densidade de 3 x 10 2 a 1 x 103 células/cm2, preferencialmente a uma densidade de 3 x 102 a 8 x 102 células/cm2. Etapas Adicionais

[0156] O técnico entenderá que os métodos, conforme ensinado no presente pedido, podem compreender passagens adicionais. O técnico no assunto entenderá que isto pode gerar culturas celulares da passagem 4 (P4), passagem 5 (P5), passagem 6 (P6), passagem 7 (P7), passagem 8 (P8), passagem 9 (P9) ou passagem 10 (P10). A passagem 0 (P0) pode se referir a MSC ou células derivadas de MSC que não foram destacadas e/ou replaqueadas. Criopreservação

[0157] Em certas realizações, os métodos, conforme ensinado no presente pedido, podem compreender criopreservar as células derivadas de MSC de linhagem condro-osteoblástica. Em certas realizações, os métodos, conforme ensinado no presente pedido, podem compreender (d) ressuspender as células derivadas de MSC de linhagem condro-osteoblástica em um meio de criopreservação adequado para a administração a um sujeito. Ressuspendendo as células derivadas de MSC de linhagem condro-osteoblástica em um meio de criopreservação adequado para a administração a um sujeito, pode ser obtido um produto celular adequado para a administração a um sujeito. O produto celular pode ser convenientemente armazenado por criopreservação, o produto celular criopreservado pode ser facilmente transportados e entregue mediante solicitação. Portanto, o produto celular adequado para a administração fica imediatamente disponível para o tratamento mediante solicitação. Além disso, a criopreservação do produto celular obtido pelos presentes métodos permite realizar todos os testes de liberação do produto celular e obter os resultados antes da administração do produto celular.

[0158] Em certas realizações, os métodos, conforme ensinado no presente pedido, podem compreender (d) ressuspender as células derivadas de MSC de linhagem condro-osteoblástica em um meio de criopreservação adequado para a administração a um sujeito; e (e) criopreservar as células derivadas de MSC de linhagem condro-osteoblástica.

[0159] Então, em um aspecto adicional, a invenção fornece um método para obter células derivadas de MSC de linhagem condro-osteoblástica a partir de MSC, sendo que o método compreende: (a) cultivar MSC recuperadas a partir de uma amostra biológica de um sujeito em um meio de cultura que compreende FGF-2, TGFβ e heparina ou um derivado ou análogo da mesma a uma concentração de pelo menos 0,01 UI/mL; obtendo assim as células derivadas de MSC; (b) passar as células derivadas de MSC por um primeiro período tempo e ainda cultivar as células derivadas de MSC em um meio conforme definido em (a); (c) passar as células derivadas de MSC por um segundo período de tempo e ainda cultivar as células derivadas de MSC em um meio conforme definido em (a), obtendo assim as células derivadas de MSC de linhagem condro-osteoblástica; (d) ressuspender as células derivadas de MSC de linhagem condro- osteoblástica (da etapa (c)) em um meio de criopreservação adequado para a administração a um sujeito; e (e) criopreservar as células derivadas de MSC de linhagem condro- osteoblástica (da etapa (d)).

[0160] Em certas realizações, os métodos, conforme ensinado no presente pedido, podem compreender (d) ressuspender as células derivadas de MSC de linhagem condro-osteoblástica a uma concentração clínica em um meio de criopreservação adequado para a administração a um sujeito; e (e) criopreservar as células derivadas de MSC de linhagem condro-osteoblástica. Essa concentração clínica vantajosamente permite administrar as células derivadas de MSC de linhagem condro-osteogênica obtidas pelos presentes métodos diretamente a um sujeito sem quaisquer etapas adicionais de diluição ou concentração ou sem etapas de lavagem adicionais das células derivadas de

MSC de linhagem condro-osteoblástica antes da administração.

[0161] Em certas realizações, os métodos, conforme ensinado no presente pedido, podem compreender criopreservar as células derivadas de MSC de linhagem condro-osteoblástica, obtendo assim um produto celular adequado para a administração. O produto celular adequado para a administração pode ser diretamente entregue a um sujeito com necessidade do mesmo sem a etapa de lavagem adicional antes da administração.

[0162] Em certas realizações dos métodos, usos ou produtos celulares, conforme ensinado no presente pedido, as células derivadas de MSC de linhagem condro-osteoblástica são ressuspensas no meio de criopreservação na etapa (d) a uma concentração entre cerca de 1 x 10 7 células/mL e cerca de 1 x 108 células/mL. Por exemplo, as células derivadas de MSC de linhagem condro- osteoblástica são ressuspensas no meio de criopreservação na etapa (d) a uma concentração entre cerca de 1 x 107 células/mL e cerca 8 x 107 células/mL, entre cerca de 1 x 107 células/mL e cerca 6 x 107 células/mL, ou entre cerca de 2 x 107 células/mL e cerca de 5 x 107 células/mL. Preferencialmente, as células derivadas de MSC de linhagem condro-osteoblástica são ressuspensas no meio de criopreservação na etapa (d) a uma concentração entre cerca de 2 x 10 7 células/mL e cerca de 4 x 107 células/mL.

[0163] Em certas realizações, o produto celular adequado para a administração compreende as células derivadas de MSC de linhagem condro- osteoblástica a uma concentração entre cerca de 1 x 10 7 células/mL e cerca de 1 x 108 células/mL. Por exemplo, o produto celular adequado para a administração compreende as células derivadas de MSC de linhagem condro- osteoblástica a uma concentração entre cerca de 1 x 10 7 células/mL e cerca 8 x 107 células/mL, entre cerca de 1 x 107 células/mL e cerca 6 x 107 células/mL, ou entre cerca de 2 x 107 células/mL e cerca de 5 x 107 células/mL. Preferencialmente, o produto celular adequado para a administração compreende as células derivadas de MSC de linhagem condro-osteoblástica a uma concentração entre cerca de 2 x 107 células/mL e a cerca de 4 x 107 células/mL.

[0164] Em certas realizações, o produto celular adequado para a administração compreende as células derivadas de MSC de linhagem condro- osteoblástica em um meio de criopreservação a uma concentração entre cerca de 1 x 107 células/mL e cerca de 1 x 108 células/mL. Por exemplo, o produto celular adequado para a administração compreende as células derivadas de MSC de linhagem condro-osteoblástica em um meio de criopreservação a uma concentração entre cerca de 1 x 107 células/mL e cerca 8 x 107 células/mL, entre cerca de 1 x 107 células/mL e cerca 6 x 107 células/mL, ou entre cerca de 2 x 107 células/mL e cerca de 5 x 107 células/mL. Preferencialmente, o produto celular adequado para a administração compreende as células derivadas de MSC de linhagem condro-osteoblástica em um meio de criopreservação a uma concentração entre cerca de 2 x 107 células/mL e cerca de 4 x 107 células/mL.

[0165] Em certas realizações dos métodos, usos ou produtos celulares, conforme ensinado no presente pedido, o meio de criopreservação pode compreender um composto antioxidante como benzopirano.

[0166] Em certas realizações dos métodos, usos ou produtos celulares, conforme ensinado no presente pedido, o meio de criopreservação pode incluir dimetilsulfóxido (DMSO), albumina de soro humana (HSA), adenosina, polipeptídeo, benzopirano ou uma combinação dos mesmos. Em certas realizações dos métodos, usos ou produtos celulares, conforme ensinado no presente pedido, o meio de criopreservação pode compreender DMSO, HSA, adenosina, (poli)peptídeos, um composto antioxidante ou uma combinação dos mesmos. Esse meio de criopreservação vantajosamente permite administrar as células derivadas de MSC de linhagem condro-osteogênica obtidas pelos presentes métodos sem etapa de lavagem adicional das células derivadas de MSC de linhagem condro-osteogênica antes da administração a um sujeito.

[0167] Em certas realizações, o produto celular adequado para a administração compreende as células derivadas de MSC de linhagem condro- osteoblástica em um meio de criopreservação que compreende DMSO, HSA,

adenosina, polipeptídeo, benzopirano, ou uma combinação dos mesmos, a uma concentração entre cerca de 1 x 107 células/mL e cerca de 1 x 108 células/mL. Por exemplo, o produto celular adequado para a administração compreende as células derivadas de MSC de linhagem condro-osteoblástica em um meio de criopreservação que compreende DMSO, HSA, adenosina, polipeptídeo, benzopirano, ou uma combinação dos mesmos, a uma concentração entre cerca de 1 x 107 células/mL e cerca 8 x 107 células/mL, entre cerca de 1 x 107 células/mL e cerca 6 x 107 células/mL, ou entre cerca de 2 x 107 células/mL e cerca de 5 x 107 células/mL. Preferencialmente, o produto celular adequado para a administração compreende as células derivadas de MSC de linhagem condro- osteoblástica em um meio de criopreservação que compreende DMSO, HSA, adenosina, polipeptídeo, benzopirano, ou uma combinação dos mesmos, a uma concentração entre cerca de 2 x 107 células/mL e cerca de 4 x 107 células/mL.

[0168] Em certas realizações, o produto celular adequado para a administração compreende as células derivadas de MSC de linhagem condro- osteoblástica em um meio de criopreservação que compreende DMSO, HSA, adenosina, (poli)peptídeos, um composto antioxidante, ou uma combinação dos mesmos, a uma concentração entre cerca de 1 x 107 células/mL e cerca de 1 x 108 células/mL. Por exemplo, o produto celular adequado para a administração compreende as células derivadas de MSC de linhagem condro-osteoblástica em um meio de criopreservação que compreende DMSO, HSA, adenosina, (poli)peptídeos, benzopirano, um composto antrioxidante ou uma combinação dos mesmos, a uma concentração entre cerca de 1 x 10 7 células/mL e cerca 8 x 107 células/mL, entre cerca de 1 x 107 células/mL e cerca 6 x 107 células/mL, ou entre cerca de 2 x 107 células/mL e cerca de 5 x 107 células/mL. Preferencialmente, o produto celular adequado para a administração compreende as células derivadas de MSC de linhagem condro-osteoblástica em um meio de criopreservação que compreende DMSO, HSA, adenosina, (poli)peptídeos, um composto antioxidante, ou uma combinação dos mesmos, a uma concentração entre cerca de 2 x 107 células/mL e cerca de 4 x 107 células/mL.

[0169] Em certas realizações dos métodos, usos ou produtos celulares, conforme ensinado no presente pedido, o meio de criopreservação pode ser uma composição que compreende nucleosídeo (por exemplo, adenosina), açúcares (por exemplo, dextran-40, dextrose, sacarose, manitol, ácido lactobiônico), tripeptídeo (por exemplo, L-glutationa), tampão (por exemplo, N-(2-hidroxietil) piperazina-N’-(ácido 2-etanossulfônico)), sais (por exemplo, hidróxido de sódio, cloreto de potássio, bicarbonato de potássio, fosfato de potássio, cloreto de cálcio, cloreto de magnésio) e DMSO. Um meio de criopreservação comercialmente disponível é o meio de criopreservação de células CS10 CryoStor® (C2874, Merck KGaA, Darmstadt, Alemanha). Outros exemplos são os meios de criopreservação de células CS5, CS2 ou CSB (Merck KGaA, Darmstadt, Alemanha).

[0170] Em certas realizações, o meio de criopreservação pode compreender pelo menos 1%, em energia, pelo menos 2%, pelo menos 5% ou de pelo menos 10% de DMSO.

[0171] Em certas realizações dos métodos, usos ou produtos celulares, conforme ensinado no presente pedido, o meio de criopreservação pode ser uma composição que compreende nucleosídeo (por exemplo, adenosina), açúcares (por exemplo, dextran-40, dextrose, sacarose, manitol, ácido lactobiônico), tripeptídeo (por exemplo, L-glutationa), tampão (por exemplo, N-(2-hidroxietil) piperazina-N’-(ácido 2-etanossulfônico)), sais (por exemplo, hidróxido de sódio, cloreto de potássio, bicarbonato de potássio, fosfato de potássio, cloreto de cálcio, cloreto de magnésio) e benzopirano (por exemplo, ácido 6‐hidroxi‐2,5,7,8‐ tetrametilcroman‐2‐carboxílico). Um meio de criopreservação comercialmente disponível é a solução conservante HypoThermosol® FRS (H4416, Merck KGaA, Darmstadt, Alemanha).

[0172] Os termos “Trolox” ou “ácido 6‐hidroxi‐2,5,7,8‐tetrametilcroman‐ 2‐carboxílico” podem ser usados de forma intercambiável.

[0173] Em certas realizações, o meio de criopreservação pode compreender pelo menos 1%, em energia, pelo menos 2%, pelo menos 5% ou de pelo menos 10% de benzopirano. Em certas realizações, o meio de criopreservação pode compreender pelo menos 1%, pelo menos 2%, pelo menos 5% ou pelo menos 10% de ácido 6‐hidroxi‐2,5,7,8‐tetrametilcroman‐2‐ carboxílico. Reivindicações de Métodos de Combinação

[0174] Em certas realizações dos métodos, conforme ensinado no presente pedido, as células derivadas de MSC podem ser cultivadas na etapa (a) por um período de cerca de 13 dias a cerca 15 dias e na etapa (b) por um período de cerca de 8 dias a cerca 12 dias. Em certas realizações dos métodos, conforme ensinado no presente pedido, as células derivadas de MSC podem ser cultivadas na etapa (a) por um período de cerca de 13 dias a cerca 15 dias e na etapa (c) por um período de cerca de 10 dias a cerca 14 dias. Em certas realizações dos métodos, conforme ensinado no presente pedido, as células derivadas de MSC podem ser cultivadas na etapa (b) por um período de cerca de 8 dias a cerca 12 dias) e na etapa (c) por um período de cerca de 10 dias a cerca 14 dias. Em certas realizações dos métodos, conforme ensinado no presente pedido, as células derivadas de MSC podem ser cultivadas na etapa (a) por um período de cerca de 13 dias a cerca 15 dias, e na etapa (b) por um período de cerca de 8 dias a cerca 12 dias e na etapa (c) por um período de cerca de 10 dias a cerca 14 dias.

[0175] Em certas realizações dos métodos, conforme ensinado no presente pedido, as células derivadas de MSC podem ser cultivadas na etapa (a) por um período de cerca de 14 dias e na etapa (b) por um período de cerca de 10 dias. Em certas realizações dos métodos, conforme ensinado no presente pedido, as células derivadas de MSC podem ser cultivadas na etapa (a) por um período de cerca de 14 e na etapa (c) por um período de cerca de 12 dias. Em certas realizações dos métodos, conforme ensinado no presente pedido, as células derivadas de MSC podem ser cultivadas na etapa (b) por um período de cerca de 10 dias e na etapa (c) por um período de cerca de 12 dias. Em certas realizações dos métodos, conforme ensinado no presente pedido, as células derivadas de MSC podem ser cultivadas na etapa (a) por um período de cerca de 14 dias, na etapa (b) por um período de cerca de 10 dias e na etapa (c) por um período de cerca de 12 dias.

[0176] Em certas realizações dos métodos, conforme ensinado no presente pedido, as células derivadas de MSC podem ser plaqueadas para a cultura adicional na etapa (b) a uma densidade de 3 x 10 2 a 1 x 103 células/cm2, e a cultura adicional na etapa (c) a uma densidade de 3 x 10 2 a 8 x 102 células/cm2.

[0177] Em certas realizações dos métodos, conforme ensinado no presente pedido, as células derivadas de MSC podem ser plaqueadas para a cultura adicional na etapa (b) a uma densidade de 3 x 10 2 a 8 x 102 células/cm2, e a cultura adicional na etapa (c) a uma densidade de 3 x 10 2 a 8 x 102 células/cm2. População de Células

[0178] Em um aspecto adicional, a invenção fornece uma população de células derivadas de MSC de linhagem condro-osteoblástica obtida ou que pode ser obtida pelos métodos conforme definidos no presente pedido.

[0179] As citações “população de células derivadas de MSC de de linhagem condro-osteoblástica” ou “células derivadas de MSC de linhagem condro-osteoblástica” podem ser usadas de forma intercambiável no presente pedido.

[0180] O termo “população”, como usado no presente pedido, refere-se a um grupo substancialmente puro (isto é, composto principalmente de) e homogêneo de células de um tipo celular desejado, como de células derivadas de MSC de linhagem condro-osteoblástica.

[0181] Um aspecto adicional refere-se a uma população de células derivadas de MSC de linhagem condro-osteoblástica que pode ser obtida ou é obtida por expReiviansão in vitro ou ex vivo de MSC, através da qual pelo menos 90% das células derivadas de MSC de linhagem condro-osteoblástica em suspensão têm um diâmetro igual ou menor que 25 µm (D90 ≤ 25 µm) e em que no máximo 1% das células derivadas de MSC de linhagem condro-osteoblástica em suspensão têm um diâmetro maior que 35 µM. Em certas realizações da população de células derivadas de MSC de linhagem condro-osteoblástica, as células derivadas de MSC de linhagem condro-osteoblástica podem ser obtidas ou são obtidas pelos métodos conforme definidos no presente pedido. Diâmetro

[0182] Conforme ilustrado na seção de Exemplos, os métodos, conforme ensinado no presente pedido, produzem células derivadas de MSC de linhagem condro-osteoblástica ou populações que as compreendem, com características superiores, como, em particular, um tamanho menor e mais homogêneo do que as células derivadas de MSC descritas anteriormente. O tamanho menor e mais homogêneo das células derivadas de MSC de linhagem condro-osteoblástica que podem ser obtidas pelos métodos conforme descritos no presente pedido, torna as células com propriedades aprimoradas de transplante. Mais particularmente, o tamanho menor e mais homogêneo das células derivadas de MSC de linhagem condro-osteoblástica que podem ser obtidas pelos métodos descritos no presente pedido, torna as células adequadas para todas as rotas de administração e, em particular, administração intravascular, entre outras, reduzindo ou eliminando o risco de embolia pulmonar e infarto, oferecendo um bom perfil de segurança in vivo e/ou seringabilidade. Além disso, as células derivadas de MSC de linhagem condro-osteoblástica que podem ser obtidas pelos métodos conforme descritos no presente pedido permitem que uma concentração celular alta e ajustável seja entregue no local com um volume administrado limitado.

[0183] Em realizações específicas, o diâmetro médio das células derivadas de MSC de linhagem condro-osteoblástica em suspensão é menor que 30 µm, menor que 25 µm, menor que 24 µm, menor que 23 µm, menor que 22 µm, menor que 21 µm ou menor que 20 µm. Preferencialmente, o diâmetro médio das células derivadas de MSC de linhagem condro-osteoblástica em suspensão é menor que 20 µm.

[0184] Os termos “suspensão” e “ suspensão celular" geralmente se referem a células derivadas de MSC, particularmente células derivadas de MSC viáveis, dispersas em uma fase líquida.

[0185] Em realizações específicas, o diâmetro médio das células derivadas de MSC de linhagem condro-osteoblástica em suspensão é maior que 10 µm, maior que 11 µm, maior que 12 µm, maior que 13 µm, maior que 14 µm ou maior que 15 µm.

[0186] Em realizações específicas, o diâmetro médio das células derivadas de MSC de linhagem condro-osteoblástica em suspensão está entre 10 µm e 25 µm, preferencialmente entre 15 µm e 20 µm.

[0187] Em realizações específicas, pelo menos 90% das células derivadas de MSC de linhagem condro-osteoblástica em suspensão têm um diâmetro igual ou menor que 25 µm ( D90 ≤ 25 µm), igual ou menor que 24 µm (D90 ≤ 24 µm), igual ou menor que 23 µm (D90 ≤ 23 µm), igual ou menor que 22 µm (D90 ≤ 22 µm), igual ou menor que 21 µm (D90 ≤ 21 µm), ou igual ou menor que 20 µm (D90 ≤ 20 µm), preferencialmente igual ou menor que 25 µm (D90 ≤ 25 µm).

[0188] Em realizações específicas, as células derivadas de MSC de linhagem condro-osteoblástica em suspensão têm um D90 igual ou menor que 25 µm (D90 ≤ 25 µm) e no máximo 1% das células derivadas de MSC de linhagem condro-osteoblástica em suspensão têm um diâmetro de mais de 35 µm. Em realizações específicas, as células derivadas de MSC de linhagem condro- osteoblástica em suspensão têm um D90 igual ou menor que 24 µm (D90 ≤ 24 µm), igual ou menor que 23 µm (D90 ≤ 23 µm), igual ou menor que 22 µm (D90 ≤ 22 µm), igual ou menor que 21 µm (D90 ≤ 21 µm), ou igual ou menor que 20 µm (D90 ≤ 20 µm), no máximo 1% das células derivadas de MSC de linhagem condro- osteoblástica em suspensão têm um diâmetro maior que 35 µm.

[0189] Em realizações específicas, as células derivadas de MSC de linhagem condro-osteoblástica em suspensão têm um D90 igual ou menor que 25 µm (D90 ≤ 25 µm) e no máximo 1% das células derivadas de MSC de linhagem condro-osteoblástica em suspensão têm um diâmetro de mais de 30 µm. Em realizações específicas, as células derivadas de MSC de linhagem condro- osteoblástica em suspensão têm um D90 igual ou menor que 24 µm (D90 ≤ 24 µm), igual ou menor que 23 µm (D90 ≤ 23 µm), igual ou menor que 22 µm (D90 ≤ 22 µm), igual ou menor que 21 µm (D90 ≤ 21 µm), ou igual ou menor que 20 µm (D90 ≤ 20 µm), no máximo 1% das células derivadas de MSC de linhagem condro- osteoblástica em suspensão têm um diâmetro maior que 30 µm.

[0190] Em realizações específicas, as células derivadas de MSC de linhagem condro-osteoblástica em suspensão têm um D90 entre cerca de 25 µm e cerca de 10 µm (10 µm ≤ D90 ≤ 25 µm), entre cerca de 24 µm e cerca de 10 µm (10 µm ≤ D90 ≤ 24 µm), entre cerca de 23 µm e cerca de 10 µm (10 µm ≤ D90 ≤ 23 µm),entre cerca de 22 µm e cerca de 10 µm (10 µm ≤ D 90 ≤ 22 µm), entre cerca de 21 µm e cerca de 10 µm (10 µm ≤ D90 ≤ 21 µm) ou entre cerca de 20 µm e cerca de 10 µm (10 µm ≤ D90 ≤ 20 µm), preferencialmente entre cerca de 25 µm e cerca de 10 µm (10 µm ≤ D90 ≤ 25 µm).

[0191] O diâmetro de uma célula pode ser determinado por qualquer método conhecido na técnica, por exemplo, por um microscópio digital e software acompanhado para análise de imagens (por exemplo, Motic Image Plus ® 2,02). O diâmetro celular médio, como citado no presente pedido, deve ser determinado com base no diâmetro das células em um estado não fixado, flutuante livre, então, das células em suspensão. As células estão preferencialmente suspensas em uma solução que compreende um tampão transparente, não tóxico, isotônico como PBS, e opcionalmente um corante para diferenciar as células vivas e mortas, como azul de tripano. Preferencialmente, pelo menos cem células devem ser medidas para considerar a análise estatisticamente significativa. Composição

[0192] Um aspecto adicional refere-se a um composição que compreende as células derivadas de MSC de condro-osteoblástica ou a população de células derivadas de MSC de linhagem condro-osteoblástica,

conforme definido no presente pedido.

[0193] Em certas realizações, as composições ainda podem compreender um ou mais dentre outros componentes. Por exemplo, podem ser incluídos componentes que podem manter ou melhorar a viabilidade de células. Por meio de exemplo e sem limitação, esses componentes podem incluir sais para assegurar condições substancialmente isotônicas, estabilizadores de pH, como sistema(s) tampão (por exemplo, para assegurar pH substancialmente neutro, como sistema tampão fosfato ou carbonato), proteínas carreadoras como, por exemplo, albumina, meios que incluem meios basais e/ou suplementos de meios, soro ou plasma, nutrientes, fontes de carboidratos, conservantes, estabilizantes, antioxidantes ou outros materiais bem conhecidos pelos técnicos no assunto. São também divulgados métodos de produção das ditas composições, por mistura das respectivas células derivadas de MSC de linhagem condro-osteoblástica com os ditos um ou mais componentes adicionais, conforme acima. As composições podem ser, por exemplo, líquidas ou podem ser semissólidas ou sólidas (por exemplo, podem ser composições congeladas ou podem existir como gel ou podem existir em suporte sólido ou arcabouço, etc.).

[0194] Os termos “composição”, “formulação” ou “preparação” podem ser usados de forma intercambiável no presente pedido. Formulações Farmacêuticas

[0195] Em realizações específicas, a composição pode ser uma formulação farmacêutica que compreende as células derivadas de MSC de linhagem condro-osteoblástica, conforme definido no presente pedido e, opcionalmente, um ou mais excipientes farmaceuticamente aceitáveis.

[0196] Então, em um aspecto adicional, a invenção fornece uma formulação farmacêutica que compreende a população de células derivadas de MSC de linhagem condro-osteoblástica, conforme definido no presente pedido.

[0197] O termo “farmaceuticamente aceitável”, como usado no presente pedido, é coerente com a técnica e os meios compatíveis com os outros ingredientes de uma formulação farmacêutica e não prejudicial para o seu receptor.

[0198] Como usado no presente pedido, “carreador” ou “excipiente” inclui todos e quaisquer solventes, diluentes, tampões (por exemplo, solução salina tamponada neutra ou solução salina tamponada com fosfato), solubilizantes, coloides, meios de dispersão, veículos, preenchedores, agentes quelantes (por exemplo, EDTA ou glutationa), aminoácidos (por exemplo, glicina), proteínas, disintegrantes, aglutinantes, lubrificantes, agente umidificador, emulsionantes, adoçantes, corantes, flavorizantes, aromatizantes, espessantes, agentes para atingir um efeito de depósito, revestimentos, agentes antifúngicos, conservantes, estabilizantes, antioxidantes, agentes controladores de tonicidade, agentes retardadores de absorção, e similares. O uso desses meios e agentes para substâncias ativas farmacêuticas é bem conhecido na técnica. Esses materiais não devem ser tóxicos e não devem interferir na atividade das células.

[0199] A natureza precisa do carreador ou excipiente ou outro material dependerá da rota de administração. Por exemplo, a composição pode estar sob a forma de uma solução aquosa aceitável de modo parenteral, que é livre de pirogênio e tem pH adequado, isotonicidade e estabilidade. Para princípios gerais em formulação medicinal, o leitor é submetido para Cell Therapy: Stem Cell Transplantation, Gene Therapy, and Cellular Immunotherapy, por G. Morstyn & W. Sheridan eds., Cambridge University Press, 1996; e Hematopoietic Stem Cell Therapy, E. D. Ball, J. Lister & P. Law, Churchill Livingstone, 2000.

[0200] As formulações farmacêuticas líquidas geralmente podem incluir um carreador líquido, como água ou uma solução aquosa farmaceuticamente aceitável. Por exemplo, solução salina fisiológica, meio de cultura de tecidos ou células, dextrose ou outra solução de sacarídeo ou glicóis, como etilenoglicol, propilenoglicol ou polietilenoglicol, podem ser incluídos.

[0201] A composição pode incluir uma ou mais moléculas protetoras celulares, moléculas regenerativas celulares, fatores de crescimento, fatores antiapoptóticos ou fatores que regulam a expressão gênica nas células. Essas substâncias podem tornar as células independentes do seu ambiente.

[0202] Essas formulações farmacêuticas podem conter componentes adicionais, garantindo a viabilidade das células nelas. Por exemplo, as composições podem compreender um sistema tampão adequado (por exemplo, sistema tampão fosfato ou carbonato) para atingir o pH desejável, geralmente mais próximo do pH neutro, e podem compreender sal suficiente para garantir as condições isosmóticas às células, para evitar estresse osmótico. Por exemplo, uma solução adequada para esses propósitos pode ser solução salina tamponada com fosfato (PBS), solução de cloreto de sódio, injeção de Ringer ou injeção de Ringer com Lactato, como conhecido na técnica. Além disso, a composição pode compreender uma proteína carreadora, por exemplo, albumina (por exemplo, albumina bovina ou humana), que pode aumentar a viabilidade das células.

[0203] Além disso, carreadores ou aditivos adequados farmaceuticamente aceitáveis são bem conhecidos na técnica e, por exemplo, podem ser selecionados a partir de proteínas colágeno ou gelatina, carboidratos como amido, polissacarídeos, açúcares (dextrose, glicose e sacarose), derivados de celulose como carboximetilcelulose de sódio ou cálcio, hidroxipropil celulose ou hidroxipropilmetil celulose, amidos pré-geletanizados, pectina, ágar, carragena, argilas, gomas hidrofílicas (goma de acácia, goma guar, goma arábica e goma xantana), ácido algínico, alginatos, ácido hialurônico, ácido poliglicólico e poliláctico, dextrano, pectinas, polímeros sintéticos como polímero acrílico solúvel em água ou polivinilpirrolidona, proteoglicanos, fosfato de cálcio, e similares.

[0204] Se desejável, a preparação celular pode ser administrada em um suporte, arcabouço, matriz ou material para fornecer uma regeneração tecidual aprimorada. Por exemplo, o material pode ser uma cerâmica granular ou um biopolímero, como gelatina, colágeno ou fibrinogênio. Matrizes porosas podem ser sintetizadas de acordo com técnicas padrão (por exemplo, Mikos et al.,

Biomaterials 14: 323, 1993; Mikos et al., Polymer 35:1068, 1994; Cook et al., J. Biomed. Mater. Res. 35:513, 1997). Esse suporte, arcabouço, matriz ou material pode ser biodegradável ou não biodegradável. Então, as células podem ser transferidas e/ou cultivadas em substrato adequado, como substrato poroso ou não poroso, para fornecer implantes. Por exemplo, as células que proliferaram, ou que estão sendo diferenciadas em pratos de cultura, podem ser transferidas para suportes sólidos tridimensionais para que se multipliquem e/ou continuem o processo de diferenciação, por incubação do suporte sólido em um meio líquido de nutrientes da invenção, se necessário. As células podem ser transferidas para um suporte sólido tridimensional, por exemplo, impregnando o dito suporte com uma suspensão líquida contendo as ditas células. Os suportes impregnados obtidos desse modo podem ser implantados em um sujeito. Esses suportes impregnados também podem ser recultivados por imersão dos mesmos em um meio líquido de cultura, antes de serem finalmente implantados. O suporte sólido tridimensional precisa ser biocompatível para permitir que seja implantado em um humano. Pode ser biodegradável ou não biodegradável.

[0205] As células ou populações celulares podem ser administradas de forma a permitir que sobrevivam, cresçam, se propaguem e/ou se diferenciem para os tipos celulares desejados como, por exemplo, osteoblastos. As células ou populações celulares podem ser enxertadas ou podem migrar e se enxertar no órgão pretendido, como defeito ósseo. Pode ser previsto o enxerto das células ou das populações celulares em outros lugares.

[0206] Em uma realização, a preparação de células farmacêuticas, conforme definido acima, pode ser administrada sob a forma de composição líquida. Em realizações, as células ou a formulação farmacêutica que as compreende podem ser administradas sistemicamente, de forma tópica, no interior de um órgão, em um local de disfunção ou lesão do órgão ou em um local de lesão do tecido.

[0207] Preferencialmente, as formulações farmacêuticas podem compreender uma quantidade terapeuticamente efetiva das células desejadas.

O termo “quantidade terapeuticamente efetiva” refere-se a uma quantidade que pode provocar uma resposta biológica ou medicinal em um tecido, sistema, animal ou humano que está sendo buscado por um pesquisador, veterinário, médico ou outro clínico e, em particular, pode prevenir ou aliviar um ou mais dos sintomas ou características locais ou sistêmicas de uma doença ou condição que está sendo tratada. Quantidades apropriadas terapeuticamente efetivas podem ser determinadas por um médico qualificado, tendo em conta a natureza das células desejadas, a condição e severidade da doença, e a idade, tamanho e condição do sujeito.

[0208] Também são fornecidos métodos para produzir as ditas formulações farmacêuticas por mistura das células da invenção com um ou mais componentes adicionais, conforme descrito acima, bem como com um ou mais excipientes farmacêuticos, conforme descrito acima.

[0209] Em uma realização, a formulação farmacêutica, conforme definido acima, pode ser administrada sob a forma de composição líquida ou viscosa.

[0210] Em certas realizações dos métodos, usos ou produtos celulares, conforme ensinado no presente pedido, a formulação farmacêutica pode sinda compreender um componente com propriedades osteocondutoras, como fosfato tricálcico, hidroxiapatita, combinação de partículas de hidroxiapatita/fosfato tricálcico, ácido poliláctico, poli(ácido láctico-glicólico), ácido hialurônico ou um derivado do mesmo, quitosana, poli-L-lisina, gelatina, colágeno, osteonectina, fibrinogênio, osteocalcina, ou uma combinação dos mesmos.

[0211] O termo “osteocondutor” refere-se à capacidade de um componente para servir como um arcabouço no qual as células, como as células derivadas de MSC de linhagem condro-osteoblástica, conforme ensinado no presente pedido, podem se anexar, migrar, crescer e produzir um novo osso.

[0212] Conforme mencionado acima, as formulações farmacêuticas, conforme ensinado no presente pedido, podem compreender componentes úteis para a reparação de feridas ósseas e defeitos ósseos. As formulações farmacêuticas podem compreender um arcabouço ou matriz com propriedades osteocondutoras. As formulações farmacêuticas podem ser combinadas com a matriz óssea desmineralizada (DBM) ou outras matrizes para produzir o compósito osteogênico, bem como osteocondutor e osteoindutivo. Métodos similares com o uso de células da medula óssea com DBM alogênica têm produzido bons resultados (Connolly et al. 1995. Clin Orthop 313: 8-18).

[0213] As formulações farmacêuticas, conforme ensinado no presente pedido, podem ainda incluir ou serem coadministradas com um fator bioativo complementar ou uma proteína osteoindutiva, como a proteína morfogenética óssea como, BMP-2, BMP-7 ou BMP-4, ou qualquer outro fator de crescimento. Outros componentes potenciais que acompanham incluem as fontes inorgânicas adequadas de cálcio ou fosfato para ajudar a regeneração óssea (documento WO 00/07639). Se desejável, a preparação celular pode ser administrada em uma matriz ou em um material carreador para fornecer uma regeneração tecidual aprimorada. Por exemplo, o material pode ser um hidrogel ou um biopolímero como gelatina, colágeno, ácido hialurônico ou derivados dos mesmos, osteonectina, fibrinogênio ou osteocalcina. Os biomateriais podem ser sintetizados de acordo com técnicas padrão (por exemplo, Mikos et al., Biomaterials 14:323, 1993; Mikos et al., Polymer 35:1068, 1994; Cook et al., J. Biomed. Mater. Res. 35:513, 1997).

[0214] Também é divulgado um arranjo ou kit de partes que compreende um instrumento ou dispositivo cirúrgico para a administração das células derivadas de MSC de linhagem condro-osteoblástica, conforme ensinado no presente pedido, ou das formulações farmacêuticas, conforme ensinado no presente pedido, para um sujeito, como, por exemplo, sistemicamente, por exemplo, por injeção, e ainda compreendendo as células derivadas de MSC de linhagem condro-osteoblástica, conforme ensinado no presente pedido, ou as formulações farmacêuticas, conforme ensinado no presente pedido. Usos Médicos

[0215] Em outro aspecto, a invenção fornece a população de células derivadas de MSC de linhagem condro-osteoblástica, conforme definido no presente pedido, ou a formulação farmacêutica, conforme definido no presente pedido, para uso como um medicamento.

[0216] Em outro aspecto, a invenção fornecea população de células derivadas de MSC de linhagem condro-osteoblástica, conforme definido no presente pedido, ou a formulação farmacêutica, conforme definido no presente pedido, para uso no tratamento de um sujeito com necessidade de transplante de células de linhagem condro-osteoblástica.

[0217] Em aspectos relacionados, a invenção fornece um método de tratamento de um sujeito com necessidade de transplante de células de linhagem condro-osteoblástica, que compreende administrar ao dito sujeito uma quantidade terapeuticamente efetiva das células derivadas de MSC de linhagem condro-osteoblástica definidas no presente pedido ou a população de células derivadas de MSC de linhagem condro-osteoblástica ou as formulações farmacêuticas que compreendem as células derivadas de MSC de linhagem condro-osteoblástica ou a população de células derivadas de MSC de linhagem condro-osteoblástica para o sujeito.

[0218] Em aspectos relacionados, a invenção fornece o uso das células derivadas de MSC de linhagem condro-osteoblástica definidas acima ou a população de células derivadas de MSC de linhagem condro-osteoblástica ou formulações farmacêuticas que compreendem as células derivadas de MSC de linhagem condro-osteoblástica ou a população de células derivadas de MSC de linhagem condro-osteoblástica para a fabricação de um medicamento para tratamento de um sujeito com necessidade de transplante de células de linhagem condro-osteoblástica.

[0219] Como usado no presente pedido, os termos “tratar” ou “tratamento” referem-se tanto a tratamento terapêutico e profilático como medidas preventivas, em que o objetivo é prevenir ou desacelerar (diminuir) uma alteração ou disfunção fisiológica indesejada. Resultados clínicos benéficos ou desejados incluem, mas não se limitam a, alívio de sintomas, diminuição do grau da doença, estado estável da doença (isto é, sem piora), retardo ou desaceleração da progressão da doença e ocorrência de complicações, melhora ou paliação do estado da doença. “Tratamento” também pode significar sobrevida prolongada, em comparação à sobrevida esperada se não receber tratamento.

[0220] O termo “sujeito com necessidade de transplante de células de linhagem condro-osteoblástica”, como usado no presente pedido, inclui sujeitos, como mamíferos ou sujeitos humanos, que se beneficiariam do tratamento de uma determinada condição, preferencialmente uma condição ou doença conforme definidas no presente pedido. Esses sujeitos tipicamente incluem, sem limitação, aqueles que foram diagnosticados com a condição, aqueles propensos a ter ou desenvolver a condição e/ou aqueles em que a condição deve ser prevenida. Transplante Celular

[0221] O termo “transplante” ou “transplante celular” tem seu significado normal e refere-se particularmente à administração de células a um sujeito. O termo “transplante celular” pode ser usado de forma intercambiável com “terapia celular”. O transplante de células pode ser realizado por qualquer técnica conhecida. Por exemplo, e sem limitação, as células podem ser transplantadas por infusão em um sujeito. Normalmente, a infusão celular pode ser realizada por via parenteral, por exemplo, por via intravascular, subcutânea, intradérmica ou intramuscular, preferencialmente intravascular. As células podem ser administradas, por exemplo, e sem limitação, sistemicamente, topicamente ou no local de uma lesão. Pode ser claro que, dependendo da aplicação específica, tecidos-alvo, propósitos terapêuticos ou tipo celular, o ajuste pode ser feito, consequentemente, em relação às rotas de administração, bem como formulações, concentrações, etc.

[0222] Em certas realizações dos métodos, usos ou produtos celulares, conforme ensinado no presente pedido, a população de células derivadas de MSC de linhagem condro-osteoblástica ou a formulação farmacêutica podem ser adequadas para administração percutânea, intraóssea, intra-articular, intervertebral ou intravascular.

[0223] Em certas realizações dos métodos, usos ou produtos celulares, conforme ensinado no presente pedido, a população de células derivadas de MSC de linhagem condro-osteoblástica ou a formulação farmacêutica podem ser adequadas para a administração em um local de um defeito ósseo.

[0224] O tamanho celular homogêneo e pequeno das células derivadas de MSC de linhagem condro-osteoblástica, conforme ensinado no presente pedido, leva a uma toxicidade aguda reduzida ou abolida após a administração intravenosa das ditas células a um sujeito. Portanto, as células derivadas de MSC de linhagem condro-osteoblástica, conforme ensinado no presente pedido, são particularmente adequadas para administração intravascular ou percutânea.

[0225] Portanto, em realizações particulares, as células derivadas de MSC de linhagem condro-osteoblástica, a população de células derivadas de MSC de linhagem condro-osteoblástica ou a formulação farmacêutica, podem ser administradas ao dito sujeito com necessidade de transplante de células de linhagem condro-osteoblástica percutânea ou intravascular.

[0226] Além disso, os inventores descobriram que as células derivadas de MSC de linhagem condro-osteoblástica obtidas pelos métodos, conforme ensinado no presente pedido, têm propriedades osteogênicas.

[0227] Consequentemente, em uma realização específica, o sujeito com necessidade de transplante de células de linhagem condro-osteoblástica pode ser um sujeito que tem uma doença musculoesquelética.

[0228] O termo “doença musculoesquelética”, como usado no presente pedido, refere-se a qualquer tipo de doença óssea, doença muscular, doença articular ou condrodistrofia, cujo tratamento pode se beneficiar da administração da presente formulação farmacêutica a um sujeito que tem a doença. Em particular, essa doença pode ser caracterizada, por exemplo, por formação óssea e/ou cartilaginosa diminuída ou reabsorção óssea e/ou cartilaginosa excessiva, por número, viabilidade ou função diminuída de osteoblastos ou osteócitos presentes nos ossos e/ou condroblastos ou condrócitos presentes na cartilagem, massa óssea e/ou massa cartilaginosa diminuída em um sujeito, afinamento do osso, força óssea ou elasticidade comprometida, etc.

[0229] Exemplos não limitantes de doenças musculoesqueléticas podem incluir disfunções locais ou sistêmicas, como, qualquer tipo de osteoporose ou osteopenia, por exemplo, primária, pós-menopausa, senil, induzida por corticoide, induzida por bisfosfonatos e induzida por radioterapia; qualquer osteonecrose mono- ou multilocal secundária; qualquer tipo de fratura, por exemplo, não-união, mal-união, fraturas ou compressão de união retardada, fraturas maxilo-faciais; condições que requerem fusão óssea (por exemplo, fusões espinhais e reconstrução); defeito ósseo congênito; reconstrução óssea, por exemplo, após lesão traumática ou cirurgia de câncer, e reconstrução óssea crânio-facial; artrite traumática, defeito focal na cartilagem e/ou articulações, artrite degenerativa focal; osteoartrite, artrite degenerativa, gonartrose, e coxartrose; osteogênese imperfeita; câncer ósseo osteolítico; Doença de Paget; disfunções endocrinológicas; hipofosfatemia; hipocalcemia; osteodistrofia renal; osteomalácia; doença óssea adinâmica, hiperparatiroidismo, hiperparatireoidismo primário, hiperparatireoidismo secundário; doença periodontal; doença de Gorham-Stout e síndrome de McCune-Albright; artrite reumatoide; espondiloartropatias, incluindo espondilite anquilosante, artrite psoriática, artropatia enteropática, e espondiloartrite indiferenciada e artrite reativa; lúpus eritematoso sistêmico e síndromes relacionadas; escleroderma e disfunções relacionadas; Síndrome de Sjogren; vasculite sistêmica, incluindo Arterite de células gigantes (doença de Horton), arterite de Takayasu, polimialgia reumática, vasculite associada a ANCA (como granulomatose de Wegener, poliangiite microscópica, e Síndrome de Churg-Strauss), Síndrome de Behcet, e outras poliarterites e doenças relacionadas (como poliarterite nodosa, Síndrome de Cogan, e doença de Buerger); artrite qua acompanha outras doenças inflamatórias sistêmicas, incluindo amiloidose e sarcoidose; artropatias de cristal, incluindo gota, doença do diidrato de pirofosfato de cálcio, disfunções ou síndromes associadas com deposição articular de fosfato de cálcio ou cristais de oxalato de cálcio; condrocalcinose e artropatia neuropática; Síndrome de Felty e Síndrome e Síndrome de Reiter; doença de Lyme e febre reumática.

[0230] Em uma realização específica, o sujeito com necessidade de transplante de células de linhagem condro-osteoblástica pode ser um sujeito que tem uma disfunção relacionada ao osso.

[0231] Consequentemente, o termo “disfunção relacionada aos ossos”, como usado no presente pedido, refere-se a qualquer tipo de doença óssea, cujo tratamento pode se beneficiar do transplante de células com propriedades de formação óssea por exemplo, células osteocondroprogenitoras, osteoprogenitoras, pré-osteoblastos, osteoblastos ou com fenótipo osteoblástico, a um sujeito que tem a disfunção. Em particular, essas disfunções podem ser caracterizadas, por exemplo, por formação óssea e/ou cartilaginosa diminuída ou reabsorção óssea excessiva, por número, viabilidade ou função diminuída de osteoblastos ou osteócitos presentes nos ossos, massa óssea diminuída em um sujeito, afinamento do osso, força óssea ou elasticidade comprometida, etc.

[0232] A título de exemplo, mas não de limitação, disfunções relacionadas aos ossos que podem se beneficiar do transplante de células derivadas de MSC de linhagem condro-osteoblástica (por exemplo, células de linhagem osteoblástica) obtidas pelo método da presente invenção podem incluir disfunções locais ou sistêmicas como, qualquer tipo de osteoporose ou osteopenia, por exemplo, primária, pós-menopausa, senil, induzida por corticoide, qualquer osteonecrose secundária, mono ou multilocal, qualquer tipo de fratura, por exemplo, não-união, mal-união, retardo de união de fraturas ou compressão, condições que exigem fusão óssea (por exemplo, fusões espinhais e reconstrução), fraturas maxilo-faciais, reconstrução óssea, por exemplo, após lesão traumática ou cirurgia de câncer, reconstrução óssea crânio-facial, osteogênese imperfeita, câncer ósseo osteolítico, doença de Paget, disfunções endocrinológicas, hipofosfatemia, hipocalcemia, osteodistrofia renal,

osteomalácia, doença óssea adinâmico, artrite reumatoide, hiperparatireoidismo, hiperparatireoidismo primário, hiperparatireoidismo secundário, doença periodontal, doença de Gorham-Stout e síndrome de McCune-Albright.

[0233] As células derivadas de MSC de linhagem condro-osteoblástica, a população de células derivadas de MSC de linhagem condro-osteoblástica e as formulações farmacêuticas descritas no presente pedido podem ser usadas isoladamente ou em combinação com quaisquer das terapias conhecidas ou compostos ativos para as respectivas doenças. A administração pode ser simultânea ou sequencial, em qualquer ordem, conforme descrito em outra parte.

[0234] Se as células forem derivadas de fonte heteróloga (ou seja, não- autóloga, não-homóloga ou não-alogênica), pode ser tipicamente administrada terapia imunossupressora concomitante, por exemplo, com o uso de agentes imunossupressores, como ciclosporina ou tacrolimus (FK506). Dosagem

[0235] A quantidade de células a ser administrada irá variar para o sujeito que está sendo tratado. Em uma realização, a quantidade de células a ser administrada é entre 102 a 1010 ou entre 102 a 109, ou entre 103 a 1010 ou entre 103 a 109, ou entre 104 a 1010 ou entre 104 a 109, como entre 104 e 108, ou entre 105 e 107, por exemplo, cerca de 1 x105, cerca de 5 x 105, cerca de 1 x 106, cerca de 5 x 106, cerca de 1 x 107, cerca de 5 x 107, cerca de 1 x 108, cerca de 5 x 108, cerca de 1 x 109, cerca de 2 x 109, cerca de 3 x 109, cerca de 4 x 109, cerca de 5 x 109, cerca de 6 x 109, cerca de 7 x 109, cerca de 8 x 109, cerca de 9 x 109 ou cerca de 1 x 1010 células podem ser administradas a um sujeito humano. Em realizações adicionais, entre 106 a 108 células por kg de peso corporal ou entre 1 x 107 a 9 x 107 células por kg de peso corporal, por exemplo, cerca de 1 x 107, cerca de 2 x 107, cerca de 3 x 107, cerca de 4x107, cerca de 5 x 107, cerca de 6 x 107, cerca de 7 x 107, cerca de 8 x 107, cerca de 9 x 107 ou cerca de 1 x 108 células por kg de peso corporal podem ser administradas ao sujeito humano. Por exemplo, esse número de células ou esse número de células por kg de peso corporal pode se referir particularmente ao número total de células a ser administrada a um sujeito, cuja administração pode ser convenientemente distribuída em uma ou mais doses (por exemplo, distribuída em 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 ou mais doses administradas durante um ou mais dias (por exemplo, em 1, 2, 3, 4 ou 5 dias ou mais). No entanto, a determinação precisa de uma dose terapeuticamente efetiva pode ser baseada em fatores individuais para cada paciente, incluindo seu tamanho, idade, tamanho do dano no tecido e o tempo desde que o dano ocorreu, e pode ser facilmente determinada pelo técnico no assunto a partir dessa divulgação e do conhecimento no assunto.

[0236] Adequadamente, em uma formulação farmacêutica a ser administrada, as células derivadas de MSC de linhagem condro-osteoblástica podem estar presentes a uma concentração entre cerca 10 4 células/mL a cerca de 109 células/mL, preferencialmente entre cerca de 105 células/mL e cerca 108 células/mL, ainda mais preferencialmente entre cerca de 1 x 10 6 células/mL e cerca de 1 x 108 células/mL.

[0237] Em certas realizações, a formulação farmacêutica a ser administrada compreende as células derivadas de MSC de linhagem condro- osteoblástica a uma concentração entre cerca de 1 x 107 células/mL e cerca de 1 x 108 células/mL. Em certas realizações, a formulação farmacêutica a ser administrada compreende as células derivadas de MSC de linhagem condro- osteoblástica a uma concentração entre cerca de 2 x 10 7 células/mL e a cerca de 4 x 107 células/mL.

[0238] Em certas realizações, a formulação farmacêutica a ser administrada compreende as células derivadas de MSC de linhagem condro- osteoblástica em um meio de criopreservação a uma concentração entre cerca de 1 x 107 células/mL e cerca de 1 x 108 células/mL. Em certas realizações, a formulação farmacêutica a ser administrada compreende as células derivadas de MSC de linhagem condro-osteoblástica em um meio de criopreservação a uma concentração entre cerca de 2 x 107 células/mL e cerca de 4 x 107 células/mL.

[0239] Em certas realizações, a formulação farmacêutica a ser administrada compreende as células derivadas de MSC de linhagem condro- osteoblástica em um meio de criopreservação que compreende DMSO, HSA, adenosina, polipeptídeo, benzopirano, ou uma combinação dos mesmos, a uma concentração entre cerca de 1 x 107 células/mL e cerca de 1 x 108 células/mL. Em certas realizações, a formulação farmacêutica a ser administrada compreende as células derivadas de MSC de linhagem condro-osteoblástica em um meio de criopreservação que compreende DMSO, HSA, adenosina, polipeptídeo, benzopirano, ou uma combinação dos mesmos, a uma concentração entre cerca de 2 x 107 células/mL e cerca de 4 x 107 células/mL.

[0240] Em certas realizações dos métodos, usos ou produtos celulares, conforme ensinado no presente pedido, as células derivadas de MSC de linhagem condro-osteoblástica podem estar presentes, por exemplo, em uma formulação farmacêutica a ser administrada, a uma concentração entre cerca de 1 x 107 células/mL e cerca de 1 x 108 células/mL, preferencialmente entre cerca de 2 x 107 células/mL e cerca de 4 x 107 células/mL.

[0241] O tamanho celular reduzido das células derivadas de MSC de linhagem condro-osteoblástica, conforme ensinado no presente pedido, permite uma concentração celular alta e/ou ajustável. Consequentemente, se a composição for uma composição líquida, o volume da composição que compreende células derivadas de MSC de linhagem condro-osteoblástica obtidas pelo método, conforme ensinado no presente pedido, a ser administrada ao sujeito com necessidade de transplante de células derivadas de MSC, é menor que o volume da composição que compreende células derivadas de MSC obtidas por outros métodos.

[0242] O presente pedido também fornece aspectos e realizações conforme apresentados nas seguintes declarações:

[0243] Declaração 1. Um método para obter células derivadas de células-tronco mesenquimais (MSC) de linhagem condro-osteoblástica a partir de MSC, sendo que o método compreende: (a) cultivar as MSC recuperadas a partir de uma amostra biológica de um sujeito em um meio de cultura que compreende fator de crescimento de fibroblastos 2 (FGF-2), fator de crescimento transformador beta (TGFβ) e heparina ou um derivado ou análogo da mesma a uma concentração de pelo menos 0,01 UI/mL, obtendo assim as células derivadas de células-tronco mesenquimais (MSC); (b) passar as células derivadas de MSC por um primeiro período de tempo e ainda cultivar as células derivadas de MSC em um meio conforme definido em (a); e (c) passar as células derivadas de MSC por um segundo período de tempo e ainda cultivar as células derivadas de MSC em um meio conforme definido em (a), obtendo assim as células derivadas de MSC de linhagem condro-osteoblástica, em que as células derivadas de MSC são cultivadas na etapa (b) por um período de x dias, em que o dia x é último dia no qual pelo menos 20% das células derivadas de MSC estão se proliferando.

[0244] Declaração 2. O método de acordo com a declaração 1, em que as células derivadas de MSC são cultivadas na etapa (b) por um período de cerca de 8 dias a cerca de 12 dias, preferencialmente por um período de cerca de 10 dias.

[0245] Declaração 3. O método de acordo com a declaração 1 ou 2, em que as células derivadas de MSC são cultivadas na etapa (a) por um período de cerca de 13 dias a cerca de 15 dias, preferencialmente por um período de cerca de 14 dias.

[0246] Declaração 4. O método de acordo com qualquer uma das declarações 1 a 3, em que as células derivadas de MSC são cultivadas na etapa (c) por um período de cerca de 10 dias a cerca de 14 dias, preferencialmente por um período de cerca de 12 dias.

[0247] Declaração 5. O método de acordo com qualquer uma das declarações 1 a 4, em que as células derivadas de MSC que estão se proliferando estão na fase S, na fase G2 ou na fase M do ciclo celular.

[0248] Declaração 6. Um método para obter células derivadas de MSC de linhagem condro-osteoblástica a partir de MSC, sendo que o método compreende: (a) cultivar MSC recuperadas a partir de uma amostra biológica de um sujeito em um meio de cultura que compreende FGF-2, TGFβ e heparina ou um derivado ou análogo da mesma a uma concentração de pelo menos 0,01 UI/mL; obtendo assim as células derivadas de MSC; (b) passar as células derivadas de MSC por um primeiro período de tempo e ainda cultivar as células derivadas de MSC em um meio conforme definido em (a); e (c) passar as células derivadas de MSC por um segundo período de tempo e ainda cultivar as células derivadas de MSC em um meio conforme definido em (a), obtendo assim as células derivadas de MSC de linhagem condro-osteoblástica, em que as células derivadas de MSC são plaqueadas para a cultura adicional na etapa (b) a uma densidade de 3 x 10 2 a 1 x 103 células/cm2, preferencialmente a uma densidade de 3 x 102 a 8 x 102 células/cm2.

[0249] Declaração 7. O método de acordo com a declaração 6, em que as células derivadas de MSC são plaqueadas para a cultura adicional na etapa (c) a uma densidade de 3 x 102 a 1 x 103 células/cm2, preferencialmente a uma densidade de 3 x 102 a 8 x 102 células/cm2.

[0250] Declaração 8. Um método para obter células derivadas de MSC de linhagem condro-osteoblástica a partir de MSC, sendo que o método compreende: (a) cultivar MSC recuperadas a partir de uma amostra biológica de um sujeito em um meio de cultura que compreende FGF-2, TGFβ e heparina ou um derivado ou análogo da mesma a uma concentração de pelo menos 0,01 UI/mL; obtendo assim as células derivadas de MSC; (b) passar as células derivadas de MSC por um primeiro período tempo e ainda cultivar as células derivadas de MSC em um meio conforme definido em

(a); (c) passar as células derivadas de MSC por um segundo período de tempo e ainda cultivar as células derivadas de MSC em um meio conforme definido em (a), obtendo assim as células derivadas de MSC de linhagem condro-osteoblástica; (d) ressuspender as células derivadas de MSC de linhagem condro- osteoblástica em um meio de criopreservação adequado para a administração a um sujeito; e (e) criopreservar as células derivadas de MSC de linhagem condro- osteoblástica.

[0251] Declaração 9. O método de acordo com a declaração 8, em que as células derivadas de MSC de linhagem condro-osteoblástica são ressuspensas no meio de criopreservação na etapa (d) a uma concentração entre cerca de 1 x 107/mL e cerca de 1 x 108/mL, preferencialmente a uma concentração entre cerca de 2 x 107/mL e cerca de 4 x 107/mL.

[0252] Declaração 10. O método de acordo com a declaração 8 ou 9, em que o meio de criopreservação compreende dimetilsulfóxido (DMSO), albumina de soro humano (HSA), adenosina, polipeptídeo, benzopirano, ou uma combinação dos mesmos.

[0253] Declaração 11. O método de acordo com qualquer uma das declarações 1 a 10, em que TGFβ é selecionado a partir do grupo que consiste em TGFβ1, TGFβ2, TGFβ3, e misturas dos mesmos; preferencialmente em que TGFβ é TGFβ1.

[0254] Declaração 12. O método de acordo com qualquer uma das declarações 1 a 11, em que: - a concentração de heparina ou derivado ou análogo da mesma é cerca de 0,1 UI/mL; e/ou - heparina ou derivado de heparina ou análogo da mesma é selecionado a partir do grupo que consiste em heparina não fracionada (UFH); heparina de baixo peso molecular (LMWH), como enoxaparina, dalteparina,

nadroparina, tinzaparina, certoparina, reviparina, ardeparina, parnaparina, bemiparina, ou misturas das mesmas; um heparinoide, como sulfato de heparano, sulfato de dermatano, sulfato de condroitina, sulfato de acarano, sulfato de queratano, ou misturas dos mesmos, como danaparoide; um sal de heparina; um sal de heparinoide; um fragmento de heparina; um fragmento de heparinoide; e misturas dos mesmos.

[0255] Declaração 13. O método de acordo com qualquer uma das declarações 1 a 12, em que as MSC ou células derivadas de MSC são adicionalmente colocadas em contato com o meio em que adicionalmente compreende um ou mais dentre plasma, soro ou um substituto dos mesmos.

[0256] Declaração 14. O método de acordo com qualquer uma das declarações 1 a 13, em que o sujeito é um sujeito humano.

[0257] Declaração 15. Uma população de células derivadas de MSC de linhagem condro-osteoblástica que pode ser obtida ou é obtida pelos métodos conforme definidos em qualquer uma das declarações 1 a 14.

[0258] Declaração 16. Uma população de células derivadas de MSC de linhagem condro-osteoblástica que pode ser obtida ou é obtida por expansão in vitro ou ex vivo de MSC, através da qual pelo menos 90% das células derivadas de MSC de linhagem condro-osteoblástica em suspensão têm um diâmetro igual ou menor que 25 µm (D90 ≤ 25 µm) e em que no máximo 1% das células derivadas de MSC de linhagem condro-osteoblástica em suspensão têm um diâmetro maior que 35 µM.

[0259] Declaração 17. A população de células derivadas de MSC de linhagem condro-osteoblástica de acordo com a declaração 16, em que as células derivadas de MSC de linhagem condro-osteoblástica podem ser obtidas ou são obtidas pelos métodos conforme definidos em qualquer uma das declarações 1 a 14.

[0260] Declaração 18. Uma formulação farmacêutica que compreende a população de células derivadas de MSC de linhagem condro-osteoblástica, conforme definido em qualquer uma das declarações 15 a 17.

[0261] Declaração 19. A formulação farmacêutica de acordo com a declaração 18, em que a formulação farmacêutica compreende ainda um componente com propriedades osteocondutoras, como fosfato tricálcico, hidroxiapatita, combinação de partículas de hidroxiapatita/fosfato tricálcico, ácido poliláctico, poli(ácido láctico-glicólico), ácido hialurônico ou um derivado do mesmo, quitosana, poli-L-lisina, gelatina, colágeno, osteonectina, fibrinogênio, osteocalcina, ou uma combinação dos mesmos.

[0262] Declaração 20. A população de células derivadas de MSC de linhagem condro-osteoblástica, de acordo com qualquer uma das declarações 15 a 17, ou a formulação farmacêutica de acordo com a reivindicação 18 ou 19, para uso como um medicamento, preferencialmente para uso no tratamento de um sujeito com necessidade de transplante de células de linhagem condro- osteoblástica.

[0263] Declaração 21. A população ou a formulação farmacêutica para uso de acordo com a declaração 20, em que: - as células derivadas de MSC de linhagem condro-osteoblástica estão presentes a uma concentração entre cerca de 1 x 107/mL e cerca de 1 x 108/mL, preferencialmente entre cerca de 2 x 107/mL e a cerca de 4 x 107 células/mL; e/ou - a população de células derivadas de MSC de linhagem condro- osteoblástica ou a formulação farmacêutica é adequada para a administração percutânea, intraóssea, intra-articular, intervertebral ou intravascular; - a população de células derivadas de MSC de linhagem condro- osteoblástica ou a formulação farmacêutica é adequada para a administração em um local de um defeito ósseo.

[0264] Embora a invenção tenha sido descrita em conjunto com realizações específicas da mesma, é evidente que muitas alternativas, modificações e variações serão aparentes para o técnico no assunto em vista da descrição acima. Consequentemente, pretende-se adotar todas essas alternativas, modificações e variações como a seguir no espírito e no amplo escopo das reivindicações anexas.

[0265] Os aspectos e realizações da invenção divulgados no presente pedido são ainda apoiados pelos seguintes exemplos não limitantes. Exemplos Exemplo 1 Método para Obter Células Derivadas de MSC de Linhagem Condro- Osteoblástica de Acordo com Uma Realização da Invenção

[0266] Foi usado meio de cultura convencional suplementado com 5% de OctaPlasLG® (Octapharma), 0,1 UI/mL de heparina (Leo Pharma), FGF-b (CellGenix) e TGFβ-1 (Humanzyme) como o meio de cultura média.

[0267] 20 a 60 mL de aspirados de medula óssea (BM) humana foram obtidos a partir da crista ilíaca de doadores voluntários saudáveis. Após a coleta, os glóbulos brancos da medula óssea foram contados, semeados a uma densidade de 50.000 células/cm2 no meio de cultura, e incubados a 37 ºC em uma incubadora umidificada contendo 5% de CO2. Em 4 dias após a semeadura, as células não aderentes foram removidas e o meio foi renovado com meio de cultura. Em 7 dias e 11 dias após a semeadura, metade do meio de cultura foi removido e substituído por um novo para renovar os fatores de crescimento. As células foram cultivadas durante a cultura primária por 14 dias. No dia 14, as células foram coletadas por destacamento com Trypzean (Lonza) e por agitação e pipetagem para cima e para baixo (passagem 1: P1). As células intermediárias foram criopreservadas (em CryoStor® CS10) e armazenadas em nitrogênio líquido. Cada estoque celular foi distribuído a partir de um doador, sem nenhum agrupamento (pooling) entre os doadores.

[0268] Em seguida, as células intermediárias foram descongeladas e replaqueadas para cultura secundária a uma densidade de 572 células/cm². As células foram cultivadas durante a cultura secundária por 10 dias. No dia 24, as células foram coletadas por destacamento com Trypzean (Lonza) e por agitação e pipetagem para cima e para baixo (passagem 2: P2). As células intermediárias foram criopreservadas (em CryoStor® CS10) e armazenadas em nitrogênio líquido.

[0269] Subsequentemente, as células intermediárias foram descongeladas e replaqueadas para cultura terciária a uma densidade de 572 células/cm². As células foram cultivadas durante a cultura terciária por 10 dias. No dia 34, as células foram coletadas por destacamento com Trypzean (Lonza) e por agitação e pipetagem para cima e para baixo (passagem 3: P3). Para obter o produto celular final, as células foram ressuspensas em OctaPlasLG ® a uma concentração final de 25 x 106 células/mL. Este produto celular será citado no presente pedido como “produto celular C - fresco”.

[0270] No final da cultura terciária, as células foram criopreservados por longo período de armazenamento. Além disso, as células foram ressuspensas em meio de criopreservação para alcançar a concentração desejada (25 x 10 6 células/mL). A suspensão celular foi, em seguida, transferidas para criotubos que foram armazenados em nitrogênio líquido. Este produto celular será citado no presente como “produto celular C - crio” ou “células de formação óssea C crio(preservadas)”, também abreviado como “células C B-F”. O meio de criopreservação foi: - CryoStor® CS10 (BioLife Solutions Inc.), ou - 50% (v/v) CryoStor® CS10 (BioLife Solutions Inc.) e 50% (v/v) de albumina de soro humano (Octapharma), ou - 95% (v/v) CryoStor® CS10 (BioLife Solutions Inc.) e 5% (v/v) de albumina de soro humano (Octapharma), ou - 80% (v/v) de Hipotermosol® (BioLife Solutions Inc.), 10% (v/v) de DMSO e 10% (v/v) de albumina de soro humano (Octapharma). Exemplo Comparativo 1 Métodos da Técnica Anterior para Obter Células-tronco Mesenquimais e Células Derivadas de MSC

[0271] Produtos celulares comparativos de acordo com a técnica anterior e os seus métodos de produção são descritos abaixo.

Células-tronco Mesenquimais

[0272] MSC indiferenciadas foram preparadas pela obtenção de aspirados de medula óssea humana (BM) da crista ilíaca de doadores voluntários saudáveis. Após a coleta, os glóbulos brancos da medula óssea foram contados, semeados a uma densidade de 50.000 células/cm 2 em um meio de cultura convencional, e incubados a 37 ºC em uma incubadora umidificada contendo 5% de CO2. Após 24 h, o meio de cultura foi removido e foi adicionado meio de cultura celular fresco. O meio de cultura foi substituído a cada 2 a 3 dias. Quando mais da metade das colônias alcançaram uma confluência de 80% ou quando algumas colônias alcançaram uma confluência de 100%, as células foram coletadas (passagem 1: P1). Nesta primeira passagem, as células foram diretamente criopreservadas em CryoStor® CS10 (BioLife Solutions Inc.). Para concluir o processo de cultura, as MSCs foram descongelados, plaqueadas a 572 células/cm² para a segunda cultura, e cultivadas. As células foram coletadas quando mais da metade das colônias alcançaram uma confluência de 80% ou quando algumas colônias alcançaram uma confluência de 100% para obter as MSCs na passagem 2 (P2). Este produto celular é citado no presente pedido como “MSC”. Produto Celular A

[0273] Foi usado meio de cultura convencional suplementado com 5% de Octaserum (50:50 soro autólogo e OctaPlasLG® (Octapharma)), FGF-b (CellGenix) e TGFβ-1 (Humanzyme) como o meio de cultura.

[0274] Meio de congelamento: 80% de meio de cultura convencional, 10% de Octaserum (50:50 soro autólogo e OctaPlasLG® (Octapharma)), 10% de DMSO.

[0275] As células derivadas de MSC diferenciadas in vitro citada no presente como “produto Celular A” foram preparadas pela obtenção de aspirados de BM humana da crista ilíaca de doadores voluntários saudáveis. Após a coleta, os glóbulos brancos da medula óssea foram contados, semeados a uma densidade de 50.000 células/cm2 no meio de cultura, e incubados a 37 ºC em uma incubadora umidificada contendo 5% de CO2. Em 4 dias após a semeadura, as células não aderentes foram removidas e o meio foi renovado com meio de cultura. Em 7 dias e 11 dias após a semeadura, metade do meio de cultura foi removido e substituído por um novo. As células foram cultivadas durante a cultura primária por 14 dias. No dia 14, as células foram coletadas por destacamento com Trypzean (Lonza) e por agitação e pipetagem para cima e para baixo (passagem 1: P1). As células intermediárias foram criopreservados em CryoStor® CS10 (BioLife Solutions Inc.) ou meio de congelamento e armazenadas em nitrogênio líquido.

[0276] Para a cultura secundária, as células foram descongeladas e replaqueadas a uma densidade de 1144 células/cm². As células foram cultivadas durante a cultura secundária por 14 dias. No dia 28, as células foram coletadas por destacamento com Trypzean (Lonza) e por agitação e pipetagem para cima e para baixo (passagem 2: P2). Para obter o produto celular final, as células foram ressuspensas em OctaPlasLG® a uma concentração final de 25 x 106 células/mL. Este produto celular é citado no presente pedido como “Produto celular A”. Produto Celular B

[0277] Foi usado meio de cultura convencional suplementado com 5% de OctaPlasLG® (Octapharma), 0,1 UI/mL de heparina (Leo Pharma), FGF-b (CellGenix) e TGFβ-1 (Humanzyme) como o meio de cultura média.

[0278] As células derivadas de MSC diferenciadas in vitro foram preparadas pela obtenção de aspirados de BM humana da crista ilíaca de doadores voluntários saudáveis. Após a coleta, os glóbulos brancos da medula óssea foram contados, semeados a uma densidade de 50.000 células/cm 2 no meio de cultura, e incubados a 37 ºC em uma incubadora umidificada contendo 5% de CO2. Em quatro dias após a semeadura, as células não aderentes foram removidas e o meio foi renovado com meio de cultura. Em sete dias e onze dias após a semeadura, metade do meio de cultura foi removido e substituído por um novo para renovar os fatores de crescimento. As células foram cultivadas durante a cultura primária por 14 dias. No dia 14, as células foram coletadas por destacamento com Trypzean (Lonza) e por agitação e pipetagem para cima e para baixo (passagem 1: P1). As células intermediárias foram criopreservadas em CryoStor® CS10 (BioLife Solutions Inc.) e armazenadas em nitrogênio líquido.

[0279] Em seguida, as células intermediárias foram descongeladas e replaqueadas para cultura secundária a uma densidade de 286 células/cm². As células foram cultivadas durante a cultura secundária por 14 dias. No dia 28, as células foram coletadas por destacamento com Trypzean (Lonza) e por agitação e pipetagem para cima e para baixo (passagem 2: P2). Para obter o produto celular final, as células foram ressuspensas em OctaPlasLG ® a uma concentração final de 25 x 106 células/mL. Este produto celular é citado no presente pedido como “Produto celular B”. Exemplo 2 Caracterização Celular In Vitro de Células Derivadas de MSC de Linhagem Condro-osteoblástica Obtidas pelos Métodos de Acordo com as Realizações da Invenção, e de MSCs e Células Derivadas de MSC Obtidas pelos Métodos da Técnica Anterior Materiais e Métodos Células

[0280] Os produtos celulares que ilustram a invenção (isto é, produto celular C fresco e produtos celulares C crio) foram obtidos conforme descrito no Exemplo 1. Os produtos celulares comparativos (isto é, MSC, produto celular A e produto celular B) foram obtidas conforme descrito no Exemplo Comparativo

1. Contagem de Células e Viabilidade

[0281] A densidade celular e viabilidade foram determinadas com o uso de um ensaio de exclusão com azul de tripano. Após coleta, as células foram diluídas 1:2 com Azul de Tripano (0,4%, Lonza BioWhittaker®) e a viabilidade celular foi analisada com o uso de uma câmara Bürker (Sigma-Aldrich®) e um microscópio invertido (AE31, Motic®). A viabilidade celular também foi analisada por citometria de fluxo com o uso de Amino-Actinomycin D (7-AAD, BD Biosciences®), os softwares BD FACSCanto II™ e BD FACSDiva™ (Becton Dickinson®). Após a coleta, 50.000 células foram incubadas no escuro durante 10 min à temperatura ambiente em PBS-albumina de soro bovino (BSA) 1% (Lonza BioWhittaker®) com 2,5 µL de 7-AAD. Citometria de Fluxo

[0282] Produtos celulares comparativos (isto é, MSC e células derivadas de MSC: produtos celulares A e B) e produtos celulares que ilustram a invenção (isto é, as células derivadas de MSC de linhagem condro- osteoblástica: produtos celulares C) obtidos conforme descrito no Exemplo Comparativo e 1 Exemplo 1 acima, foram coletados e os marcadores de superfície celular foram analisados por citometria de fluxo (softwares BD FACSCanto™ II e BD FACSDiva™; Becton Dickinson). As células foram incubadas com os seguintes anticorpos monoclonais: anti-CD73, anti-CD90, anti-CD105 e anti-CD166 (que são marcadores mesenquimais, e devem ser altamente, expressos pelas MSC ou células derivadas de MSC), anti-CD3, anti- CD34 e anti-CD45 (que são marcadores hematopoieticos, e devem estar substancialmente ausentes nas MSC ou células derivadas de MSC), anti-CD44, anti-CD51/61, anti-CD49a-e, anti-CD29 (que são marcadores de adesão), anti- CD40, anti-CD86 e anti-HLA-DR (que são marcadores de imunogenicidade) e fosfatase alcalina (ALP) por 15 min à temperatura ambiente, e então lavadas com PBS antes da centrifugação e ressuspensão em 0,3 mL de PBS.

[0283] Para a caracterização de marcadores de superfície celular CD105, CD73, CD10 e CD44, 5 x 104 células a uma concentração de 1 x 106células/mL em PBS - BSA 1% foram incubadas 10 min no escuro com 5 µL de anticorpos. Após esse tempo de incubação, as células foram lavadas uma vez com PBS. Os diferentes anticorpos usados para a coloração extracelular são os seguintes: anticorpos conjugados com aloficocianina (APC) contra CD105 (BD Biosciences®, cat nº: 562408), CD73 (BD Biosciences®, Cat nº: 560847),

anticorpos conjugados com Ficoeritrina (PE) contra CD10 (BD Biosciences ®, Cat nº: 555375), CD44 (BD Biosciences®, Cat nº: 550989). A coloração não específica foi determinada incubando células com imunoglobulina G (IgG) de controle conjugada com FITC, APC e PE (todos da BD Biosciences ®, Cat nº: 556649; 555751; 556650 respectivamente). Antes da análise, foi realizado o gating de singuletos e da população de interesse.

A análise de citometria de fluxo foi realizada em 1 x 104eventos da população aprisionada (gated) com o uso dos softwares FACS CantoII (BD Biosciences®) e FACS Diva® 8.0 (BD Biosciences®). As configurações de parâmetros usados para a análise foram realizadas automaticamente com microesferas (BD CompBeads Plus®, Cat nº 560497). Para cada conjugado, o corte de positividade foi fixado em 1% da positividade do anticorpo controle de isotipo e a positividade de cada marcador foi determinada.

A mediana de intensidade de fluorescência (MFI) de toda a população analisada também foi determinada e dividida pela MFI do anticorpo controle de isotipo correspondente para obter a MFI normalizada (nMFI). Tabela 1 Visão Geral de Fornecedores e Números de Catálogos de Anticorpos Usados nos Exemplos Anticorpo Fornecedor Número de catálogo Anti-ALP BD Biosciences 561433 Anti-CD166 BD Biosciences 560903 Anti-CD3 BD Biosciences 555340 Anti-CD34 BD Biosciences 555824 Anti-CD40 BD Biosciences 555588 Anti-CD44 BD Biosciences 550989 Anti-CD45 BD Biosciences 555485 Anti-CD49a BD Biosciences 559596 Anti-CD49b BD Biosciences 555669 Anti-CD49c BD Biosciences 556025 Anti-CD49d BD Biosciences 555503

Anticorpo Fornecedor Número de catálogo Anti-CD49e BD Biosciences 555617 Anti-CD51/61 BD Biosciences 550037 Anti-CD73 BD Biosciences 561254 Anti-CD29 BD Biosciences 556048 Anti-CD86 BD Biosciences 555660 Anti-CD90 R&D System FAB7335P Anti-HLA-DR BD Biosciences 555558 Anti-CD105 BD Biosciences 562408 Anti-CD10 BD Biosciences 555375 Anti-HLA-DR-DP-DQ BD Biosciences 555558 Anti-HLA-ABC BD Biosciences 555552 Medição de Atividade Enzimática de Alp

[0284] A atividade enzimática de ALP foi medida por um ensaio bioquímico baseado na hidrólise do p-nitrofenil fosfato (pNPP). Depois de ser desfosforilado pela ALP, o pNPP torna-se amarelo e pode ser detectado por um espectrofotômetro a 410 nm. A atividade enzimática de ALP das células é determinada em relação a uma curva padrão baseada na atividade de ALP intestinal de bezerro purificada. A atividade de ALP é relatada em Unidade de ALP/mg de proteína. Uma unidade de ALP hidrolisa 1 µmol de pNPP em 1 minuto a 37ºC. Transcrição Reversa-Reação em Cadeia da Polimerase Quantitativa (RT- qPCR)

[0285] Após coleta, as células foram armazenadas a -80ºC como péletes secos (500.000 células) até a extração de RNA. Os RNAs totais foram extraídos com o uso do Mini kit RNeasy® (Qiagen®), de acordo com as instruções do fabricante. A concentração de RNA foi medida com o uso de DropSense® 16 (Trinean®). A transcrição reversa de RNA (RT) foi realizada a partir de 1 µg de extratos totais de RNA, com o uso do kit de reagentes PrimeScript ® RT (Takara®),

de acordo com as instruções do fabricante. qPCRs foram realizadas com o uso de Premix Ex Taq® (Takara®) Premix Ex Taq® (Takara®) a partir de 2 µL de cDNA, seguindo as instruções do fabricante.

Foram quantificados os níveis de expressão dos seguintes genes de interesse: Foram quantificados os níveis de expressão dos seguintes genes de interesse: RUNX2 (Forward: GGTTCCAGCAGGTAGCTGAG (SEQ ID NO: 1), Reverso: AGACACCAAACTCCACAGCC (SEQ ID NO: 2)), SOX9 (F:TAAAGGCAACTCGTACCCAA (SEQ ID NO: 3), R: ATTCTCCATCATCCTCCACG (SEQ ID NO: 4), BMP2 (F:GGAACGGACATTCGGTCCTT (SEQ ID NO: 5), R:CACCATGGTCGACCTTTAGGA (SEQ ID NO: 6)), ALPL (F:ACCATTCCCACGTCTTCACATTTG (SEQ ID NO: 7), R: AGACATTCTCTCGTTCACCGCC (SEQ ID NO: 8)), MMP13 (F:TGGAATTAAGGAGCATGGCGA (SEQ ID NO: 9), R: AACTCATGCGCAGCAACAAG (SEQ ID NO: 10)), CHI3L1(F:TGGGTCTCAAAGATTTTCCAAGA (SEQ ID NO: 11), R: GCTGTTTGTCTCTCCGTCCA (SEQ ID NO: 12)), DCN (F:AAAATGCCCAAAACTCTTCAGG (SEQ ID NO: 13), R:GCCCCATTTTCAATTCCTGAG (SEQ ID NO: 14)), OCN (F:AAGGTGCAGCCTTTGTGT (SEQ ID NO: 15), R:GCTCCCAGCCATTGATACAG (SEQ ID NO: 16)), SPON1 (F:CCTGCGGAACTGCCAAGTA(SEQ ID NO: 17), R:CACGGGTGAGCCCAATTCT (SEQ ID NO: 18)), POSTN (F:TTTGGGCACCAAAAAGAAAT (SEQ ID NO: 19), R:TTCTCATATAACCAGGGCAACA (SEQ ID NO: 20)). qPCRs foram executadas em duplicatas com o uso de um LightCycler ® 480 (Roche®). A normalização foi realizada com o uso da média geométrica obtida de três genes housekeeping: RPL13A (F:CATAGGAAGCTGGGAGCAAG (SEQ ID NO: 21), R:GCCCTCCAATCAGTCTTCTG (SEQ ID NO: 22)), TBP (F:AACAACAGCCTGCCACCTTA (SEQ ID NO: 23),

R:GCCATAAGGCATCATTGGAC (SEQ ID NO: 24)), HPRT (F:CCCTGGCGTCGTGATTAGT (SEQ ID NO: 25), R: GTGATGGCCTCCCATCTCCTT (SEQ ID NO: 26)). A comparação entre as diferentes células derivadas de MSC dos mesmos doadores foi realizada calculando a expressão gênica (razão relativa (fold change)) com o uso do método 2-∆∆Ct para cada gene de interesse (Schmittgen e Livak, 2008, 3(6), 1101-8; Nature Protocols, 3(6), 1101– 1108).

[0286] A análise estatística foi realizada com o uso do software JMP ® (13.1.0). Os dados de RT-qPCR expressos na razão de mudança foram transformados em log e os testes de Student (com α = 0,05) foram realizados para avaliar a significância estatística das diferenças observadas entre os tipos celulares. A significância estatística foi representada graficamente, dependendo do valor-p (p) obtido: * para p < 0,05, ** para p < 0,01 e *** para p < 0,001. Ensaio Multiplex

[0287] Após coleta, as células foram plaqueadas a uma densidade de

50.000 células/cm². Após 48 horas de incubação a 37ºC C em uma atmosfera umidificada contendo 5% de CO2, os sobrenadantes da cultura celular foram coletados, centrifugados (5 min a 1500 rpm em temperatura ambiente) e armazenados a -80ºC. Os sobrenadantes foram analisados pelo ensaio Luminex® com o uso dos Ensaios Human Magnetic Luminex® (R&D System®). O Multiplex pré-misturado foi feito sob encomenda (R&D System ®). Foram investigados os seguintes fatores secretados: BMP-2, COL1A1, MMP13, OPN, OPG, SPARC, RANKL, CHI3L1. O ensaio foi realizado seguindo as instruções do fabricante e as análises foram realizadas com o uso do Sistema MAGPIX ® (R&D System®) e do Software Bio-Plex Manager 5.0TM (Bio-Rad®). Medição do Tamanho Celular

[0288] Produtos celulares comparativos (isto é, MSC e células derivadas de MSC: produtos celulares A e B) e produtos celulares que ilustram a invenção (isto é, as células derivadas de MSC de linhagem condro- osteoblástica: produtos celulares C) obtidos conforme descrito no Exemplo

Comparativo 1 e Exemplo 1, foram coletados e suspensos em PBS com azul de tripano 0,4% a uma densidade celular de 12,5 x 10 6 células/mL. Dez µL da suspensão celular foram colocados em uma lâmina graduada (Motic ®) e então protegidos por uma lamínula a ser colocada em um microscópio invertido com ampliação de 40X (AE31; Motic). As imagens obtidas com uma câmera (Moticam, Motic ®) colocada no microscópio foram analisadas pelo software Motic Image Plus ® 2.02 para medir os diâmetros celulares. Pelo menos 100 células foram medidas para considerar a análise estatisticamente significativa.

[0289] O tamanho das células obtidas em diferentes momentos da cultura ex vivo também foi analisado por citometria de fluxo (BD FACSCanto™ II e o software BD FACSDiva™; Becton Dickinson). Brevemente, nos dias 21, 23, 26 e 28, após o início da cultura celular ex vivo, conforme descrito na Exemplo 1 ou Exemplo Comparativo 1, as células foram coletadas, suspensas em solução salina tamponada com fosfato (PBS) a uma densidade celular de 1 x 10 6 células/mL e analisadas com o citômetro de fluxo para a medição de dispersão de luz anterior (FSC) (expressa em unidade de fluorescência relativa). A dispersão anterior mede a luz dispersa na direção do caminho do laser e, portanto, fornece um tamanho relativo para as células que passam pela câmara de fluxo. Resultados Rendimentos de Cultura

[0290] O método que ilustra a invenção aumentou significativamente a disponibilidade de células alogênicas (isto é, o número de células obtidas a partir de uma doação de medula óssea) para uso clínico, já que os rendimentos totais de cultura aumentaram drasticamente (Tabela 2, produto celular C fresco versus produtos A e B). Tabela 2 Respectivos Rendimentos de Cultura de Produtos Celulares Comparativos (isto é, Produto Celular A, Produto Celular B) e Produtos

Celulares que Ilustram a Invenção (isto é, Produtos Celulares C) Produto celular Produto celular Produto celular C A B fresco Rendimento de 63 ± 168% (n = 139 ± 91% (n = 212 ± 74% (n = 6) cultura primária 93) 57) Rendimento de cultura secundária

1.656 ± 1.126% 25.254 ± 7.547% 17.837 ± 5.973% (n (primeira (n = 183) (n = 41) = 6) passagem no Dia 14) Rendimento da 10,641% ± 4,295(n =

NA NA cultura terciária 6)

46.768 ±

1.068 ± 2.353% 5.145.960 ± Rendimento total* 33.201% (n = (n = 183) 6.103.554% (n = 6) 41) PDL cumulativo (teórico) (a partir de D0 até o final 16 ± 2 22 ± 2 28 ± 1 do processo de produção) Média ± DP, levando em conta a variabilidade entre os lotes, incluindo a variabilidade devido ao efeito de doador (variabilidade entre os materiais de partida de medula óssea); PDL: O nível de duplicação da população é o número de células que foi duplicado ao longo do tempo; * O rendimento total leva em conta o acúmulo de rendimentos de culturas de todas as culturas sucessivas (a partir do plaqueamento celular no Dia 0 até o final do processo de produção e geração das células derivadas de MSC); NA: não disponível Perfil de Expressão de Marcador Celular

[0291] A análise de citometria de fluxo revelou que a identidade celular geral, em peso, com base nos perfis de expressão de marcador de superfície celular do produto celular A, produto celular B (gerados com os métodos comparativos de acordo com a técnica anterior), e os produtos celulares C, com ou sem a criopreservação final (gerados com um método que ilustra a invenção) foram comparáveis.

[0292] Todas eles expressaram os marcadores mesenquimais CD73, CD90 e CD105 e não expressaram os marcadores hematopoiéticos CD45, CD34 e CD3 (menos de 5% da população celular expressou esses marcadores) (Tabela 3). O produto celular B e os produtos celulares C (com ou sem a criopreservação final) (i) expressaram níveis baixos de receptor de superfície celular de MHC classe II, como o HLA-DR e (ii) expressaram altamente ALP (Tabelas 3 e 4). A fraca imunogenicidade representada pela fraca expressão de HLA-DR permite vantajosamente o transplante de células, por exemplo, para sujeitos alogênicos (Tabela 3). Além disso, o produto celular A, o produto celular B e os produtos celulares C (com ou sem criopreservação final) expressaram altamente o marcador de adesão CD49e e a enzima ALP em sua superfície, em comparação com o as MSCs indiferenciadas (Tabelas 3 e 4). A alta expressão de ALP destaca o comprometimento do produto celular A, produto celular B e dos produtos celulares C (com ou sem criopreservação final) para a linhagem osteoblástica. Tabela 3 Perfil de Expressão de Marcador de Superfície Celular de Produtos Celulares Comparativos (isto é, MSC, Produto Celular A, Produto Celular B) e Produtos Celulares que Ilustram a Invenção (isto é, Produtos Celulares C) Produto celular C criopreservado Expressão de Produto CS10 Produto Produto HTS 10% de marcador (em Estatísticas MSCs celular C diluído CS10 5% celular A celular B CS10 DMSO 10% de %) fresco em HSA de HSA

HSA 1:1 Média 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 CD73-APC Desvio 0,0 0,0 0,0 0,1 0,0 0,0 0,0 0,0

Produto celular C criopreservado Expressão de Produto CS10 Produto Produto HTS 10% de marcador (em Estatísticas MSCs celular C diluído CS10 5% celular A celular B CS10 DMSO 10% de %) fresco em HSA de HSA

HSA 1:1 Padrão N 6 11 22 15 10 2 3 3 Média 100,0 99,9 99,9 99,7 99,9 99,5 99,9 99,8 Desvio CD90-PE 0,1 0,2 0,2 0,6 0,2 0,7 0,2 0,4 Padrão N 8 12 22 18 10 2 3 3 Média 100,0 99,8 100,0 99,9 100,0 100,0 100,0 100,0 Desvio CD105-APC 0,0 0,5 0,1 0,3 0,0 0,0 0,0 0,0 Padrão N 8 12 20 18 10 2 3 3 Média 1,3 1,0 0,9 0,6 1,0 Desvio ND ND ND CD45-FITC 0,7 0,3 0,0 0,3 0,1 Padrão N 0 0 0 16 10 2 3 3 Média 0,4 0,3 1,0 Desvio ND ND ND ND ND CD45-APC 0,2 0,2 2,9 Padrão N 8 12 19 0 0 0 0 0 Média 0,6 1,0 1,6 2,1 1,6 2,8 3,3 1,5 Desvio CD34-APC 0,4 0,6 1,8 1,6 0,9 2,2 2,2 1,0 Padrão N 8 12 22 16 10 2 3 3 Média 0,2 0,1 0,2 0,0 0,1 0,1 0,0 0,0 Desvio CD3-PE 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 Padrão N 6 10 17 16 10 1 3 3 Média 0,7 1,0 1,8 1,6 0,9 1,4 1,4 1,4 Desvio HLA-DR-PE 1,2 0,6 2,0 1,8 0,7 0,8 0,8 0,9 Padrão N 8 12 22 16 10 2 3 3 Média 1,0 1,6 1,6 2,0 1,5 1,8 1,8 1,6 HLA- Desvio DR/DP/DQ- 0,4 1,1 1,1 1,6 0,7 0,6 0,8 0,2 Padrão

FITC N 8 12 22 16 10 2 3 3

HSA 1:1 Média 40,7 88,7 94,8 96,2 96,2 97,7 98,7 98,4 Desvio ALP-PE 5,6 6,6 4,4 3,6 2,0 0,9 1,7 Padrão N 1 5 10 18 10 3 2 3 Média 92,7 99,6 99,8 99,9 100,0 99,9 99,8 99,9 Desvio CD49e-PE 20,5 1,1 0,5 0,4 0,1 0,2 0,4 0,2 Padrão N 8 12 19 18 10 3 2 3 Média 99,9 99,7 100,0 100,0 100,0 100,0 99,9 100,0 Desvio CD44-PE 0,2 0,5 0,0 0,1 0,0 0,1 0,2 0,1 Padrão N 8 12 22 18 10 3 2 3 Média 19,6 99,6 98,8 99,3 99,5 99,3 99,1 98,9 Desvio CD10-PE 14 0,4 1,5 16 0,5 0,6 0,4 0,7 Padrão N 10 12 25 16 10 2 3 3 Abreviações: ALP: fosfatase alcalina; APC: aloficocianina; FITC: isotiocianato de fluoresceína; HLA-DR: antígeno leucocitário humano - isotipo DR; HLA-DR/DP/DQ: antígeno leucocitário humano - DR/DP/DQ isotipos; MSC: células-tronco mesenquimais; ND: não determinado; PE: ficoeritrina; DP: desvio padrão Tabela 4 Níveis de Expressão de ALP de Produtos Celulares Comparativos (isto é, MSC, Produto Celular A, Produto Celular B) e Produtos Celulares que

Ilustram a Invenção (isto é, Produtos Celulares C) Produto celular C de criopreservação (também citado como produto celular C criopreservado) Produto Produto Produto CS10 Estatística MSCs celular C HTS 10% de celular A celular B diluído CS10 5% fresco CS10 DMSO 10% de em HSA de HSA

HSA 1:1 Média 40,7 88,7 94,8 96,2 96,2 98,7 97,7 98,4 Positividade da Desvio População ALP- 5,6 6,6 4,4 3,6 0,9 2,0 1,7 Padrão PE (%) N 1 5 10 18 10 2 3 3 Nível de Média 2,4 19,8 56,1 60,3 38,0 57,7 42,7 41,2 Expressão de Desvio Superfície 10,8 27,4 38,9 24,2 43,1 37,2 31,3 Padrão Celular ALP-PE N 1 5 10 18 10 2 3 3 (nMFI) Média 176,3 671,9 874,7 895,5 801,5 719,9 633,6 Atividade

ND Enzimática de Desvio 252,9 305,8 772,9 387,3 351,3 277,0 263,9 ALP (mU/mg de Padrão proteína total) N 3 9 26 12 5 0 2 2 Abreviações: ALP: fosfatase alcalina; ND: não determinado; PE: ficoeritrina

[0293] O perfil de expressão do marcador de superfície celular não se caracterizou somente pela presença de marcadores na superfície celular (porcentagem de positividade de população), mas também analisando a quantidade de marcadores expressos na superfície celular (mediana normalizada de fluorescência da população) de diferentes marcadores. Estas análises destacaram algumas diferenças entre as diferentes células derivadas de MSC.

[0294] O produto celular B e os produtos celulares C (com ou sem criopreservação final) cultivados na presença de heparina expressaram nível mais alto de ALP que as MSCs e que o produto celular A cultivado na ausência de heparina (resultados nMFI ALP-PE), reforçando os seus comprometimentos para a linhagem osteoblástica de células de formação óssea.

[0295] A expressão dos marcadores mesenquimais CD73 e CD105 na superfície celular também foi dependente dos tipos celulares. Os produtos celulares gerados na presença de heparina (produto celular B e os produtos celulares C, com ou sem criopreservação final) expressaram nível mais alto de CD73 e CD105 que o produto celular A. Além disso, os produtos celulares C pareceram possuir mais CD73 e CD105 em suas superfícies que o produto celular B, especialmente quando o produto celular C não foi submetido a uma criopreservação final (Tabela 5). Os produtos celulares diferenciados A, B e C expressam quantidade mais alta de marcador celular CD10 que as MSC indiferenciadas. Além disso, os produtos celulares C possuem mais CD10 em sua superfície que os produtos celulares A e B (Tabela 5).

[0296] A análise de citometria de fluxo nMFI revelou que as expressões de proteínas CD73 e CD44 foram mais elevadas no produto celular C que em outros tipos de células (Figura 1). Tabela 5 Resultados Adicionais de Expressão de Marcador de Superfície Celular de Produtos Celulares (isto é, MSC, Produto Celular A, Produto Celular B) e Produtos Celulares que Ilustram a Invenção (isto é, Produtos Celulares C) Produto celular C de criopreservação (também Expressão Produto citado como produto celular C criopreservado) Produto Produto de marcador Estatística MSCs celular C CS10 HTS 10% de celular A celular B CS10 5% (em nMFI) fresco CS10 diluído em DMSO 10% de de HSA HSA 1:1 HSA Média 2,4 19,8 56,1 60,3 38,0 57,7 42,7 41,2 Desvio ALP-PE / 10,8 27,4 38,9 24,2 43,1 37,2 31,3 Padrão N 1 5 10 18 10 2 3 3 Média 234,8 130,7 646,3 996,9 703,9 777,8 719,2 784,2 Desvio CD73-APC 84,3 80,1 138,8 181,1 150,0 73,3 90,6 47,3 Padrão N 6 11 22 15 10 2 3 3 Média 207,7 26,6 59,1 99,7 70,2 74,6 72,6 67,0 Desvio CD105-APC 67,6 15,2 13,1 27,0 13,1 2,3 4,2 3,9 Padrão N 8 12 20 18 10 2 3 3

Produto celular C de criopreservação (também Expressão Produto citado como produto celular C criopreservado) Produto Produto de marcador Estatística MSCs celular C CS10 HTS 10% de celular A celular B CS10 5% (em nMFI) fresco CS10 diluído em DMSO 10% de de HSA HSA 1:1 HSA Média 139,8 62,0 156,6 362,8 378,4 185,5 227,5 261,3 Desvio CD44-PE 57,5 19,1 40,7 250,4 205,3 19,6 80,1 147,7 Padrão N 8 12 22 18 10 2 3 3 Média 81,0 22,5 33,5 44,3 39,6 35,7 35,2 36,87 Desvio CD49e-PE 51,4 9,9 11,0 8,0 7,4 3,3 3,5 10,0 Padrão N 8 12 19 18 10 2 3 3 Média 26,1 21,6 80,2 115,7 104,7 71,5 79,5 70,1 HLA-ABC- Desvio / 5,2 17,4 22,0 24,9 27,2 22,1 18,0 FITC Padrão N 1 4 8 16 10 2 3 3 Média 0,8 36,2 32,2 64,0 59,3 63,8 64,1 57,9 Desvio CD10-PE 1,1 16,4 16,8 38,5 30,5 45,5 35,4 32,9 Padrão N 8 12 22 18 10 2 3 3 Abreviações: ALP: fosfatase alcalina; APC: aloficocianina; FITC: isotiocianato de fluoresceína; HLA-ABC: antígeno leucocitário humano ABC; HLA-DR: antígeno leucocitário humano - isotipo DR; MSC: células-tronco mesenquimais; NA: não disponível; ND: não determinado; PE: ficoeritrina; DP: desvio padrão RT-qPCR e Ensaio Multiplex

[0297] A análise revelou que o gene RUNX2 no produto celular C fresco foi significativamente (*) superexpresso, em comparação com as MSC, mas foi significativamente (*) infrarregulado em comparação com o produto celular B (Tabela 6a). O gene MMP13 no produto celular C fresco foi significativamente (*) suprarregulado, em comparação com as MSCs e o produto celular A, mas sua expressão permaneceu significativamente (*) mais alta no produto celular B (Tabela 6a).

[0298] Por outro lado, os genes SPARC e KI67 foram significativamente (**) infrarregulados no produto celular C fresco, em comparação com todos os outros tipos celulares (Tabela 6a). O gene PPARG foi igualmente expresso para o produto celular C fresco e MSC e significativamente (***) infrarregulado, em comparação com os produtos celulares A e B (Tabela 6a).

[0299] Além disso, os genes BMP2, SOX9, MMP13 e ALPL no produto celular C criopreservado foram significativamente superexpressos, em comparação com MSC (Tabela 6b), indicando seu engajamento na linhagem condro-osteogênica. Tabela 6a Perfil de Expressão Gênica de Produtos Celulares Comparativos (isto é, MSC, Produto Celular A, Produto Celular B) e os Produtos Celulares que Ilustram a Invenção (isto é, Produto Celular C Fresco) (Expresso em Razão Relativa (Fold Change) em Relação à Média de Valores de MSCs - A Significância Estatística Está Representado Graficamente Dependente do Valor-P (P) Obtido: * para p < 0,05 para, ** p < 0,01 , e *** para p < 0,001, NS: Estatisticamente Não Significativo) Produto Expressão Produto Produto Estatística MSC celular C gênica celular A celular B Fresco Média 1,000 0,367 1,080 1,336 CD73 SD 0,058 0,217 0,665 Marcadores N 1 3 5 16 mesenquimais Média 1,000 0,533 0,500 0,397 CD105 SD 0,115 0,100 0,033 N 1 3 5 4 Média 1,029 1,467 1,661 1,354 RUNX2 SD 0,287 0,274 0,425 0,364 N 7 9 28 16 Média 1,143 2,967 2,057 2,743 SOX9 SD 0,735 1,434 0,861 1,030 Genes mestres de N 7 9 28 16 diferenciação Média 1,186 6,922 3,086 0,696 PPARG SD 0,760 2,142 1,848 0,393 N 7 9 28 4 Média 1,471 49,833 63,586 63,081 ZNF521 SD 1,174 29,088 23,485 32,999

Produto Expressão Produto Produto Estatística MSC celular C gênica celular A celular B Fresco N 7 9 28 16 Média 1,000 0,000 0,000 0,018 DKK1 SD 0,000 0,000 0,004 N 1 3 5 4 Média 1,083 576,244 546,964 496,801 SPON1 SD 0,431 397,782 343,407 167,873 N 6 9 28 3 Média 1,014 2,089 0,896 0,949 COL1A1 SD 0,291 0,417 0,403 0,295 N 7 9 28 4

Marcadores Média 1,014 2,189 1,279 1,654 relacionados à matriz BGN SD 0,069 0,372 0,347 0,498 extracelular N 7 9 28 4 Média 1,029 2,222 0,914 0,695 SPARC SD 0,150 0,576 0,318 0,495 N 7 9 28 16 Média 1,114 8,244 14,848 4,457 IBSP SD 0,467 11,279 15,446 4,085 N 7 9 27 4 Média 1,500 13,833 9,096 11,813 ALPL SD 1,615 5,980 6,777 3,895 N 7 9 28 4 Média 1,029 10,767 33,489 24,517 BMP2 SD 0,275 6,210 25,988 19,700 N 7 9 28 16 Média 1,857 430,189 770,104 503,885 CHI3L1 SD 2,202 309,051 470,030 447,824 N 7 9 28 16 Média 1,329 216,256 2827,021 1289,936 MMP13 SD 1,246 254,257 2900,256 1572,880 N 7 9 28 16 Média 1,000 62,633 63,940 125,704 CD10 SD 14,459 30,435 78,670 N 1 3 5 4 Média 1,271 0,122 0,143 0,097 KI67 SD 1,131 0,259 0,140 0,053 N 7 9 28 16

Produto Expressão Produto Produto Estatística MSC celular C gênica celular A celular B Fresco Média 1,086 0,633 0,611 0,623 PCNA SD 0,515 0,087 0,238 0,119 N 7 9 28 4 Média 1,071 3,426 0,993 0,944 BCL2 SD 0,454 0,968 0,440 0,238 Marcadores N 7 9 28 4 associados à Média 1,014 1,633 1,957 1,185 apoptose BAX SD 0,121 0,180 2,468 0,126 N 7 9 28 4

SD: desvio padrão

Tabela 6b Perfil de Expressão Gênica de Produtos Celulares Comparativos (isto é, MSC) e Produtos Celulares que Ilustram a Invenção (isto é, Produto Celular C Criopreservado) (Expresso em Razão Relativa (Fold Change) para a Média de Valores de MSCs) Produto celular C Expressão gênica Estatística MSC criopreservado Média 1,065 1,394 CD73 SD 0,461 0,719

Marcadores N 2 6 mesenquimais Média 1,039 0,397 CD105 SD 0,439 0,217 N 2 6 Média 1,041 1,360 RUNX2 SD 0,539 0,659 N 8 6 Média 1,170 3,163 SOX9 SD 0,801 1,603

Genes mestres de N 8 6 diferenciação Média 1,162 0,853 PPARG SD 0,829 0,863 N 8 6 Média 1,400 65,271 ZNF521 SD 1,076 41,226 N 8 6

Produto celular C Expressão gênica Estatística MSC criopreservado Média 1,158 0,029 DKK1 SD 0,536 0,019 N 2 6 Média 1,074 330,737 SPON1 SD 0,626 256,467 N 7 6 Média 1,055 1,149 COL1A1 SD 0,594 0,742 N 8 6 Marcadores Média 1,018 1,357 relacionados à matriz BGN SD 0,513 0,701 extracelular N 8 6 Média 3,755 4,093 SPARC SD 2,224 2,739 N 8 6 Média 1,092 6,072 IBSP SD 0,662 5,551 N 8 6 Média 1,418 10,558 ALPL SD 1,344 10,476 N 8 6 Média 1,040 14,338 BMP2 SD 0,545 8,558 N 8 6 Média 1,710 404,507 CHI3L1 SD 1,738 291,544 N 8 6 Média 1,346 701,802 MMP13 SD 1,290 721,829 N 8 6 Média 1,071 60,284 CD10 SD 0,466 39,484 N 2 6 Média 1,261 0,118 KI67 DP 1,115 0,089 N 8 6 Média 1,084 0,659

PCNA SD 0,645 0,340

Produto celular C Expressão gênica Estatística MSC criopreservado N 8 6 Média 1,067 0,866 BCL2 SD 0,612 0,467 Marcadores N 8 6 associados à apoptose Média 1,011 1,287 BAX DP 0,491 0,653 N 8 6 DP: desvio padrão Tamanho Celular

[0300] As medições de tamanho celular com o uso de (i) software Motic Image Plus® 2.0 e (ii) análise de citometria de fluxo FSC confirmaram que o produto celular B, produto celular C fresco e os produtos celulares C crio eram menores e mais homogêneos que o produto celular A (Tabela 7, Figura 2).

[0301] De forma muito interessante, a grande maioria dos produtos celulares C (pelo menos 90%) não excederam 25 µm de diâmetro, e menos de 1% deles ultrapassou 35 µm de diâmetro. Ao contrário, o produto celular A incluiu apenas 35,4% das células que não excederam 25 µm de diâmetro e 26,9% das células com um diâmetro maior que 35 µm (Tabela 8, Figura 2). O produto celular B incluiu apenas 73,7% das células que não excederam 25 µm de diâmetro e 3,3% das células com um diâmetro maior que 35 µm (Tabela 8, Figura 2). Tabela 7 Diâmetro de Produtos Celulares Comparativos (isto é, MSC, Produto Celular A, Produto Celular B) e Produtos Celulares que Ilustram a Invenção (isto é, Produtos Celulares C) Diâmetro da célula (µm) Média ± SD Mín. - Máx. N MSCs 19,2 ± 4,8 9,8 a 41,8 450 Produto celular A 30,2 ± 9,9 11,4 a 67 1205 Produto celular B 22,4 ± 6,4 7,9 a 74,5 1744 Produto celular C - fresco 17,6 ± 7,3 7,3 a 44,3 2238 Produto celular C crio CS10 17,9 ± 4,8 9,1 a 53,8 876 Produto celular C crio CS10 diluído em 18,3 ± 3,9 10,9 a 33,8 209 HSA 1:1

Diâmetro da célula (µm) Média ± SD Mín. - Máx. N Produto celular crio CS10 5% de HSA 18,7 ± 4,3 11,2 a 35,7 339 Produto celular C crio 19,7 ± 3,5 12,9 a 31,4 361 HTS 10% de HSA 10% de DMSO Tabela 8 Distribuição de Tamanho Celular de Produtos Celulares Comparativos (isto é, MSC, Produto Celular A, Produto Celular B) e Produtos Celulares que Ilustram a Invenção (isto é, Produtos Celulares C) Célula com um diâmetro ≤ 25 µm > 35 µm MSCs 89,9% 1,3% Produto celular A 35,4% 26,9% Produto celular B 73,7% 3,3% Produto celular C - fresco 94,6% 0,9% Produto celular C crio CS10 91,3% 0,3% Produto celular C crio CS10 diluído em HSA 1:1 94,3% 0,0% Produto celular C crio CS10 5% de HSA 92,3% 0,3% Produto celular C crio 92,0% 0,0% HTS 10% de HSA 10% de DMSO Exemplo 3 Formação Óssea In Vivo de Células Derivadas de MSC de Linhagem Condro-Osteoblástica Obtidas pelo Método do Exemplo 1 Materiais e Métodos Células

[0302] O produto celular que ilustra a invenção (isto é, o produto celular C crio) foi obtido conforme descrito no Exemplo 1. Camundongos

[0303] Camundongos fêmeas NMRI-Nude (nu/nu) com 10 a 11 semanas foram adquiridos junto à Janvier S.A.S. (Le Genest-St-Isle, França) e alojados em condições padrão com comida e água à vontade. Modelo de Camundongo de Formação Óssea da Calvária

[0304] Camundongos fêmeas NMRI-Nude (nu/nu) com 12 semanas de idade foram anestesiados com isoflurano (IsoFlo®) e receberam uma única administração subcutânea de produto celular C crio (2,5 x 10 6 células em 100 µL por camundongo) ou excipiente (100 µL) através do osso da calvária. Para marcar a neoformação óssea ao longo do tempo, os fluorocromos de ligação ao cálcio foram administrados sequencialmente aos camundongos. Vermelho de alizarina (vermelho), calceínas (verde e azul) e tetraciclina (amarelo) (todos da Sigma-Aldrich®) foram injetados por via intraperitoneal 2 ou 3 dias antes e 5, 12 e 19 dias após a administração celular, respectivamente. Animais experimentais foram monitorados quanto ao peso corporal, sinais clínicos gerais e sinais clínicos no local de administração por 4 semanas após a administração. Os camundongos foram eutanasiados 4 semanas após administração celular por deslocamento cervical e a calvária de cada camundongo foi coletada para avaliar as propriedades de formação óssea das células de formação óssea por imagem de raios X, histomorfometria (quantificação de formação óssea) e imunofluorescência. Quantificação de Reparação Óssea por Análises de Raios X

[0305] Na eutanásia, foi realizado o imageamento de raios-X ex vivo da calvária de cada camundongo, colocado lado a lado, com o uso do dispositivo Faxitron® MX-20. Foram obtidas imagens digitais em uma ampliação de 1,5X em modo manual, com tensão ajustada em 35 kV, tempo de exposição em 4,8 s, brilho/contraste em 8.300/6000. As imagens de raios X geradas são imagens de nível de cinza com valores de intensidade de cinza variando de 0 (região em preto) a 255 (região em branco) e são diretamente proporcionais à rádio- opacidade e, portanto, a opacidade óssea ou a espessura óssea. O valor de intensidade de nível de cinza da parte de osteoindução da formação óssea (nódulos mineralizados descartados da seleção) nos ossos parietais (seleção manual) foi analisado com o uso da ferramenta de histograma do software AdobePhotoshop®.

[0306] O imageamento de raios-X e o software AdobePhotoshop® também foram usados para quantificar a superfície dos nódulos mineralizados (seleção manual).

Incorporação de Amostra e Corte Histológico

[0307] Para a histomorfometria, foram usadas as colorações ALP, TRAP (fosfatase ácida resistente ao tartarato), tricrômica de Masson-Goldner e imunofluorescência, as calvárias foram fixadas e desidratadas com sucessivas incubações em banho de etanol a 70%, 80% e 90%, 12 horas cada um, a 4ºC, com agitação suave, e incorporadas em resina plástica de hidroxietil metacrilato (HEMA) (HistoResin, Leica®) Cortes coronais com espessura de 4 µm e espessura de 8 µm foram cortados com o uso de um micrótomo (Leica ®, RM2255). Coloração de Imunofluorescência

[0308] A avaliação do colágeno I humano e murino por imunofluorescência foi realizada em cortes histológicos coronais de calvária em plástico com 4 µm de espessura. Resumidamente, após uma etapa de permeabilização com o uso de uma solução de PBS 1X/Triton 0,3% durante 30 min em temperatura ambiente (RT), os cortes histológicos foram incubados durante 1 hora em RT na solução de bloqueio (isto é, PBS/BSA/soro de cavalo/TritonTM) para saturar os sítios de ligação não específicos. As lâminas histológicas foram então incubadas durante a noite a 4ºC com anticorpos primários de coelho anti-colágeno I murino e anti-humano de camundongo (Abcam; nº ab138492 e Abcam; nº ab21286, respectivamente). Após 3 etapas de enxágue em PBS por 5 min. à RT, o bloqueio foi realizado com a solução de bloqueio por 1 hora à RT. Os anticorpos secundários diluídos na solução de bloqueio foram então adicionados por 2 horas à RT protegidos da luz. O anticorpo secundário de burro anti-IgG de coelho H&L Alexa Fluor® 488 (ThermoFisher, nº A21206) e Alexa Fluor® Cy3® e de cabra anti-IgG de camundongo H&L (Abcam; nº ab97035) foram usados para visualizar o colágeno I murino em verde e o colágeno I humano em vermelho, respectivamente. As lâminas foram então enxaguadas 3 vezes em PBS 1X por 5 min em RT e incubadas com solução NucBlue® por 1 min em RT para corar o núcleo. Finalmente, as lâminas foram rapidamente enxaguadas uma vez em PBS e, em seguida, montadas no reagente Glycergel®. Como controle negativo de imunofluorescência, foi realizada a omissão de anticorpo primário na lâmina histológica adjacente. Coloração Histológica

[0309] As atividades osteoblásticas e osteoclasásticas foram avaliadas nos cortes de calvárias, respectivamente, usando métodos de detecção de atividade enzimática de ALP e TRAP, respectivamente. Para a coloração ALP, cortes coronais de calvária em plástico com 4 µm de espessura foram incubados durante 1 hora com uma solução de Sal RR azul rápido (Sigma-Aldrich®) e Naftol AS-MX fosfato alcalino (Sigma-Aldrich®). A coloração TRAP foi realizada em cortes coronais de calvária em plástico com 8 µm de espessura, com o uso de fosfatase ácida, kit de leucócitos (TRAP) (Sigma-Aldrich®), de acordo com as instruções do fabricante. Para avaliar o estado de mineralização do osso neoformado, foi realizada coloração tricrômica de Masson-Goldner nos cortes de calvária corados com ALP usando um kit (Bio-Optica®) de acordo com as instruções do fabricante. Foram obtidas imagens digitais com um microscópio óptico (Leica®) e o software Leica® LAS EZ. Análises Histomorfométricas de Calvárias

[0310] A quantificação de formação óssea (isto é, a formação óssea absoluta) foi realizada em tecidos incorporados em plástico. As medições da espessura absoluta do osso neoformado (a partir da mineralização basal frontal fluorescentemente marcada por vermelho de alizarina final até a neoformação óssea fluorescentemente marcada por calceína e tetraciclina) com e sem nódulos mineralizados foram medidas (em µm) em corte coronal de 4 µm de espessura pelo software de análise de imagem ZEN® (Zeiss). Para cada animal, foram realizadas 4 medições de espessura absoluta em 5 níveis independentes, com uma distância de 200 µm entre cada nível. Como primeira etapa, a média da espessura (com e sem nódulos) ± DP (isto é, a média das 4 medidas por nível nos 5 níveis) foi calculada para cada animal.

Análises Estatísticas

[0311] Os resultados foram expressos como média ± desvio padrão (DP). As análises estatísticas foram realizadas com o uso dos softwares JMP ® (SAS Institute Inc.) ou GaphPad Prism®. As diferenças entre os grupos foram consideradas estatisticamente significativas quando p < 0,05. Resultados

[0312] Os camundongos nos quais foram administrados os produtos celulares produtos crio apresentaram maior formação óssea do que os controles em 4 semanas após a administração (Figuras 8A a C). A opacidade óssea foi significativamente maior para as células de formação óssea C crio, em comparação com o excipiente (Figura 8B). A superfície de osteogenia foi significativamente mais alta em comparação ao excipiente no qual não foram observados nódulos mineralizados (Figura 8C). As medidas histomorfométricas da osteoindução com ou sem osteogenia (representada pela formação óssea absoluta) foram significativamente mais altas para as células de formação óssea C crio, em comparação com o excipiente (Figuras 8D a E). Além disso, em adição às atividades de osteoindução, as células de formação óssea C crio promoveram uma alta atividade osteogênica realçada pela presença de nódulos mineralizados. Esta atividade osteogênica foi observada em 4/5 dos doadores de medula óssea (ou produção em lote) e 65% dos camundongos (Figura 8F). Um doador/lote foi considerado como sendo osteogênico (positivo) quando pelo menos um nódulo mineralizado foi observado em um camundongo por grupo. Nenhum nódulo foi observado após a administração de excipiente.

[0313] Mais particularmente, os produtos celulares C crio exibiram tanto propriedades osteoindutoras (formação óssea homogênea de origem murina sobre a calvária) como propriedades osteogênicas (nódulos mineralizados de origem humana e murina) (Figura 9).

[0314] A ossificação intramembranosa de hospedeiro foi induzida ao longo da superfície da calvária (Figuras 9 e 10). Mais particularmente, as células de formação óssea C crio exibiram propriedades de osteoindução e osteogênicas (Figura 10, “fluo”). A dupla marcação de colágeno tipo I de camundongo/humano (Figura 10, “colágeno tipo I humano”) revelou a presença de osso de origem de hospedeiro e de doador (osteogenia). As atividades de osteoblastos (Figura 10, “ALP+”) e osteoclastos (Figura 10, “TRAP”) foram detectadas principalmente em nódulos mineralizados, mostrando que o processo de remodelação óssea nos nódulos estava ainda em curso 4 semanas pós- administração. Esta observação foi dependente do tamanho do nódulo: quanto maior o nódulo, mais atividade de ALP e TRAP está ainda presente em 4 semanas pós-administração. Osteoide fraco (Figura 10, “coloração tricrômica de Masson-Goldner) foi destacado indicando que o processo de formação óssea está completo.

[0315] Consequentemente, as células de formação óssea C criopreservadas aumentaram a neoformação óssea.

[0316] Isto demonstra a utilidade dos produtos celulares e da composição celular, conforme descrito no relatório descritivo e nos Exemplos, para o tratamento de defeitos ósseos em ossos planos, bem como em ossos longos. Exemplo 4 Defeito de Tamanho Subcrítico (Sub-CSD) Femoral Segmentar de Camundongo In Vivo Reparado por Produto Celular C Obtido pelo Método do Exemplo 1 Procedimentos Experimentais Células

[0317] Os produtos celulares que ilustram a invenção (isto é, o produto celular C crio) são obtidos conforme descrito no Exemplo 1. Modelo de Defeito de Tamanho Subcrítico Segmentar Femoral (SFCSD)

[0318] O procedimento cirúrgico foi realizado sob condições assépticas de acordo com a literatura (Manassero et al., 2013, Tissue Engineering, Part C Methods, 19(4):271-80; Manassero et al., 2016, Journal of Visualized Experiments; (116): 52940). Resumidamente, camundongos NMRI-Nus (nu/nu)

fêmea de 13 semanas de idade foram anestesiados com isoflurano (IsoFlo ®) ou com uma injeção intraperitoneal de uma mistura de cloridrato de dexmedetomidina (Dexdomitor®, Orion Pharma, 1 mg/kg de peso corporal) e cetamina (Nimatek®, Euronet, 150 mg/kg de peso corporal) e foram colocados em uma posição ventral em uma placa de aquecimento. Após aplicar uma placa de microtravamento de PEEK com 6 orifícios (RISystem AG ®) no lado anterior do fêmur esquerdo, foi realizada uma osteotomia femoral diafasária média de 2 mm de comprimento usando uma serra Gigli e um gabarito (RISystem AG ®). Como medicação preventiva, foram administrados antibióticos (Baytril®, 10 mg/kg de peso corporal) foram administrados no dia anterior à cirurgia (em água potável) e analgésicos (cloridrato de buprenorfina, Temgesic®, Schering-Plow, 0,1 mg/kg de peso corporal) no dia anterior à cirurgia e a cada 12 horas por pelo menos 3 dias após a cirurgia. As células derivadas de MSC C criopreservadas (1,25 x 106 células em um volume de 50 µL por camundongo) ou o excipiente (grupo de controle) foram administradas no dia após a cirurgia, localmente no local do defeito ósseo, por injeção percutânea com o uso de uma seringa de 100 µl Hamilton®. Os camundongos foram eutanasiados 10 semanas após a administração de células ou excipiente por deslocamento cervical. O fêmur esquerdo de cada camundongo foi dissecado, coletado e mantido em solução de NaCl 0,9% à temperatura ambiente até o imageamento de raios-X. Quantificação de Reparação Óssea por Análises de Raios X

[0319] Foram realizadas imagens por raios X in vivo do fêmur esquerdo de cada camundongo com o uso do dispositivo Faxitron® MX-20 logo após a cirurgia para controlar a fixação da placa, o tamanho do defeito femoral segmentar e para obter uma avaliação inicial, e a cada duas semanas até 10 semanas após a administração de células derivadas de MSC ou excipiente. As imagens digitais foram obtidas em visualizações mediolaterais e ântero- posteriores em uma ampliação de 5X em modo manual, com tensão ajustada em 35 kV, tempo de exposição em 4,8 s, brilho em 4.300 e contraste em 7.100.

[0320] A eficácia foi medida por 3 métodos diferentes, isto é, a porcentagem de reparação óssea, escore de união radiográfica (RUS) adaptado e escore de fusão, a cada duas semanas do monitoramento: - A porcentagem de reparação óssea foi calculada dividindo o tamanho do defeito com reparação pelo tamanho do defeito inicial. O tamanho do defeito foi quantificado para cada camundongo ao longo do tempo, medindo a distância (µm) entre as duas bordas do defeito ósseo em dois locais (ambas corticais) nas imagens de raios X médio-lateral e ântero-posterior do, com o uso do software ImageJ®. A média das quatro medições foi calculada para cada camundongo em cada ponto no tempo. - O escore de união radiográfica (RUS) adaptado para o modelo SFCSD é uma medição semi-quantitativa, com base na presença ou ausência de uma neoformação óssea, uma ponte e uma linha de fratura (imagens radiográficas ântero-posterior e médio-lateral). O escore corresponde à soma de escores de 4 escores determinados em 2 locais de defeito cortical em ambas as vistas (total de 4 escores variando de 1 a 4 cada um). Portanto, os escores variam de 4 (nenhum sinal de cura) a 16 (fusão completa). - O escore de fusão é um escore binário que avalia a taxa de fusão entre as bordas do defeito femoral. O critério radiológico utilizado para definir a fusão é a visualização de formação de ponte do defeito em pelo menos 3 córtices (Cekiç E et al., Acta Orthop Traumatol Turc. 2014, 48(5), 533-40). O escore é 0 (sem fusão) ou 1 (fusão). Para esse parâmetro, apenas o último ponto no tempo foi analisado (W10, aqui). Análises Estatísticas

[0321] Os resultados são expressos como média ± desvio padrão (DP). A análise estatística compreendendo ANOVA de dois fatores com medidas repetidas, seguido por um teste post-hoc de Bonferroni são realizados com o uso do software JMP® (SAS Institute Inc.) ou GraphPad Prism®. As diferenças entre os grupos foram consideradas estatisticamente significativas quando p < 0,05. Resultados

[0322] No modelo sub-CSD femoral segmentar, as células de formação óssea C criopreservadas melhoraram e aceleraram significativamente aprimoradas a percentagem de reparação de fratura óssea (Figuras 11 e 12), em comparação ao excipiente de 2 a 10 semanas após a administração (p < 0,001). Além disso, o escore RUS aumentou significativamente para o grupo de células de formação óssea C criopreservadas, em comparação com o grupo excipiente (Figura 13). Por fim, a taxa de fusão também foi melhorada, com fusão de 9/19 (47%) de camundongos 10W após a administração de células de formação óssea C criopreservadas, em comparação a nenhuma fusão após administração de excipiente.

[0323] Isto demonstra a utilidade dos produtos celulares e da composição celular, conforme descrito no relatório descritivo e nos Exemplos, para o tratamento de defeitos ósseos em ossos longos, bem como em ossos planos. Exemplo 5 Duração de Cultura Secundária e Terciária, de Acordo Com Os Estudos de Cinética e Análise de Expressão de Marcador

[0324] As células derivadas de MSC de acordo com a realização da invenção, obtida após a cultura secundária conforme descrito no Exemplo 1 acima, foram coletadas em pontos no tempo diferentes (D21, D22, D23, D24, D25 e D28) e o ciclo celular foi analisado por citometria de fluxo (softwares BD FACSCanto II™ e BD FACSDiva™; Becton Dickinson).

[0325] O DNA celular total foi corado com 7-amino-actinomicina D (7- AAD) com o uso dos kits BD PharmigenTM BrdU Flow. Em resumo, 105 células foram fixadas em 100 µL de tampão BD Cytofix/Cytoperm seguido pela incubação por 20 min à temperatura ambiente e lavadas com 1 mL de tampão BD Perm/Wash, em seguida, centrifugadas por 5 min a 300 g. O sobrenadante foi descartado, e as células foram permeabilizadas em 100 µL de tampão de permeabilização Plus BD Cytoperm seguido de incubação por 10 min a 4 ºC e lavadas com tampão de lavagem/BD Perm, em seguida, centrifugadas por 5 min a 300 g. O sobrenadante foi descartado, e as células foram novamente fixadas em 100 µL de tampão de BDCytofix/ Cytoperm (5 min à temperatura ambiente) e lavadas com tampão de lavagem/BD Perm, centrifugadas por 5 min a 300 g. O DNA celular total foi corado em 20 µL de solução 7-AAD seguido de incubação durante 10 min à temperatura ambiente no escuro. Foi adicionado 1 mL de tampão de coloração às amostras antes de serem transferidas para tubos adaptados para citometria de fluxo.

[0326] As amostras foram analisadas em um citômetro de fluxo FACSCantoTM II (Becton-Dickinson) e a emissão de 7-AAD foi coletada após a passagem através de um filtro de passagem longa de 650 nm.

[0327] As Figuras 3 e 4 mostram que as células em D24 estavam situadas perto do fim da curva de proliferação. As células ainda não tinham saído do ciclo celular, enquanto que a partir de D25, as células estavam principalmente saindo do ciclo celular, isto é, elas não se proliferaram mais.

[0328] A Figura 4 ilustra a análise do ciclo celular com os eventos/fases (G0/G1, S e G2/M) das células em cultura secundária em diferentes durações de cultura. Em D24, 42% das células ainda estavam se proliferando (11% em S e 31% em G2/M), enquanto que a partir de D25, as células estavam principalmente saindo do ciclo celular. Portanto, a duração ideal para a cultura secundária foi de 24 dias.

[0329] As células derivadas de MSC obtidas após a cultura terciária, conforme descrito no Exemplo 1, foram coletadas em pontos no tempo diferentes: a cada dia a partir do dia 34 (D34) até 42 (D42) e a expressão dos marcadores de superfície celular foi analisada por citometria de fluxo, conforme descrito no Exemplo 2, Citometria de Fluxo.

[0330] A análise de expressão de marcador por citometria de fluxo realizada em uma população celular de células derivadas de MSC de linhagem condro-osteoblástica mostrou que as expressões de marcadores de diferenciação (BMP2, RUNX2, ZNFS21, SPARC, MMP13, CHI3L1) aumentou de D34 a D42 (Figura 5), e a expressão de marcador de proliferação KI67 diminuiu durante a duração da cultura (de D34 para D42).

[0331] A Figura 6 ilustra a densidade celular em diferentes períodos de tempo de cultura para 8 lotes. A densidade celular foi, em geral, maior em D36. As células foram contadas por citometria (BD Trucount TM). A Figura 7 ilustra a média do diâmetro celular em diferentes períodos de tempo de cultura para 2 lotes. O diâmetro celular era mínimo em D35 e D36. Portanto, a contagem de células e a medição do tamanho celular mostram que as células estavam atingindo um platô de proliferação entre D35 e D38 e o tamanho celular era mínimo em D35 e D36 (Figuras 6 e 7).

[0332] Em vista dos mesmos e considerando que a densidade celular é a mais alta em D36, a duração ideal para a cultura terciária foi D36.

Claims

Reivindicações

1. MÉTODO PARA OBTER CÉLULAS DERIVADAS DE CÉLULAS- TRONCO MESENQUIMAIS (MSC) DE LINHAGEM CONDRO- OSTEOBLÁSTICA A PARTIR DE MSC, sendo o método caracterizado por compreender: (a) cultivar as MSC recuperadas a partir de uma amostra biológica de um sujeito em um meio de cultura que compreende fator de crescimento de fibroblastos 2 (FGF-2), fator de crescimento transformador beta (TGFβ) e heparina ou um derivado ou análogo da mesma a uma concentração de pelo menos 0,01 UI/mL, obtendo assim as células derivadas de células-tronco mesenquimais (MSC); (b) passar as células derivadas de MSC por um primeiro período de tempo e ainda cultivar as células derivadas de MSC em um meio conforme definido em (a); e (c) passar as células derivadas de MSC por um segundo período de tempo e ainda cultivar as células derivadas de MSC em um meio conforme definido em (a), obtendo assim as células derivadas de MSC de linhagem condro-osteoblástica, em que as células derivadas de MSC são cultivadas na etapa (b) por um período de x dias, em que o dia x é último dia no qual pelo menos 20% das células derivadas de MSC estão se proliferando.

2. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelas células derivadas de MSC serem cultivadas na etapa (b) por um período de cerca de 8 dias a cerca de 12 dias, preferencialmente por um período de cerca de 10 dias.

3. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 2, caracterizado pelas células derivadas de MSC serem cultivadas na etapa (a) por um período de cerca de 13 dias a cerca de 15 dias, preferencialmente por um período de cerca de 14 dias.

4. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3,

caracterizado pelas células derivadas de MSC são cultivadas na etapa (c) por um período de cerca de 10 dias a cerca de 14 dias, preferencialmente por um período de cerca de 12 dias.

5. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelas células derivadas de MSC que estão se proliferando estarem na fase S, na fase G2 ou na fase M do ciclo celular.

6. MÉTODO PARA OBTER CÉLULAS DERIVADAS DE MSC DE LINHAGEM CONDRO-OSTEOBLÁSTICA A PARTIR DE MSC, sendo o método caracterizado por compreender: (a) cultivar MSC recuperadas a partir de uma amostra biológica de um sujeito em um meio de cultura que compreende FGF-2, TGFβ e heparina ou um derivado ou análogo da mesma a uma concentração de pelo menos 0,01 UI/mL; obtendo assim as células derivadas de MSC; (b) passar as células derivadas de MSC por um primeiro período de tempo e ainda cultivar as células derivadas de MSC em um meio conforme definido em (a); e (c) passar as células derivadas de MSC por um segundo período de tempo e ainda cultivar as células derivadas de MSC em um meio conforme definido em (a), obtendo assim as células derivadas de MSC de linhagem condro-osteoblástica, em que as células derivadas de MSC são plaqueadas para a cultura adicional na etapa (b) a uma densidade de 3 x 10 2 a 1 x 103 células/cm2, preferencialmente a uma densidade de 3 x 102 a 8 x 102 células/cm2.

7. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelas células derivadas de MSC serem plaqueadas para a cultura adicional na etapa (c) a uma densidade de 3 x 102 a 1 x 103 células/cm2, preferencialmente a uma densidade de 3 x 102 a 8 x 102 células/cm2.

8. MÉTODO PARA OBTER CÉLULAS DERIVADAS DE MSC DE LINHAGEM CONDRO-OSTEOBLÁSTICA A PARTIR DE MSC, sendo o método caracterizado por compreender:

(a) cultivar MSC recuperadas a partir de uma amostra biológica de um sujeito em um meio de cultura que compreende FGF-2, TGFβ e heparina ou um derivado ou análogo da mesma a uma concentração de pelo menos 0,01 UI/mL; obtendo assim as células derivadas de MSC; (b) passar as células derivadas de MSC por um primeiro período tempo e ainda cultivar as células derivadas de MSC em um meio conforme definido em (a); (c) passar as células derivadas de MSC por um segundo período de tempo e ainda cultivar as células derivadas de MSC em um meio conforme definido em (a), obtendo assim as células derivadas de MSC de linhagem condro-osteoblástica; (d) ressuspender as células derivadas de MSC de linhagem condro- osteoblástica em um meio de criopreservação adequado para a administração a um sujeito; e (e) criopreservar as células derivadas de MSC de linhagem condro- osteoblástica.

9. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelas células derivadas de MSC de linhagem condro-osteoblástica serem ressuspensas no meio de criopreservação na etapa (d) a uma concentração entre cerca de 1 x 107/mL e cerca de 1 x 108/mL, preferencialmente a uma concentração entre cerca de 2 x 107/mL e cerca de 4 x 107/mL.

10. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 8 a 9, caracterizado pelo meio de criopreservação compreender dimetilsulfóxido (DMSO), albumina de soro humano (HSA), adenosina, polipeptídeo, benzopirano, ou uma combinação dos mesmos.

11. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo TGFβ ser selecionado a partir do grupo que consiste em TGFβ1, TGFβ2, TGFβ3, e misturas dos mesmos; preferencialmente em que TGFβ é TGFβ1.

12. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11,

caracterizado por: - a concentração de heparina ou derivado ou análogo da mesma ser cerca de 0,1 UI/mL; e/ou - heparina ou derivado de heparina ou análogo da mesma ser selecionado a partir do grupo que consiste em heparina não fracionada (UFH); heparina de baixo peso molecular (LMWH), como enoxaparina, dalteparina, nadroparina, tinzaparina, certoparina, reviparina, ardeparina, parnaparina, bemiparina, ou misturas das mesmas; um heparinoide, como sulfato de heparano, sulfato de dermatano, sulfato de condroitina, sulfato de acarano, sulfato de queratano, ou misturas dos mesmos, como danaparoide; um sal de heparina; um sal de heparinoide; um fragmento de heparina; um fragmento de heparinoide; e misturas dos mesmos.

13. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizado pelas MSC ou células derivadas de MSC serem adicionalmente colocadas em contato com o meio que adicionalmente compreende um ou mais dentre plasma, soro ou um substituto dos mesmos.

14. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, caracterizado pelo sujeito ser um sujeito humano.

15. POPULAÇÃO DE CÉLULAS DERIVADAS DE MSC DE LINHAGEM CONDRO-OSTEOBLÁSTICA, caracterizada por poder ser obtida ou ser obtida pelos métodos, conforme definidos em qualquer uma das reivindicações 1 a 14.

16. POPULAÇÃO DE CÉLULAS DERIVADAS DE MSC DE LINHAGEM CONDRO-OSTEOBLÁSTICA, caracterizada por poder ser obtida ou ser obtida por expansão in vitro ou ex vivo de MSC, através da qual pelo menos 90% das células derivadas de MSC de linhagem condro-osteoblástica em suspensão têm um diâmetro igual ou menor que 25 µm (D90 ≤ 25 µm) e em que no máximo 1% das células derivadas de MSC de linhagem condro-osteoblástica em suspensão têm um diâmetro maior que 35 µM.

17. POPULAÇÃO, de acordo com a reivindicação 16, caracterizada pelas células derivadas de MSC de linhagem condro-osteoblástica poderem ser obtidas ou serem obtidas pelos métodos, conforme definidos em qualquer uma das reivindicações 1 a 14.

18. FORMULAÇÃO FARMACÊUTICA, caracterizada por compreender a população de células derivadas de MSC de linhagem condro-osteoblástica, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 15 a 17.

19. FORMULAÇÃO, de acordo com a reivindicação 18, caracterizada pela formulação farmacêutica compreender ainda um componente com propriedades osteocondutoras, como fosfato tricálcico, hidroxiapatita, combinação de partículas de hidroxiapatita/fosfato tricálcico, ácido poliláctico, poli(ácido láctico-glicólico), ácido hialurônico ou um derivado do mesmo, quitosana, poli-L-lisina, gelatina, colágeno, osteonectina, fibrinogênio, osteocalcina, ou uma combinação dos mesmos.

20. POPULAÇÃO DE CÉLULAS DERIVADAS DE MSC DE LINHAGEM CONDRO-OSTEOBLÁSTICA, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 15 a 17, ou a formulação farmacêutica, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 18 a 19, caracterizada por se destinar ao uso como medicamento, preferencialmente para uso no tratamento de um sujeito com necessidade de transplante de células de linhagem condro-osteoblástica.

21. POPULAÇÃO OU FORMULAÇÃO FARMACÊUTICA, para uso de acordo com a reivindicação 20, caracterizada por: - as células derivadas de MSC de linhagem condro-osteoblástica estão presentes a uma concentração entre cerca de 1 x 107/mL e cerca de 1 x 108/mL, preferencialmente entre cerca de 2 x 107/mL e a cerca de 4 x 107 células/mL; e/ou - a população de células derivadas de MSC de linhagem condro- osteoblástica ou a formulação farmacêutica ser adequada para a administração percutânea, intraóssea, intra-articular, intervertebral ou intravascular; - a população de células derivadas de MSC de linhagem condro- osteoblástica ou a formulação farmacêutica ser adequada para a administração em um local de um defeito ósseo.