BE1026595B9 - Procedes de differenciation de cellules souches mesenchymateuses - Google Patents

Abstract

La présente invention concerne des méthodes permettant d'obtenir des cellules dérivées de cellules souches mésenchymateuses (CSM) de lignée chondro-ostéoblastique à partir de CSM. L'invention concerne également une population de cellules dérivées de CSM de lignée chondro-ostéoblastique obtenue par les méthodes, une formulation pharmaceutique comprenant la population de cellules dérivées de CSM de lignée chondro-ostéoblastique, et leur utilisation dans le traitement d'un sujet nécessitant une greffe de cellules de lignée chondro-ostéoblastique.

Description

PROCÉDÉS DE DIFFERENTIATION DE CELLULES SOUCHES MÉSENCHYMATEUSES DOMAINE DE L'INVENTION La présente invention se situe dans le domaine de la thérapie régénérative, en particulier dans le domaine des produits de thérapie cellulaire osseuse administrables par des techniques mini-invasives. En particulier, l'invention porte sur des méthodes d'obtention de cellules souches mésenchymateuses (CSM) de lignée chondro-ostéoblastique à partir de CSM, de cellules de lignée chondro-ostéoblastique et de populations cellulaires dérivées de CSM, et de produits comprenant ces cellules et populations cellulaires, des méthodes et des utilisations.

CONTEXT La greffe de cellules souches capables de subir une différenciation ostéogénique, de cellules engagées dans la différenciation ostéogénique ou de cellules ayant la capacité de former de l’os est une voie prometteuse pour le traitement des maladies liées aux os, en particulier lorsque le traitement nécessite la production de nouveaux tissus Osseux.

Les cellules souches mésenchymateuses (CSM) ont déjà été utilisées pour traiter des troubles osseux (Gangji et al., 2005 Expert Opinion Biol Ther 5 : 437-42). Cependant, bien que ces cellules souches relativement indifférenciées puissent être transplantées, elles ne sont pas associées à une lignée ostéoblastique et, par conséquent, une proportion considérable des cellules souches ainsi transplantées ne peuvent finalement pas contribuer à la formation du tissu osseux souhaité. De plus, la quantité de telles cellules souches est souvent insatisfaisante.

Des procédés de fabrication permettant de produire ex vivo des cellules osseuses sans modifier génétiquement les cellules ont été décrits dans l'art.

WO 2007/093431 concerne une méthode d'expansion in vitro de CSM isolées, qui a donné des cellules présentant un phénotype ostéoblastique. Dans ce procédé, des CSM humaines ont été mises en culture en présence de sérum ou de plasma et du facteur de croissance des fibroblastes basiques (FGF-2).

WO 2009/087213 concerne une méthode d'obtention d'ostéoprogéniteurs, d'ostéoblastes ou de cellules de phénotype ostéoblastique à partir de CSM humaines in vitro ou ex vivo, comprenant la mise en contact desdites CSM avec du plasma ou du sérum humain, du FGF-2 et le facteur de croissance transformateur beta (TGF-B).

Toutefois, le développement d'un produit cellulaire allogénique formant de l’os suscite encore de grandes préoccupations, notamment en ce qui concerne le volume de production, c'est-à-dire le nombre de doses provenant d'un seul don de moelle osseuse, la disponibilité et le rapport coût-efficacité du produit. De plus, avec la productivité du processus de fabrication, des dizaines de moelles osseuses devront être qualifiées chaque année pour assurer la capacité de fabrication. Il est donc nécessaire d'accroître la productivité obtenue à partir d'un don de moelle osseuse et, plus généralement, d'améliorer les méthodes permettant d'obtenir des cellules dérivées de CSM et des produits cellulaires utiles, entre autres, pour la thérapie régénérative.

RESUME DE L'INVENTION Comme le confirme la partie expérimentale, qui illustre certains modes de réalisation représentatifs de l’invention, les inventeurs ont réalisé que le volume de production de cellules souches mésenchymateuses (CSM) de lignée chondro-ostéoblastique peut être considérablement amélioré lorsque lesdites cellules sont obtenues par un procédé de fabrication comprenant une culture tertiaire (et donc l'addition d'un passage cellulaire intermédiaire "P2”), et le contrôle d'un ou plusieurs réglages de la durée de culture de la culture secondaire, de la durée de culture de la culture tertiaire, de l'ajout d'une étape de cryoconservation à la fin de la culture tertiaire, ou de la densité d’ensemencement.

Ainsi, dans un aspect, l'invention fournit une méthode pour obtenir, par exemple, par différenciation ou par expansion, des cellules dérivées de CSM de lignée chondro-ostéoblastique à partir de CSM, la méthode comprenant : (a) la culture de CSM provenant d'un échantillon biologique d'un sujet dans un milieu de culture comprenant le facteur de croissance des fibroblastes-2 (FGF-2), le facteur de croissance transformant bêta (TGFP) et de l'héparine ou un dérivé ou analogue de celle-ci à une concentration d'au moins 0,01 IU/ml, pour obtenir des cellules dérivées de cellules souches mésenchymateuses (cellules dérivées de CSM) ; b) un premier passage des cellules dérivées de CSM et la culture ultérieure des cellules dérivées de CSM dans un milieu tel que défini au point a) ; et (c) un second passage des cellules dérivées de CSM et la culture ultérieure des cellules dérivées de CSM dans un milieu tel que défini en (a), obtenant ainsi les cellules dérivées de CSM de lignée chondro- ostéoblastique, dans laquelle les cellules dérivées de CSM sont mises en culture dans l'étape (b) pendant une période de x jours, le jour x étant le dernier jour où au moins 20 % des cellules dérivées de CSM prolifèrent (en se trouvant par exemple en phase S, phase G2 ou phase M du cycle cellulaire).

Dans un autre aspect, l'invention fournit une méthode pour obtenir des cellules dérivées de CSM de lignée chondro-ostéoblastique à partir de CSM, la méthode comprenant : (a) la culture de CSM provenant d'un échantillon biologique d'un sujet dans un milieu de culture comprenant du FGF-2, du TGFB et de l'héparine ou un dérivé ou analogue de celle-ci à une concentration d'au moins 0,01 Ul/ml, obtenant ainsi des cellules dérivées de CSM;

b) le premier passage des cellules dérivées de CSM et la culture ultérieure des cellules dérivées de CSM dans un milieu tel que défini au point a) ; et (c) le second passage des cellules dérivées de CSM et la culture ultérieure des cellules dérivées de CSM dans un milieu tel que défini en (a), obtenant ainsi les cellules dérivées de CSM de lignée chondro- ostéoblastique, dans laquelle les cellules dérivées de CSM sont ensemencées pour la culture ultérieure de l'étape (b) à une densité de 3x10* à 1x10° cellules/em”, de préférence à une densité de 3x10° à 8x10° cellules/cm”. Dans un autre aspect, l'invention fournit une méthode pour obtenir des cellules dérivées de CSM de lignée chondro-ostéoblastique à partir de CSM, la méthode comprenant : (a) la culture de CSM provenant d'un échantillon biologique d'un sujet dans un milieu de culture comprenant du FGF-2, du TGFB et de l'héparine ou un dérivé ou analogue de celle-ci à une concentration d'au moins 0,01 Ul/ml, obtenant ainsi des cellules dérivées de CSM; (b) un premier passage des cellules dérivées de CSM et la culture ultérieure des cellules dérivées de CSM dans un milieu tel que défini en (a) ; (©) un second passage des cellules dérivées de CSM et la culture ultérieure des cellules dérivées de CSM dans un milieu tel que défini en (a), obtenant ainsi les cellules dérivées de CSM de lignée chondro- ostéoblastique ; (d) La resuspension des cellules dérivées de CSM de lignée chondro-ostéoblastique dans un milieu de cryopréservation approprié pour administration à un sujet ; et (e) la cryoconservation les cellules dérivées de CSM de lignée chondro-ostéoblastique.

Par ailleurs, l'invention concerne une population de cellules dérivées de CSM de lignée chondro- ostéoblastique pouvant être obtenues ou obtenues par les méthodes définies ici.

Par ailleurs, l'invention fournit une population de cellules dérivées de CSM de lignée chondro- ostéoblastique pouvant être obtenues ou obtenues par expansion in vitro ou ex vivo de CSM, où au moins 90% des cellules dérivées de CSM de lignée chondro-ostéoblastique en suspension ont un diamètre égal ou inférieur à 25 um (Ds < 25 um) et où au plus 1% des cellules dérivées de CSM de lignée chondro- ostéoblastique en suspension ont un diamètre supérieur à 35 um.

Par ailleurs, l'invention concerne une formulation pharmaceutique comprenant la population de cellules dérivées de CSM de lignée chondro-ostéoblastique telle que précédemment décrite.

Dans un autre aspect, l'invention concerne une population de cellules dérivées de CSM de lignée chondro- ostéoblastique telle que précédemment décrite, ou une formulation pharmaceutique telle que précédemment décrite, pour une utilisation comme médicament, de préférence pour une utilisation dans le traitement d'un sujet nécessitant une transplantation de cellules de lignée chondro-ostéoblastique.

Les inventeurs ont constaté que les méthodes actuelles peuvent offrir un ou plusieurs avantages, comme on le verra plus loin. Les méthodes actuelles permettent d'augmenter substantiellement les rendements de culture et la productivité des cellules dérivées de CSM de lignée chondro-ostéoblastique obtenues à partir d'un échantillon de moelle osseuse. Par conséquent, un don de moelle osseuse suffit pour couvrir un volume de production satisfaisant. De plus, les méthodes actuelles augmentent la disponibilité de cellules dérivées de CSM de lignée chondro-ostéoblastique pour une utilisation clinique. En outre, la cryoconservation des cellules de la lignée chondro-ostéoblastique dérivées de CSM obtenue par les méthodes actuelles conduit à un produit cellulaire qui peut être directement administré à un sujet ayant besoin d'une transplantation de cellules de la lignée chondro-ostéoblastique. La cryoconservation des cellules de la lignée chondro-ostéoblastique dérivées de CSM obtenues par les méthodes actuelles permet la distribution et la livraison directe du produit cellulaire sur demande, et donc le traitement immédiat d'un sujet nécessitant une transplantation de cellules de la lignée chondro-ostéoblastique. De plus, la cryoconservation des cellules de lignée chondro-ostéoblastique dérivées de CSM obtenue par les méthodes actuelles permet d'effectuer tous les tests de libération du produit cellulaire et d'obtenir les résultats avant administration du produit cellulaire. De plus, les cellules dérivées de CSM de lignée chondro-ostéoblastique obtenues par les méthodes définies ici ont un potentiel ostéoinductif et ostéogénique avantageux.

Ces aspects, ainsi que d'autres aspects et les réalisations privilégiées de l'invention sont décrits dans les sections suivantes et dans les revendications jointes en annexe. L'objet des revendications ci-jointes est expressément incorporé dans la présente spécification.

DESCRIPTION DES FIGURES La figure 1 représente des graphiques illustrant les niveaux d'expression en CD73 (figure 1A) et en CD44 (figure 1B) analysés par cytométrie en flux dans A : CSM ; B : produit cellulaire A ; C : produit cellulaire B ; C : produit cellulaire B ; D : produit cellulaire C - frais (N=12, 6, 22, 15 (CD73) et N=22, 8, 22, 18 (CD44) pour les CSM, produits cellulaire A, B et C respectivement).

La figure 2 représente des graphiques illustrant la taille des cellules des produits cellulaires comparatifs selon l'état de la technique et des produits cellulaires illustrant l'invention : A : CSM ; B : produit cellulaire À ; C : produit cellulaire B ; D : produit cellulaire C - frais ; E : produit cellulaire C - cryo CS10 ; F : produit cellulaire C - cryo CS10 dilué HSA 1:1 ; G : produit cellulaire C - cryo CS10 5%HSA ; H : produit cellulaire C - cryo HTS 10% HSA 10% DMSO.

La figure 3 représente un graphique illustrant la densité cellulaire en fonction de la durée de culture. Les cellules ont été comptées: FIG. 3A : manuellement (méthode Trypan Blue avec chambre Bürker) ou FIG. 3B : par cytométrie (BD TrucountTM). La figure 4 représente un graphique illustrant l'analyse du cycle cellulaire avec les événements/phases 5 (G0/G1, S et G2/M) des cellules en culture secondaire à différentes durées de culture. À D24, 42% des cellules sont encore en prolifération (11% S et 31% G2/M) alors qu'à D25, les cellules ont principalement quitté le cycle cellulaire. La figure 5 représente des graphiques illustrant le niveau d'expression des marqueurs de différenciation cellulaire (BMP2, RUNX2, ZNFS21, SPARC, MMP13, CHI3L1) à différentes durées de culture (N=8 pour les points de temps D34 à D38, et N=6 pour D42).

La figure 6 représente un graphique illustrant la densité cellulaire des populations cellulaires à différentes durées de culture (N=8).

La figure 7 représente un graphique illustrant le diamètre moyen de deux populations cellulaires à différentes durées de culture (N=2).

La figure 8 illustre l'ostéoinduction et l'ostéogénie évaluées par analyse radiographique. R : L'ostéoinduction (A, panneau de gauche) est évaluée en mesurant la valeur de l'intensité de gris qui est directement corrélée à l'opacité de l'os et donc à son épaisseur. L'ostéogénie (A, panneau de droite) est évaluée en mesurant la surface du nodule qui semble plus réfringent par imagerie radiographique. B : L'opacité osseuse est significativement plus élevée pour les cellules formatrices d’os C cryopréservées ("cellules B-F C”) que pour les excipients (n=20 (excipient) et n=34 (cellules B-F C de 5 lots différents). C : La surface de l'ostéogénie est significativement plus élevée que celle d'un excipient dans lequel aucun nodule minéralisé n'a été observé (n=20 (excipient) et n=34 (cellules B-F C de 5 lots différents). D-E : L'ostéoinduction avec (Fig. 8D) ou sans (Fig. 8E) ostéogénie (représentée par la formation osseuse absolue) est significativement plus élevée pour les cellules C cryopréservées ("cellules B-F C") que pour l’excipient. Mann Whitney U-test : ***p< 0.001. F : en plus des activités d'ostéoinduction, les cellules osseuses C cryopréservées ("cellules B-F C") favorisent une activité ostéogénique élevée indiquée par la présence d'au moins un nodule minéralisé chez 4/5 des donneurs de moelle osseuse (ou production de lots) et 65% des souris (n=20 (excipient) et n=34 (cellules B-F C de 5 lots distincts).

La figure 9 illustre la section histologique coronale 4 semaines après une seule administration de cellules formatrices d’os C cryoconservées ou d'excipient. Les cellules formatrices d’os C cryoconservées ont deux mécanismes : (1) "l’ostéoinduction” : stimulation de la formation osseuse de l'hôte par sécrétion paracrine conduisant à une ossification intramembraneuse et (ii) "l’ostéogenèse” : stimulation de la formation osseuse "directe" (d'origine donneur/humaine) par ossification endochondrale.

La figure 10 illustre l'analyse histologique de la voûte crânienne de souris 4 semaines après avoir reçu une seule injection de cellules formatrices d'os C cryopréservées. Les cellules osseuses C cryopréservées présentent des propriétés ostéoinductrices et ostéogéniques ("fluo"). La formation osseuse humaine ("collagène humain de type I") a été mise en évidence dans les nodules minéralisés (ostéogénie). Les activités des ostéoblastes ("ALP" indiqué par des flèches noires dans le troisième panneau) et des ostéoclastes ("TRAP", indiqué par des flèches noires dans le quatrième panneau) ont surtout été détectées dans des nodules minéralisés montrant que le processus de remodelage osseux des nodules était toujours en cours 4 semaines après leur administration. Aucun ostéoïde ("coloration au trichrome de Masson de Goldner ") n'a été mis en évidence indiquant que le processus de formation osseuse est terminé.

La figure 11 illustre l'effet des cellules formatrices d’os C cryopréservées (" cellules B-F C ") dans un modèle de défaut fémoral segmentaire de taille subcritique. Les radiographies représentent les défauts fémoraux segmentaires du jour 0 jusqu'à la semaine 10 après l'administration de l'excipient seul ou des cellules formatrices d’os C cryopréservées.

La figure 12 illustre l'effet de la cryoconservation des cellules formatrices d’os C dans un modèle de défaut fémoral segmentaire de taille subcritigue (modèle sub-CSD). Le graphique représente le pourcentage de réparation osseuse sur les images radiographiques le jour de l'intervention chirurgicale ou de l'administration de l'article ("WO") et jusqu'à 10 semaines ("W10") après l'administration de l'excipient seul, ou sur les cellules formatrices d’os C cryopréservées ("cellules B-F C”) ; moyenne + SEM, *** p<0,001 (ANOV A).

La figure 13 illustre l'effet de la cryoconservation des cellules formatrices d’os C dans un modèle de défaut fémoral segmentaire de taille subcritique (modèle sous-CCD). Le graphique représente le score RUS déterminé à partir d'images radiographiques le jour de l'intervention chirurgicale ("WO") et jusqu'à 10 semaines ("W10") après l'administration de l'excipient seul, ou des cellules formatrices d’os C cryopréservées (cellules B-F C) ; moyenne + SEM, ** p<0,01, *** p< 0,001 (ANOVA à deux voies — répétées).

DESCRIPTION DÉTAILLÉE DES MODES DE RÉALISATION PRÉFÉRÉES Tel qu'utilisé ici, les formes singulières "un", "une" et "le/la” incluent à la fois les référents singuliers et pluriels, sauf si cela est clairement contre-indiqué dans le contexte.

Les termes "comprenant”, "comprend” et "composé de" utilisés ici sont synonymes de "y compris”, “comportant” ou "contenant", "contient", et sont inclusifs ou ouverts et n'excluent pas les membres, éléments ou étapes de procédés supplémentaires, non mentionnés. Ces termes couvrent également les termes"consistant" et "essentiellement constitué de", qui ont une signification bien établie dans la terminologie des brevets.

La récitation d'intervalles numériques par des limites comprend tous les nombres et fractions compris à l'intérieur des intervalles respectifs, ainsi que des limites mentionnées.

Les termes "environ" ou "approximativement” utilisés ici pour désigner une valeur mesurable telle qu'un paramètre, une quantité, une durée temporelle et autres, sont destinés à couvrir des variations de la valeur spécifiée, telles que les variations de + 10% ou moins, de préférence + 5% ou moins, plus préférablement + 1% ou moins, et encore plus préférablement + 0,1% ou moins de la valeur spécifiée, dans la mesure où de telles variations sont appropriées à la présente invention.

Il faut comprendre que la valeur à laquelle se réfère le modificateur "environ" est elle-même aussi spécifiquement, et de préférence décrite.

Bien que les termes "un ou plusieurs” ou "au moins un", tels qu'un ou plusieurs membres ou au moins un membre d'un groupe de membres, soient clairs en soi, par le biais d'autres exemples, les termes couvrent notamment une référence à l'un quelconque desdits membres, ou à deux ou plusieurs desdits membres, tels que, par exemple, >3, >4, >5, >6 ou >7, et desdits membres.

Dans un autre exemple, "un ou plusieurs" ou "au moins un” peut se référer à 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou plus.

L'exposé du contexte de l'invention est inclus dans le présent document pour expliquer le contexte de l'invention.

Cela ne doit pas être considéré comme une admission qu’une partie quelconque des documents auxquels il est fait référence ait été publiée, connue ou fait partie des connaissances générales courantes dans un pays quelconque à la date de priorité de l'une quelconque des revendications.

Dans l’ensemble de cette description, diverses publications, brevets et spécifications de brevets publiés sont référencés par une citation d'identification.

Tous les documents cités dans la présente spécification sont intégrés en référence dans leur intégralité.

En particulier, les enseignements ou les sections de ces documents spécifiquement référencés présentement sont intégrés en référence.

Sauf indication contraire, tous les termes utilisés dans la description de l'invention, y compris les termes techniques et scientifiques, ont leur signification couramment connue de l’homme du métier auquel cette invention appartient.

À titre d'indication supplémentaire, les définitions des termes sont incluses pour mieux apprécier l'enseignement de l'invention.

Lorsque des termes spécifiques sont définis en relation avec un aspect particulier de l'invention ou une réalisation particulière de l'invention, une telle connotation est destinée à s'appliquer à l’ensemble de cette spécification, c'est-à-dire également dans le contexte d'autres aspects ou réalisations de l'invention, sauf définition contraire.

Dans les sections suivantes, différents aspects ou modes de réalisation de l'invention sont définis plus en detail.

Chaque aspect ou mode de réalisation ainsi défini peut-être combiné avec tout autre aspect ou incarnation, sauf indication contraire.

En particulier, toute caractéristique indiquée comme étant privilégiée ou avantageuse peut être combinée à toute autre caractéristique ou aux autres caractéristiques indiquées comme étant privilégiées ou avantageuses.

Dans la présente spécification, l'expression "un mode de réalisation" signifie qu'un élément, une structure ou une caractéristique particulière décrite dans le contexte du mode de réalisation est incluse dans au moins une incarnation de la présente invention. Ainsi, les apparences des expressions "dans une incarnation” ou "dans une incarnation” en divers endroits de la présente spécification ne se réfèrent pas nécessairement toutes à la même incarnation, mais peuvent le faire. En outre, les particularités, structures ou caractéristiques peuvent être combinées de toute manière appropriée, comme le montrerait une personne versée dans l'art d'après cette divulgation, en une ou plusieurs incarnations. De plus, bien que certaines incarnations décrites dans le présent document comprennent certaines caractéristiques, mais pas d'autres, qui sont incluses dans d'autres incarnations, les combinaisons de caractéristiques de différentes incarnations sont censées entrer dans le champ d'application de l'invention et former différentes incarnations, comme l'entendent les auteurs de l'invention. Par exemple, dans les revendications annexées, n'importe laquelle des représentations revendiquées peut être utilisée dans n'importe quelle combinaison. Dans un aspect, l'invention fourni une méthode pour obtenir des cellules dérivées de CSM de lignée chondro-ostéoblastique de CSM, la méthode comprenant: (a) la culture de CSM récupérées provenant d'un échantillon biologique d'un sujet dans un milieu de culture comprenant du FGF-2, du TGFB et de l'héparine ou un dérivé ou analogue de celle-ci à une concentration d'au moins 0,01 Ul/ml, obtenant ainsi des cellules dérivées de CSM; b) un premier passage des cellules dérivées de CSM et la culture ultérieure des cellules dérivées de CSM dans un milieu tel que défini au point a) ; et (c) un second passage des cellules dérivées de CSM et la culture ultérieure des cellules dérivées de CSM dans un milieu tel que défini en (a), obtenant ainsi les cellules dérivées de CSM de lignée chondro- ostéoblastique.

L'expression "cellule souche mésenchymateuse” ou "CSM", telle qu'elle est utilisée ici, désigne une cellule souche adulte dérivée du mésoderme qui est capable de générer des cellules de lignées — mésenchymateuses, généralement de deux ou plusieurs lignées mésenchymateuses, plus généralement trois ou plusieurs lignées mesenchymateuses, par exemple, la lignée chondro-ostéoblastique (cartilage et os), ostéoblastique (os), chondroblastique (cartilage), myocytaire (muscle), ténocytaire (tendon), fibroblastique (tissu conjonctif), adipocytaire (graisse) et stromogénique (stroma médullaire). Les CSM peuvent être isolés à partir d'un échantillon biologique, de préférence un échantillon biologique d'un sujet humain, par exemple de moelle osseuse, d'os trabéculaire, de sang, de cordon ombilical, de placenta, de sac vitellin foœtal, de peau (derme), en particulier de peau fœtale et adolescente, de périoste, de pâte dentaire, de tendon et de tissu adipeux.

Les termes "échantillon biologique” ou "échantillon" utilisés ici désignent un échantillon obtenu à partir d'une source biologique, par exemple d'un organisme, tel qu'un sujet animal ou humain, une culture cellulaire, un échantillon de tissu, etc. Un échantillon biologique d'un sujet animal ou humain se réfère à un échantillon prélevé sur un sujet animal ou humain et comprenant des cellules de celui-ci. L'échantillon biologique d'un sujet animal ou humain peut comprendre un ou plusieurs types de tissus et peut comprendre des cellules d'un ou plusieurs types de tissus. Les méthodes d'obtention d'échantillons biologiques d'un animal ou d'un sujet humain sont bien connues dans l'art, par exemple la biopsie tissulaire ou le prélèvement sanguin. Le CSM humain, son isolement, son expansion in vitro et sa différenciation ont été décrits dans, par exemple, US Pat. No. 5,486,359 ; US Pat. No 5,811,094 ; US Pat. No. 5,736,396 ; US Pat. No. 5,837,539 ; ou US Pat. No. 5,827,740. Tout CSM décrit dans l'art et isolé par toute méthode décrite dans l'art peut convenir dans la présente méthode. En particulier, les CSM peuvent être définies comme présentant la capacité de différenciation mésenchymateuse trilignée in vitro en ostéoblastes, adipocytes et chondroblastes (Dominici et al., 2006, vol. 8, 315).

Le terme "CSM" englobe également la descendance de CSM, par exemple la descendance obtenue par prolifération in vitro ou ex vivo (propagation/expansion) de CSM obtenues à partir d'un échantillon biologique d'un sujet animal ou humain.

Le terme "cellule souche” désigne généralement une cellule non spécialisée ou relativement moins spécialisée et compétente en matière de prolifération, capable de s'auto-renouveler, c'est-à-dire de proliférer sans différenciation, et dont la progéniture peut donner naissance à au moins un type cellulaire relativement plus spécialisé. Le terme englobe les cellules souches capables d'un auto-renouvellement sensiblement illimité, c'est-à-dire dans lesquelles la descendance d'une cellule souche ou au moins une partie de celle-ci conserve sensiblement le phénotype non spécialisé ou relativement moins spécialisé, le potentiel de différenciation et la capacité de prolifération de la cellule souche mère, ainsi que les cellules souches qui présentent un auto-renouvellement limité, dans laquelle la capacité de la descendance ou d'une partie de celle-ci à poursuivre la prolifération et/ou la différenciation est réduite de manière démontrable par rapport à la cellule mère. Par exemple, une cellule souche peut donner naissance à des descendants capables de se différencier en une ou plusieurs lignées pour produire des cellules de plus en plus spécialisées, de tels descendants et/ou cellules de plus en plus spécialisées pouvant être eux-mêmes des cellules souches telles que définies ici, ou même produire des cellules différenciées en phase terminale, c'est-à-dire des cellules totalement spécialisées, qui peuvent être post-mitotiques.

Le terme "cellule souche adulte”, tel qu'il est utilisé ici, désigne une cellule souche présente dans un organisme ou obtenue à partir (par exemple, isolée à partir) d'un organisme au stade fœtal ou de préférence, après la naissance (par exemple, mais sans limitation, pour un organisme humain, au moins un mois après la naissance, par exemple au moins 2 mois, au moins 3 mois, par exemple, au moins 4 mois, au moins 5 mois, par exemple au moins 6 mois après la naissance, comme par exemple 1 an ou plus, 5 ans ou plus, au moins 10 ans ou plus, 15 ans ou plus, 20 ans ou plus, ou 25 ans ou plus après la naissance), comme par exemple, après avoir atteint la majorité. À titre d’exemple, les cellules souches adultes peuvent être obtenues à partir de sujets humains qui seraient autrement décrits dans les termes conventionnels "nourrisson", "enfant", "jeune", "adolescent" ou "adulte".

Des CSM préférentielles ont le potentiel de générer des cellules d'au moins la lignée chondro- ostéoblastique, telles que des cellules de la lignée ostéoblastique, telles que des chondro- ostéoprogéniteurs et/ou des ostéoprogéniteurs et/ou des préostéoblastes et/ou des ostéoblastes et/ou ostéocytes, et/ou la lignée chondroblastique, telles que des chondro-ostéoprogéniteurs et/ou des chondroprogéniteurs et/ou des pré-chondroblastes et/ou chondroblastes et/ou chondrocytes.

D'autres CSM préférentielles ont le potentiel de générer des cellules d'au moins la lignée ostéoblastique (os), telles que, par exemple, les chondro-ostéoprogéniteurs et/ou les ostéoprogéniteurs et/ou les pré- ostéoblastes et/ou les ostéoblastes et/ou les ostéocytes, etc. ou au moins de la lignée chondroblastique (cartilage), comme par exemple, chondro-ostéoprogéniteurs et/ou chondroprogéniteurs et/ou préchondroblastes et/ou chondroblastes et/ou chondrocytes ; lignée fibroblastique (tissu conjonctif), telle que, par exemple, fibroblastes, fibrocytes ; ou au moins synoviocytes (fluide synovial) ; ou ténocytes (tendon) etc.

Sauf indication contraire, les termes sujet" ou "patient" sont utilisés de façon interchangeable et désignent des animaux, de préférence des vertébrés, de préférence des mammifères, et plus particulièrement des patients humains et des mammifères non humains. Les patients préférentiels sont des sujets humains. Les sujets animaux comprennent les formes prénatales d'animaux, comme les fœtus. Les sujets humains peuvent inclure des fœtus, et non des embryons.

Dans certains aspects de réalisation des méthodes, d’utilisations ou de produits cellulaires tels qu'enseignés ici, le sujet peut être un sujet humain.

Le terme "produit cellulaire", tel qu'il est utilisé ici, désigne les cellules dérivées de CSM, les cellules dérivées de CSM de la lignée chondro-ostéoblastique telles qu'enseignées ici, une population de cellules dérivées de CSM de la lignée chondro-ostéoblastique telles qu'enseignées ici ou une formulation pharmaceutique comprenant des cellules dérivées de CSM de la lignée chondro-ostéoblastique telles qu'enseignées ici, ou une population de cellules dérivées de CSM de la lignée chondro-ostéoblastique telle qu'enseignée, comme les cellules pouvant servir de produit cellulaire (par exemple, des cellules dérivées de CSM de lignée chondro-ostéoblastique dans un milieu de cryopréservation).

Dans un mode de réalisation, les CSM peut être obtenues à partir d'un sujet sain, ce qui peut aider à assurer la fonctionnalité des cellules dérivées de CSM obtenues à partir desdites CSM.

Dans un autre mode de réalisation, les CSM sont obtenues à partir d'un sujet humain qui a besoin d'une transplantation de cellules dérivées de CSM.

Dans certains aspects de réalisation des méthodes, utilisations ou produits cellulaires tels qu'enseignés ici, les cellules CSM ou dérivées de la lignée chondro-ostéoblastique peuvent être allogéniques par rapport au sujet à traiter.

Les termes "allogénique” ou "homologue" en référence à des cellules CSM ou dérivées CSM de lignée chondro-ostéoblastique indiquent que les cellules CSM ou de lignée chondro- ostéoblastique dérivées de CSM proviennent d'un ou de plusieurs sujets (regroupés) autres que le sujet à contacter ou traiter avec les cellules dérivées de CSM.

Dans certains aspects de réalisation des méthodes, utilisations ou produits cellulaires tels qu'enseignés ici, les cellules CSM ou dérivées de la lignée chondro-ostéoblastique peuvent être autologues pour le sujet à traiter.

Le terme "autologue”, en référence aux cellules CSM ou dérivées de CSM de lignée chondro- ostéoblastique, indique que les cellules CSM ou dérivées de CSM de lignée chondro-ostéoblastique sont obtenues à partir du même sujet à contacter ou traiter avec les cellules de CSM de lignée chondro- ostéoblastique.

Dans certains modes de réalisations des méthodes, utilisations ou produits cellulaires tels qu'enseignés ici, les cellules de CSM ou dérivées de CSM de lignée chondro-ostéoblastique peuvent comprendre un mélange de cellules autologues et allogéniques (c'est-à-dire homologues). De préférence, les cellules CSM ou les cellules de lignée chondro-ostéoblastique dérivées de CSM sont allogéniques au sujet à traiter.

L'expression "cellules souches mésenchymateuses” ou "cellules dérivées de cellules CSM”, telle qu'elle est utilisée ici, désigne les cellules de lignée mésenchymateuse (par exemple, chondro-ostéoblastique (os et cartilage), ostéoblastique (os), chondroblastique (cartilage), myocytaire (muscle), ténocytaire (tendon), fibroblastique (tissu conjonctif), adipocytaire (graisse) ou stromogénique (stroma médullaire) lignée obtenue par différenciation des CSM, notamment par différenciation in vitro (incluant ex vivo) des CSM.

La différenciation des CSM peut impliquer la culture de CSM dans des conditions pouvant induire la différenciation des CSM vers le type de cellule désiré, plus typiquement la culture de CSM dans un milieu comprenant un ou plusieurs agents (par exemple, des facteurs de croissance) capables d'induire la différenciation des CSM vers le type cellulaire souhaité.

Les protocoles de différenciation des CSM sont connus en tant que tels (voir, entre autres, WO 2007/093431 ; et REGER, R.L. et al. « Differentiation and Characterization of Human CSMs » dans : Mesenchymal Stem Cell Assays and Applications : Methods and (Methods in Molecular Biology), édité par D.J.

Prockop et al.

Humana Press, 2008, vol. 449, p. 93- 107 ; VERMURI, M.C. et al (Eds.). Essais et applications des cellules souches mésenchymateuses (méthodes en biologie moléculaire). Humana Press, 2011, vol. 698, en particulier les pages 201 à 352). Le terme "facteur de croissance”, tel qu'il est utilisé ici, désigne une substance biologiquement active qui influence la prolifération, la croissance, la différenciation, la survie et/ou la migration de divers types de cellules et qui peut affecter les changements liés au développement, morphologiques et fonctionnels dans un organisme, seule ou lorsqu’elle est modulée par d'autres substances.

Un facteur de croissance peut généralement agir en se liant, en tant que ligand, à un récepteur (par exemple, un récepteur de surface ou intracellulaire) présent dans les cellules sensibles au facteur de croissance.

Un facteur de croissance peut être une entité protéique comprenant une ou plusieurs chaînes polypeptidiques.

Par exemple, et sans limitation, le terme "facteur de croissance" couvre les membres de la famille des facteurs de croissance des fibroblastes (FGF), de la famille des protéines morphogénétiques osseuses (BMP), de la famille des facteurs de croissance dérivés des plaquettes (PDGF), de la famille des facteurs de croissance transformants bêta (TGFB), de la famille des facteurs de croissance nerveux (NGF), de la famille des facteurs de croissance épidermique (EGF), de la famille des facteurs de croissance analogue à l'insuline

(IGF), de la famille des facteurs de différenciation de la croissance (GDF), de la famille des facteurs de croissance des hépatocytes (HGF), de la famille des facteurs de croissance hématopoïétiques (HeGF), de la famille des facteurs de croissance des cellules endothéliales dérivées des plaquettes (PD-ECGF), de l’angiopoïétine, de la famille des facteurs de croissance vasculaire endothéliale (VEGF), des glucocorticoïdes et similaires.

L’homme du métier comprendra que le facteur de croissance ou la combinaison de facteurs de croissance peut être n'importe quel facteur de croissance ou combinaison de facteurs de croissance connus pour être capables d'induire une différenciation des CSM vers un type cellulaire désiré.

L’homme du métier comprendra que les méthodes in vitro pour induire la différenciation des CSM vers un type de cellule désiré (par exemple, vers des cellules de lignée chondro-ostéoblastique) peuvent aboutir à une population cellulaire sensiblement pure (c'est-à-dire, composée principalement de) du type cellulaire désiré.

Sans limitation, la population cellulaire ainsi dérivée peut contenir au moins 90% (en nombre) du type de cellule désiré, comme par exemple 91%, >92%, =93%, >94%, >95%, >95%, >96%, 297%, 298%, >99%, ou 100% du type de cellule désiré.

En particulier, les cellules dérivées de CSM sont de lignée chondro-ostéoblastique (cartilage et os). Le terme "cellules dérivées de CSM de lignée chondro-ostéoblastique" tel qu'utilisé ici peut se référer à des cellules progénitrices qui ont la capacité de se différencier en cellules de la lignée ostéoblastique, tels que les chondro-ostéoblastes, ostéoprogéniteurs et/ou pré ostéoblastes et/ou ostéoblastes et/ou ostéocytes, ete, ou dans des cellules de la lignée chondroblastique, telles que les chondro-ostéoprogéniteurs, les chondroprogéniteurs et/ou les préchondroblastes et/ou les chondroblastes et/ou les chondrocytes.

L’homme du métier comprendra que les cellules progénitrices se différencieront soit en cellules de la lignée ostéoblastique (par exemple, pré-ostéoblastes ou ostéoblastes), soit en cellules de la lignée chondroblastique (par exemple, pré- ou chondroblastes) selon les conditions auxquelles elles sont exposées in vitro ou in vivo, comme les facteurs physiques, chimiques ou biologiques tels que les facteurs de croissance.

Dans certains mode de réalisation, la récitation "cellules de la lignée ostéoblastique" ou "cellules dérivées de CSM de la lignée ostéoblastique” peut se référer à des types de cellules ayant un phénotype ostéoblastique et qui peuvent contribuer ou sont capables de se développer en cellules pouvant contribuer à la formation de matière osseuse ou de matrice osseuse, comme les chondro-ostéoprogéniteurs, les ostéoprogéniteurs, les préostéoblastes, les ostéoblastes ou les ostéocytes, ou leurs mélanges. Les “ostéoprogéniteurs”, tels qu'ils sont utilisés ici, peuvent notamment comprendre les ostéoprogéniteurs précoces et tardifs. De préférence, les "cellules de la lignée ostéoblastique" ou les "cellules dérivées de CSM de la lignée ostéoblastique” peuvent également désigner les chondro-ostéoprogéniteurs, les ostéoprogéniteurs, les préostéoblastes ou les ostéoblastes, ou leurs mélanges, encore plus préférablement, l'expression peut se référer aux chondro-ostéoprogéniteurs ou aux pré-ostéoblastes ou ostéoblastes, ou à leurs mélanges, comme dans certains exemples l'expression peut se référer aux pré-ostéoblastes, ou dans certains autres exemples l'expression peut se référer aux ostéoblastes. Tous ces termes sont bien connus en soi.

Les ostéoprogéniteurs, les pré-ostéoblastes et les ostéoblastes, ainsi que les populations cellulaires comprenant des pré-ostéoblastes et/ou des ostéoblastes d'ostéoprogéniteurs peuvent présenter les caractéristiques suivantes au moyen de directives supplémentaires et sans limitation : a) les cellules comprennent l'expression du facteur de transcription 2 (Runx2), un facteur de transcription multifonctionnel qui régule la différenciation des ostéoblastes et l'expression de nombreux gènes de protéines de matrice extracellulaire pendant la différenciation des ostéoblastes ; b) les cellules comprennent l'expression d'au moins un des éléments suivants : la phosphatase alcaline (ALP), plus précisément l'ALP de type os-foie-rein ; et, plus préférentiellement, comprennent également l'expression d'un ou plusieurs marqueurs osseux supplémentaires tels que l'ostéocalcine (OCN, BGLAP), le propeptide amino-terminal procollagène de type 1 (PINP), l'ostéonectine (ON, SPARC), l'ostéopontine (OPST, SPP1, OPN) et/ou une sialoprotéine (BSP), et/ou une ou plusieurs protéines supplémentaires dans la matrice osseuse comme la décorine et/ou l'ostéoprotégérine (OPG) ; c) les cellules n'expriment pratiquement pas de CD45 (par exemple, moins d'environ 10%, de préférence moins de 5%, de préférence moins de 2% des cellules peuvent exprimer CD45) : d) les cellules présentent des signes d'aptitude à minéraliser l'environnement externe ou à synthétiser une matrice extracellulaire contenant du calcium (par exemple, lorsqu'elles sont exposées à un milieu ostéogénique ; voir Jaiswal et al. J Cell Biochem, 1997, vol. 64, 295-312). L'accumulation de calcium à l'intérieur des cellules et le dépôt dans les protéines matricielle peuvent être mesurés de façon conventionnelle, par exemple, par culture dans le Ca”, lavage et re-culture, puis détermination de toute radioactivité présente dans la cellule ou déposée dans la matrice extracellulaire (US 5,972,703), ou par un test de minéralisation à base de rouge d’alizarine (voir, par exemple, Gregory et al. Analytical Bioochemistry, 2004, vol. 329, 77-84) ;

e) les cellules ne se différencient sensiblement pas en cellules de la lignée adipocytaire (par exemple, les adipocytes) ou chondroblastique (par exemple, les chondroblastes, les chondrocytes). L'absence de différenciation vers de telles lignées cellulaires peut être évaluée en utilisant des conditions standard d'induction de différenciation établies dans l'art (par exemple, voir Pittenger et al.

Science, 1999, vol. 284, 143-7), et des méthodes de dosage (par exemple, lorsqu’ils sont induit, les adipocytes se colorent généralement avec de l’Oil Red O indiquant une accumulation lipidique ; les chondrocytes se colorent généralement avec du bleu alcian ou de la safranine-orange). L'absence substantielle de propension à la différenciation adipogénique et/ou chondrogénique peut typiquement signifier que moins de 20%, ou moins de 10%, ou moins de 10%, ou moins de 5%, ou moins de 1% des cellules testées présentent des signes de différenciation adipogène ou chondrogénique quand elles sont testées respectivement.

Dans certains modes de réalisation, les récitations "cellules de la lignée chondroblastique (cartilagineux)" ou "cellules dérivées de CSM de la lignée chondroblastique (cartilagineux)" peuvent désigner des types de cellules ayant un phénotype chondroblastique, et qui peuvent contribuer ou sont capables de se développer en cellules pouvant contribuer à la formation du cartilage ou à la matrice cartilagineuse.

Dans le présent document, les “chondroprogéniteurs" peuvent notamment comprendre les chondroprogéniteurs précoces et tardifs.

De préférence, les "cellules de la lignée chondroblastique (cartilagineux)" ou les “cellules dérivées de CSM de la lignée chondroblastique (cartilagineux)" peuvent désigner les chondro- ostéoprogéniteurs, les chondroprogéniteurs, les préchondroblastes ou les chondroblastes, ou leurs mélanges, encore plus préférablement, l'expression peut se référer à des pré-chondroblastes ou à des chondroblastes, ou à des mélanges de ceux-ci, comme dans certains exemples, l'expression peut se référer à des pré-chondroblastes, ou dans certains autres exemples, l'expression peut désigner des chondroblastes.

Tous ces termes sont bien connus en soi.

Les cellules de lignée chondro-ostéoblastique et/ou chondroblastique, telles que les chondro- ostéoprogéniteurs, les chondroprogéniteurs, les pré-chondroblastes et les chondroblastes, ainsi que les populations cellulaires comprenant des chondro-ostéoprogéniteurs, des chondroprogéniteurs, des pré- chondroblastes et/ou chondroblastes peuvent présenter les caractéristiques suivantes au moyen de directives supplémentaires et sans limitation a) les cellules comprennent l'expression de SOX9, un facteur de transcription qui joue un rôle central dans la différenciation des chondroblastes et la formation du cartilage ; b) les cellules comprennent l'expression d'au moins un des éléments suivants : aggrécane (ACAN), collagène de type II ou CD90 ; c) les cellules n'expriment pratiquement pas de CD45 (par exemple, moins d'environ 10%, de préférence moins de 5%, de préférence moins de 2% des cellules peuvent exprimer CD45) :

d) les cellules présentent des preuves de leur capacité à produire un taux élevé de collagène de types II, IX et XI et de protéoglycanes, les principaux constituants de la matrice extracellulaire hyaline (ECM) in situ. La formation du cartilage peut être mesurée de manière conventionnelle, par exemple, en utilisant un dosage safranine-orange/vert rapide pour colorer respectivement les protéoglycanes et les protéines non collagènes (voir, par exemple, Lee et al. Tissue Engineering, 2011, vol. 18, 484-98) ; €) les chondrocytes articulaires humains peuvent présenter des caractéristiques d'expression cellulaire résumées par Diaz-Romero et al. 2005 (J Cell Physiol, vol. 202(3), 731-42), par exemple, ils peuvent exprimer des intégrines et d'autres molécules d'adhésion (CD49a, CD49b, CD49c, CD49e, CD49f, CD51/61, CD54, CD106, CD166, CD58, CD44), les tétraspanines (CD9, CD63, CD81, CD82, CD151), les récepteurs (CD105, CD119, CD130, CD140a, CD221, CD95, CD120a, CD71, CD14), les ectoenzymes (CD10, CD26) et autres molécules de surface (CD90, CD99). Au cours d'une culture monocouche, les chondrocytes peuvent réguler à la hausse certains marqueurs considérés comme caractéristiques des cellules souches mésenchymateuses (CD10, CD90, CD105, CD166). Ces marqueurs peuvent donc aussi être exprimés par les pré-chondroblastes ou chondroblastes moins matures.

f) les cellules ne se différencient sensiblement pas en cellules de lignée adipocytaire (par exemple, les adipocytes) ou ostéoblastique (par exemple, les ostéoblastes ou les ostéocytes). L'absence de différenciation vers de telles lignées cellulaires peut être vérifiée en utilisant des conditions standard d'induction de différenciation établies dans l'art (par exemple, voir Pittenger et al. Science, 1999, vol. 284, 143-7), et des méthodes de dosage (par exemple, quand une différenciation adipogénique est induite, les adipocytes se colorent généralement avec de l’Oil Red O montrant une accumulation lipidique ; tandis que les préosteoblastes et ostéoblastes sont généralement détecté via le marquage de leur ALP). L'absence substantielle de propension à la différenciation adipogénique et/ou ostéoblastique peut typiquement signifier que moins de 20%, ou moins de 10%, ou moins de 10%, ou moins de 5%, ou moins de 1% des cellules testées présenteraient des signes de différenciation adipogénique ou ostéoblastique lorsqu'elles sont soumises au test correspondant.

Dans certains modes de réalisation, les cellules dérivées de CSM de la lignée chondro-ostéoblastique peuvent avoir des propriétés ostéogéniques.

Les termes "propriétés ostéogéniques", "potentiel ostéogénique" ou "activité ostéogénique” utilisés ici font référence à la capacité des cellules à se (trans)différencier en cellules sécrétant une matrice osseuse ou à la capacité des cellules à sécréter une matrice osseuse (c'est-à-dire, sans avoir recours à une étape de (trans)différenciation), in vivo et éventuellement in vitro. Le terme couvre la capacité des cellules à former du tissu osseux par ossification intramembranaire ou ossification endochondrale. La capacité des cellules à former du tissu osseux par ossification intramembranaire représente généralement la capacité des cellules à former du tissu osseux sans avoir besoin d'une matrice cartilagineuse calcifiée comme modèle. La capacité des cellules à former du tissu osseux par ossification endochondrale représente typiquement la capacité des cellules à former du tissu osseux en formant d'abord une matrice cartilagineuse calcifiée et en utilisant ensuite ladite matrice cartilagineuse calcifiée comme modèle pour la formation du tissu osseux. Le terme ne couvre pas pas le potentiel ostéoinductif des cellules.

Par exemple, la puissance cellulaire des cellules dérivées de CSM de lignée chondro-ostéoblastique peut être déterminée en mesurant l'activité ostéogénique de ces cellules. L'activité ostéogénique des cellules humaines dérivées de CSM de lignée chondro-ostéoblastique peut être mesurée in vivo par exemple en déterminant la présence d'au moins un nodule minéralisé (par exemple, d'origine humaine ou mixte homme-murine) après administration des cellules aux souris par injection sous-cutanée sur la voûte crânienne. L'activité ostéogénique des cellules humaines dérivées de CSM de lignée chondro- ostéoblastique peut être mesurée in vivo, par exemple en évaluant l'épaisseur de nodules nouvellement minéralisés (par exemple, d'origine humaine ou mixte homme-murine) après administration des cellules à des souris par injection sous-cutanée sur la voûte crânienne , ou en évaluant le degré de réparation osseuse dans un modèle murin de défaut sub-critique fémoral segmentaire (sub-CSD). Par exemple, des cellules CSM humaines de lignée chondro-ostéoblastique, telles que 2,5 x 10° cellules formulées dans un excipient de 100 ul, peuvent être administrées à des souris nude par une seule administration sous-cutanée sur la voûte crânienne . Pour marquer la néoformation osseuse au fil du temps, des fluorochromes de liaison au calcium comme le rouge d'alizarine (rouge), la calcéine (verte), la calcéine (bleue) et la tétracycline (jaune) peuvent être administrés séquentiellement à des souris par injection intrapéritonéale 3 jours avant et 4, 8 et 12 jours après l'administration cellulaire des cellules chondro-ostéoblastiques issues des CSM, respectivement. Les souris peuvent être euthanasiées 2 semaines après l'administration cellulaire et la voûte crânienne de chaque souris peut être prélevée pour évaluer les propriétés de formation osseuse par histomorphométrie (par exemple, la quantification de la formation osseuse). Les épaisseurs initiale et finale de la voûte crânienne peuvent être utilisées pour calculer le pourcentage de néoformation osseuse après administration des cellules. En outre, les propriétés de formation osseuse peuvent également être évaluées par immunofluorescence (par exemple, origine murine ou humaine de la formation osseuse). L'activité ostéoblastique peut être évaluée sur des sections de la voûte crânienne en utilisant la méthode de détection de l'activité enzymatique de l’ALP. L'activité ostéoclastique peut être évaluée sur des coupes de la voûte crânienne à l'aide des méthodes de détection de l'activité enzymatique TRAP. L'état de minéralisation de l'os néoformé peut être évalué en utilisant la coloration au Trichrome de Masson Goldner sur les sections de la voûte crânienne colorées à l'ALP par exemple, en utilisant des kits disponibles dans le commerce (par exemple, le Bio-Optica®). La formation du cartilage peut être évaluée à l'aide d'une coloration à la safranine-orange sur les sections de paraffine sagittale de la voûte crânienne. Dans un autre exemple, des cellules CSM humaines de lignée chondro-ostéoblastique, telles que des cellules de 1,25 x 10° formulées dans un excipient de 50 ul, peuvent être administrées localement à des souris au site du défaut osseux par injection percutanée un jour après avoir réalisé le défaut fémoral segmentaire sub-critique. La réparation osseuse peut être quantifiée par radiographie. La taille du défaut osseux peut être quantifiée en mesurant la distance entre les deux bords du défaut osseux.

Dans certains modes de réalisation, les cellules dérivées de CSM de la lignée chondro-ostéoblastique peuvent avoir des propriétés ostéoinductives. Les termes "propriétés ostéoinductives”, "potentiel ostéoinductif” ou "activité ostéoinductive" utilisés ici font référence à la capacité des cellules à attirer d'autres cellules sécrétant une matrice osseuse et/ou à induire la (trans)différenciation d'autres cellules en cellules secrétant une matrice osseuse. Par exemple, la puissance des cellules dérivées de CSM de lignée chondro-ostéoblastique peut être déterminée en mesurant l'activité ostéoinductive de ces cellules. La capacité des cellules dérivées de CSM de lignée chondro-ostéoblastique à induire la formation osseuse peut être mesurée in vivo, par exemple, en évaluant l'épaisseur de l'os nouvellement minéralisé après administration des cellules à des souris par injection sous-cutanée sur la voûte crânienne ou en évaluant la réparation osseuse dans un modèle murin de défaut fémoral segmentaire de taille sub-critique (sub-CSD). La capacité des cellules dérivées de CSM de lignée chondro-ostéoblastique à induire la formation osseuse peut également être mesurée par exemple, par l'évaluation de l'activité de la phosphatase alcaline (ALP) par une coloration du substrat ALP. Dans certains mode de réalisation, les cellules dérivées de CSM de la lignée chondro-ostéoblastique peuvent avoir à la fois des propriétés ostéoinductives et ostéogéniques. De manière avantageuse, les cellules dérivées de CSM de lignée chondro-ostéoblastique telles qu'enseignées ici, lors d'une transplantation chez un sujet qui en a besoin, permettent une néoformation osseuse qui dépasse la néoformation osseuse comparativement à une transplantation avec des CSM ou des cellules dérivées de CSM obtenues par des méthodes de l'art antérieur. Par exemple, mais sans s'y limiter, les marqueurs de surface cellulaire appropriés pour évaluer l'identité cellulaire des cellules de lignée chondro-ostéoblastique dérivées de CSM peuvent inclure les CD73, CD105, CD10 et CD44. Ces marqueurs de surface cellulaire peuvent par exemple, être détectés par des anticorps monoclonaux disponibles dans le commerce, tels que les anticorps monoclonaux marqués au fluorochrome permettant la détection cellulaire par cytométrie en flux. En particulier, les CD73 et CD105 sont des marqueurs mésenchymateux ; le CD44 est un marqueur d'adhésion ; et le CD10 est un marqueur ostéochondroblastique qui sont généralement exprimés par une fraction élevée de cellules dérivées de CSM de lignée chondro-ostéoblastique. La quantité de CD73 à la surface cellulaire des cellules dérivées de CSM de lignée chondro-ostéoblastique est généralement élevée ; la quantité de CD105 à la surface cellulaire des cellules dérivées de CSM de lignée chondro-ostéoblastique est généralement faible ; et la quantité de CD44 à la surface cellulaire des cellules dérivées de CSM de lignée chondro-ostéoblastique est normalement élevée.

En particulier, la quasi-totalité (par exemple, au moins 90% (en nombre), comme par exemple, 91%, >92%, >93%, >94%, >95%, >96%, 296%, >97%, >98%, >99%, ou 100%) des cellules issues de CSM de lignée chondro-ostéoblastique sont positives pour les CD73, CD105, CD44 et CD10.

Dans certains modes de réalisation, la quasi-totalité (par exemple, au moins 90 % (en nombre), telles que 291%, 292%, 293%, 294%, 295%, 295%, 296%, 296%, 297%, 298%, 299%, ou 100%) des cellules dérivées des CSM de lignée chondro-ostéoblastique sont négatives pour CD34.

En particulier, la quasi-totalité (par exemple, au moins 90% (en nombre), comme 291%, 292%, 293%, =94%, >95%, >96%, >96%, 297%, >98%, >99%, ou 100%) des cellules issues de CSM de lignée chondro-ostéoblastique sont positives pour CD73, CD105, CD44 et CD10 ; et pratiquement toutes (par exemple, au moins 90 % (en nombre), comme par exemple 291%, 292%, 293%, >94%, 295%, 296%, 296%, >96%, 297%, 297%, 298%, 299%, ou 100%) les cellules dérivées de CSM de lignée chondro- ostéoblastique sont négatives pour CD34.

Dans des modes de réalisation particuliers, la quasi-totalité (par exemple, au moins 90% (en nombre), comme par exemple 291%, 292%, 293%, >94%, 295%, 295%, 296%, 296%, 297%, 298%, 299%, ou 100%) des cellules dérivées de CSM de lignée chondro-ostéoblastique sont négatives pour CD45, CD34 et CD3.

En particulier, la quasi-totalité (par exemple, au moins 90% (en nombre), comme 291%, 292%, >93%, =94%, 295%, 296%, >96%, 297%, 298%, 299%, ou 100%) des cellules dérivées de CSM de lignée chondro-ostéoblastique sont positives pour CD73, CD105, CD44 et CD10 ; et pratiquement toutes (par exemple, au moins 90% (en nombre), comme par exemple >91%, 292%, 293%, 293%, 294%, >95%, 296%, 296%, 296%, 297%, 298%, 299%, ou 100%) les cellules dérivées des CSM de lignée chondro- ostéoblastique sont négatives pour CD45, CD34 et CD3.

En particulier, les cellules dérivées de CSM de lignée chondro-ostéoblastique ont une ou plusieurs médianes normalisées d'intensité de fluorescence (nMFI) pour CD73 (nMFlcps3) d'au moins 500, une nMFI pour CD44 (nMFlcpa44) d'au moins 100 ou une nMFI pour CD105 (nMFlepios) de 150 maximum. Par exemple, les cellules dérivées de CSM de lignée chondro-ostéoblastique ont un ou plusieurs des nMFIcp73 d'au moins 550, au moins 600, au moins 650, au moins 700, au moins 700, au moins 750, au moins 800, au moins 850 ou au moins 900 ; un nMFlcp4s d'au moins 110, au moins 120, au moins 130, au moins 140, au moins 140, au moins 150, au moins 200, au moins 250, au moins 300 ou au moins 350 ; ou un nMFlcp10s d'au plus 180, au plus 170, au plus 160, au plus 150, au plus 140, au plus 130, au plus 120, au plus 110 ou au plus 100. De préférence, les cellules dérivées de CSM de lignée chondro-ostéoblastique ont un nMFlçp73 d'au moins 500, un nMFlcpa44 d'au moins 100 et un nMFIcp19s de 150 au plus.

En particulier, la quasi-totalité des cellules (par exemple, au moins 90% (en nombre), telles que 291%, >92%, >93%, >94%, 95%, >95%, >96%, 97%, >98%, 99%, ou 100%) dérivées des cellules CSM de lignée chondro-ostéoblastique sont positives pour CD73, CD105, CD10 et CD44 (c’est-à-dire, CD73, CD105, CD10 et CD44 exprimés à la surface cellulaire), et les cellules dérivées de CSM de lignée chondro-ostéoblastique ont un ou plusieurs des nMFlcp73 d'au moins 500, nMFlep4 d'au moins 100 ou nMFlepios de 150 au plus.

Par exemple, la quasi-totalité (par exemple au moins 90% (en nombre), comme 291%, 292%, 93%, 293%, 294%, 295%, 296%, 296%, 297%, 298%, 299%, ou 100%) des cellules dérivées de CSM de lignée chondro-ostéoblastique sont positives pour CD73, CD105, CD10 et CD44 (c’est-à-dire, CD73, CD105, CD10 et CD44 sur la surface cellulaire), et les cellules dérivées de CSM de lignée chondro-ostéoblastique présentent une ou plusieurs cellules d'un nMFlçp73 d'au moins 550, au moins 600, au moins 650, au moins 700, au moins 750, au moins 800, au moins 850 ou au moins 900 ; un nMFlepu d'au moins 110, au moins 120, au moins 130, au moins 140, au moins 140, au moins 150, au moins 200, au moins 250, au moins 300 ou au moins 350 ; et un nMFlcp10s d'au plus 180, au plus 170, au plus 160, au plus 150, au plus 140, au plus 130, au plus 120, au plus 110 ou au plus 100. De préférence, la quasi-totalité (par exemple au moins 90% (en nombre), comme >91%, >92%, >93%, >93%, >94%, >95%, =96%, =96%, >96%, 297%, 298%, 299%, ou 100%) des cellules issues de CSM de lignée chondro-ostéoblastique sont positives aux CD73, CD105, CD10 et CD44 (c’est-à-dire, CD73, CD105, CD10 et CD44 exprimés à la surface cellulaire), et les cellules dérivées de CSM de lignée chondro- ostéoblastique ont un nMFlçp73 d'au moins 500, un nMFlcpa d'au moins 100 et un nMFlcpios de 150 au plus.

L’"intensité de fluorescence moyenne normalisée” ou "nMFI" telle qu'elle est utilisée ici se réfère au rapport entre la MFI de l'ensemble de la population cellulaire analysée marquée avec un ou plusieurs anticorps conjugués au fluorochrome et la MFI de la population cellulaire marquée avec un ou plusieurs anticorps anti-isotype conjugués au fluorochrome, comme l'immunoglobuline G (IgG) conjuguée à un fluorochrome comme l'isothiocyanate de fluorescéine (FITC), l'allophycocyanine (APC) ou la phycoérythrine (PE). Les résultats de I'nMFI sont proportionnels à la quantité de marqueurs présents à la surface cellulaire d'une population d'intérêt.

La (n)MFI est généralement liée à la longueur d'onde à laquelle l'émission du signal fluorescent est mesurée.

Les récitations "nMFI pour CD73" ou "nMFlcpas" utilisées ici se réfèrent au rapport entre la MFI de l'ensemble de la population cellulaire analysée marquée avec un anticorps conjugué APC contre le CD73 (par exemple BD Biosciences”, Cat N°:560847) et la MFI de la population cellulaire marquée avec contrôle IgG conjugué avec APC (par exemple BD Biosciences”, Cat N° : 555751). De préférence, le nMFIcps: est mesuré avec une longueur d'onde d'excitation de 633 nm et une longueur d'onde d'émission de 660 nm pour APC.

Les récitations " nMFI pour CD44" ou "nMFlcpaa" utilisées ici se réfèrent au rapport entre la MFI de l'ensemble de la population cellulaire analysée marquée avec un anticorps conjugué PE contre CD44 (par exemple BD Biosciences®, Cat N° : 550989) et la MFI de la population cellulaire marquée avec un IgG témoin conjugué avec PE (par exemple BD Biosciences®, Cat N° : 556650). De préférence, le nMFIcpas est mesuré avec une longueur d'onde d'excitation de 488 nm et une longueur d'onde d'émission de 580 nm pour PE.

Les récitations "nMFI pour CD105" ou "nMFlcpios" utilisées ici se réfèrent au rapport de la MFI de l'ensemble de la population cellulaire analysée marquée avec des anticorps conjugués APC contre CD105 (par exemple BD Biosciences”, Cat N° : 562408) à la MFI de la population cellulaire marquée avec contrôle IgG conjugué avec APC (par exemple BD Biosciences”, Cat N° : 555751). De préférence, le nMFlep105s est mesuré avec une longueur d'onde d'excitation de 633 nm et une longueur d'onde d'émission de 660 nm pour APC.

Les récitations "nMFI pour CD10" ou "“nMFlcpio" utilisées ici se réfèrent au rapport de la MFI de l'ensemble de la population cellulaire analysée marquée avec un anticorps conjugué PE contre CD10 (par exemple, BD Biosciences”, Cat N° : 555375) et celle de la population cellulaire marquée avec IgG conjugué avec PE (par exemple, BD Biosciences®, Cat N° : 556650). De préférence, la nMFlep1o est mesuré avec une longueur d'onde d'excitation de 488 nm et une longueur d'onde d'émission de 580 nm pour PE.

Comme décrit précédemment, les méthodes détaillées ci-dessus peuvent produire des cellules de lignée chondro-ostéoblastique dérivées de CSM, ou des populations de celles-ci, présentant des caractéristiques supérieures, comme en particulier (1) une expression élevée d'ALP, qui représente l'engagement de la cellule vers la lignée chondro-ostéoblastique ou ostéoblastique, et (it) une faible expression en HLA-DR, qui représente l'immunogénicité limitée des cellules dérivées de CSM de lignée ostéochondroblastique ou ostéoblastique, indiquant que les cellules sont plus appropriées pour la transplantation cellulaire, par exemple chez les sujets allogéniques.

Ainsi, en particulier, au moins 70 % (en nombre) (par exemple au moins 75 % (en nombre), comme par exemple >80%, 285%, 290%, 290%, 295%, 296%, 297%, 298%, 299%, ou 100%) des cellules dérivées de CSM de lignée chondro-ostéoblastique sont positives pour la phosphatase alcaline (ALP) ; et moins de 10% (en nombre) (par exemple, moins de 5 % (en nombre), par exemple moins de 3 %, moins de 2 % ou moins de 1 %) des cellules dérivées de CSM de lignée chondro-ostéoblastique sont positives pour le HLA-DR.

En particulier, la quasi-totalité (par exemple, au moins 90 % (en nombre), comme >91%, 292%, 93%, >94%, >95%, 296%, >96%, 297%, 298%, 299%, ou 100%) des cellules issues de CSM de lignée chondro-ostéoblastique sont positives pour CD73, CD105, CD10 et CD44 ; pratiquement toutes (par exemple, au moins 90 % (en nombre), comme par exemple 291%, =92%, =93%, >93%, >94%, 295%, >96%, 296%, 296%, 297%, >98%, 299%, ou 100%) Les cellules dérivées de CSM de lignée chondro- ostéoblastique sont négatives pour CD34 ; au moins 70% (par exemple, au moins 75 % (en nombre), comme par exemple =80%, >85%, >90%, 95%, 296%, 297%, >98%, 98%, 299%, ou 100%) des cellules dérivées de CSM de lignée chondro-ostéoblastique sont positives pour la phosphatase alcaline (ALP) ; et moins de 10% (par exemple, moins de 5 % (en nombre), par exemple moins de 3 %, moins de 2 % ou moins de 1 %) des cellules dérivées de CSM de lignée chondro-ostéoblastique sont positives pour le HLA-DR. En particulier, la quasi-totalité (par exemple, au moins 90 % (en nombre), comme >91%, 292%, 93%, >94%, >95%, >96%, >96%, =97%, >98%, >99%, ou 100%) des cellules issues de CSM de lignée chondro-ostéoblastique sont positives pour CD73, CD105, CD10 et CD44 ; pratiquement toutes (par exemple, au moins 90 % (en nombre), comme par exemple 291%, =92%, =93%, >93%, >94%, 295%, >96%, 296%, 296%, 297%, 298%, 299%, ou 100%). Les cellules dérivées de CSM de lignée chondro- ostéoblastique sont négatives pour CD45, CD34 et CD3 ; au moins 70% (par exemple, au moins 75 % (en nombre), comme par exemple 80%, =85%, 290%, 295%, >96%, 297%, >98%, >98%, 299%, ou 100%) des cellules dérivées de CSM de lignée chondro-ostéoblastique sont positives pour la phosphatase alcaline (ALP) ; et moins de 10% (par exemple, moins de 5 % (en nombre), par exemple moins de 3 %, moins de 2 % ou moins de 1 %) des cellules dérivées de CSM de lignée chondro-ostéoblastique sont positives pour le HLA-DR.

Lorsqu'une cellule est dite positive pour un marqueur particulier (ou pour exprimer ou comprendre l'expression d'un marqueur particulier), cela signifie qu'une personne qualifiée conclura à la présence ou à la preuve d'un signal distinct, par exemple détectable par des anticorps ou détectable par une réaction en chaîne de polymérase à transcription inverse, pour ce marqueur lorsqu'elle effectue la mesure appropriée, par rapport aux témoins adéquats. Lorsque la méthode permet une évaluation quantitative du marqueur, les cellules positives peuvent en moyenne générer un signal significativement différent du témoin, par exemple, mais sans limitation, au moins 1,5 fois plus élevé que le signal généré par les cellules témoins, par exemple au moins 2 fois, au moins 4 fois, au moins 10 fois, au moins 20 fois, au moins 30 fois, au moins 40 fois, au moins 50 fois plus ou même plus.

L'expression des marqueurs spécifiques des cellules ci-dessus peut être détectée à l'aide de toute technique immunologique appropriée connue dans l'art, telle que l'immunohitochimie ou l'adsorption par affinité, l'analyse par Western blot, la cytométrie en flux, l’ELISA, etc, ou par tout dosage biochimique approprié de l'activité enzymatique (par exemple pour l’ALP) ou par toute technique appropriée pour mesurer la quantité du mRNA du marqueur, comme le Northern blot, RT-PCR semiquantitative ou quantitative, etc. Les données de séquence pour les marqueurs énumérés dans cette divulgation sont connues et peuvent être obtenues à partir de bases de données publiques telles que GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/).

Dans certains modes de réalisation, les cellules de la lignée chondro-ostéoblastique dérivées de CSM peuvent être des cellules animales, de préférence des cellules animales à sang chaud, plus préférentiellement des cellules de mammifères, telles que des cellules humaines ou non humaines, et plus particulièrement des cellules humaines.

Le terme "in vitro", tel qu'il est utilisé ici, désigne extérieur au corps animal ou humain. Le terme "in vitro", tel qu'il est utilisé dans le présent document, doit être compris comme incluant "ex vivo”. Le terme "ex vivo" désigne généralement les tissus ou cellules prélevés sur le corps d'un animal ou d'un être humain etconservés ou propagés à l'extérieur du corps, par exemple dans un récipient de culture.

Les cellules dérivées de CSM de lignée chondro-ostéoblastique telles que prévues ici sont de préférence adhérentes, c'est-à-dire qu'elles ont besoin d'une surface pour leur croissance, et se développent généralement en monocouche adhérente sur ladite surface (c'est-à-dire en culture cellulaire adhérente), plutôt que comme des cellules en suspension dans un milieu de culture (culture en suspension).

L'adhésion des cellules à une surface, telle que la surface d'un récipient en plastique de culture tissulaire, peut être facilement examinée par inspection visuelle au microscope inversé. Les cellules cultivées en culture adhérente nécessitent un passage périodique, dans lequel les cellules peuvent être décollées de la surface par voie enzymatique (par exemple à l'aide de trypsine), mises en suspension dans le milieu de croissance et réensemencées dans un ou plusieurs nouveaux récipients de culture. En général, une surface ou un substrat qui permet l'adhérence des cellules à celui-ci peut être tout substrat sensiblement hydrophile. Comme reconnu dans l'art, les récipients de culture de tissus, par exemple les flacons de culture, les plaques de puits, les plats ou autres, peuvent généralement être faits d'une grande variété de matériaux polymères, convenablement traités en surface ou revêtus après moulage afin d'obtenir des surfaces hydrophiles du substrat. Le terme "contact" tel qu'utilisé ici signifie réunir, directement ou indirectement, un€ ou plusieurs molécules, composants ou matériaux avec un(e) autre, facilitant ainsi les interactions entre eux(elles). Généralement, un ou plusieurs agents capables d'induire l'expansion et/ou la différenciation de CSM ou cellules dérivées de CSM peuvent être mis en contact avec des CSM ou cellules dérivées de CSM par leur inclusion dans les milieux dans lesquels les cellules CSM ou dérivées de CSM sont mises en culture.

Dans certains cas, les méthodes enseignées ici peuvent comprendre (a) la culture de CSM provenant d'un échantillon biologique d'un sujet dans un milieu de culture comprenant du FGF-2, du TGFß et de l'héparine ou un dérivé ou analogue de celle-ci à une concentration d'au moins 0,01 Ul/ml, obtenant ainsi des cellules dérivées de CSM. L'étape (a) peut également être appelée ici "culture primaire”.

L'expression "facteur de croissance des fibroblastes 2 (FGF-2)", "FGF de base”, "FGF-b", "FGFB", "BFGF", "facteur de croissance liant l'héparine 2 (HBGF-2)" ou "prostatropine" peut être utilisée de façon interchangeable et désigne un membre ainsi connu de la famille du facteur de croissance des fibroblastes. Les inventeurs ont réalisé que le FGF-2 est particulièrement efficace dans la méthode de la présente invention. Les termes "facteur de croissance transformant bêta (TGFB)", "TGFB" ou "TGFbeta" utilisés ici font référence à un membre de la famille du facteur de croissance transformant bêta (TGFB). Les inventeurs ont réalisé que TGFP est particulièrement efficace dans la méthode de la présente invention. Dans un autre mode de réalisation, ledit membre de la famille du TGFPB est choisi parmi un groupe constitué de TGF-beta-1, TGF-beta-2, TGF-beta-3, TGF-beta-4, GDF1 (facteur de différenciation de croissance 1), GDF-2, GDF-3, GDF-5, GDF-6, GDF-7, GDF-8, GDF-9, GDF-11, GDF-15, INHA (chaîne inhibine alpha), INHBA (chaîne inhibine beta A), INHBB (chaîne inhibine bêta B), INHBC (chaîne inhibine bêta C), INHBE (chaîne inhibine bêta F), MIS (facteur inhibiteur de Muellerian), et d'autres membres de la sous-famille du GDNF, dont GDNF (facteur neurotrophique dérivé de la lignée gliale), NRTN (neurine), PSPN (persephin) et leurs mélanges.

Dans certains mode de réalisation des méthodes, utilisations ou produits cellulaires tels qu'enseignés ici, le TGFB peut être choisi parmis le groupe constitué de TGFB1, TGFB2, TGFP3, et leurs mélanges. De préférence, le TGFB est du TGFB1.

Dans un autre cas, les CSM ou cellules dérivées de CSM peuvent être - en plus du FGF-2 et du TGFB - contactées avec un ou plusieurs facteurs de croissance exogènes supplémentaires, autres que le FGF-2 et le TGFP. Dans un autre cas, FGF-2 et TGFP peuvent être les seuls facteurs de croissance exogènes avec lesquels les cCSM ou cellules dérivées de CSM sont en contact.

Dans un mode de réalisation préféré, le facteur de croissance utilisé dans la méthode actuelle est un facteur de croissance humain. Dans le présent document, l'expression "facteur de croissance humain" — désigne un facteur de croissance, essentiellement le même qu'un facteur de croissance humain naturel. Par exemple, lorsque le facteur de croissance est une entité protéique, son ou ses peptides ou polypeptides constitutifs peuvent avoir une séquence d'acides aminés primaires identique à un facteur de croissance humain naturel. L'utilisation de facteurs de croissance humains dans la méthode actuelle est préférable, car on s'attend à ce que ces facteurs de croissance aient un effet souhaitable sur la fonction cellulaire.

Le terme "naturel" est utilisé pour décrire un objet ou une entité que l'on peut trouver dans la nature et qui n'est pas produit artificiellement par l'homme. Par exemple, une séquence polypeptidique présente dans un organisme, qui peut être isolée d'une source dans la nature et qui n'a pas été modifiée intentionnellement par l'homme en laboratoire, se produit naturellement. Lorsqu'on se réfère à une entité particulière, par exemple un polypeptide ou une protéine, le terme couvre toutes les formes et variantes de celle-ci qui apparaissent dans la nature, par exemple en raison d'une variation normale entre individus. Par exemple, lorsqu'on fait référence à un facteur de croissance protéique, l'expression "d'origine naturelle” englobe les facteurs de croissance ayant des différences dans la séquence primaire de leur(s) peptide(s) ou polypeptide(s) constituant(s) en raison des variations alléliques normales entre individus.

La présente méthode peut utiliser une variante ou un fragment biologiquement actif d'un facteur de croissance. Dans la méthode de l'invention, les variants ou fragments "biologiquement actifs” d'un facteur de croissance atteignent au moins à peu près le même degré d'obtention de cellules de lignée chondro- ostéoblastique dérivées de CSM que celui enseigné ici à partir de CSMs comme facteur de croissance respectif, lorsque les autres conditions sont sensiblement les mêmes.

Un "variant" d'un polypeptide a une séquence d'acides aminés qui est sensiblement identique (c'est-à-dire largement mais pas totalement identique) à la séquence d'acides aminés du polypeptide. Par "sensiblement identique", on entend au moins 85 % identique, c'est-à-dire au moins 90 % identique, de préférence au moins 95 % identique, c'est-à-dire au moins 99 % identique. Des différences de séquence peuvent résulter de l'insertion (addition), de la suppression et/ou de la substitution d'un ou plusieurs acides aminés.

Dans un autre cas, les facteurs de croissance utilisés dans la présente méthode, à savoir au moins les FGF- 2 et TGFP, peuvent être des facteurs de croissance animaux non humains, et en particulier des facteurs de croissance mammifères non humains, ou des variantes ou dérivés biologiquement actifs de ceux-ci. Dans le présent document, les termes "facteur de croissance animal non humain" et "facteur de croissance mammifère non humain" désignent un facteur de croissance sensiblement le même que, respectivement, un facteur de croissance animal non humain naturel ou non humain. Par exemple, lorsque le facteur de croissance est une entité protéique, son ou ses peptides ou polypeptides constitutifs peuvent avoir une séquence d'acides aminés primaires identique à celle d'un facteur de croissance naturel non humain, animal ou mammifère non humain. Une personne qualifiée comprendra que des facteurs de croissance de mammifères non humains ou animaux non humains peuvent s'appliquer dans la présente méthode, — quoique dans une moindre mesure que les facteurs de croissance animaux humains, puisque ces derniers sont de la même origine que les cellules CSM. En particulier, des facteurs de croissance non humains, animaux ou mammifères, peuvent être utilisés s'ils produisent l'effet désiré, par exemple un effet similaire à un facteur de croissance humain (analogue).

Dans un mode de réalisation préférée, les facteurs de croissance ou une variante ou un dérivé biologiquement actif de ceux-ci sont recombinants, c'est-à-dire produits par un organisme hôte par l'expression d'une molécule d'acide nucléique recombinant, qui a été introduite dans l'organisme hôte ou un de ses ancêtres, et qui comprend une séquence codant ledit polypeptide. L'expression "molécule d'acide nucléique recombinant” utilisée ici désigne une molécule d'acide nucléique (par exemple, une molécule d'ADN ou d'ADNc) qui est composée de segments reliés entre eux par une technologie d'ADN recombinant.

Dans certain modes de réalisation des méthodes, utilisations ou produits cellulaires tels qu'enseignés ici, les cellules CSM ou cellules dérivées de CSM sont, en outre, mises en contact avec, un milieu qui comprend, en outre, le plasma, sérum ou un substitut de ceux-ci ou une combinaison de ceux-ci. Le terme "plasma" est tel que défini conventionnellement et comprend le plasma frais, le plasma congelé puis décongelé, le plasma traité au moyen d'un solvant ou d'un détergent, le plasma transformé (par exemple, le PRP) ou un mélange de deux ou plusieurs de ces éléments. Le plasma est habituellement obtenu à partir d'un échantillon de sang total, fourni ou mis en contact avec un anticoagulant (par exemple, l’héparine (à de très faibles concentrations, habituellement environ 15 x105 Ul/ml) le citrate, oxalate ou EDTA). Ensuite, les composants cellulaires de l'échantillon sanguin sont séparés du composant liquide (plasma) par une technique appropriée, généralement par centrifugation. Au moyen d'un exemple spécifique mais non limitatif, pour obtenir du plasma utilisable dans la présente invention, un échantillon de sang peut être prélevé dans un tube sous vide contenant l'anticoagulant EDTA (acide éthylènediaminetétraacétique) (par exemple, tube plastique BD Vacutainer EDTA, 10 ml, 1,8 mg/mL). L'échantillon est délicatement agité, puis centrifugé pendant 10 minutes à température ambiante à 1000- 2000 g pour séparer le plasma des globules rouges. Le surnageant (plasma) est recueilli, éventuellement mis en commun (si plusieurs échantillons de sang sont utilisés) et aliquoté dans des fioles pour cryoconservation, qui sont conservés à -80°C jusqu'à l'utilisation. Le terme "plasma" désigne une composition qui ne fait pas partie du corps humain ou animal. Le terme "plasma" peut, dans certains cas, inclure spécifiquement le plasma transformé, c'est-à-dire le plasma soumis après sa séparation du sang total à une ou plusieurs étapes de transformation qui modifient sa composition, en particulier sa composition chimique, biochimique ou cellulaire. Par conséquent, le terme "plasma" tel qu'il est entendu ici, peut inclure le plasma riche en plaquettes (PRP), c'est-à-dire le plasma qui a été enrichi en plaquettes. Typiquement, le PRP peut contenir environ 1,0x10° plaquettes/ul, alors que la concentration plaquettaire dans le sang total peut être d'environ 1,5x10° à 3,5x10°/uL.

Le plasma peut être traité au solvant ou au détergent. Les termes "plasma traité par solvant ou détergent", “plasma traité par S/D" ou "plasma S/D" désignent généralement un plasma décellularisé pouvant être obtenu ou obtenu par un procédé comprenant les étapes : (a) le traitement du plasma avec un solvant et un détergent et (b) la filtration du plasma traité avec un solvant ou un détergent. Les solvants appropriés pour un tel traitement sont les solvants tels que les di- ou trialkylphosphates et les détergents qui sont décrits dans la norme US 4.764.369. Le détergent utilisé pour la préparation du plasma S/D est de préférence un détergent non toxique (par exemple le Tween® 20 ou le Tween® 80).

Le terme "sérum” a la définition conventionnelle et comprend le sérum frais, le sérum congelé puis décongelé ou le sérum préparé à partir de plasma, ou un mélange de deux ou plusieurs de ceux-ci. Le sérum peut généralement être obtenu à partir d'un échantillon de sang total en permettant d'abord la coagulation dans l'échantillon, puis en séparant le caillot ainsi formé et les composants cellulaires de l'échantillon de sang du composant liquide (sérum) par une technique appropriée, généralement par centrifugation. La coagulation peut être facilitée par un catalyseur inerte, par exemple des billes de verre ou de la poudre. Alternativement, le sérum peut être obtenu à partir du plasma en éliminant l'anticoagulant et la fibrine. Au moyen d'un exemple spécifique mais non limitatif, pour obtenir un sérum adapté à l'utilisation dans la présente invention, un échantillon de sang peut être prélevé dans un tube de vacutainer ne contenant aucun anticoagulant (par exemple un tube de sérum plastique BD Vacutainer Plus, 10 ml) et incubé pendant 30 à 45 minutes à température ambiante pour permettre la formation de caillots. Le tube est ensuite centrifugé pendant 15 minutes à température ambiante à 1.000-2.000 g pour séparer le sérum des globules rouges. Le surnageant (sérum) est prélevé, éventuellement mis en commun (si plusieurs échantillons de sang sont utilisés) et aliquoté dans des cryofioles qui sont conservées à -80°C jusqu'à utilisation. Le terme "sérum” désigne donc une composition acellulaire qui ne fait pas partie du corps humain ou animal. Le sérum tel qu'il est prévu ici est du sérum humain, c'est-à-dire obtenu à partir d'un seul sujet humain ou d'une pluralité de sujets humains (par exemple, un mélange de sérums). Le sérum peut être du sérum non traité, c'est-à-dire du sérum obtenu par séparation du sang total et non soumis à des étapes de traitement en aval qui modifient sa composition chimique, biochimique ou cellulaire, autres que l'inactivation thermique, le stockage (cryogénique ou non cryogénique), la stérilisation, la lyophilisation et/ou la filtration. Dans certains cas, le sérum peut être obtenu à partir de plasma traité au solvant ou au détergent.

Le plasma isolé, le sérum ou son substitut peuvent être utilisés directement dans la méthode de la présente invention. Ils peuvent également être conservés de manière appropriée pour une utilisation ultérieure (par exemple, pendant des périodes plus courtes, par exemple jusqu'à environ 1-2 semaines, à une température supérieure aux points de congélation respectifs du plasma, du sérum ou de son substitut, mais inférieure à la température ambiante, cette température sera généralement d'environ 4°C à 5°C ; ou pendant des périodes plus longues par conservation au froid, généralement entre environ -70°C et environ -80°C).

Le plasma isolé, le sérum ou son substitut peuvent être inactivés à la chaleur comme connu dans l'art, en particulier pour éliminer le complément. Lorsque la présente méthode utilise du plasma, du sérum ou un substitut de celui-ci autologue aux cellules cultivées en présence de celui-ci, il peut être inutile d'inactiver le plasma, le sérum ou le substitut de celui-ci par chauffage. Lorsque le plasma, le sérum ou son substitut est au moins partiellement allogénique aux cellules cultivées, il peut être avantageux d'inactiver le plasma, le sérum ou leur substitut par chauffage. En option, le plasma, le sérum ou son substitut peut également être stérilisé avant l'entreposage ou l'utilisation, à l'aide de filtres microbiologiques conventionnels, de préférence avec une taille de pores de 0,2 um ou moins.

Dans un mode de réalisation, la présente méthode peut employer du plasma humain, du sérum ou un substitut de celui-ci autologue des CSM humaines ou des cellules dérivées de CSM. Le terme "autologue", en ce qui concerne le plasma, le sérum ou son substitut, signifie que le plasma, le sérum ou son substitut est obtenu à partir du même sujet que les CSM ou cellules dérivées de CSM misent en contact avec ledit plasma, sérum ou son substitut. L'utilisation de plasma autologue, de sérum ou de son substitut peut assurer une acceptation optimale des cellules par le sujet et/ou éviter la transmission accidentelle d'agents infectieux provenant, par exemple, d'autres sérums.

Dans une autre réalisation, la méthode peut employer du plasma humain, du sérum ou un substitut de celui-ci qui est "homologue" ou "allogénique" à des cellules humaines CSM ou dérivées de CSM, c'est-à- dire obtenues à partir d'un ou plusieurs sujets humains (regroupés) autres que le sujet dont les CSM sont obtenus.

Dans un autre cas, la méthode peut utiliser un mélange de plasma autologue et allogénique (c'est-à-dire homologue), de sérums ou de leurs substituts tels que définis ci-dessus. L'expression "substitut de sérum ou de plasma”, telle qu'elle est utilisée ici, désigne une composition naturelle ou artificielle non toxique ayant une ou plusieurs des fonctions du plasma et/ou du sérum, telles que les compositions capables d'induire la croissance et/ou l'expansion des CSM ou cellules dérivées de CSM. Parmi les exemples non limitatifs de substituts du sérum ou du plasma, mentionnons le lysat plaquettaire et les compositions pour culture cellulaire comprenant un ou plusieurs composants fractionnés du plasma ou du sérum, comme l'albumine sérique humaine. Une personne compétente sait que le plasma humain, le sérum et leurs substituts sont des compositions biologiques complexes, qui peuvent comprendre un ou plusieurs facteurs de croissance, cytokines ou hormones.

Il est prévu que les facteurs de croissance FGF-2 et TGFP ou leurs variantes ou dérivés biologiquement actifs respectifs soient fournis en complément, c'est-à-dire de manière exogène ou en complément, d'un ou plusieurs plasmas, sérums ou de leurs substituts.

Le terme "héparine” utilisé ici désigne un polymère de la famille des glycosaminoglycanes d'hydrates de carbone ayant un poids moléculaire compris entre 3 et 30 kDa caractérisée par ses effets anticoagulants. L'activité de l'héparine ou d'un de ses dérivés ou analogues peut être déterminée in vitro par un dosage biologique dans lequel la concentration d'héparine nécessaire pour empêcher la coagulation des ovins ou des caprins ou du plasma humain est comparée à la concentration d'un étalon de référence accepté à l'échelle internationale, un étalon de référence accepté à l'échelle internationale fondé sur les unités d'activité héparinique par milligramme. Un mg d'héparine équivaut généralement à 140 à 180 unités internationales (UD).

Le terme "UI" ou "unités internationales" est une mesure standard de la quantité d'une substance biologique exprimée en tant qu'activité ou effet biologique de ladite substance biologique. Pour chaque substance à laquelle cette unité est affectée, une activité ou un effet biologique internationalement accepté est attendu avec une dose de 1 UI lorsque testé selon une procédure biologique internationalement acceptée.

Dans certains cas, l'héparine ou son dérivé ou analogue peut être choisi dans le groupe constitué par l'héparine non fractionnée (HNF) ; l'héparine de faible poids moléculaire (HBPM), comme l'énoxaparine, la daltéparine, la nadroparine, la tinzaparine, la certoparine, la cétoparine, la reviparine, la variparine, l'ardéparine, la parnaparine, la bémiparine ou leurs mélanges ; un héparinoïde, tel que le sulfate d'héparine, le sulfate de dermatane, le sulfate de chondroitine, le sulfate d'acharane, le sulfate de kératane, ou leurs mélanges, tels que le danaparoïde, un sel d'héparine, un sel héparinoïde, un fragment d’héparine, un fragment héparinoïde et leurs mélanges. De préférence, l'héparine ou le dérivé ou analogue de l'héparine est choisi dans le groupe constitué par l'HNF, la daltéparine, le danaparoïde et le sulfate d'héparine.

En particulier, les incorporations, dites FGF-2, dites TGFB, dites héparine ou un dérivé ou analogue de celle-ci, et facultativement un ou plusieurs éléments parmi le plasma, le sérum ou substitut de celui-ci, sont inclus dans un milieu, généralement un milieu de culture cellulaire liquide. Typiquement, le milieu comprendra une formulation de milieu basal telle que connue dans l'art. De nombreuses formulations de milieux de base (provenant par exemple de l'American Type Culture Collection, ATCC ; ou d'Invitrogen, Carlsbad, Californie) peut être utilisé pour cultiver les cellules ici présentes, y compris, mais sans s'y limiter, le milieu minimal essentiel d'Eagle (MEM), le milieu minimal essentiel modifié d'Eagle (DMEM) de Dulbecco et le milieu minimal essentiel modifié par alpha (Alpha-MEM), le Basal Medium Essential (BME), BGJb, F-12 Nutrient Mixture (Ham), Iscove Modified Dulbecco's Medium (IMDM), ou X- VIVO"" (qualité clinique), disponible chez Invitrogen ou Cambrex (New Jersey), et leurs modifications et/ou combinaisons. Les compositions des milieux de base ci-dessus sont généralement connues dans l'art et il est de la compétence de l'un dans l'art de modifier ou de moduler les concentrations des milieux et/ou des suppléments de milieux selon les besoins des cellules cultivées. De telles formulations de milieux de base contiennent des ingrédients nécessaires au développement des cellules de mammifères, qui sont connus en soi. À titre d'illustration et sans limitation, ces ingrédients peuvent inclure les sels inorganiques (en particulier les sels contenant Na, K, Mg, Ca, CI, P et éventuellement Cu, Fe, Se et Zn), les solutions tampons physiologiques (par exemple HEPES, bicarbonate), les nucléotides, nucléosides et/ou bases nucléiques, ribose, désoxyribose, acides aminés, vitamines, antioxydants (par exemple glutathione) et sources de carbone (glucose, sodium pyruvate, acétate de sodium) etc.

Pour une utilisation en culture, les milieux de base peuvent être fournis avec un ou plusieurs autres composants. Par exemple, des suppléments supplémentaires peuvent être utilisés pour fournir aux cellules les oligo-éléments et les substances nécessaires à une croissance et une expansion optimales. Ces suppléments comprennent l'insuline, la transferrine, les sels de sélénium et leurs combinaisons. Ces composants peuvent être inclus dans une solution saline telle que, mais sans s'y limiter, la solution saline équilibrée de Hanks (HBSS), Earle's Salt Solution. D'autres suppléments antioxydants peuvent être ajoutés, par exemple du P-mercaptoéthanol. Bien que de nombreux milieux de base contiennent déjà des acides aminés, certains acides aminés peuvent être ajouté plus tard, par exemple la L-glutamine, qui est connue pour être moins stable en solution.

Un milieu peut également être enrichi par la suite avec des antibiotiques et/ou des composés antimycosiques, tels que, typiquement, des mélanges de pénicilline et de streptomycine, et/ou d'autres composés, dont l'amphotéricine est un exemple, mais pas exclusivement,

ampicilline, gentamicine, bléomycine, hygromycine, kanamycine, mitomycine, acide mycophénolique, acide nalidixique, néomycine, nystatine, paromomycine, polymyxine, puromycine, rifampicine, spectinomycine, tétracycline, tylosine et zéocine.

Les lipides et les supports lipidiques peuvent également être ajoutés aux milieux de culture cellulaire.

Ces lipides et supports peuvent comprendre, entre autres, la cyclodextrine, le cholestérol, l'acide linoléique conjugué à l'albumine, l'acide linoléique et l'acide oléique conjugué à l'albumine, l'acide linoléique non conjugué, l'acide linoléique-arachidonique non conjugué et l'acide oléique-alcooléique-alcoolique conjugué à l'albumine, et d'autres.

L'albumine peut également être utilisée dans des formulations sans acides gras.

En particulier, un ou plusieurs éléments parmi le plasma humain, du sérum ou d'un substitut de celui-ci peuvent être compris dans lesdits milieux à une proportion (volume d'un ou plusieurs du plasma, du sérum ou d'un substitut de celui-ci / volume du milieu) entre environ 0,5% et environ 30%, de préférence entre environ 1% et environ 15%, plus précisément entre 2% et 10%. Les méthodes actuelles peuvent donner des résultats satisfaisants avec des quantités relativement faibles d'un ou de plusieurs plasmas, sérums ou leurs substituts, par exemple environ 5 ou 10 % en volume ou moins, par exemple environ 1, environ 2, environ 3 ou environ 4 % en volume, permettant de diminuer le volume d'un ou plusieurs plasmas, sérums ou leurs substituts qui doivent être obtenus afin de cultiver les cellules CSM ou dérivées CSM.

Dans d'autres cas encore, un ou plusieurs produits plasmatiques concentrés (par exemple des concentrés plasmatiques tels que des concentrés de plasma congelé), des produits sériques concentrés ou des produits d'un substitut concentré du plasma ou du sérum peuvent être utilisés.

Ces produits concentrés peuvent être inclus dans la composition à une concentration inférieure à la concentration souhaitée d'un ou de plusieurs plasmas, sérums ou leurs substituts, de manière à concurrencer (contrebalancer, compenser) le facteur de concentration.

En particulier, on peut utiliser des incorporations, des combinaisons ou des mélanges de deux ou plusieurs plasmas, sérums humains et/ou un substitut de ceux-ci.

Dans certains modes de réalisation particuliers, les FGF-2 et TGFP sont compris dans ledit milieu à des concentrations suffisantes pour induire une différenciation vers un type de cellule désiré.

Dans certains modes de réalisation particuliers, les FGF-2 et TGFP sont compris dans ledit milieu à des concentrations suffisantes pour induire la différenciation de CSM en cellules dérivées de CSM d'une lignée chondro-ostéoblastique.

En règle générale, le FGF-2 ou un variant ou fragment biologiquement actif de celui-ci peut être inclus dans le milieu à une concentration comprise entre 0,1 et 100 ng/ml, de préférence entre 0,5 et 20 ng/ml, par exemple à environ 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7 ou 6 ng/ml ou à environ 5 ng/ml ou moins, par exemple à environ 4, 3, 2, 1 ou 0,5 ng/ml. En règle générale, le TGFP, comme le TGFf1, ou une variante biologiquement active ou des fragments de celle-ci peuvent être inclus dans le milieu à une concentration comprise entre 0,1 et 100 ng/ml, de préférence entre 0,25 et 20 ng/ml, par exemple à environ 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7 ou 6 ng/ml ou à environ 5 ng/ml ou moins, par exemple à environ 4, 3, 2, 1 ou 0,5 ng/ml. Ces valeurs se réfèrent aux concentrations des facteurs de croissance respectifs ou d'une variante biologiquement active ou de fragments de celle-ci, telles que complétées de manière exogène dans le milieu.

En particulier, l'héparine ou un dérivé ou analogue de celle-ci est contenue dans ledit milieu à une concentration d'au moins 0,01 Ul/ml, au moins 0,02 Ul/ml, au moins 0,03 Ul/ml, au moins 0,04 UV/ml, au moins 0,05 UlI/ml, au moins 0,06 Ul/ml, au moins 0,07 Ul/ml, au moins 0.08 Ul/ml, au moins 0,09 UI/ml, au moins 0,1 Ul/ml, au moins 0.5 Ul/ml, au moins 1 Ul/ml, au moins 5 UV/ml, au moins 5 Ul/ml, au moins 10 Ul/ml, au moins 20 Ul/mIl, au moins 30 Ul/ml, au moins 40 Ul/mIl, au moins 50 Ul/ml, au moins 60 Ul/ml, au moins 70 Ul/ml, au moins 80 Ul/ml, au moins 90 Ul/ml, au moins 100 Ul/ml. En particulier, l'héparine ou un dérivé ou analogue de celle-ci est contenue dans ledit milieu à une concentration d'au moins 0,10 Ul/ml. Dans certains modes de réalisation préférés, l'héparine ou un dérivé ou analogue de celle-ci est contenue dans ledit milieu à une concentration d'environ 0,1 Ul/ml. Dans certaines incorporations, l'héparine ou un dérivé ou analogue de celle-ci peut être contenue dans ledit milieu à une concentration d'environ 0,10 TU/ml, 0,20 IU/ml, 0,30 IU/ml, 0,40 IU/ml, 0,50 IU/ml, 0,60 IU/ml, 0,70 IU/ml, 0,80 IU/ml, 0,90 IU/ml ou 1,0 IU/ml.

Dans certains cas, la concentration d'héparine ou de ses dérivés ou analogues ou analogues peut être d'au moins 0,05 UI/ml, de préférence d'environ 0,1 Ul/ml Dans un mode de réalisation, les concentrations ci-dessus peuvent se référer à la concentration totale de facteurs de croissance ou de variants biologiquement actifs ou de fragments de ceux-ci ou de ladite héparine ou de son dérivé ou analogue dans le milieu, c'est-à-dire à la concentration totale desdits facteurs de croissance ou variants biologiquement actifs ou de leurs fragments ou de ladite héparine ou de son dérivé ou analogue tel qu’apporté par le plasma, sérum ou son substitut et comme prévu en sus.

Dans certains modes de réalisation, les concentrations ci-dessus peuvent se référer à la concentration desdits facteurs de croissance ou des variants biologiquement actifs ou des fragments de ceux-ci ou de ladite héparine ou de son dérivé ou analogue, comme prévu en plus de celle déjà apportée par le plasma ou le sérum. Naturellement, si les facteurs de croissance ou l'héparine ou son dérivé ou analogue à ajouter ne sont normalement pas présents (non détectables) dans le plasma, le sérum ou son substitut, la concentration totale et ajoutée des facteurs de croissance ou de l'héparine ou son dérivé ou analogue sera (sensiblement) la même.

Dans un mode de réalisation préféré, les CSM provenant d'un échantillon biologique d'un sujet tel que défini ailleurs dans le présent document sont cultivées dans un récipient de culture.

Le récipient de culture peut prévoir une surface en plastique pour permettre l'adhérence des cellules.

Dans un autre mode de réalisation, la surface peut être une surface de verre.

Dans un autre cas encore, la surface peut être revêtue d'un matériau approprié permettant l'adhérence et la croissance des cellules, par exemple le Matrigel®, la laminine ou le collagène.

En particulier, les CSM peuvent être prélevées sur la moelle osseuse (ou d'autres sources) en sélectionnant les cellules (mononucléaires) qui peuvent adhérer à la surface d'un substrat, par exemple, une surface plastique.

Dans certains cas, la méthode enseignée ici peut comprendre (par exemple dans le cadre de l'étape (a)) l'élimination de la matière non adhérente et la culture ultérieure de cellules adhérentes dans le milieu tel que défini en (a). En particulier, on peut laisser les cellules s'attacher pendant environ 1 à 8 jours, plus généralement entre 2 et 6 jours, plus généralement environ 4 jours avant d'enlever la matière non adhérente.

Dans le cas contraire, l'enlèvement de la matière non adhérente peut être effectué au maximum 8 jours, au maximum 6 jours, au maximum 4 jours, de préférence au maximum 4 jours, après le début de l'étape (a). Dans certains cas, la méthode enseignée ici peut consister (par exemple, dans le cadre de l'étape (a)) à remplacer une partie ou la totalité du milieu de culture par un milieu tel que défini en (a). Avantageusement, cela permet de renouveler les facteurs de croissance.

Dans certains cas, le remplacement peut être effectué au moins une fois, par exemple une, deux ou trois fois, pendant la culture primaire.

Dans certains modes de réalisation des méthodes, utilisations ou produits cellulaires tels qu'enseignés ici, les cellules dérivées de CSM peuvent être cultivées à l'étape (a) pendant une période d'environ 13 jours à environ 15 jours.

De préférence, les cellules dérivées de CSM sont cultivées à l'étape (a) pendant une période d'environ 14 jours.

Dans certains cas, les méthodes enseignées ici peuvent comprendre (b) un premier passage des cellules dérivées de CSM ("passage 1" ou "P1") et la culture ultérieure des cellules dérivées de CSM dans un milieu tel que défini en (a). L'étape (b) peut également être appelée ici "culture secondaire". Dans un mode de réalisation, l'étape (b) peut consister à collecter les cellules dérivées de CSM obtenues à l'étape (a). Dans une réalisation, l'étape (b) peut comprendre le détachement, l’ensemencement et la culture ultérieure des cellules dérivées de CSM dans un milieu tel que défini en (a), c'est-à-dire un milieu comprenant du

FGF-2, du TGFP et de l’héparine ou un dérivé ou analogue de celle-ci, de préférence à une concentration d'au moins 0,01 IU/ml.

Dans certains modes de réalisation des méthodes, utilisations ou produits cellulaires tels qu'enseignés 1ci, les cellules dérivées de CSM sont cultivées dans l'étape (b) pendant une période d'environ 8 jours à environ 12 jours.

Dans certains cas, les cellules dérivées de CSM sont cultivées à l'étape (b) pendant une période d'environ 9 jours à environ 11 jours.

De préférence, les cellules dérivées de CSM sont cultivées à l'étape (b) pendant une période d'environ 10 jours.

Dans certains cas, les cellules dérivées de CSM peuvent être cultivées à l'étape (b) pendant une période de x jours, le jour x étant le dernier jour où au moins 20 % des cellules dérivées de CSM sont en prolifération.

Ainsi, un aspect concerne une méthode d'obtention de cellules souches mésenchymateuses (CSM) de lignée chondro-ostéoblastique à partir de CSM, la méthode comprenant : (a) la culture de CSM provenant d'un échantillon biologique d'un sujet dans un milieu de culture comprenant du FGF-2, du TGFP, et de l'héparine ou un dérivé ou analogue de celle-ci à une concentration d'au moins 0,01 Ul/ml, obtenant ainsi des cellules dérivées de CSM; b) un premier passage des cellules dérivées de CSM et la culture ultérieure des cellules dérivées de CSM dans un milieu tel que défini au point a) ; et (c) un second passage des cellules dérivées de CSM et la culture ultérieure des cellules dérivées de CSM dans un milieu tel que défini en (a), obtenant ainsi les cellules dérivées de CSM de lignée chondro- ostéoblastique, dans laquelle les cellules dérivées de CSM sont cultivées dans l'étape (b) pendant une période de x jours, le jour x étant le dernier jour où au moins 20 % des cellules dérivées de CSM sont en prolifération.

Dans certains cas, les cellules dérivées de CSM peuvent être cultivées à l'étape (b) pendant une période de x jours, le jour x étant le dernier jour où au moins 25% des cellules dérivées de CSM prolifèrent (par exemple, en phases S et G2/M). Par exemple, les cellules dérivées de CSM peuvent être mises en culture à l'étape (b) pendant une période de x jours, le jour x étant le dernier jour où au moins 30%, au moins 35%, au moins 40%, au moins 45, au moins 50%, au moins 55 ou au moins 60% des cellules dérivées de CSM sont en prolifération (par exemple, en phases S et G2/M). Dans certains modes de réalisation des méthodes, utilisations ou produits cellulaires tels qu'enseignés 1ci, les cellules proliférantes dérivées de CSM sont en phase S, G2 ou M du cycle cellulaire.

L'analyse du cycle cellulaire avec les événements/phases (phases G0/G1, S et G2/M) peut être effectuée par cytométrie en flux, par exemple par tri cellulaire activé par fluorescence (FACS).

Dans certains cas, les cellules dérivées de CSM peuvent être cultivées à l'étape (b) pendant une période de x jours, le jour x étant le dernier jour où le nombre de cellules dérivées de CSM est supérieur à celui du jour x-1. Par exemple, afin de déterminer le jour x comme dernier jour où le nombre de cellules dérivées de CSM est plus élevé qu'au jour x-1, les cellules dérivées de CSM peuvent être cultivées pendant une période de 28 jours pendant la culture secondaire (selon les méthodes de l'art antérieur), des échantillons peuvent être prélevés chaque jour et le nombre de cellules ou leur densité (par exemple, exprimée en nombre de cellules/cm”) peut être déterminée pour chaque échantillon, par exemple par comptage manuel (par exemple, chambre Bürker) ou par cytométrie en flux (par exemple BD Trucount'“). Sur la base des numéros de cellules, on peut déterminer le dernier jour (c'est-à-dire le jour x) où le nombre de cellules dérivées de CSM est plus élevé que le jour précédent (c'est-à-dire le jour x-1).

Dans certains cas, les cellules dérivées de CSM peuvent être cultivées à l'étape (b) pendant une période de x jours, le jour x étant le dernier jour où au moins 20 % des cellules dérivées de CSM prolifèrent et le nombre de cellules dérivées de CSM est supérieur au jour x-1.

Dans certains cas, les cellules dérivées de CSM peuvent être plaquées pour la culture ultérieure dans l'étape (b) à une densité de 3x10* à 1x10° cellules/em”. Dans certains cas, les cellules dérivées de CSM peuvent être plaquées pour la culture ultérieure dans l'étape (b) à une densité de 5x10° à 1x10° cellules/em’. De préférence, les cellules dérivées de CSM peuvent être ensemencées pour la culture ultérieure dans l'étape (b) à une densité de 3x10" à 8x10° cellules/em”.

En conséquence, dans un autre aspect, l'invention fournit méthode pour obtenir des cellules dérivées de CSM de lignée chondro-ostéoblastique à partir de CSM, la méthode comprenant : (a) la culture CSM provenant d'un échantillon biologique d'un sujet dans un milieu de culture comprenant du FGF-2, du TGFB et de l'héparine ou un dérivé ou analogue de celle-ci à une concentration d'au moins 0,01 Ul/ml, obtenant ainsi des cellules dérivées de CSM; b) un premier passage des cellules dérivées de CSM et la culture ultérieure des cellules dérivées de CSM dans un milieu tel que défini au point a) ; et (c) un second passage des cellules dérivées de CSM et la culture ultérieure des cellules dérivées de CSM dans un milieu tel que défini en (a), obtenant ainsi des cellules dérivées de CSM de lignée chondro- ostéoblastique, dans laquelle les cellules dérivées de CSM sont ensemencées pour la culture ultérieure dans l'étape (b) à une densité de 3x10° à 1x10° cellules/cm”, de préférence à une densité de 3x10° à 8x10° cellules/cm”.

Les termes "densité” et "densité cellulaire” peuvent être utilisés de manière interchangeable et se rapportent au nombre de cellules par unité de surface (par exemple, exprimé en cellules/em”).

Dans certains modes de réalisation, les méthodes enseignées ici peuvent comprendre l'étape (c) consistant à passer les cellules dérivées de CSM pour la seconde fois ("passage 2" ou "P2") et à cultiver les cellules dérivées de CSM dans un milieu tel que défini en (a), obtenant ainsi les cellules dérivées de CSM de lignée chondro-ostéoblastique. L'étape (c) peut également être appelée ici "culture tertiaire”. Les cellules dérivées de CSM de lignée chondro-ostéoblastique obtenues à l'étape (c) peuvent être considérées comme des cellules "passage 3" ou "P3". Dans certains modes de réalisation incarnations des méthodes, utilisations ou produits cellulaires tels qu'enseignés ici, les cellules dérivées de CSM sont cultivées dans l'étape (c) pendant une période d'environ 10 jours à environ 14 jours. Dans certains cas, les cellules dérivées de CSM sont cultivées à l'étape (c) pendant une période d'environ 11 jours à environ 13 jours. De préférence, les cellules dérivées de CSM sont cultivées à l'étape (c) pendant une période d'environ 12 jours. Dans certains modes de réalisation des méthodes, utilisations ou produits cellulaires tels qu'enseignés 1ci, les cellules dérivées de CSM peuvent être plaquées pour la culture ultérieure à l'étape (c) à une densité de 3x10* à Ix10° cellules/cm”. Dans certains cas, les cellules dérivées de CSM peuvent être ensemencées pour la culture ultérieure dans l'étape (c) à une densité de 5x10° à 1x10° cellules/em”. De préférence, les cellules dérivées de CSM peuvent être ensemencées pour la culture ultérieure dans l'étape (c) à une densité de 3x10? à 8x10° cellules/em”.

En conséquence, dans un autre aspect, l'invention fournit une méthode pour obtenir des cellules dérivées de CSM de lignée chondro-ostéoblastique de CSM, la méthode comprenant : (a) la culture de CSM provenant d'un échantillon biologique d'un sujet dans un milieu de culture comprenant du FGF-2, du TGFB et de l'héparine ou un dérivé ou analogue de celle-ci à une concentration d'au moins 0,01 Ul/ml, obtenant ainsi des cellules dérivées de CSM; b) le premier passage des cellules dérivées de CSM et la culture ultérieure des cellules dérivées de CSM dans un milieu tel que défini au point a) ; et (©) second passage des cellules dérivées de CSM et la culture ultérieure des cellules dérivées de CSM dans un milieu tel que défini en (a), obtenant ainsi les cellules dérivées de CSM de lignée chondro- ostéoblastique, dans laquelle les cellules dérivées de CSM sont ensemencées pour la culture ultérieure de l'étape (c) à une densité de 3x10* à 1x10° cellules/em”, de préférence à une densité de 3x10° à 8x10° cellules/cm”.

L'homme du métier comprendra que les méthodes enseignées ici peuvent comporter d'autres passages.

L'homme du métier comprendra que cela peut générer des cultures cellulaires de passage 4 (P4), passage 5 (P5), passage 6 (P6), passage 7 (P7), passage 8 (P8), passage 9 (P9) ou passage 10 (P10). Le passage 0 (PO) peut se référer à des cellules CSM ou dérivées de CSM qui n'ont pas été détachées et/ou reproduites.

Dans certains modes de réalisation, les méthodes enseignées ici peuvent comprendre la cryoconservation des cellules dérivées de CSM de la lignée chondro-ostéoblastique.

Dans certains modes de réalisation, les méthodes enseignées ici peuvent comprendre (d) la remise en suspension des cellules de la lignée chondro-ostéoblastique dérivées de CSM dans un milieu de cryopréservation approprié pour administration à un sujet.

En remettant en suspension les cellules dérivées de CSM de la lignée chondro- ostéoblastique dans un milieu de cryoconservation approprié pour administration à un sujet, on peut obtenir un produit cellulaire approprié pour administration directe à un sujet.

Le produit cellulaire peut être facilement stocké par cryoconservation, le produit cellulaire cryoconservé peut être facilement transporté et livré sur demande.

Par conséquent, le produit cellulaire adapté à l'administration est immédiatement disponible pour le traitement sur demande.

De plus, la cryoconservation du produit cellulaire obtenue par les méthodes actuelles permet d'effectuer tous les tests de libération du produit cellulaire et d'obtenir les résultats avant administration du produit cellulaire.

Dans certains modes de réalisation, les méthodes enseignées ici peuvent comprendre (d) la remise en suspension des cellules dérivées de CSM de la lignée chondro-ostéoblastique dans un milieu de cryopréservation approprié pour administration à un sujet ; et (e) la cryopréservation des cellules dérivées de CSM de la lignée chondro-ostéoblastique.

Ainsi, dans un autre aspect, l'invention concerne une méthode pour obtenir des cellules dérivées de CSM de lignée chondro-ostéoblastique à partir de CSM, la méthode comprenant : (a) la culture de CSM provenant d'un échantillon biologique d'un sujet dans un milieu de culture comprenant du FGF-2, du TGFB et de l'héparine ou un dérivé ou analogue de celle-ci à une concentration d'au moins 0,01 Ul/ml, obtenant ainsi des cellules dérivées de CSM; (b) un premier passage des cellules dérivées de CSM et la culture ultérieure des cellules dérivées de CSM dans un milieu tel que défini en (a) ; (c) un second passage des cellules dérivées de CSM et la culture ultérieure des cellules dérivées de CSM dans un milieu tel que défini en (a), obtenant ainsi les cellules dérivées de CSM de lignée chondro- ostéoblastique ; (d) la resuspension les cellules dérivées de CSM de lignée chondro-ostéoblastique (de l'étape (c)) dans un milieu de cryopréservation approprié pour administration à un sujet ; et (e) la cryoconservation des cellules dérivées de CSM de lignée chondro-ostéoblastique (de l'étape (d)). Dans certains cas, les méthodes enseignées ici peuvent comprendre (d) la remise en suspension des cellules dérivées de CSM de la lignée chondro-ostéoblastique à une concentration clinique dans un milieu de cryopréservation approprié pour administration à un sujet ; et (€) la cryopréservation des cellules de la lignée chondro-ostéoblastique dérivées de CSM.

Une telle concentration clinique permet, de façon avantageuse, d'administrer les cellules dérivées de CSM de lignée chondro-ostéogénique obtenues par les présentes méthodes directement à un sujet sans aucune autre étape de dilution ou de concentration ou sans étapes de lavage supplémentaires des cellules dérivées de CSM de lignée chondro-ostéoblastique avant administration.

Dans certains cas, les méthodes enseignées ici peuvent comprendre la cryoconservation des cellules de la lignée chondro-ostéoblastique dérivées de CSM, ce qui permet d'obtenir un produit cellulaire adapté à l'administration. Le produit cellulaire est adapté à l'administration et peut être administré directement à un sujet qui en a besoin sans étape de lavage supplémentaire avant l'administration.

Dans certains modes de réalisation des méthodes, utilisations ou produits cellulaires tels qu'enseignés 1ci, les cellules dérivées de CSM de la lignée chondro-ostéoblastique sont remises en suspension dans le milieu de cryopréservation dans l'étape (d) à une concentration comprise entre environ 1x107 cellules/ml et environ 1x10° cellules/ml. Par exemple, les cellules dérivées de CSM de la lignée chondro- ostéoblastique sont remises en suspension dans le milieu de cryoconservation à l'étape (d) à une concentration comprise entre environ 1x107 cellules/ml et environ 8x10" cellules/ml, entre environ 1x107 cellules/ml et environ 6x107 cellules/ml, ou entre environ 2x107 cellules/ml et environ 5x107 cellules/ml. De préférence, les cellules de lignée chondro-ostéoblastique dérivées de CSM sont remises en suspension dans le milieu de cryoconservation dans l'étape (d) à une concentration comprise entre environ 2x10” cellules/ml et environ 4x10" cellules/ml. Dans certains cas, le produit cellulaire approprié à l'administration comprend les cellules dérivées de CSM de la lignée chondro-ostéoblastique à une concentration comprise entre environ 1x107 cellules/ml et environ 1x10° cellules/ml. Par exemple, le produit cellulaire approprié pour l'administration comprend les cellules dérivées de CSM de la lignée chondro-ostéoblastique à une concentration comprise entre environ 1x107 cellules/ml et environ 8x10’ cellules/ml, entre environ 1x107 cellules/ml et environ 6x10’ cellules/ml, soit entre environ 2x107 cellules/ml et environ 5x107 cellules/ml. De préférence, le produit cellulaire approprié à l'administration comprend les cellules dérivées de CSM de la lignée chondro- ostéoblastique à une concentration comprise entre environ 2x107 cellules/ml et environ 4x107 cellules/ml. Dans certains cas, le produit cellulaire approprié à l'administration comprend les cellules de la lignée chondro-ostéoblastique dérivées de CSM dans un milieu de cryopréservation à une concentration comprise entre environ 1x107 cellules/ml et environ 1x10° cellules/ml. Par exemple, le produit cellulaire approprié pour l'administration comprend les cellules dérivées de CSM de la lignée chondro- ostéoblastique dans un milieu de cryoconservation à une concentration comprise entre environ 1x107 cellules /ml et environ 8x107 cellules/ml, entre environ 1x107 cellules/ml et environ 6x107 cellules/ml ou entre environ 2x10’ cellules/ml et environ 5x10’ cellules/ml. De préférence, le produit cellulaire approprié à l'administration comprend les cellules dérivées de CSM de la lignée chondro-ostéoblastique dans un milieu de cryopréservation à une concentration comprise entre environ 2x107 cellules/ml et environ 4x107 cellules/ml.

Dans certains modes de réalisation des méthodes, utilisations ou produits cellulaires tels qu'enseignés ici, le milieu de cryoconservation peut comprendre un composé antioxydant tel que le benzopyrane.

Dans certaines versions des méthodes, des utilisations ou des produits cellulaires enseignés ici, le milieu de cryoconservation peut comprendre du diméthylsulfoxyde (DMSO), de l'albumine sérique humaine (HSA), de l'adénosine, un polypeptide, du benzopyrane ou une combinaison des deux. Dans certains modes de réalisation des méthodes, utilisations ou produits cellulaires tels qu'enseignés ici, le milieu de cryoconservation peut comprendre du DMSO, HSA, adénosine, (poly)peptides, un composé antioxydant, ou une combinaison de ceux-ci. Un tel milieu de cryoconservation permet d'administrer avantageusement les cellules dérivées CSM de la lignée chondro-ostéogénique obtenues par les méthodes actuelles sans étape de lavage supplémentaire des cellules dérivées CSM de la lignée chondro-ostéogénique avant administration à un sujet.

Dans certains cas, le produit cellulaire approprié pour l'administration comprend les cellules dérivées de CSM de lignée chondro-ostéoblastique dans un milieu de cryoconservation comprenant DMSO, HSA, adénosine, polypeptide, benzopyrane, ou une combinaison de ceux-ci, à une concentration entre environ 1x107 cellules/ml et environ 1x105 cellules/ml. Par exemple, le produit cellulaire approprié pour l'administration comprend les cellules dérivées de CSM de la lignée chondro-ostéoblastique dans un milieu de cryoconservation comprenant du DMSO, HSA, adénosine, polypeptide, benzopyrane ou une — combinaison de ceux-ci, à une concentration comprise entre environ 1x107 cellules/ml et environ 8x10’ cellules/ml, entre environ 1x10” cellules/ml et environ 6x107 cellules/ml, ou entre environ 2x10’ cellules/ml et environ 5x10/ cellules/ml. De préférence, le produit cellulaire approprié à l'administration comprend les cellules dérivées de CSM de lignée chondro-ostéoblastique dans un milieu de cryoconservation comprenant DMSO, HSA, adénosine, polypeptide, benzopyrane, ou une combinaison de ceux-ci, à une concentration comprise entre environ 2x10/ cellules/ml et environ 4x107 cellules/ml. Dans certains cas, le produit cellulaire approprié à l'administration comprend les cellules dérivées de CSM de lignée chondro-ostéoblastique dans un milieu de cryoconservation comprenant DMSO, HSA, adénosine, (poly)peptides, un composé antioxydant, ou une combinaison de ceux-ci, à une concentration entre environ 1x107 cellules/ml et environ 1x10° cellules/ml. Par exemple, le produit cellulaire approprié pour l'administration comprend les cellules dérivées de CSM de la lignée chondro-ostéoblastique dans un milieu de cryoconservation comprenant DMSO, HSA, adénosine, (poly)peptides, un composé antioxydant, ou une combinaison de ceux-ci, à une concentration entre environ 1 x 107 cellules/ml et environ 8 x 107 cellules/ml, entre environ 107 cellules/ml et environ 6 x 107 cellules/ml ou entre environ 2 x 10’ cellules/ml et 5x 107 cellules/ml environ. De préférence, le produit cellulaire approprié à l'administration comprend les cellules dérivées de CSM de lignée chondro-ostéoblastique dans un milieu de cryoconservation comprenant DMSO, HSA, adénosine, (poly)peptides, un composé antioxydant, ou une combinaison de ceux-ci, à une concentration entre environ 2x107 cellules/ml et environ 4x10’ cellules/ml.

Dans certains cas, le milieu de cryoconservation peut être une composition comprenant des nucléosides (par exemple, adénosine), des sucres (par exemple, dextran-40, dextrose, saccharose, mannitol, acide lactobionique), tripeptide (par exemple, L-glutathion), tampon (par exemple, N-(2- hydroxyéthyl)pipérazine-N'-(acide 2-éthanesulfonique)), sels (par exemple, l’hydroxyde de sodium, chlorure de potassium, bicarbonate de potassium, phosphate de potassium, chlorure de calcium, chlorure de magnésium) et le DMSO. Un milieu de cryoconservation disponible dans le commerce est le milieu de cryoconservation cellulaire CryoStor® CS10 (C2874, Merck KGaA, Darmstadt, Allemagne). D'autres exemples sont CryoStor® CS5, CS2 ou le milieu de cryoconservation cellulaire CSB (Merck KGaA, Darmstadt, Allemagne).

Dans certains cas, le milieu de cryoconservation peut comprendre au moins 1 %, au moins 2 %, au moins 5 % ou au moins 10 % de DMSO.

Dans certains cas, le milieu de cryoconservation peut être une composition comprenant des nucléosides (par exemple, adénosine), des sucres (par exemple, dextran-40, dextrose, saccharose, mannitol, acide lactobionique), des tripeptides (par exemple, L-glutathion), un tampon (par exemple, N-(2- Hydroxyéthyl)pipérazine-N'-(acide 2-éthanesulfonique)), les sels (par exemple l’hydroxyde de sodium, chlorure de potassium, bicarbonate de potassium, phosphate de potassium, chlorure de calcium, chlorure de magnésium) et le benzopyranne (par exemple, acide 6-hydroxy-2,5,7,8-tétraméthylchroman-2- carboxylique). HypoThermosol® FRS Preservation Solution (H4416, Merck KGaA, Darmstadt, Allemagne) est un milieu de cryopréservation commercial.

Les termes "Trolox" ou "acide 6-hydroxy-2,5,7,8-tétraméthylchromane-2-carboxylique" peuvent être utilisés indifféremment.

Dans certains cas, le milieu de cryoconservation peut comprendre au moins 1 %, au moins 2 %, au moins 5 % ou au moins 10 % de benzopyrane. Dans certains cas, le milieu de cryoconservation peut contenir au moins 1 %, au moins 2 %, au moins 5 % ou au moins 10 % d'acide 6-hydroxy-2,5,7,8- tétraméthylchroman-2-carboxylique.

Dans certains modes de réalisation des méthodes enseignées ici, les cellules dérivées de CSM peuvent être cultivées à l'étape (a) pendant une période d'environ 13 jours à environ 15 jours, et à l'étape (b) pendant une période d'environ 8 jours à environ 12 jours. Dans certains modes de réalisation des méthodes enseignées ici, les cellules dérivées de CSM peuvent être cultivées à l'étape (a) pendant une période d'environ 13 jours à environ 15 jours, et à l'étape (c) pendant une période d'environ 10 jours à environ 14 jours. Dans certains modes de réalisation des méthodes enseignées ici, les cellules dérivées de

CSM peuvent être cultivées à l'étape (b) pendant une période d'environ 8 jours à environ 12 jours, et à l'étape (c) pendant une période d'environ 10 jours à environ 14 jours.

Dans certaines incarnations des méthodes enseignées ici, les cellules dérivées de CSM peuvent être cultivées à l'étape (a) pendant une période d'environ 13 jours à environ 15 jours, à l'étape (b) pendant une période d'environ 8 jours à environ 12 jours et à l'étape (c) pendant une période d'environ 10 jours à environ 14 jours.

Dans certaines versions des méthodes enseignées ici, les cellules dérivées de CSM peuvent être cultivées à l'étape (a) pendant environ 14 jours, et à l'étape (b) pendant environ 10 jours.

Dans certaines versions des méthodes enseignées ici, les cellules dérivées de CSM peuvent être cultivées à l'étape (a) pendant environ 14 jours, et à l'étape (c) pendant environ 12 jours.

Dans certains modes de réalisation des méthodes enseignées ici, les cellules dérivées de CSM peuvent être cultivées à l'étape (b) pendant une période d'environ 10 jours, et à l'étape (c) pendant une période d'environ 12 jours.

Dans certaines versions des méthodes enseignées ici, les cellules dérivées de CSM peuvent être cultivées à l'étape (a) pendant environ 14 jours, à l'étape (b) pendant environ 10 jours, et à l'étape (c) pendant environ 12 jours.

Dans certains modes de réalisation des méthodes enseignées ici, les cellules dérivées de CSM peuvent être ensemencées pour la culture ultérieure dans l'étape (b) à une densité de 3x10° à 1x10° cellules/cm”, et la culture ultérieure dans l'étape (c) à une densité de 3x10" à 1x10° cellules/em”. Dans certaines incarnations des méthodes enseignées ici, les cellules dérivées de CSM peuvent être ensemencées pour la culture ultérieure dans l'étape (b) à une densité de 3x10° à 8x10° cellules/cm”, et la culture ultérieure dans l'étape (c) à une densité de 3x107 à 8x10° cellules/em”. Par ailleurs, l'invention fournit une population de cellules de lignée chondro-ostéoblastique dérivées de cellules CSM pouvant être obtenues ou obtenues par les méthodes définies ici.

Les récitations "population de cellules de la lignée chondro-ostéoblastique dérivées de CSM" ou "cellules de la lignée chondro-ostéoblastique dérivées de CSM" peuvent être utilisées indifféremment ici.

Le terme "population", tel qu'il est utilisé ici, se réfère à un groupe essentiellement pur (c'est-à-dire composé principalement de) et homogène en cellules d'un type cellulaire souhaité, telles que des cellules de lignée chondro-ostéoblastique dérivées de CSM.

Un autre aspect concerne une population de cellules dérivées de CSM de lignée chondro-ostéoblastique pouvant être obtenues ou obtenues par expansion in vitro ou ex vivo de CSM, au moins 90% des cellules dérivées de CSM de lignée chondro-ostéoblastique en suspension ayant un diamètre égal ou inférieur à 25 um (D90 < 25 um) et où au plus 1% des cellules dérivées de CSM de lignée chondro-ostéoblastique en suspension a un diamètre supérieur à 35 um.

Dans certains modes de réalisation de la population de cellules de la lignée chondro-ostéoblastique dérivées de CSM, les cellules de la lignée chondro- ostéoblastique dérivées de CSM peuvent être obtenues ou sont obtenues par les méthodes définies ici.

Comme illustré dans la section exemple, les méthodes enseignées ici donnent des cellules de lignée chondro-ostéoblastique dérivées de CSM, ou des populations comprenant de telles cellules, avec des caractéristiques supérieures, comme en particulier une taille plus petite et plus homogène que les cellules dérivées de CSM décrites précédemment. La taille plus petite et plus homogène des cellules de la lignée chondro-ostéoblastique dérivées de CSM que l'on peut obtenir par les méthodes décrites ici confère aux cellules de meilleures propriétés de transplantation. Plus particulièrement, la taille plus petite et plus homogène des cellules de lignée chondro-ostéoblastique dérivées de CSM pouvant être obtenues par les méthodes décrites ici confère aux cellules la faculté de s’adapter à toutes les voies d'administration et en particulier à l'administration intravasculaire, notamment en réduisant ou en éliminant le risque d'embolie pulmonaire et d'infarctus, en offrant un bon profil de sécurité in vivo et/ou une seringabilité. De plus, les cellules dérivées de CSM de lignée chondro-ostéoblastique pouvant être obtenues par les méthodes décrites ici permettent d'obtenir une concentration cellulaire élevée administré sur le site avec un volume limité administré.

En particulier, le diamètre moyen des cellules dérivées de CSM de la lignée chondro-ostéoblastique en suspension est inférieur à 25 um, inférieur à 24 um, inférieur à 23 um, inférieur à 22 um, inférieur à 21 um ou inférieur à 20 um. De préférence, le diamètre moyen des cellules dérivées de CSM de la lignée chondro-ostéoblastique en suspension est inférieur à 20 um.

Les termes "suspension" et "suspension cellulaire” désignent généralement les cellules dérivées de CSM, en particulier les cellules viables dérivées de CSM, dispersées dans une phase liquide.

En particulier, le diamètre moyen des cellules de la lignée chondro-ostéoblastique en suspension dérivées de CSM est supérieur à 10 um, plus de 11 um, plus de 12 um, plus de 13 um, plus de 14 um ou plus de 15 um.

En particulier, le diamètre moyen des cellules de la lignée chondro-ostéoblastique en suspension dérivées de CSM se situe entre 10 um et 25 um, de préférence entre 15 um et 20 um.

En particulier, au moins 90 % des cellules de lignée chondro-ostéoblastique en suspension dérivées de CSM ont un diamètre égal ou inférieur à 25 um (DoS 25 um), égal ou inférieur à 24 um (Dop < 24 um), égale ou inférieure à 23 um (Dop < 23 um), égale ou inférieure à 22 um (Doo < 22 um), égale ou inférieure à 21 um (Dop < 21 um), ou égale ou inférieure à 20 um (Do < 20 um), de préférence égale ou inférieure à 25 um (Do < 25 Hm).

En particulier, les cellules dérivées CSM de lignée chondro-ostéoblastique en suspension ont une Doo égale ou inférieure à 25 um (Do < 25 um) et au plus 1% des cellules dérivées CSM de lignée chondro- ostéoblastique en suspension ont un diamètre supérieur à 35 um. En particulier, les cellules dérivées de CSM de lignée chondro-ostéoblastique en suspension ont une Dog égale ou inférieure à 24 um (Doo < 24 um), égale ou inférieure à 23 um (Dop < 23 um), égale ou inférieure à 22 um (Dop < 22 um), égale ou inférieure à 21 um (Doo < 21 um), ou égale ou inférieure à 20 um (Ds < 20 um), et au plus 1% des cellules dérivées de CSM de lignée chondro-ostéoblastique en suspension ont un diamètre supérieur à 35 um.

En particulier, les cellules dérivées CSM de lignée chondro-ostéoblastique en suspension ont une Dog égale ou inférieure à 25 um (Dso < 25 um) et au plus 1% des cellules dérivées CSM de lignée chondro- ostéoblastique en suspension ont un diamètre supérieur à 30 um. En particulier, les cellules dérivées de CSM de lignée chondro-ostéoblastique en suspension ont une Dog égale ou inférieure à 24 um (Doo < 24 um), égale ou inférieure à 23 um (Dop < 23 um), égale ou inférieure à 22 um (Dop < 22 um), égale ou inférieure à 21 um (Doo < 21 um), ou égale ou inférieure à 20 um (Ds < 20 um), et au plus 1% des cellules dérivées de CSM de lignée chondro-ostéoblastique en suspension ont un diamètre supérieur à 30 um. En particulier, les cellules dérivées de CSM de lignée chondro-ostéoblastique en suspension ont une Dog comprise entre environ 25 um et environ 10 um (10 um < Do < 25 um), entre environ 24 um et environ 10 um (10 um < Doo < 24 um), entre environ 23 um et environ 10 um (10 um < Dy < 23 um), entre environ 22 um et environ 10 um (10 um < Doo < Doo < 22 um), entre environ 21 um et environ 10 um (10 um < Do < 21 um) ou entre environ 20 um et environ 10 um (10 um < Do < 20 um), de préférence entre environ 25 um et environ 10 um (10 um < Ds < 25 um). Le diamètre d'une cellule peut être déterminé par n'importe quelle méthode connue dans l'art, par exemple par un microscope numérique et un logiciel d'analyse d'images (par exemple Motic Image Plus” 2.02). Le diamètre moyen des cellules auquel il est fait référence ici doit être déterminé sur la base du diamètre des cellules dans un état flottant libre, non fixé, donc des cellules en suspension. Les cellules sont de préférence mises en suspension dans une solution comprenant un tampon isotonique transparent, non toxique, tel que le PBS, et éventuellement un colorant pour différencier les cellules vivantes et mortes, tel que le bleu trypan. Il est préférable de mesurer au moins une centaine de cellules pour que l'analyse soit statistiquement significative. Un autre aspect concerne une composition comprenant les cellules dérivées de CSM de la lignée chondro- ostéoblastique ou la population de cellules dérivées de CSM de la lignée chondro-ostéoblastique telle que définie ici. Dans certains modes de réalisation, les compositions peuvent, en outre, comprendre un ou plusieurs autres composants. Par exemple, on peut inclure des composants qui peuvent maintenir ou améliorer la viabilité des cellules. Par exemple et sans limitation, ces composants peuvent inclure des sels pour assurer des conditions essentiellement isotoniques, des stabilisateurs de pH tels que des systèmes tampons (par exemple, pour assurer un pH essentiellement neutre, comme un système tampon phosphate ou carbonate), des protéines porteuses telles que l'albumine, des milieux comprenant des milieux basaux et/ou des suppléments de milieu, du sérum ou du plasma, des nutriments, des sources de glucides, des conservateurs, des stabilisants, des antioxydants ou autres matières bien connues de la pratique. Sont également divulguées, les méthodes de production desdites compositions en mélangeant les cellules respectives dérivées de CSM de lignées chondro-ostéoblastiques avec lesdits un ou plusieurs composants additionnels comme ci-dessus. Les compositions peuvent être, par exemple, liquides ou semi-solides ou solides (par exemple, des compositions congelées ou sous forme de gel, sur support solide ou sur échafaudage, etc.). Les termes "composition", "formulation" ou "préparation" peuvent être utilisés indifféremment. En particulier, la composition peut être une formulation pharmaceutique comprenant les cellules dérivées de CSM de la lignée chondro-ostéoblastique telle que définie ici, et éventuellement un ou plusieurs excipients pharmaceutiquement acceptables.

Par conséquent, dans un autre aspect, l'invention fournit une formulation pharmaceutique comprenant la population de cellules dérivées de CSM de lignée chondro-ostéoblastique telle que définie ici. L'expression "pharmaceutiquement acceptable” utilisée ici est conforme à l'art et signifie compatible avec les autres ingrédients d'une formulation pharmaceutique et n'est pas délétère pour son destinataire.

Tel qu'il est utilisé dans le présent document, le terme “support” ou "excipient” comprend tous les solvants, diluants, tampons (par exemple, solution saline tamponnée neutre ou solution saline tamponnée au phosphate), solubilisants, colloïdes, milieux de dispersion, véhicules, charges, agents chélateurs (par exemple, EDTA ou glutathion), acides aminés (par exemple, glycine), protéines, désintégrants, liants, lubrifiants, agents mouillants, émulsifiants, édulcorants, colorants, arômes, aromatisants, épaississants, agents pour obtenir un effet de dépôt, revêtements, agents antifongiques, conservateurs, stabilisants, antioxydants, agents de contrôle de tonicité, agents retardateurs d'absorption, etc. L'utilisation de ces milieux et agents pour les substances actives pharmaceutiques est bien connue dans l'art. Ces matériaux doivent être non toxiques et ne doivent pas interférer avec l'activité des cellules.

La nature précise du support, de l'excipient ou de toute autre matière dépendra de la voie d'administration. Par exemple, la composition peut se présenter sous la forme d'une solution aqueuse pouvant être — administrée en parentérale, exempte de pyrogène et ayant un pH, une isotonicité et une stabilité appropriés. Pour les principes généraux de la formulation médicinale, le lecteur est renvoyé à la thérapie cellulaire : Stem Cell Transplantation, Gene Therapy, and Cellular Immunotherapy, par G. Morstyn & W. Sheridan eds, Cambridge University Press, 1996 ; et Hematopoietic Stem Cell Therapy, E. D. Ball, J. Lister & P. Law, Churchill Livingstone, 2000.

Les formulations pharmaceutiques liquides peuvent généralement comprendre un véhicule liquide tel que de l'eau ou une solution aqueuse pharmaceutiquement acceptable. Par exemple, une solution physiologique saline, un milieu de culture tissulaire ou cellulaire, du dextrose ou une autre solution saccharidique ou des glycols comme l'éthylène glycol, le propylène glycol ou le polyéthylène glycol peuvent être inclus.

La composition peut comprendre une ou plusieurs molécules protectrices cellulaires, des molécules régénératrices cellulaires, des facteurs de croissance, des facteurs anti-apoptotiques ou des facteurs régulant l'expression génique dans les cellules. Ces substances peuvent rendre les cellules indépendantes de leur environnement.

Ces formulations pharmaceutiques peuvent contenir d'autres composants garantissant la viabilité des cellules qu'elles contiennent. Par exemple, les compositions peuvent comprendre une solution tampon appropriée (par exemple, un tampon phosphate ou carbonate) pour atteindre le pH souhaitable, plus généralement proche du pH neutre, et peuvent comprendre suffisamment de sel pour assurer des conditions isosmotiques aux cellules afin de prévenir le stress osmotique. Par exemple, une solution appropriée à ces fins peut être une solution saline tamponnée au phosphate (PBS), une solution de chlorure de sodium, une solution injectable de Ringer ou une solution injectable Lactated Ringer, comme on l'appelle dans la pratique. En outre, la composition peut comprendre une protéine porteuse, par exemple l'albumine (par exemple l'albumine bovine ou humaine), qui peut augmenter la viabilité des cellules.

D'autres supports ou additifs pharmaceutiquement acceptables sont bien connus de ceux qui maîtrisent la technique et peuvent par exemple être choisis parmi des protéines telles que le collagène ou la gélatine, des glucides tels que l'amidon, les polysaccharides, les sucres (dextrose, glucose et saccharose), les dérivés de cellulose comme la carboxyméthylcellulose de sodium ou de calcium, la hydroxypropyl cellulose ou l'hydroxypropylméthyl cellulose, amidons prégélifiés, gélose à la pectine, carraghénine, argiles, gommes hydrophiles (gomme d'acacia, gomme de guar, gomme arabique et gomme xanthane), acide alginique, alginates, acide hyaluronique, acide polyglycolique et polylactique, dextran, pectines, polymères synthétiques tels que polymère acrylique ou polyvinylpyrrolidone, protéoglycanes, phosphate de calcium et similaires Si désiré, la préparation cellulaire peut être administrée sur un support, un échafaudage, une matrice ou un — matériau pour améliorer la régénération tissulaire. Par exemple, le matériau peut être une céramique granulaire ou un biopolymère comme la gélatine, le collagène ou le fibrinogène. Les matrices poreuses peuvent être synthétisées selon des techniques standard (par exemple, Mikos et al, Biomaterials 14 : 323, 1993 ; Mikos et al, Polymer 35 : 1068, 1994 ; Cook et al, J. Biomed. Mater. Res. 35:513, 1997). Ces supports, échafaudages, matrices ou matériaux peuvent être biodégradables ou non biodégradables. Par conséquent, les cellules peuvent être transférées et/ou cultivées sur un substrat approprié, tel qu'un substrat poreux ou non poreux, afin de fournir des implants. Par exemple, les cellules qui ont proliféré ou qui se différencient dans des boîtes de culture peuvent être transférées sur des supports solides tridimensionnels afin de les faire se multiplier et/ou continuer le processus de différenciation en incubant le support solide dans un milieu nutritif liquide de l'invention, si nécessaire. Les cellules peuvent être transférées sur un support solide tridimensionnel, par exemple en imprégnant ledit support avec une suspension liquide contenant lesdites cellules. Les supports imprégnés ainsi obtenus peuvent être implantés chez un sujet. Ces supports imprégnés peuvent également être recultivés en les immergeant dans un milieu de culture liquide, avant d'être finalement implantés. Le support solide tridimensionnel doit être biocompatible pour pouvoir être implanté chez l'homme. Il peut être biodégradable ou non biodégradable. Les cellules ou populations cellulaires peuvent être administrées d'une manière qui leur permet de survivre, de se développer, de se propager et/ou de se différencier par rapport aux types cellulaires désirés tels que les ostéoblastes. Les cellules ou les populations cellulaires peuvent être greffées ou migrer vers l'organe visé et s'y greffer, comme des défauts osseux. L'engagement des cellules ou des populations cellulaires dans d'autres lieux peut être envisagé.

Dans une incarnation, la préparation cellulaire pharmaceutique telle que définie ci-dessus peut être administrée sous la forme d'une composition liquide. Dans les incarnations, les cellules ou la formulation pharmaceutique qui les contiennent peuvent être administrées de façon systémique, topique, à l'intérieur d'un organe, à un site de dysfonctionnement ou de lésion d'un organe ou à un site de lésion d'un tissu.

De préférence, les formulations pharmaceutiques peuvent comprendre une quantité thérapeutiquement efficace des cellules désirées. L'expression "quantité thérapeutiquement efficace” désigne une quantité qui peut provoquer une réponse biologique ou médicamenteuse dans un tissu, un système, un animal ou un être humain, recherchée par un chercheur, un vétérinaire, un médecin ou un autre clinicien, et qui peut en particulier prévenir ou atténuer un ou plusieurs des symptômes ou caractéristiques locaux ou systémiques d'une maladie ou affection traitée. Les quantités thérapeutiques efficaces appropriées peuvent être déterminées par un médecin qualifié en tenant compte de la nature des cellules désirées, de l'état et de la gravité de la maladie, ainsi que de l'âge, de la taille et de l'état du sujet.

Sont également fournies des méthodes de production desdites formulations pharmaceutiques par mélange des cellules de l'invention avec un ou plusieurs composants supplémentaires comme décrit ci-dessus ainsi qu'avec un ou plusieurs excipients pharmaceutiques comme décrit ci-dessus.

Dans une incarnation, la formulation pharmaceutique telle que définie ci-dessus peut être administrée sous la forme d'une composition liquide ou visqueuse.

Dans certaines incarnations des méthodes, utilisations ou produits cellulaires tels qu'enseignés ici, la formulation pharmaceutique peut en outre comprendre un composant avec des propriétés ostéo- conductricess comme le phosphate tricalcique, l'hydroxyapatite, combinaison de particules d'hydroxyapatite/phosphate tricalcique, d'acide polylactique, d'acide glycolique polylactique, d'acide hyaluronique ou d'un dérivé de ceux-ci, de chitosane, de poly-L-lysine, de gélatine, de collagène, d'ostéonectine, de fibrinogène ou d'ostéocalcine, ou une combinaison de ceux-ci.

Le terme "ostéo-conducteur” désigne la capacité d'un composant à servir d'échafaudage sur lequel des cellules, telles que les cellules dérivées de CSM de la lignée chondro-ostéoblastique enseignée ici, peuvent se fixer, migrer, croître et produire un nouvel os.

Tel que mentionné ci-dessus, les formulations pharmaceutiques telles qu'enseignées ici peuvent comprendre des composants utiles dans la réparation des plaies osseuses et des défauts osseux.

Les formulations pharmaceutiques peuvent comprendre un support ou une matrice aux propriétés ostéo- conductrices.

Les formulations pharmaceutiques peuvent être combinées avec une matrice osseuse déminéralisée (DBM) ou d'autres matrices pour rendre le composite ostéogénique ainsi qu'ostéo- conducteur et ostéo-inducteur.

Des méthodes similaires utilisant des cellules de moelle osseuse autologues avec DBM allogénique ont donné de bons résultats (Connolly et al. 1995. Clin Orthop 313 : 8- 18). Les formulations pharmaceutiques telles qu'enseignées ici peuvent également inclure ou être co- administrées avec un facteur bioactif complémentaire ou une protéine ostéo-inductive telle qu'une protéine morphogénétique osseuse, telle que BMP-2, BMP-7 ou BMP-4, ou tout autre facteur de croissance.

D'autres composants d'accompagnement potentiels comprennent des sources inorganiques de calcium ou de phosphate appropriées pour aider à la régénération osseuse (WO 00/07639). Si désiré, la préparation cellulaire peut être administrée sur une matrice ou un matériau porteur pour améliorer la régénération tissulaire.

Par exemple, le matériau peut être un hydrogel ou un biopolymère comme la gélatine, le collagène, l'acide hyaluronique ou ses dérivés, l'ostéonectine, le fibrinogène ou l'ostéocalcine.

Les biomatériaux peuvent être synthétisés selon des techniques standard (par exemple, Mikos et al, Biomaterials 14:323, 1993 ; Mikos et al, Polymer 35:1068, 1994 ; Cook et al, J.

Biomed.

Mater.

Res. 35:513, 1997). Sont également divulgués un arrangement ou un ensemble de pièces comprenant un instrument ou un dispositif chirurgical pour l'administration des cellules dérivées de CSM de la lignée chondro- ostéoblastique telle qu'enseignée ici ou la formulation pharmaceutique telle qu'enseignée ici à un sujet, comme par exemple systématiquement, par injection, et comprenant en outre les cellules dérivées de CSM de la lignée chondro-ostéoblastique telles qu'enseignées ici ou la formulation pharmaceutique telle qu'enseignée ici.

Par ailleurs, l'invention fournit la population de cellules dérivées de cellules CSM de lignée chondro- ostéoblastique telle que définie ici, ou la formulation pharmaceutique telle que définie ici pour une utilisation comme médicament.

Dans un autre aspect, l'invention fournit la population de cellules dérivées de cellules CSM de lignée chondro-ostéoblastique telle que définie ici, ou la formulation pharmaceutique telle que définie ici pour utilisation dans le traitement d'un sujet nécessitant une transplantation de cellules de lignée chondro- ostéoblastique.

En ce qui concerne les aspects connexes, l'invention fournit une méthode de traitement d'un sujet ayant besoin d'une transplantation de cellules de lignée chondro-ostéoblastique comprenant l'administration audit sujet d'une quantité thérapeutiquement efficace des cellules de lignée chondro-ostéoblastique dérivées de CSM définies ci-dessus ou une population de cellules dérivées de CSM de lignée chondro- ostéoblastique ou des formulations pharmaceutiques comprenant les cellules dérivées de CSM de lignée chondro-ostéoblastique ou population de cellules dérivées de CSM de lignée chondro-ostéoblastique chez le sujet. En ce qui concerne les aspects connexes, l'invention prévoit l'utilisation des cellules de lignée chondro-ostéoblastique dérivées de CSM définies ci-dessus ou de la population de cellules de lignée chondro-ostéoblastique dérivées de CSM ou de formulations pharmaceutiques comprenant les cellules de la lignée chondro-ostéoblastique dérivées de CSM ou une population de cellules de la lignée chondro- ostéoblastique dérivées CSM pour la fabrication d'un médicament pour le traitement d'un sujet nécessitant une transplantation de cellules de la lignée chondro-ostéoblastique.

Dans le présent document, les termes "traiter" ou "traitement" désignent à la fois le traitement thérapeutique et les mesures prophylactiques ou préventives, le but étant de prévenir ou de ralentir (atténuer) un changement ou un trouble physiologique non désiré. Les résultats cliniques bénéfiques ou souhaités comprennent, sans s'y limiter, l'atténuation des symptômes, la diminution de l'étendue de la maladie, la stabilisation (c’est-à-dire sans aggravation) de l'état de la maladie, le retard ou le ralentissement de la progression de la maladie et la survenue de complications, l'amélioration ou la palliation de l'état pathologique. Le " traitement " peut aussi signifier prolonger la survie par rapport à la survie attendue en l'absence de traitement.

L'expression " sujet ayant besoin d'une transplantation de cellules de lignée chondro-ostéoblastique ", telle qu'utilisée ici, inclut les sujets, tels que les sujets mammifères ou humains, qui bénéficieraient d'un traitement pour une condition donnée, de préférence une condition ou maladie telle que définie ici. Ces sujets comprendront généralement, sans s'y limiter, ceux qui ont reçu un diagnostic de la maladie, ceux qui sont susceptibles d'en souffrir ou d'en souffrir et/ou ceux chez qui la maladie doit être évitée.

Les termes “transplantation” ou "greffe de cellules” ont leur sens normal et désignent en particulier l'administration de cellules à un sujet. Le terme "transplantation cellulaire” peut être utilisé de manière interchangeable avec "thérapie cellulaire”. La transplantation de cellules peut être réalisée par toute technique connue dans l'art. Par exemple, et sans limitation, des cellules peuvent être transplantées par infusion sur un sujet. Généralement, la perfusion cellulaire peut être effectuée par voie parentérale, par exemple intravasculaire, sous-cutanée, intradermique ou intramusculaire, de préférence intravasculaire. Les cellules peuvent être administrées par exemple, et sans limitation, de manière systémique, topique ou sur le site d'une lésion. Il peut être clair que, selon l'application spécifique, les tissus ciblés, le but thérapeutique ou le type de cellule, des ajustements peuvent être effectués en conséquence en ce qui concerne les voies d'administration, ainsi que les formulations, les concentrations, etc.

Dans certains modes de réalisation des méthodes, utilisations ou produits cellulaires tels qu'enseignés 1ci, la population de cellules dérivées de CSM de lignée chondro-ostéoblastique ou la formulation pharmaceutique peut convenir pour une administration percutanée, intra-osseuse, intra-articulaire, intervertébrale ou intravasculaire.

Dans certains modes de réalisation des méthodes, utilisations ou produits cellulaires tels qu'enseignés 1ci, la population de cellules dérivées de cellules CSM de lignée chondro-ostéoblastique ou la formulation pharmaceutique peut convenir à une administration au site d'un défaut osseux.

La taille homogène et petite des cellules de la lignée chondro-ostéoblastique dérivée de CSM, telle qu'enseignée ici, conduit à une toxicité aiguë réduite ou abrogée par administration intraveineuse desdites cellules à un sujet. Par conséquent, les cellules dérivées de CSM de la lignée chondro-ostéoblastique telle qu'enseignée ici sont particulièrement adaptées à une administration intravasculaire ou percutanée.

Par conséquent, en particulier, les cellules de la lignée chondro-ostéoblastique ou de la population de cellules de la lignée chondro-ostéoblastique dérivées de CSM ou la formulation pharmaceutique définies ci-dessus peuvent être administrées audit sujet nécessitant une transplantation de cellules de la lignée chondro-ostéoblastique percutanée ou intravasculaire.

De plus, les inventeurs ont découvert que les cellules dérivées de CSM de lignée chondro-ostéoblastique obtenues par les méthodes enseignées 1ci ont des propriétés ostéogéniques.

Ainsi, dans un mode de réalisation particulier, le sujet nécessitant une transplantation de cellules de lignée chondro-ostéoblastique peut être un sujet atteint d'une maladie musculo-squelettique.

L'expression "maladie musculo-squelettique”, telle qu'utilisée ici, désigne tout type de maladie osseuse, de maladie musculaire, de maladie articulaire ou de chondrodystrophie, dont le traitement peut bénéficier de l'administration de la présente formulation pharmaceutique à un sujet atteint de cette maladie. En particulier, une telle maladie peut être caractérisée, par exemple, par une diminution de la formation osseuse et/ou cartilagineuse ou une résorption osseuse et/ou cartilagineuse excessive, par une diminution du nombre, de la viabilité ou de la fonction des ostéoblastes ou ostéocytes présents dans l'os et/ou chondroblastes ou chondrocytes présents dans le cartilage, par une diminution de la masse osseuse et/ou cartilagineuse chez un sujet, par une diminution de la densité ou de la masse osseuse, une diminution de l'élasticité de l'os, etc.

Les exemples non limitatifs de maladies musculo-squelettiques peuvent inclure des troubles locaux ou systémiques, tels que tout type d'ostéoporose ou d'ostéopénie, par exemple, primaire, postménopausique, sénile, corticoïde, bisphosphonate et radiothérapie ; toute ostéonécrose secondaire, mono ou multi-sites ;

tout type de fracture, par exemple, fractures ou compression sans soudure, mal-union, fractures ou compression à soudure retardée, fractures maxillo-faciales ; conditions nécessitant une fusion osseuse (par exemple, fusions et reconstruction de la colonne vertébrale) ; défaut osseux congénital ; reconstruction osseuse, par exemple, après une blessure traumatique ou une chirurgie du cancer, et reconstruction osseuse cranio-faciale ; arthrite traumatique, défaut focal du cartilage et/ou des articulations, arthrite dégénérative focale ; ostéoarthrite, arthrose, arthrite dégénérative, gonarthrose et coxarthrose ; ostéogenèse imparfaite ; cancer ostéolytique ; maladie de Paget ; troubles endocrinologues ; hypophosphatémie ; hypocalcémie ; ostéodystrophie rénale ; ostéomalacie ; maladie osseuse adynamique, hyperparathyroïdie, hyperparathyroïdie primaire, hyperparathyroïdie secondaire ; maladie parodontale ; maladie de Gorham-Stout et syndrome de McCune-Albright ; arthrite rhumatoïde ; spondylarthropathies, y compris la spondylarthrite ankylosante, l'arthrite psoriasique, l'arthropathie entéropathique et la spondylarthrite indifférenciée et l'arthrite réactive ; lupus érythémateux systémique et syndromes apparentés ; sclérodermie et troubles connexes ; Syndrome de Sjôgren ; vascularite systémique, y compris l'artérite à cellules géantes (maladie de Horton), l'artérite de Takayasu, la polyarthrite rhumatismale polymyalgique, la vascularite associée à l'ANCA (granulomatose de Wegener, polyangiite microscopique et syndrome de Churg-Strauss), le syndrome de Behcet et autres maladies polyartérites et maladies connexes (comme la polyartérite nodosa, le syndrome de Cogan et la maladie de Buerger) ; l'arthrite accompagnant d'autres maladies inflammatoires systémiques, y compris l'amylose et la sarcoïdose ; les arthropathies cristallines, y compris la goutte, la maladie à dihydrate de pyrophosphate de calcium, les troubles ou syndromes associés au dépôt articulaire de cristaux de phosphate de calcium ou de calcium oxalate ; la chondrocalcinose et l'arthropathie neuropathique ; le syndrome de Felty's et le syndrome de Reiter ; la maladie de Lyme et la rhumatose.

Dans un mode de réalisation particulier, le sujet qui a besoin d'une transplantation de cellules de lignée chondro-ostéoblastique peut être un sujet présentant un trouble osseux.

Par conséquent, l'expression " maladie osseuse ", telle qu'elle est utilisée ici, désigne tout type de maladie osseuse dont le traitement peut bénéficier de la transplantation de cellules de lignée chondro- ostéoblastique, par exemple, ostéochondrogènes, ostéoprogéniteurs, préostéoblastes, ostéoblastes ou cellules phénotypes ostéoblastes à un sujet atteint de cette affection. En particulier, ces troubles peuvent être caractérisés, par exemple, par une diminution de la formation osseuse ou une résorption osseuse excessive, une diminution du nombre, de la viabilité ou de la fonction des ostéoblastes ou des ostéocytes présents dans l'os, une diminution de la masse osseuse chez un sujet, un amincissement de l'os, une diminution de la solidité ou de l'élasticité osseuse, etc.

À titre d'exemple, mais sans s'y limiter, les troubles osseux qui peuvent bénéficier d'une transplantation de cellules dérivées de cellules CSM de lignée chondro-ostéoblastique (par exemple, cellules de lignée ostéoblastique) obtenues par la méthode de la présente invention peuvent comprendre des troubles locaux ou systémiques, comme tout type d'ostéoporose ou d'ostéopénie, par exemple, ostéonécrose primaire, postménopausique, sénile, induite par un corticoïde, toute ostéonécrose secondaire, monosite ou multisite, tout type de fracture, par exemple, fracture non consolidée ou mal consolidée, pseudoarthrose, fracture ou compression à union retardée, conditions nécessitant une fusion osseuse (par exemple, fusions et reconstruction de la colonne vertébrale), fractures maxillo-faciales, reconstruction osseuse, par exemple, après une blessure traumatique ou une chirurgie du cancer, reconstruction osseuse cranio-faciale, ostéogenèse imparfaite, cancer ostéolytique des os, maladie de Paget, troubles endocrinologiques, hypophosphatémie, hypocalcémie, ostéodystrophie rénale, ostéomalacie, maladie adynamique, arthrite rhumatoïde, hyperparathyroïdie primaire, hyperparathyroïdie secondaire, maladie périodontale, maladie de Gorham-Stout et syndrome McCune-Albright.

Les cellules de la lignée chondro-ostéoblastique dérivées de CSM, la population de cellules de la lignée chondro-ostéoblastique dérivées de CSM et les formulations pharmaceutiques décrites ici peuvent être utilisées seules ou en combinaison avec l'un des traitements ou composés actifs connus pour ces troubles respectifs.

L'administration peut être simultanée ou séquentielle dans n'importe quel ordre, comme décrit ailleurs.

Si les cellules proviennent d'une source hétérologue (c’est-à-dire, non autologue, non homologue ou non allogénique), un traitement immunosuppresseur concomitant peut généralement être administré, par exemple, en utilisant des agents immunosuppresseurs, comme la cyclosporine ou le tacrolimus (FK506). La quantité de cellules à administrer variera selon le sujet traité.

Dans une réalisation préférée, la quantité de cellules à administrer est comprise entre 10° et 10° ou entre 10° et 10°, ou entre 10° et 10'° ou entre 103 et 10°, ou entre 10° et 10°, ou entre 10* et 10'° ou entre 10** 10” comme entre 10° et 10%, ou entre 10° et 107, par exemple, environ 1x10°, environ Sx10°, environ Sx10°, environ 1x106, environ 5x105, environ 1x107, environ 5x10", environ 5x10’, environ 1x10%, environ 5x10®, environ 1x10°, environ 2x10°, environ 3x10°, environ 4x10°, environ 5x10°, environ 6x10°, environ 7x10°, environ 8x10°, environ 9x10° ou environ 1x10"° cellules peut être administrée à un sujet humain.

En outre, 10° à 10° cellules par kg de poids corporel ou 1x107 à 9x10/ cellules par kg de poids corporel, soit environ 1x10/, environ 2x10/, environ 3x10", environ 4x10", environ 5x10", environ 6x 107, environ 7x10°, environ 8x107, environ 9x107 ou environ 1x10° cellules par kg de poids corporel peuvent être données à un sujet humain.

Par exemple, un tel nombre de cellules ou un tel nombre de cellules par kg de poids corporel peut se rapporter en particulier au nombre total de cellules à administrer à un sujet, qui peut être convenablement réparti sur une ou plusieurs doses (par exemple, réparties sur 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 doses ou plus) administrées sur une ou plusieurs journées (par exemple, 1, 2, 3, 4 ou 5 jours et plus). Toutefois, la détermination précise d'une dose efficace sur le plan thérapeutique peut être fondée sur des facteurs propres à chaque patient, y compris la taille, l'âge, la taille, les lésions tissulaires et le temps écoulé depuis que les lésions se sont produites, et peut être facilement déterminée par les personnes compétentes en la matière à partir de cette divulgation et des connaissances de l'art.

Dans une formulation pharmaceutique à administrer, les cellules dérivées de CSM de la lignée chondro- ostéoblastique peuvent être présentes à une concentration comprise entre environ 10° cellules/ml et environ 10° cellules/ml, de préférence entre environ 10° cellules/ml et environ 10° cellules/ml, et plus particulièrement entre environ 1x10° cellules/ml et environ 1x10° cellules/ml.

Dans certains cas, la formulation pharmaceutique à administrer comprend les cellules dérivées de CSM de lignée chondro-ostéoblastique à une concentration comprise entre environ 1x107 cellules/ml et environ 1x10° cellules/ml. Dans certains cas, la formulation pharmaceutique à administrer comprend les cellules dérivées de CSM de lignée chondro-ostéoblastique à une concentration comprise entre environ 2x10/ cellules/ml et environ 4x10" cellules/ml.

Dans certains cas, la formulation pharmaceutique à administrer comprend les cellules dérivées de CSM de lignée chondro-ostéoblastique dans un milieu de cryopréservation à une concentration comprise entre environ 1x107 cellules/ml et environ 1x10° cellules/ml. Dans certains cas, la formulation pharmaceutique à administrer comprend les cellules de lignée chondro-ostéoblastique dérivées de CSM dans un milieu de cryopréservation à une concentration comprise entre environ 2x107 cellules/ml et environ 4x107 cellules/ml.

Dans certains cas, la formulation pharmaceutique à administrer comprend les cellules de lignée chondro- ostéoblastique dérivées de CSM dans un milieu de cryoconservation comprenant du DMSO, de l’HSA, adénosine, polypeptide, benzopyrane, ou une combinaison de ceux-ci, à une concentration entre environ 1x10" cellules/ml et environ 1x10° cellules/ml. Dans certains cas, la formulation pharmaceutique à administrer comprend les cellules dérivées de CSM de lignée chondro-ostéoblastique dans un milieu de cryoconservation comprenant DMSO, HSA, adénosine, polypeptide, benzopyrane, ou une combinaison de ceux-ci, à une concentration entre environ 2x107 cellules/ml et environ 4x10" cellules/ml.

Dans certains modes de réalisation des méthodes, utilisations ou produits cellulaires tels qu'enseignés ici, les cellules dérivées de la lignée chondro-ostéoblastique dérivées de CSM peuvent être présentes, par exemple dans une formulation pharmaceutique à administrer, à une concentration entre environ 1x107 cellules/ml et environ 1x10° cellules/ml, de préférence entre environ 2x107 cellules/ml et environ 4x107 cellules/ml.

La taille réduite des cellules de la lignée chondro-ostéoblastique dérivée de CSM, telle qu'enseignée ici, permet une concentration cellulaire élevée et/ou accordable. En conséquence, si la composition est une composition liquide, le volume de la composition comprenant des cellules dérivées de CSM de lignée chondro-ostéoblastique obtenues par la méthode enseignée ici à administrer au sujet nécessitant une transplantation de cellules dérivées de CSM est inférieur au volume de la composition comprenant des cellules dérivées de CSM obtenues par d'autres méthodes.

La présente demande fournit également des aspects et des modes de réalisation tels qu'ils sont énoncés dans les déclarations suivantes : Déclaration 1. Procédé d'obtention de cellules souches mésenchymateuses (CSM) de lignée chondro- ostéoblastique à partir de CSM, le procédé comprenant : (a) la culture de CSM provenant d'un échantillon biologique d'un sujet dans un milieu de culture comprenant le facteur de croissance des fibroblastes-2 (FGF-2), le facteur de croissance transformant bêta (TGFP) et de l'héparine ou un dérivé ou analogue de celle-ci à une concentration d'au moins 0,01 IU/mLl, pour obtenir des cellules dérivées de cellules souches mésenchymateuses (CSM) ; b) un premier passage des cellules dérivées de CSM et la culture ultérieure des cellules dérivées de CSM dans un milieu tel que défini au point a) ; et (c) un second passage des cellules dérivées de CSM et la culture ultérieure des cellules dérivées de CSM dans un milieu tel que défini en (a), obtenant ainsi les cellules dérivées de CSM de lignée chondro- ostéoblastique, dans lequel les cellules dérivées de CSM sont cultivées dans l'étape (b) pendant une période de x jours, le jour x étant le dernier jour où au moins 20 % des cellules dérivées de CSM sont en prolifération.

Déclaration 2. Procédé selon la déclaration 1, dans lequel les cellules dérivées de CSM sont cultivées dans l'étape (b) pendant une période d'environ 8 jours à environ 12 jours, de préférence pendant une période d'environ 10 jours.

Déclaration 3. Procédé selon la déclaration 1 ou 2, dans lequel les cellules dérivées de CSM sont cultivées dans l'étape (a) pendant une période d'environ 13 jours à environ 15 jours, de préférence pendant une période d'environ 14 jours.

Déclaration 4. Procédé selon l'une quelconque des déclarations 1 à 3, dans lequel les cellules dérivées de CSM sont cultivées dans l'étape (c) pendant une période d'environ 10 jours à environ 14 jours, de préférence pendant une période d'environ 12 jours.

Déclaration 5. Procédé selon l'une quelconque des déclarations 1 à 4, dans lequel les cellules dérivées de CSM en prolifération sont en phase S, en phase G2 ou en phase M du cycle cellulaire.

Déclaration 6. Procédé d'obtention de cellules dérivées de CSM de lignée chondro-ostéoblastique à partir de CSM, le procédé comprenant :

(a) la culture de CSM provenant d'un échantillon biologique d'un sujet dans un milieu de culture comprenant du FGF-2, du TGFB et de l'héparine ou un dérivé ou analogue de celle-ci à une concentration d'au moins 0,01 Ul/ml, obtenant ainsi des cellules dérivées de CSM ; b) un premier passage des cellules dérivées de CSM et la culture ultérieure des cellules dérivées de CSM dans un milieu tel que défini au point a) ; et (c) un second passage des cellules dérivées de CSM et la culture ultérieure des cellules dérivées de CSM dans un milieu tel que défini en (a), obtenant ainsi les cellules dérivées de CSM de lignée chondro- ostéoblastique, dans lequel les cellules dérivées de CSM sont ensemencées pour la culture ultérieure de l'étape (b) à une densité de 3x10° à 1x10° cellules/em”, de préférence à une densité de 3x10° à 8x10° cellules/cm”.

Déclaration 7. Procédé selon la déclaration 6, dans lequel les cellules dérivées de CSM sont ensemencées pour la culture ultérieure dans l'étape (c) à une densité de 3x10* à 1x10° cellules/cm”, de préférence à une densité de 3x10° à 8x10° cellules/cm”.

Déclaration 8. Procédé d'obtention de cellules dérivées de CSM de lignée chondro-ostéoblastique à partir de CSM, le procédé comprenant : (a) la culture de CSM provenant d'un échantillon biologique d'un sujet dans un milieu de culture comprenant du FGF-2, du TGFB et de l'héparine ou un dérivé ou analogue de celle-ci à une concentration d'au moins 0,01 Ul/ml, obtenant ainsi des cellules dérivées de CSM; (b) un premier passage des cellules dérivées de CSM et la culture ultérieure des cellules dérivées des CSM dans un milieu tel que défini en (a) ; (c) un second passage des cellules dérivées de CSM et la culture ultérieure des cellules dérivées de CSM dans un milieu tel que défini en (a), obtenant ainsi les cellules dérivées de CSM de lignée chondro- ostéoblastique ; (d) la remise en suspension des cellules dérivées de CSM de lignée chondro-ostéoblastique dans un milieu de cryopréservation approprié pour l’administration à un sujet ; et (e) la cryoconservation des cellules dérivées de CSM de lignée chondro-ostéoblastique.

Déclaration 9. Procédé selon la déclaration 8, dans lequel les cellules dérivées de CSM de lignée chondro-ostéoblastique sont remises en suspension dans le milieu de cryoconservation dans l'étape (d) à une concentration comprise entre environ 1x10"cellules/ml et environ 1x10° cellules/ml, de préférence à une concentration entre environ 2x10" cellules/ml et environ 4x10" cellules/ml.

Déclaration 10. Procédé selon la déclaration 8 ou 9, dans lequel le milieu de cryoconservation comprend du diméthylsulfoxyde (DMSO), de l'albumine sérique humaine (HSA), de l'adénosine, un polypeptide, du benzopyranne, ou une combinaison de ceux-ci.

Déclaration 11. Méthode selon l'une quelconque des déclarations 1 à 10, dans laquelle le TGFP est choisi dans le groupe constitué de TGFB1, TGFP2, TGFB3, et leurs mélanges ; de préférence dans laquelle le TGFP est le TGFB1. Déclaration 12. Méthode selon l'un quelconque des déclarations 1 à 11, dans laquelle : - la concentration d'héparine ou de son dérivé ou analogue ou analogue est d'environ 0,1 Ul/ml ; et/ou - l'héparine ou son dérivé ou analogue est choisie dans le groupe constitué par l'héparine non fractionnée (HNF) ; l'héparine de faible poids moléculaire (HBPM), comme l'énoxaparine, la daltéparine, la nadroparine, la tinzaparine, la certoparine, la reviparine, l'ardeparine, la parnaparine, la bemiparine ou leurs mélanges ; un héparinoïde, tel que le sulfate d'héparine, le sulfate de dermatane, le sulfate de chondroïtine, le sulfate d'acharane, le sulfate de kératane, ou leurs mélanges, tels que le danaparoïde, un sel d'héparine, un sel héparinoïde, un fragment héparinoïde, un fragment héparine et leurs mélanges.

Déclaration 13. Procédé selon l'une quelconque des déclarations 1 à 12, dans laquelle les cellules dérivées de CSM ou les CSM sont mises en contact avec, par exemple, un milieu comprenant, en outre, le plasma, le sérum ou un substitut de celui-ci ou un mélange de ceux-ci.

Déclaration 14. Méthode selon l'une quelconque des déclarations 1 à 13, dans laquelle le sujet est un sujet humain.

Déclaration 15. Une population de cellules dérivées de CSM de lignée chondro-ostéoblastique chondro- ostéoblastique pouvant être obtenues ou obtenues par les méthodes définies dans l'un quelconque des déclarations 1 à 14. Déclaration 16. Population de cellules dérivées de CSM de lignée chondro-ostéoblastique pouvant être obtenues ou obtenues par expansion et ou différentiation in vitro ou ex vivo de CSM, au moins 90% des cellules dérivées de CSM de lignée chondro-ostéoblastique en suspension ayant un diamètre égal ou inférieur à 25 um (Doo < 25 um) et où au plus 1% des cellules dérivées de CSM de lignée chondro- ostéoblastique en suspension ayant un diamètre supérieur à 35 um.

Déclaration 17. Population de cellules dérivées de CSM de lignée chondro-ostéoblastique selon la déclaration 16, dans lequel les cellules dérivées de CSM de lignée chondro-ostéoblastique peuvent être obtenues ou sont obtenues par les méthodes définies dans une des déclarations 1 à 14. Déclaration 18. Formulation pharmaceutique comprenant la population de cellules dérivées de CSM de lignée chondro-ostéoblastique telle que définie dans l'une quelconque des déclarations 15à 17. .

Déclaration 19. Formulation pharmaceutique selon la déclaration 18, dans laquelle la formulation pharmaceutique comprend en outre un composant ayant des propriétés ostéo-conductrices, tel que du phosphate tricalcique, de l'hydroxyapatite, une combinaison de particules d'hydroxyapatite/ phosphate tricalcique, de l’acide polylactique, de l’acide glycolique polylactique, de l’acide hyaluronique ou un dérivé de ceux-ci, du chitosan, du polyL-lysine, de la gélatine, du collagène, de l’ostéonectine, du fibrinogène, de l’ostéocalcine ou une combinaison de ceux-ci. Déclaration 20. La population de cellules dérivées de CSM de lignée chondro-ostéoblastique selon l'une quelconque des déclarations 15 à 17, ou la formulation pharmaceutique selon la revendication 18 ou 19, pour utilisation comme médicament, de préférence pour utilisation dans le traitement d'un sujet nécessitant une transplantation de cellules de lignée chondro-ostéoblastique.

Déclaration 21. La population ou la formulation pharmaceutique à utiliser selon la déclaration 20, où : -les cellules de lignée chondro-ostéoblastique dérivées de CSM sont présentes à une concentration comprise entre environ 1x107 cellules/ml et environ 1x10° cellules/ml, de préférence entre environ 2x10" cellules/ml et environ 4x10" cellules/ml ; et/ou ‘a population de cellules de lignée chondro-ostéoblastique dérivées de CSM ou la formulation pharmaceutique convient à l'administration percutanée, intra-osseuse, 1ntra-articulaire, intervertébrale ou intravasculaire ; -Ja population de cellules de lignée chondro-ostéoblastique dérivées de CSM ou la formulation pharmaceutique convient à l'administration au site d'un défaut osseux.

Bien que l'invention ait été décrite en référence à des modes de réalisation spécifiques de celle-ci, il est évident que de nombreuses alternatives, modifications et variations apparaîtront à l’homme du métier à la lecture de la description faite ci-dessus. Par conséquent, il est prévu de couvrir toutes ces solutions de rechange, modifications et variations comme suit dans l'esprit et la portée générale des revendications ci- jointes.

Les aspects et les réalisations de l'invention divulgués dans le présent document sont étayés par les exemples non limitatifs suivants.

EXEMPLES Exemple 1 : Méthode d'obtention de cellules de lignée chondro-ostéoblastique dérivées de CSM selon une réalisation de l'invention Un milieu de culture conventionnel complémenté avec 5 % d'OctaPlasLG® (Octapharma), 0,1 Ul/ml d'héparine (LEO Pharma), du FGF-b (CellGenix) et du TGFB-1 (Humanzyme) a été utilisé comme milieu de culture.

20 à 60 ml de moelle osseuse humaine (BM) ont été prélevés sur la crête iliaque d'un donneur volontaire sain.

Après la récolte, les globules blancs de la moelle osseuse ont été comptés, ensemencés à une densité de 50 000 cellules/cm’ dans le milieu de culture et incubés à 37°C dans un incubateur humidifié contenant 5% de CO». 4 jours après l'ensemencement des cellules, les cellules non adhérentes ont été retirées et le milieu a été renouvelé avec un milieu de culture. 7 jours et 11 jours après l'ensemencement, la moitié du milieu de culture a été enlevée et remplacée par un milieu frais pour renouveler les facteurs de croissance.

Les cellules ont été cultivées pendant la culture primaire pendant 14 jours.

Au jour 14, les cellules ont été détachées avec du Trypzean (Lonza) et par tourbillonnement et pipetage de haut en bas puis collectées (passage 1 : PI). Les cellules intermédiaires ont été cryopréservées (dans du CryoStor® CS10) et stockées dans l'azote liquide.

Chaque stock de cellules provenait d'un donneur, sans qu'il y ait de mise en commun entre les donneurs.

Ensuite, les cellules intermédiaires ont été décongelées et re-ensemencées pour une culture secondaire à une densité de 572 cellules/em?. Les cellules ont été cultivées pendant 10 jours pendant la culture secondaire.

Au jour 24, les cellules ont été prélevées par détachement avec du Trypzean (Lonza) et par tourbillonnement et pipetage de haut en bas (passage 2 : P2). Les cellules intermédiaires ont été cryopréservées (dans CryoStor® CS10) et stockées dans l'azote liquide.

Par la suite, les cellules intermédiaires ont été décongelées et re-ensemencées pour une culture tertiaire à une densité de 572 cellules/cm2. Les cellules ont été cultivées pendant la culture tertiaire pendant 10 jours.

Au jour 34, les cellules ont été prélevées par détachement avec du Trypzean (Lonza) et par tourbillonnement et pipetage de haut en bas (passage 3 : P3). Pour obtenir le produit cellulaire final, les cellules ont été remises en suspension dans de l’OctaPlasLG® à une concentration finale de 25x10° cellules/ml.

Ce produit cellulaire sera ci-après dénommé "produit cellulaire C - frais”. A la fin de la culture tertiaire, les cellules ont également été cryoconservées pour un stockage de longue durée.

Les cellules ont été remises en suspension dans un milieu de cryoconservation pour atteindre la concentration souhaitée (25x10° cellules/ml). La suspension cellulaire a ensuite été transférée dans des cryotubes qui ont été stockés dans de l'azote liquide.

Ce produit cellulaire sera appelé dans le présent document "produit cellulaire C - cryo" ou "cellules formatrices d'os C cryo(préservées) ", également abrégé en "cellules B-F C". Le milieu de cryoconservation était : -CryoStor® CS10 (BioLife Solutions Inc.), ou -50 % (v/v) de CryoStor® CS10 (BioLife Solutions Inc.) et 50 % (v/v) d'albumine sérique humaine (Octapharma), ou -CryoStor® CS10 (BioLife Solutions Inc.) et 5 % (v/v) d'albumine sérique humaine (Octapharma), ou -80 % (v/v) d'Hypothermosol® (BioLife Solutions Inc.), 10 % (v/v) de DMSO et 10 % (v/v) d'albumine sérique humaine (Octapharma).

Exemple comparatif 1 : Méthodes d'antériorité pour l'obtention de cellules souches mésenchymateuses et de cellules dérivées de CSM Les produits cellulaires comparatifs selon l'état de la technique et leurs méthodes de fabrication sont décrits ci-dessous.

Cellules souches mésenchymateuses Des CSM indifférenciés ont été préparés en prélevant des échantillons de moelle osseuse humaine (BM) de la crête iliaque de donneurs volontaires en bonne santé. Après la récolte, les globules blanes de la moelle osseuse ont été comptés, ensemencés à une densité de 50 000 cellules/cm” dans un milieu de culture classique et incubés à 37°C dans un incubateur humidifié contenant 5% de CO,. Après 24h, le milieu de culture a été retiré et un milieu de culture frais de cellules a été ajouté. Le milieu de culture était remplacé tous les 2-3 jours. Lorsque plus de la moitié des colonies ont atteint une confluence de 80 % ou lorsque certaines colonies ont atteint une confluence de 100 %, les cellules ont été récoltées (passage 1 : PI). Lors de ce premier passage, les cellules ont été directement cryoconservées dans du CryoStor® CS10 (BioLife Solutions Inc.). Pour terminer le processus de culture, les CSM ont été décongelées, ensemencées à 572 cellules/cm? pour la deuxième culture et cultivés. Les cellules ont été prélevées lorsque plus de la moitié des colonies ont atteint un confluent de 80 % ou lorsque certaines colonies ont atteint une confluence de 100 % pour obtenir des CSM au passage 2 (P2). Ce produit cellulaire est appelé dans le présent document "CSM".

Cellule produit A Le milieu de culture conventionnel complété avec 5% d'Octaserum (sérum autologue 50:50 et OctaPlasLG® (Octapharma)), FGF-b (CellGenix) et TGFB-1 (Humanzyme) a été utilisé comme milieu de culture.

Milieu de congélation : 80% milieu de culture conventionnel, 10% Octaserum [sérum autologue 50:50 et OctaPlasLG® (Octapharma)] et 10% DMSO.

Les cellules différenciées in vitro dérivées de CSM appelées ici "produit cellulaire A" ont été préparées en prélevant des échantillons humains de BM dans la crête iliaque de donneurs volontaires sains. Après la récolte, les globules blancs de la moelle osseuse ont été comptés, ensemencés à une densité de 50 000 cellules/em” dans le milieu de culture et incubés à 37°C dans un incubateur humidifié contenant 5% de CO». 4 jours après l'ensemencement des cellules, les cellules non adhérentes ont été retirées et le milieu a été renouvelé avec un milieu de culture. 7 jours et 11 jours après l'ensemencement, la moitié du milieu de culture a été enlevée et remplacée par un milieu frais. Les cellules ont été cultivées pendant la culture primaire pendant 14 jours. Au jour 14, les cellules ont été prélevées par détachement avec Trypzean (Lonza) et par tourbillonnement et pipetage de haut en bas (passage 1 : P1). Les cellules intermédiaires ont été cryoconservées dans du CryoStor® CS10 (BioLife Solutions Inc.) ou du milieu de congélation et stockées dans l'azote liquide.

Pour la culture secondaire, les cellules ont été décongelées et re-ensemencées à une densité de 1 144 cellules/cm2. Les cellules ont été cultivées pendant 14 jours pendant la culture secondaire. Au jour 28, les cellules ont été prélevées par détachement avec du Trypzean (Lonza) et par tourbillonnement et pipetage de haut en bas (passage 2 : P2). Pour obtenir le produit cellulaire final, les cellules ont été remises en suspension dans de l’OctaPlasLG® à une concentration finale de 25x10° cellules/ml. Ce produit cellulaire est appelé dans le présent document "produit cellulaire A". Cellule produit B Un milieu de culture conventionnel complété avec 5 % d'OctaPlasLG® (Octapharma), 0,1 Ul/ml d'héparine (LEO Pharma), du FGF-b (CellGenix) et du TGFB-1 (Humanzyme) a été utilisé comme milieu de culture. Des cellules dérivées de CSM par différenciation in vitro ont été obtenues à partir de l’aspiration de moelle osseuse de la crête iliaque de donneurs humains volontaires sains. Après la récolte, les globules blancs de la moelle osseuse ont été comptés, ensemencés à une densité de 50 000 cellules/cm’ dans le milieu de culture et incubés à 37°C dans un incubateur humidifié contenant 5% de CO. Quatre jours après l'ensemencement des cellules, les cellules non adhérentes ont été retirées et le milieu a été renouvelé avec un milieu de culture. Sept jours et onze jours après l'ensemencement, la moitié du milieu de culture a été enlevée et remplacée par un milieu frais pour renouveler les facteurs de croissance. Les cellules ont été cultivées pendant la culture primaire pendant 14 jours. Au jour 14, les cellules ont été prélevées par détachement avec Trypzean (Lonza) et par tourbillonnement et pipetage de haut en bas (passage 1 : P1). Les cellules intermédiaires ont été cryoconservées dans du CryoStor® CS10 (BioLife Solutions Inc.) et stockées dans l'azote liquide. Ensuite, les cellules intermédiaires ont été décongelées et ré-ensemencées pour une culture secondaire à une densité de 286 cellules/em?. Les cellules ont été cultivées pendant 14 jours pendant la culture secondaire. Au jour 28, les cellules ont été prélevées par détachement avec du Trypzean (Lonza) et par tourbillonnement et pipetage de haut en bas (passage 2 : P2). Pour obtenir le produit cellulaire final, les cellules ont été remises en suspension dans de l’OctaPlasLG® à une concentration finale de 25x10° cellules/ml. Ce produit cellulaire est appelé dans le présent document "produit cellulaire B”.

Exemple 2 : caractérisation cellulaire in vitro de cellules de lignée chondro-ostéoblastique dérivées de CSM obtenues par des méthodes conformes aux réalisations de l'invention, et de cellules CSM et cellules dérivées de CSM obtenues par des méthodes de l'état de la technique Matériel et méthodes Cellules Les produits cellulaires illustrant l'invention (c'est-à-dire, le produit cellulaire C frais et le produit cellulaire C cryo) ont été obtenus comme décrit dans l'exemple 1. Les produits cellulaires comparatifs (c'est-à-dire, les CSM, le produit cellulaire A et le produit cellulaire B) ont été obtenus comme décrit dans l'exemple comparatif 1.

Comptage et viabilité des cellules La densité et la viabilité des cellules ont été déterminées à l'aide d'un test d'exclusion au trypan bleu. Après avoir été récoltées, les cellules ont été diluées au 1: 2 avec du bleu trypan (0,4%, Lonza BioWhittaker®) et la viabilité cellulaire a été analysée à l'aide d'une chambre Bürker (Sigma-Aldrich®) et d'un microscope inversé (AE31, Motic®). La viabilité cellulaire a également été analysée par cytométrie en flux à l'aide des logiciels Amino-Actinomycine D (7-AAD, BD Biosciences®), BD FACSCanto IITM et BD FACSDivaTM (Becton Dickinson®). Après la récolte, 50 000 cellules ont été incubées dans l'obscurité pendant 10 minutes à température ambiante dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) — de l’albumine de sérum bovin (BSA) à 1% (Lonza BioWhittaker®) et 2,5 ul de 7-AAD.

Cytométrie en flux Des produits cellulaires comparatifs (c'est-à-dire, les CSM et les cellules dérivées de CSM : produits cellulaires A et B) et des produits cellulaires illustrant l'invention (c'est-à-dire, des cellules de lignée chondro-ostéoblastique dérivées de CSM: produits cellulaires C) obtenus comme décrit dans l’exemple 1 et l’exemple comparatif 1 ci-dessus, ont été prélevés et analysés par cytométrie en flux (logiciels BD FACSCantoTM II et BD FACSDivaTM ; Becton Dickinson). Les cellules ont été incubées avec les — anticorps monoclonaux conjugués suivants : anti-CD73, anti-CD90 et anti-CD166 (qui sont des marqueurs mésenchymateux et devraient être fortement exprimés par les CSM et les cellules dérivées des CSM), anti-CD3, anti-CD34 et anti-CD45 (qui sont des marqueurs hématopoïétiques et devraient être sensiblement absents des CSM et des cellules dérivées de CSM), anti-CD44, anti-CD51/61, anti-CD49a- e, anti-CD29 (qui sont des marqueurs d'adhésion), anti-CD40, anti-CD86 et anti-HLA-DR (qui sont des marqueurs d'immunogénicité), et anti-phosphatase alcaline (anti-ALP) pendant 15 minutes à température ambiante, puis lavé au PBS avant centrifugation et resuspension dans 0.3 ml de PBS. Pour la caractérisation des marqueurs de surface cellulaire CD105, CD73, CD10 et CD44, 5x10° cellules à une concentration de 1x10° cellules/ml en PBS - 1% BSA ont été incubées 10 min dans l'obscurité avec ul d'anticorps.

Après cette période d'incubation, les cellules ont été lavées une fois avec du PBS.

Les différents anticorps utilisés pour la coloration extracellulaire sont les suivants : anticorps conjugués à l'allophycocyanine (APC) contre CD105 (BD Biosciences®, Cat N° : 562408), CD73 (BD Biosciences®, Cat N°:560847), Phycoérythrine (PE) - anticorps conjugués contre CD10 (BD Biosciences”, Cat N° : 5 555375), CD44 (BD Biosciences®, Cat N° : 550989). La coloration non spécifique a été déterminée par incubation des cellules avec un contrôle d'immunoglobuline G (IgG) conjugué aux FITC, APC et PE (tous BD Biosciences®, Cat N° : 556649 ; 555751 ; 556650 respectivement). Avant l'analyse, un tri d’individu et de population d'intérêt a été effectué.

L'analyse par cytométrie en flux a été réalisée sur 1x10* événements de la population fermée en utilisant FACSCanto"" II (BD Biosciences®) et FACSDiva® 8.0 (BD Biosciences”). Les paramètres de réglage utilisés pour l'analyse sont appliqués automatiquement avec des billes (BD CompBeads Plus”, Cat N°560497). Pour chaque conjugué, le seuil de positivité a été fixé à 1 % de la positivité de l'anticorps isotype témoin et la positivité de chaque marqueur a été déterminée.

La médiane de l'intensité de fluorescence (MFI) de l'ensemble de la population analysée a également été déterminée et divisée par la MFI de l'anticorps isotype témoin correspondant pour obtenir une MFI normalisée (nMFI). Tableau 1 : présentation des fournisseurs et des numéros de catalogue des anticorps utilisés dans les exemples

Mesure de l'activité enzymatique ALP L'activité enzymatique de l'ALP a été mesurée par un dosage biochimique basé sur l'hydrolyse du p- nitrophényl phosphate (pNPP). Après avoir été déphosphorylé par l’ALP, le pNPP devient jaune et peut être détecté par un spectrophotomètre à 410 nm. L'activité enzymatique de l’ALP des cellules est déterminée par rapport à une courbe d’étalonnage basée sur l'activité de l’ALP purifiée d’intestin de veau. L'activité de l'ALP est rapportée en unité d'ALP/mg de protéine. Une unité d'ALP hydrolyse 1 umol de pNPP en 1 min à 37°C.

Réaction en chaîne par polymérase quantitative par transcription inverse (RT-gPCR) Après collecte, les cellules ont été conservées à -80°C sous forme de culots secs (500 000 cellules) jusqu'à l'extraction de l'ARN. Les ARN totaux ont été extraits à l'aide du Mini Kit RNeasy® (Qiagen®) selon les instructions du fabricant. La concentration d'ARN a été mesurée avec DropSense® 16 (Trinean®). La transcription inverse (RT) de l'ARN a été réalisée à partir de 1 ug d'extraits d'ARN total, à l'aide du kit de réactifs PrimeScript® RT (Takara®) conformément aux instructions du fabricant. Les qPCR ont été réalisées en utilisant le Premix Ex Tag® (Takara®) à partir de 2 ul d’ADNc selon les instructions du fabricant. Les niveaux d'expression des gènes d'intérêt suivants ont été quantifiés : RUNX2 (Avant : GGTTCCAGCAGGGGTAGCTGAG (SEQ ID NO : 1), Arrière : AGACACCACAAACTCCACAGCCAGCC (SEQ ID NO : 2), SOX9 (F : TAAAGGCAACTCGTACCCAA (SEQ ID NO : 3), R : ATTCTCCATCCATCCTCCCACGACG (SEQ ID NO : 4), BMP2 (F : GGACGGACGACATTCGATGTCCTCC (SEQ ID NO : 5), R:CACCATGGTCGACCTTTAGGA (SEQ ID NO : 6))), ALPL (F:ACCATTCCCACGTTCCTTCACATTTG (SEQ ID NO : 7), R : AGACATTCTCTCGTTCACCGCC (SEQ ID NO : 8), MMP13 (F:TGGAATTAAGGAGCATGGCGA (SEQ ID NO : 9), R : AACTCATGCGCAGCAACAAG (SEQ ID NO : 8) 10)), CHBL1(F:TGGGTCTCAAAGATTTTCCAAGA (SEQ ID NO : 11), R : GCTGTTTGTCTCTCTCCGTCCGTCCA (SEQ ID NO : 12), DCN (F :AAAAAATGCCCAAAAACTCTTCAGG (SEQ ID NO : 13), R:GCCCCATTTTCAATTCCTTCCTGAG (SEQ ID NO : 14)), OCN (F:AAGGTGCAGCCTCTTTGTGTGT (SEQ ID NO : 15),

R:GCTCCCAGCCATTGATTGATACAGAG (SEQ ID NO : 16))), SPONI (F:CCTGCGGAACTGGAACTGCCAAGTA(SEQ ID NO : 17), R:CACGGGTGAGCCCAATTCT (SEQ ID NO : 18), POSTN (FE:TTTGGGCACCAAAAAGAAAT (SEQ ID NO : 19), R:TCTCATACCAGGGACACTACAAAAAAT (SEQ ID NO : 20)). Les qPCR ont été exécutées en double avec un LightCycler® 480 (Roche®). La normalisation a été effectuée en utilisant la moyenne géométrique obtenue à partir de trois gènes d'entreten ménager : RPLI3A (F:CATAGGAAGGAAGCTGGGAGCAAGCAAG (SEQ ID NO : 21), R:GCCCTCCAATCAGTCAGTCTCTTCTG (SEQ ID NO : 22)), TBP (F:AACAACAGCCTGCCACCTTA (SEQ ID NO : 23), R:GCCATAAGGCATCATTCATTGGAC (SEQ ID NO : 24))), HPRT (F:CCCTGGCGCGTCGTGATTAGT (SEQ ID NO : 25), R : GTGATGGCCTCCTCTCTCCTCTCCTCCTT (SEQ ID NO : 26)). La comparaison entre les différents produits cellulaires dérivés de CSM provenant des mêmes donneurs a été effectuée en calculant l'expression génique (facteur de changement) en utilisant la méthode 2-AACt pour chaque gène d'intérêt (Schmittgen et Livak, 2008, 3(6), 1101-8 ; Nature Protocols, 3(6), 1101-1108).

L'analyse statistique a été effectuée à l'aide du logiciel JMP® (13.1.0). Les données RT-qPCR exprimées en facteur de changement ont été converties en logarithme et des tests de Student (avec o=0.05) ont été effectués pour évaluer la signification statistique des différences observées entre les types de cellules. La signification statistique a été représentée graphiquement en fonction de la valeur p (p) obtenue : * pour p<0,05, ** pour p<0,01, et *** pour p<0,001.

Dosage multiplex Après la récolte, les cellules ont été ensemencées à une densité de 50 000 cellules/cm?. Après 48 heures d'incubation à 37°C dans une atmosphère humidifiée contenant 5% de CO,, les surnageants de culture cellulaire ont été récoltés, centrifugés (5 min à 1500 rpm à température ambiante) et stockés à -80°C. Les surnageants ont été analysés au moyen du test Luminex® magnétique humain (R&D System®). Le Multiplex prémélangé a été fabriqué sur mesure (R&D System”). Les facteurs sécrétés suivants ont été étudiés : BMP-2, COL1A1, MMP13, OPN, OPG, SPARC, RANKL, CHI3L1. L'essai a été effectué selon les instructions du fabricant et les analyses ont été effectuées à l'aide de MAGPIX® (R&D System”) et du logiciel Bio-Plex Manager 5.0TM (Bio-Rad®).

Mesure de la taille des cellules Des produits cellulaires comparatifs (c'est-à-dire, des cellules CSM et des cellules dérivées de CSM : produits cellulaires A et B) et des produits cellulaires illustrant l'invention (c'est-à-dire, des cellules de lignée chondro-ostéoblastique dérivées de CSM : produits cellulaires C) obtenus comme décrit dans l’exemple 1 et l’exemple comparatifs 1, ont été prélevés et mis en suspension dans un PBS à 0,4% de bleu trypan à une densité cellulaire de 12,5x10° cellules/ml. Dix ul de la suspension cellulaire ont été placés sur une lame graduée (Motic®), puis protégés par une lamelle qui a été placée sous un microscope inversé à grossissement 40X (AE31 ; Motic®). Les images prises avec une caméra (Moticam, Motic®) placée sur le microscope ont été analysées par le logiciel Motic Image Plus” 2.02 afin de mesurer le diamètre des cellules. Au moins 100 cellules ont été mesurées pour considérer l'analyse comme statistiquement significative. La taille des cellules obtenues à différents moments de la culture ex vivo a également été analysée par cytométrie en flux (BD FACSCanto'M II et le logiciel BD FACSDivaTM ; Becton Dickinson). Brièvement, au jour 21, 23, 26 et 28 après le début de la culture cellulaire ex vivo décrite dans l'exemple 1 ou l'exemple comparatif 1, les cellules ont été prélevées, mises en suspension dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) à une densité cellulaire de 1x10° cellules/ml et analysées avec le cytomètre en flux pour mesurer la diffusion vers l’avant (FSC) (exprimée en unité relative de fluorescence). La diffusion vers l’avant mesure la lumière diffusée dans la direction du trajet du laser et donne donc une taille relative des cellules traversant la chambre d'écoulement.

Résultats Rendements en culture La méthode illustrant l'invention a augmenté de façon significative la disponibilité des cellules allogéniques (c’est-à-dire, le nombre de cellules obtenues à partir d'un don de moelle osseuse) à des fins cliniques, car les rendements globaux des cultures ont augmenté considérablement (tableau 2, produit cellulaire C frais versus produits cellulaires À et B).

Tableau 2 : Rendements respectifs des cultures de produits cellulaires comparatifs (c’est-à-dire, le produit cellulaire A, le produit cellulaire B) et les produits cellulaires illustrant l'invention (c’est-à- dire, les produits cellulaires C) Produit Produit Produit cellulaire Le ee Rendement de la culture primaire 63 + 168% | 139 + 91% (n= | 212 + 74% (n= 6) len 1 Rendement de la culture secondaire (premier | 1,656 + 1,126% | 25,254 + | 17,837 + 5,973% passage au 14e jour) (n=183) 7,547% (n= | (n=6) 41) Rendement de la troisième culture NA NA 10,641% + 4,295 en Oe Rendement global“ 1,068 + 2,353% | 46,768 + | 5,145,960 + (n=183) 33,201% (n= | 6,103,554% (n=6) 41)

PDL cumulé (théorique) (de DO à la fin du | 16 +2 22 +2 28 +1

CE Moyenne + écart-type, en tenant compte de la variabilité entre les lots, y compris la variabilité due à l'effet du donneur (variabilité entre les matières premières de la moelle osseuse) ; PDL : le niveau de doublement de la population est le nombre de fois où le nombre de cellules a été doublé ; * Le rendement global prend en compte l'accumulation des rendements des cultures de toutes les cultures successives (de l'implantation cellulaire du jour O à la fin du processus de fabrication et la génération des cellules dérivées de CSM) ; NA : non disponible Profil d'expression de marqueurs cellulaires L'analyse par cytométrie en flux a révélé que l'identité cellulaire générale basée sur les profils d'expression des marqueurs de surface cellulaire du produit cellulaire A, du produit cellulaire B (générés avec des méthodes comparatives selon l'art antérieur) et des produits cellulaires C avec ou sans cryopréservation finale (générés avec une méthode 1llustrant l'invention) étaient comparables. Tous exprimaient les marqueurs mésenchymateux CD73, CD90 et CD105 et n'exprimaient pas les marqueurs hématopoïétiques CD45, CD34 et CD3 (moins de 5% de la population cellulaire a exprimé ces marqueurs) (tableau 3). Le produit cellulaire B et les produits cellulaires C (avec ou sans cryoconservation finale) (i) exprimaient de faibles niveaux de récepteur de surface cellulaire CMH de classe II, comme le HLA-DR, et (ii) exprimant fortement l’ALP (tableaux 3 et 4). La faible immunogénicité représentée par une faible expression de HLA-DR permet avantageusement la transplantation cellulaire par exemple sur des sujets allogéniques (tableau 3). En outre, le produit cellulaire A, le produit cellulaire B et les produits cellulaires C (avec ou sans cryoconservation finale) expriment fortement le marqueur d'adhésion CD49e et l'enzyme ALP à leur surface par rapport aux CSM indifférenciées (tableaux 3 et 4). La haute expression en ALP souligne l'engagement du produit cellulaire A, du produit cellulaire B et des produits cellulaires C (avec ou sans cryopréservation finale) vers la lignée ostéoblastique. Tableau 3 : Profil d'expression des marqueurs de surface cellulaire des produits cellulaires — comparatifs (c’est-à-dire, CSM, produit cellulaire A, produit cellulaire B) et des produits cellulaires illustrant l'invention (c’est-à-dire, les produits cellulaires C) Produits cellulaires C des Produit Produit | Produit ST Statistiques | CSM | cellulaire | cellulaire | cellulaire HTS marqueurs - CS10 W 7 | a 1:1 10%HSA

Moyenne 100.0 | 100.0 100.0 100.0 100.0 | 100.0 | 100.0 100.0

0.1 com-ac [D oo [00 on [oo oa [|

NEE EEE EE oss soos [WE

NEE EE EE BE 1000/998 | 100.0 999 100.01100.01100.0 |100.0 ve B [00 (05 [01 [03 |oo oe eoa

AP

NEE EEE EE oven ND IND ND 09 [06 Hi Ve ee EEE

NEE EE Moyenne [06 [0 [EE Ge ss

NEE EEE EE Moyenne [02 [01 [02 [00017 or oo fo or [sp or jr ar rn fe ar er

NEE EE on [Moyenne [07 [6 [Bm [5 fra DE ee [os jo8 os

OEE EEE EE DROP SD [04 [|G [oo [0e [02 mc NE Cc EE ar ID [| Ee [ET Moyenne [92.7 [99.6 [998 [999 [1000/9959 [998 [9

N Moyenne [99.9 [99.7 | 100.0 100.0 100.0 100.0 [99.9 (100.0 CD44-PE CS jos poser 00" jor "oz er

ORE EB EEE eva [100 [06 es ma [ps [a res on Ce Abréviations : ALP : phosphatase alcaline ; APC : allophycocyanine ; FITC : isothiocyanate de fluorescéine ; HLA-DR : antigène leucocytaire humain - isotype DR ; HLA-DR/DP/DQ : antigène leucocytaire humain - isotypes DR/DP/DQ ; CSM : cellules souches mésenchymateuses ; ND : non déterminé ; PE : phycoérythrine ; SD : écart type Tableau 4 : Niveaux d'expression en ALP des produits cellulaires comparatifs (c’est-à-dire, CSM, produit cellulaire A, produit cellulaire B) et produits cellulaires illustrant l'invention (c’est-à-dire, les produits cellulaires C) Cryopréservations du produit cellulaire C (également référé Produit |Produit |Produit comme produits cellulaires Statistiques | CSM | cellulaire | cellulaire | cellulaire eryopréservés) A B C frais CS10 | CS10 Is 1:1 A 9 10% HSA positivity ma 9 | po expression ma level N Nn enzymatic ND (mU/mg of total N a

Abréviations : ALP : phosphatase alcaline ; ND : non déterminé ; PE : phycoérythrine ; SD : écart type Le profil d'expression des marqueurs de surface cellulaire a été caractérisé non seulement par la présence de marqueurs de surface cellulaire (pourcentage de positivité de la population) mais aussi par l'analyse de la quantité de marqueurs exprimés à la surface cellulaire (médiane de fluorescence normalisée de la population) de différents marqueurs.

Ces analyses ont mis en évidence certaines différences entre les différentes cellules dérivées de CSM.

Le produit cellulaire B et les produits cellulaires C (avec ou sans cryoconservation finale) cultivés en présence d'héparine expriment un niveau d'ALP plus élevé que les CSM et le produit cellulaire À cultivé en l'absence d'héparine (résultats ALP-PE nMFD) renforçant leur engagement envers la lignée ostéoblastique des cellules formatrices d’os.

L'expression des marqueurs mésenchymateux CD73 et CD105 à la surface des cellules dépendait également du type de cellules.

Les produits cellulaires générés en présence d'héparine (produit cellulaire B et produits cellulaires C avec ou sans cryoconservation finale) exprimaient des taux plus élevés de CD73 et de CD105 que le produit cellulaire A.

De plus, les produits cellulaires C semblaient posséder plus de CD73 et de CD105 à leur surface que le produit cellulaire B, surtout lorsque le produit cellulaire C ne subissait pas de cryopréservation finale (tableau 5). Les produits cellulaires différenciés A, Bet C expriment une quantité plus élevée de marqueur cellulaire CD10 que le CSM indifférencié.

De plus, les produits cellulaires C possèdent plus de CD10 à leur surface que les produits cellulaires A et B (tableau 5). L'analyse par cytométrie en flux nMFI a révélé que les expressions des protéines CD73 et CD44 étaient plus élevées dans le produit cellulaire C que dans les autres types cellulaires (figure 1).

Tableau 5 : Autres résultats de l'expression des marqueurs de surface cellulaire des produits cellulaires comparatifs (c’est-à-dire, les CSM, produit cellulaire À, produit cellulaire B) et des produits cellulaires illustrant l'invention (c’est-à-dire, produits cellulaires C) Cryopréservations du produit ee Produit |Produit |Produit |comme produits cellulaires des Statistiques | CSM | cellulaire | cellulaire | cellulaire | cryopréservés) MED A B C CS10 - CS10 HTS CS10 | HSA 10%DMSO 1:1 570 HSA 10% HSA

234.

EEE

207.

EEE

139.

EE EEE cum _Jer m jeher

EEE en ne [m sE

Abréviations : ALP : phosphatase alcaline ; APC : allophycocyanine ; FITC : isothiocyanate de fluorescéine ; HLA-ABC : antigène des leucocytes humains ABC ; HLA-DR : antigène des leucocytes humains - isotype DR ; CSM : cellules souches mésenchymateuses ; NA : non disponible ; ND : non déterminé ; PE : phycoérythrine ; SD : écart type RT-qPCR et essai multiplex L'analyse a révélé que le gène RUNX2 du produit cellulaire C frais était significativement (*) surexprimé par rapport aux CSM mais significativement (*) sous-exprimé par rapport au produit cellulaire B (Tableau 6a). Le gène MMP13 dans le produit cellulaire C frais était significativement (*) surexprimé par rapport aux CSM et au produit cellulaire A, mais son expression restait significativement (*) plus élevée dans le produit cellulaire B (Tableau 6a).

Par contre, les gènes SPARC et KI67 étaient significativement (**) sous-exprimé dans le produit cellulaire C frais par rapport à tous les autres types cellulaires (Tableau 6a). Le gène PPARG était exprimé de la même façon pour le produit cellulaire C frais et CSM et significativement (***) sous- exprimé par rapport aux produits cellulaires À et B (tableau 6a).

De plus, les gènes BMP2, SOX9, MMP13 et ALPL du produit cellulaire C cryopréservé étaient significativement surexprimés par rapport aux CSM (Tableau 6b), indiquant leur engagement dans la lignée chondro-ostéogénique.

Tableau 6a : Profil d'expression génique des produits cellulaires comparatifs (c’est-à-dire, CSM, produit cellulaire A, produit cellulaire B) et des produits cellulaires illustrant l'invention (c’est-à- dire, produit cellulaire C frais) (exprimé sous forme de variation par rapport aux valeurs moyennes des CSM - la signification statistique est représentée graphiquement selon la valeur p (p) obtenue : * pour p<0,05, ** pour p<0,01, et *** pour p<0,001, NS : non statistiquement significatif) | | Produit se cellulaire À | cellulaire B frais "

Produit Produit Produit Genes Statistiques | CSM cellulaire C cellulaire À | cellulaire B frais de 0.287 0.274 0.425 0.364

1.143 2.967 2.057 2.743 SOX9 SD [0.735 1.434 0.861 1.030

NT PBE

1.186 6.922 3.086 0.696 PPARG SD [0.760 2.142 1.848 0.393

NPB

1.471 49.833 63.586 63.081 ZNF521 1.174 29.088 23.485 32.999

NE

1.000 0.000 0.000 0.018 DKK1 SD | 0.000 0.000 0.004 Marqueurs de 1.083 576.244 546.964 496.801 la matrice | SPON1 sp [0.431 397.782 343.407 167.873

1.014 2.089 0.896 0.949 COL1A1 SD [0.291 0.417 0.403 0.295

NT PBE

1.014 2.189 1.279 1.654 BGN 0.069 0.372 0.347 0.498

NT PBE

1.029 2.222 0.914 0.695 SPARC SD [0.150 0.576 0.318 0.495

NT PBE

1.114 8.244 14.848 4.457 IBSP 0.467 11.279 15.446 4.085

NP

1.500 13.833 9.096 11.813 ALPL 1.615 5.980 6.777 3.895

NT B B

Produit Gènes Statistiques | CSM Produit Produit cellulaire C cellulaire À | cellulaire B frais ours

PF EE

PF EE more

PF EE on eea Re

NEE NEE

EEE SD: écart type Tableau 6b : Profil d'expression génique des produits cellulaires comparatifs (c’est-à-dire, CSM) et des produits cellulaires illustrant l'invention (c’est-à-dire, le produit cellulaire C cryopréservé) (exprimé en changement par rapport aux valeurs moyennes CSM) Expression génique | Gènes Statistiques CSM Produit cellulaire C

OJ mésenchymateux Ln De Gènes maîtres de | RUNX2 différentiation 5e sf EE sf EE sf EE

BOB EE matrice be

PE EE SE SE SE

SE pe + €

EE ER EE EE

EE apoptotiques ==

EER SD : écart type

Taille de la cellule Les mesures de la taille des cellules utilisant (i) le logiciel Motic Image Plus” 2.0 et (ii) l'analyse FSC par cytométrie en flux ont confirmé que les cellules des produit cellulaire B, produit cellulaire C frais et produit cellulaire C cryo étaient plus petites et plus homogènes que les cellules du produit cellulaire A (tableau 7, figure 2).

Il est très intéressant de noter que la grande majorité des cellules des produits cellulaires C (au moins 90 %) ne dépassent pas 25 um de diamètre et que moins de 1 % d'entre elles dépassent 35 um de diamètre.

En revanche, le produit A ne comprenait que 35,4 % des cellules dont le diamètre ne dépasse pas 25 um et 26,9 % des cellules dont le diamètre est supérieur à 35 um (tableau 8, figure 2). Le produit B comprenait 73,7 % des cellules dont le diamètre ne dépasse pas 25 um et 3,3 % des cellules dont le diamètre est supérieur à 35 um (tableau 8, figure 2).

Tableau 7 : diamètre cellulaire des produits cellulaires comparatifs (c’est-à-dire, CSM, produit cellulaire A, produit cellulaire B) et produits cellulaires illustrant l'invention (c’est-à-dire, produits cellulaires C) Produit cellulaire C cryo 19.7 +3.5 12.9 31.4 Ee IE Tableau 8 : distribution de la taille des cellules des produits cellulaires comparatifs (c’est-à-dire, CSM, produit cellulaire A, produit cellulaire B) et des produits cellulaires illustrant l'invention (c’est-à-dire, produit cellulaire C)

Produit cellulaire C cryo CS10 dilué HSA 1:1 | 94.3% Produit cellulaire C cryo CS10 5% HSA 92.3% Produit cellulaire C cryo

92.0% 0.0% HTS 10% HSA 10% DMSO Exemple 3 : Formation osseuse in vivo de cellules de lignée chondro-ostéoblastique dérivées de CSM obtenues par la méthode de l'exemple 1 Matériel et méthodes Cellules Le produit cellulaire illustrant l'invention (c’est-à-dire, le produit cellulaire C cryo) a été obtenu comme décrit dans l'exemple 1. Souris Des souris femelles NMRI-Nude (nu/nu) de 10-11 semaines ont été achetées à Janvier S.A.S. (Le Genest- St-Isle, France) et logées dans des conditions standard avec nourriture et eau ad libitum. Modèle de formation osseuse de voûte crânienne chez la souris Des souris femelles NMRI-Nude (nu/nu) âgées de 12 semaines ont été anesthésiées avec de l'isoflurane (IsoFlo®) et ont reçu une seule administration sous-cutanée du produit cellulaire C cryo (2,5 x 10° cellules dans 100 ul par souris) ou excipient (100 ul) sur la voûte crânienne. Pour marquer la néoformation osseuse au fil du temps, des fluorochromes de liaison au calcium ont été administrés séquentiellement aux souris. Du rouge d'alizarine (rouge), des calcéines (vertes et bleues) et de la tétracycline (jaunes) (toutes de Sigma-Aldrich®) ont été injectées par voie intrapéritonéale 2 ou 3 jours avant et 5, 12 et 19 jours après administration cellulaire, respectivement. Le poids corporel, les signes cliniques généraux et les signes cliniques des animaux de laboratoire ont été surveillés au site d’injection pendant 4 semaines après l'administration. Les souris ont été euthanasiées 4 semaines après l'administration cellulaire par dislocation cervicale et la voûte crânienne de chaque souris a été prélevée pour évaluer les propriétés de formation osseuse des cellules osseuses par imagerie radiographique, histomorphométrie (quantification de la formation osseuse) et par immunofluorescence. Quantification de la formation osseuse par analyse radiographique Après l'euthanasie, l'imagerie radiographique ex vivo de la voûte crânienne de chaque souris placée côte à côte a été réalisée à l'aide du dispositif Faxitron® MX-20. Les images numériques ont été prises à un grossissement de 1,5X en mode manuel avec une tension réglée à 35 kV, un temps d'exposition de 4,8 secondes, une luminosité/contraste de 8300/6000. Les images radiographiques générées sont des images de niveau de gris avec des valeurs d'intensité de gris allant de 0 (région noire) à 255 (région blanche) et sont directement proportionnelles à la radio-opacité et donc à l'opacité ou à l'épaisseur osseuse.

La valeur d'intensité du niveau de gris de la partie ostéoinductrice de la formation osseuse (nodules minéralisés rejetés de la sélection) sur les os pariétaux (sélection manuelle) a été analysée à l'aide de l'histogramme du logiciel AdobePhotoshop®. L'imagerie par rayons X et le logiciel AdobePhotoshop® ont également été utilisés pour quantifier la surface des nodules minéralisés (sélection manuelle). Incorporation de l'échantillon et sectionnement histologique Pour l'histomorphométrie, l'ALP, la TRAP (phosphatase acide résistant au tartrate), les colorants Trichrome Goldner de Masson et l'immunofluorescence, les voûtes crâniennes ont été fixées et déshydratées par incubations successives dans des bains d'éthanol à 70%, 80% et 90% pendant 12 heures chacune, à 4°C et en agitant doucement, dans une résine plastique hydroxyéthylméthacrylate (HistoResin, Leica”). Quatre coupes coronales de 8 um d'épaisseur ont été réalisées à l'aide d'un microtome (Leica®, RM2255). Coloration par immunofluorescence L'évaluation du collagène I humain et murin par immunofluorescence a été réalisée sur des coupes histologiques coronales plastiques de 4 um d'épaisseur de la voûte crânienne.

Brièvement, après une étape de perméabilisation à l'aide d'une solution de PBS 1X/Triton 0,3 % pendant 30 minutes à température ambiante (RT), les coupes histologiques ont été incubées pendant 1 heure à RT dans la solution de blocage (PBS/BSA/sérum de cheval/Triton'") à des sites de liaison non spécifiques.

Les lames histologiques ont ensuite été incubées pendant la nuit à 4°C avec des anticorps primaires au collagène I anti-humain et anti-murin de souris (Abcam ; #ab138492 et Abcam ; #ab21286 respectivement). Après 3 étapes de rinçage au PBS pendant 5 min à RT, le blocage a été réalisé avec la solution de blocage pendant 1 heure à RT.

Les anticorps secondaires dilués dans la solution bloquante ont ensuite été ajoutés pendant 2 heures à la RT et dans l’obscurité.

Les anticorps secondaires Alexa Fluor” 488 d’âne anti-lapin IgG H&L (ThermoFisher, #A21206) et Alexa Fluor® Cy3®° Goat anti-mouse IgG H&L (Abcam ; #ab97035) ont été utilisés pour visualiser le collagène I murin en vert et le collagène I humain en rouge.

Les lames ont ensuite été rincées 3 fois dans PBS 1X pendant 5 minutes à RT et incubées avec la solution NucBlue® pendant 1 minute à RT pour colorer le noyau.

Enfin, les lames ont été brièvement rincées une fois dans du PBS puis montées sur du GlycerGel®. Comme contrôle négatif de l'immunofluorescence, l'anticorps primaire a été omis sur la lame histologique adjacente.

Coloration histologique Les activités ostéoblastiques et ostéoclastiques ont été évaluées sur des coupes de la voûte crânienne en détectant, respectivement, l’activité enzymatique de l’ALP et TRAP.

Pour la coloration de l’ALP, des sections coronales de la voûte crânienne de 4 um d'épaisseur ont été incubées pendant 1 heure avec une solution de sel de bleu solide RR (Sigma-Aldrich®) et de phosphate Naphtol AS-MX alcalin (Sigma- Aldrich®). La coloration du TRAP a été effectuée sur des coupes coronales de la voûte crânienne de 8 um d'épaisseur à l'aide du kit TRAP (Acid Phosphatase, Leukocyte) (Sigma-Aldrich®) en suivant les instructions du fabricant. Pour évaluer l'état de minéralisation de l'os néo-formé, une coloration au Trichrome de Masson Goldner a été effectuée sur les coupes de la voûte crânienne colorées avec ALP à l'aide d'un kit (Bio-Optica®) selon les instructions du fabricant. Les images numériques ont été prises avec un microscope optique (Leica®) et le logiciel Leica” LAS EZ.

Analyses histomorphométriques des voûtes crâniennes La quantification de la formation osseuse (c’est-à-dire, la formation osseuse absolue) a été effectuée sur des tissus intégrés dans du plastique. L’épaisseur absolue de l'os néo-formé (du front de minéralisation basal fluorescent marqué au rouge d'alizarine à la néo-formation osseuse fluorescente marquée à la calcéine et à la tétracycline) avec et sans nodules minéralisés a été mesurée (en um) sur section coronale de 4 um d'épaisseur par le logiciel ZEN® (Zeiss). Pour chaque animal, 4 mesures d'épaisseurs absolues ont été effectuées sur 5 niveaux indépendants, avec une distance de 200 um entre chaque niveau. Dans un premier temps, la moyenne de l'épaisseur (sans ou sans nodules) + SD (c'est-à-dire, la moyenne des 4 mesures par niveau sur les 5 niveaux) a été calculée pour chaque animal. Analyses statistiques Les résultats ont été exprimés en moyenne + SD. Les analyses statistiques ont été effectuées à l'aide du logiciel JMP® (SAS Institute Inc.) ou GaphPad Prism”. Les différences entre les groupes étaient considérées comme statistiquement significatives lorsque p<0,05. Résultats Les souris auxquelles on a administré les produits cellulaires C cryo ont montré une formation osseuse supérieure à celle des témoins 4 semaines après l'administration (figures 8A-C). L'opacité osseuse était significativement plus élevée pour les cellules C cryo formatrices d'os que pour l'excipient (figure 8B). La surface de l'ostéogénie était significativement plus élevée que celle de l'excipient dans lequel aucun nodule minéralisé n'a été observé (figure 8C). Les mesures histomorphométriques de l'ostéoinduction avec ou sans ostéogénie (représentée par la formation osseuse absolue) étaient significativement plus élevées pour les cellules C cryo formatrices d’'os que pour l’excipient (figure 8D-E). De plus, en plus des activités d'ostéoinductionles cellules formatrices d’os C cryo ont favorisé une forte activité ostéogénique mise en évidence par la présence de nodules minéralisés. Cette activité ostéogénique a été observée chez 4/5 donneurs de moelle osseuse (ou production de lots) et 65% des souris (figure 8F). Un donneur/lot a été considéré comme ostéogénique (positif) lorsqu'au moins un nodule minéralisé a été observé chez une souris par groupe. Aucun nodule n'a été observé après l'administration de l'excipient.

Plus particulièrement, les produits cellulaires C cryo présentaient des propriétés ostéoinductives (formation osseuse homogène d'origine murine sur la voûte crânienne) et ostéogéniques (nodules minéralisés d'origine humaine et murine) (figure 9). Une ossification intramembranaire de l'hôte a été induite le long de la surface de la voûte crânienne (figures 9 et 10). Plus particulièrement, les cellules C cryo ostéo-inductrices présentent des propriétés ostéoinductrices et ostéogéniques (figure 10, "fluo"). La double immunomarquage collagène de type I souris/humain (figure 10, "collagène humain de type I”) a révélé la présence d'os provenant de l’hôte et du donneur (ostéogénie). Les activités des ostéoblastes (figure 10, "ALP+") et des ostéoclastes (figure 10, "TRAP") ont surtout été détectées dans les nodules minéralisés montrant que le processus de remodelage osseux des nodules était toujours en cours 4 semaines après leur administration. Cette observation dépendait de la taille du nodule : plus le nodule est grand, plus les activités de l’ALP et du TRAP sont encore présentes 4 semaines après son administration. Un ostéoïde de petite taille (figure 10, "Coloration au trichrome de Masson de Goldner”) a été mis en évidence indiquant que le processus de formation osseuse est terminé.

Par conséquent, les cellules formatrice d’os C cryopréservées augmentent la néoformation osseuse.

Ceci démontre l'utilité des produits cellulaires et de la composition cellulaire tels que décrits dans la spécification et les exemples de traitement des défauts osseux dans les os plats ainsi que dans les os longs. Exemple 4 : Défaut fémoral segmentaire de taille subcritique (sub-CSD) réparé in vivo chez la souris par le produit cellulaire C cryo obtenu par la méthode de l'exemple 1 Procédures expérimentales Cellules Les produits cellulaires illustrant l'invention (c'est-à-dire, le produit cellulaire C cryo) sont obtenus comme décrit dans l'exemple 1.

Modèle de défaut fémoral segmentaire de taille subcritique (sub-CSD) L'intervention chirurgicale a été réalisée dans des conditions aseptiques selon la littérature (Manassero et al, 2013, Tissue Engineering, Part C Methods, 19(4):271-80 ; Manassero et al, 2016, Journal of Visualized Experiments ; (116) : 52940). Brièvement, des souris femelles NMRI-Nude (nu/nu) âgées de 13 semaines ont été anesthésiées avec de l'isoflurane (IsoFlo®) ou par injection intrapéritonéale d'un mélange de chlorhydrate de dexmédétomidine (Dexdomitor®, Orion Pharma, 1 mg/kg de poids vif) et de kétamine (Nimatek®, Euronet, 150 mg/kg de poids ventral) sur une plaque chauffante. Après l'application d'une plaque de microblocage PEEK à 6 trous (RISystem AG”) sur la face antérieure du fémur gauche, une ostéotomie fémorale mi-diaphysaire de 2 mm de long a été réalisée à l’aide d’une scie Gigli et d’un pied coulissant (RISystem AG”). Comme médicament préventif, des antibiotiques (Baytril®, 10 mg/kg de poids corporel) ont été administrés la veille de l'intervention (dans de l'eau potable) et des analgésiques (chlorhydrate de buprénorphine, Temgesic”, Schering-Plough, 0,1 mg/kg de poids corporel) la veille et toutes les 12 heures pendant au moins 3 jours après la chirurgie. Les cellules C dérivées de CSM ont été cryopréservées (1,25 x 10° cellules dans un volume de 50 ul par souris) ou l'excipient (groupe contrôle) a été administré le lendemain de l'intervention, localement au site du défaut osseux, par injection percutanée avec une seringue Hilton® de 100 ul. Des souris ont été euthanasiées 10 semaines après l'administration de cellules ou d'excipient par dislocation cervicale. Le fémur gauche de chaque souris a été disséqué, prélevé et conservé dans du NaCl à 0,9 % à température ambiante jusqu'à la radiographie.

Quantification de la réparation osseuse par radiographie Une imagerie radiographique in vivo du fémur gauche de chaque souris a été réalisée à l'aide du dispositif Faxitron® MX-20 juste après l'intervention pour contrôler la fixation de la plaque, la taille du défaut fémoral segmentaire et pour obtenir une valeur de référence, et toutes les deux semaines jusqu'à 10 semaines après administration des cellules ou excipients. Les images numériques ont été prises en vue médio-latérale et antéro-postérieure à un grossissement 5X en mode manuel avec une tension réglée à 35 kV, un temps d'exposition de 4,8 secondes, une luminosité de 4 300 et un contraste de 7 100.

L'efficacité a été mesurée selon trois méthodes différentes, soit le pourcentage de réparation osseuse, le score d'union radiographique (RUS) adapté et le score de fusion, toutes les deux semaines de la surveillance : - Le pourcentage de réparation osseuse a été calculé en divisant la taille du défaut de réparation par la taille initiale du défaut. La taille du défaut a été quantifiée pour chaque souris au fil du temps en mesurant la distance (um) entre les deux bords du défaut osseux à deux endroits (les deux corticales) sur des images radiographiques médiolatérales et antéropostérieures (4 mesures au total), en utilisant le logiciel Image)”. La moyenne des quatre mesures a été calculée pour chaque souris à chaque point dans le temps.

- Le RUS (score d'union radiographique) adapté pour le modèle sub-CSD est une mesure semi- quantitative basée sur la présence ou l'absence d'une néoformation osseuse, d'un pontage et d'une ligne de fracture (images radiographiques antéro-postérieures et médiolatérales). Le score correspond à la somme de 4 scores déterminés sur 2 sites de défauts corticaux sur les deux vues (total de 4 scores allant de 1 à 4 chacun). Le score varie donc de 4 (aucun signe de guérison) à 16 (fusion complète).

- Le score de fusion est un score binaire qui évalue le taux de fusion entre les bords du défaut fémoral. Les critères radiologiques utilisés pour définir la fusion sont la visualisation du pontage du défaut dans au moins 3 corticales (Cekig E et al, Acta Orthop Traumatol Turc. 2014, 48(5), 533-40). Le score peut être de 0 (pas de fusion) ou de 1 (fusion). Pour ce paramètre, seul le dernier point dans le temps a été analysé (W10, ici).

Analyses statistiques Les résultats sont exprimés en moyenne + écart type (SD). Les analyses statistiques comprenant des mesures répétées ANOV A bidirectionnelles suivies d'un test post-hoc Bonferroni sont effectuées à l'aide du logiciel JMP® (SAS Institute Inc.) ou GraphPad Prism”. Les différences entre les groupes étaient considérées comme statistiquement significatives lorsque p<0,05. Résultats Dans le modèle segmentaire fémoral sub-CSD, la cryoconservation des cellules C formatrices d’os a amélioré et accéléré significativement le pourcentage de réparation des fractures osseuses (figures 11 et 12) par rapport à l'excipient de 2 à 10 semaines après administration (p<0,001). De plus, le score RUS était significativement plus élevé pour le groupe cryopréservé des cellules C formatrices d’os que pour le groupe des excipients (figure 13). Enfin, le taux de fusion a également été amélioré avec la fusion chez 9/19 (47 %) des souris 10 semaines après l'administration de cellules formatrices d’os C cryopréservées, comparativement à l'absence de fusion après l'administration d'excipient.

Ceci démontre l'utilité des produits cellulaires et de la composition cellulaire tels que décrits dans la spécification et les exemples de traitement des défauts osseux dans les os longs ainsi que dans les os plats.

Exemple 5 : Durée de la culture secondaire et tertiaire selon les études cinétiques et l'analyse de l'expression des marqueurs Les cellules dérivées de CSM selon le mode de réalisation de l'invention obtenue après la culture secondaire décrite dans l'exemple 1 ci-dessus ont été prélevées à différents moments (D21, D22, D23, D24, D24, D25 et D28) et le cycle cellulaire a été analysé par cytométrie en flux (BD FACSCanto IITM et le logiciel BD FACSDivaTM ; Becton Dickinson). L'ADN total des cellules a été coloré avec de la 7-amino-actinomycine D (7-AAD) à l'aide des Flow Kits BrdU de BD Pharmigen"". En résumé, 10° cellules ont été fixées dans 100 ul de BD Cytofix/Cytoperm Buffer puis incubées pendant 20 min à température ambiante et lavées avec 1 ml de BD Perm/Wash Buffer puis centrifugées 5 min à 300 g.

Le surnageant a été jeté et les cellules ont été perméabilisées dans 100 ul de BD Cytoperm Permeabilization Buffer Plus puis incubées pendant 10 min à 4°C puis lavées avec BD Perm/Wash Buffer puis centrifugées 5 min à 300 g.

Le surnageant a été jeté et les cellules ont de nouveau été fixées dans 100 ul de tampon BD Cytofix/Cytoperm (5 min à température ambiante) et lavées avec BD Perm/Wash Buffer, centrifugées 5 min à 300 g.

L'ADN cellulaire total a été coloré dans 20 ul de solution 7-AAD puis incubé pendant 10 min à température ambiante dans le noir.

Un ml de tampon de coloration a été ajouté aux échantillons avant d'être transféré dans des tubes adaptés à la cytométrie en flux.

Les échantillons ont été analysés sur un cytomètre en flux FACSCanto"" II (Becton-Dickinson) et l'émission de 7-AAD a été quantifiée après avoir traversé un filtre passe-haut de 650 nm.

Les figures 3 et 4 montrent que les cellules à D24 étaient situées près de la fin de la courbe de prolifération. Les cellules n'avaient pas encore quitté le cycle cellulaire alors qu'à partir de D25, les cellules avaient principalement quitté le cycle cellulaire, c'est-à-dire qu'elles ne proliféraient plus.

La figure 4 illustre l'analyse du cycle cellulaire avec les événements/phases (G0/G1, S et G2/M) des cellules en culture secondaire à différentes durées de culture. À D24, 42% des cellules étaient encore en prolifération (11% S et 31% G2/M) alors qu'à D25, les cellules étaient principalement sorties du cycle cellulaire. Par conséquent, la durée optimale pour la culture secondaire était de 24 jours.

Les cellules dérivées de CSM obtenues après une culture tertiaire, comme décrit dans l'exemple 1, ont été prélevées à différents moments : chaque jour du jour 34 (D34) au jour 42 (D42) et l'expression des marqueurs de surface cellulaire a été analysée par cytométrie en flux comme décrit dans l'exemple 2. L'analyse de l'expression des marqueurs de cytométrie en flux effectuée sur une population cellulaire de cellules de lignée chondro-ostéoblastique dérivées de CSM a montré que les expressions des marqueurs de différenciation (BMP2, RUNX2, ZNFS21, SPARC, MMP13, CHI3L1) augmentent de D34 à D42 (figure 5), et que l'expression du marqueur de prolifération KI67 diminue pendant la durée de culture (de D34 à D42).

La figure 6 illustre la densité cellulaire à différentes durées de culture pour 8 lots. La densité cellulaire était généralement plus élevée à D36. Les cellules ont été comptées par cytométrie (BD Trucount'"). La figure 7 illustre le diamètre moyen des cellules à différentes durées de culture pour 2 lots. Le diamètre de la cellule était minimal à D35 et D36. Par conséquent, le comptage et la mesure de la taille des cellules montrent que les cellules atteignaient un plateau de prolifération entre D35 et D38 et que la taille des cellules était minimale à D35 et D36 (figures 6 et 7).

Compte tenu de cela et de la densité cellulaire la plus élevée à D36, la durée optimale pour la culture tertiaire est à D36.

Claims (20)

REVENDICATIONS modifiées

1. Procédé d'obtention de cellules souches mésenchymateuses (CSM) de lignée chondro- ostéoblastique à partir de CSM, le procédé comprenant : (a) la culture de CSM provenant d'un échantillon biologique d'un sujet dans un milieu de culture comprenant le facteur de croissance des fibroblastes-2 (FGF-2), le facteur de croissance transformant bêta (TGFB) et de l'héparme ou un dérivé ou analogue de celle-ci à une concentration d'au moins 0,01 IU/ml, pour obtenir des cellules dérivées de cellules souches mésenchymateuses (CSM) ; b) un premier passage des cellules dérivées de CSM et la culture ultérieure des cellules dérivées de CSM dans un milieu tel que défini au point a) ; et (c) un second passage des cellules dérivées de CSM et la culture ultérieure des cellules dérivées de CSM dans un milieu tel que défini en (a), obtenant ainsi les cellules dérivées de CSM de lignée chondro-ostéoblastique, dans lequel les cellules dérivées de CSM sont cultivées dans l'étape (b) pendant une période de x jours, le jour x étant le dernier jour où au moins 20% des cellules dérivées de CSM sont en prolifération.

2. Procédé selon la revendication 1, dans lequel les cellules dérivées de CSM sont cultivées dans l'étape (b) pendant une période d'environ 8 jours à environ 12 jours, de préférence pendant une période d'environ 10 jours.

3. Procédé selon la revendication 1 ou 2, dans lequel les cellules dérivées de CSM sont cultivées dans l'étape (a) pendant une période d'environ 13 jours à environ 15 jours, de préférence pendant une période d'environ 14 jours.

4. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, dans lequel les cellules dérivées de CSM sont cultivées dans l'étape (c) pendant une période d'environ 10 jours à environ 14 jours, de préférence pendant une période d'environ 12 jours.

5, Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, dans lequel les cellules dérivées de CSM en prolifération sont en phase S, en phase G2 ou en phase M du cycle cellulaire.

6. Procédé d'obtention de cellules dérivées de CSM de lignée chondro-ostéoblastique à partir de CSM, le procédé comprenant :

(a) la culture de CSM provenant d'un échantillon biologique d'un sujet dans un milieu de culture comprenant du FGF-2, du TGFB et de l'héparine ou un dérivé ou analogue de celle-ci à une concentration d'au moins 0,01 Ul/ml, obtenant ainsi des cellules dérivées de CSM; b) un premier passage des cellules dérivées de CSM et la culture ultérieure des cellules dérivées de CSM dans un milieu tel que défini au point a) ; et (c) un second passage de cellules dérivées de CSM et la culture ultérieure des cellules dérivées de CSM dans un milieu tel que défini en (a), obtenant ainsi les cellules dérivées de CSM de lignée chondro-ostéoblastique, dans lequel les cellules dérivées de CSM sont ensemencées pour la culture ultérieure dans l'étape (b) à une densité de 3x10? à 1x10° cellules/cm?, de préférence à une densité de 3x10? à 8x10° cellules/em”.

7, Procédé selon la revendication 6, dans lequel les cellules dérivées de CSM sont ensemencées pour la culture ultérieure dans l'étape (c) à une densité de 3x10? à 1x10* cellules/em”, de préférence à une densité de 3x10? à 8x10? cellules/cm”.

8. Procédé d'obtention de cellules dérivées de CSM de lignée chondro-ostéoblastique à partir de CSM, le procédé comprenant : (a) la culture de CSM provenant d'un échantillon biologique d'un sujet dans un milieu de culture comprenant du FGF-2, du TGFP et de l'héparine ou un dérivé ou analogue de celle- ci à une concentration d'au moins 0,01 Ul/m|, obtenant ainsi des cellules dérivées de CSM ; (b) un premier passage des cellules dérivées de CSM et la culture ultérieure des cellules dérivées de CSM dans un milieu tel que défini en (a) ; (c) un second passage des cellules dérivées de CSM et la culture ultérieure des cellules dérivées de CSM dans un milieu tel que défini en (a), obtenant ainsi les cellules dérivées de CSM de lignée chondro-ostéoblastique ; (d) la resuspension les cellules dérivées de CSM de lignée chondro-ostéoblastique dans un milieu de cryopréservation approprié pour administration à un sujet ; et (e) la cryoconservation des cellules dérivées de CSM de lignée chondro-ostéoblastique.

9. Procédé selon la revendication 8, dans lequel les cellules dérivées de CSM de lignée chondro- ostéoblastique sont remises en suspension dans le milieu de cryoconservation dans l'étape (d) à une concentration comprise entre environ 1x107 cellules/ml et environ 1x10* cellules/ml, de préférence à une concentration entre environ 2x107 cellules/ml et environ 4x107 cellules/ml.

10. Procédé selon la revendication 8 ou 9, dans lequel le milieu de cryoconservation comprend du diméthylsulfoxyde (DMSO), de l'albumine sérique humaine (HSA), de l'adénosine, un polypeptide, un benzopyranne, ou une combinaison de ceux-ci.

11. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 10, dans lequel le TGFB est choisi parmi le groupe constitué de TGFB1, TGFP2, TGFB3, et leurs mélanges ; de préférence dans lequel le TGFP est du TGFP1.

12. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 11, dans lequel : -la concentration d'héparine ou de son dérivé ou analogue est d'environ 0,1 UI/ml ; et/ou -l'héparine ou son dérivé ou analogue est choisi dans le groupe constitué par l'héparine non fractionnée (HNF) ; l'héparine de faible poids moléculaire (HBPM), comme l'énoxaparimne, la daltéparine, la nadroparine, la tinzaparine, la certoparine, la reviparine, l'ardeparine, la pamaparine, la bémiparine ou leurs mélanges ; un héparinoïde, tel que le sulfate d'héparane, le sulfate de dermatane, le sulfate de chondroïtine, le sulfate d'acharane, le sulfate de kératane, ou leurs mélanges, tels que le danaparoïde, un sel d'héparine, un sel d’héparinoïde, un fragment héparinoïde, un fragment héparinoïde et leurs mélanges.

13. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 12, dans lequel les CSM ou les cellules dérivées de CSM sont, en outre, mises en contact avec, un milieu qui comprend, en outre, le plasma, sérum ou un substitut de ceux-ci ou une combinaison de ceux-ci.

14. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 13, dans lequel le sujet est un sujet humain.

15. Population de cellules dérivées de CSM de lignée chondro-ostéoblastique pouvant être obtenues ou obtenues par expansion in vitro ou ex vivo de CSM, dans lequel au moins 90% des cellules dérivées de CSM de lignée chondro-ostéoblastique en suspension ont un diamètre égal ou inférieur à 25 um (Ds < 25 um) et dans lequel au plus 1% des cellules dérivées de CSM de lignée chondro-ostéoblastique en suspension ont un diamètre supérieur à 35 um.

16. Population de cellules dérivées de CSM de lignée chondro-ostéoblastique selon la revendication 15, dans laquelle les cellules dérivées de CSM de lignée chondro-ostéoblastique peuvent être obtenues ou sont obtenues par les méthodes définies dans l'une quelconque des revendications 1 à 14.

17. Formulation pharmaceutique comprenant la population de cellules dérivées de CSM de lignée chondro-ostéoblastique telle que définie dans l'une quelconque des revendications 15 ou 16.

18. Formulation pharmaceutique selon la revendication 17, dans laquelle la formulation pharmaceutique comprend, en outre, un composant ayant des propriétés ostéoconductrices, telles que du phosphate tricalcique, de l'hydroxyapatite, une combinaison de particules d'hydroxyapatite/phosphate tricalcique, de l'acide polylactique, de l'acide glycolique polylactique, de l'acide hyaluronique ou un dérivé de ceux-ci, du chitosan, du poly L-lysine, de la gélatine, du collagène, de l'ostéonectine, de fibrinogène, de l'ostéocalcine ou une combinaison de ces substances.

19. La population de cellules dérivées de CSM de lignée chondro-ostéoblastique selon l'une quelconque des revendications 15 ou 16, ou la formulation pharmaceutique selon la revendication 17 ou 18, pour utilisation en tant que médicament, de préférence pour utilisation dans le traitement d'un sujet nécessitant une transplantation de cellules de lignée chondro- ostéoblastique.

20. Population ou formulation pharmaceutique destinée à être utilisée selon la revendication 19, dans laquelle : -les cellules dérivées de CSM de lignée chondro-ostéoblastique sont présentes à une concentration comprise entre environ 1x107 cellules/ml et environ 1x10° cellules/ml, de préférence entre environ 2x107 cellules/ml et environ 4x10" cellules/ml : et/ou -la population de cellules dérivées de CSM de lignée chondro-ostéoblastique ou la formulation pharmaceutique est adaptée à une administration percutanée, intra-osseuse, intra-articulaire, intervertébrale ou intravasculaire ; -la population de cellules dérivées de CSM de lignée chondro-ostéoblastique ou la formulation pharmaceutique est adaptée à une administration au site d'un défaut osseux