BE1020528A3 - Utilisations du facteur de croissance et differenciation 8 (gdf 8). - Google Patents
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Description
TITRE : UTILISATIONS DU FACTEUR DE CROISSANCE ET DIFFERENCIATION 8 (GDF-8)
DOMAINE
La présente invention concerne des applications du facteur de croissance et différenciation 8 (GDF-8) in vitro ou in vivo pour modifier les propriétés de cellules telles que, en particulier, des cellules souches mésenchymateuses (CSM), des tissus ou des matériaux. La présente invention concerne en outre des procédés pour différencier des CSM in vitro ou ex vivo en ostéoprogéniteurs (comprenant des ostéoprogéniteurs précoces et tardifs) ou cellules ostéoblastiques (comprenant des pré-ostéoblastes, des ostéoblastes et des ostéocytes) ou une population de cellules comprenant des ostéoprogéniteurs et/ou des cellules ostéoblastiques. De plus, la présente invention concerne des ostéoprogéniteurs ou des cellules ostéoblastiques ou une population de cellules comprenant de tels ostéoprogéniteurs et/ou cellules ostéoblastiques, pouvant être obtenus par les procédés, et lesdits ostéoprogéniteurs ou cellules ostéoblastiques (tels que par exemple, des ostéoprogéniteurs allogéniques ou des ostéoblastes allogéniques) ou la population de cellules comprenant des ostéoprogéniteurs et/ou des cellules ostéoblastiques pour utilisation dans le traitement de maladies musculosquelettiques.
CONTEXTE
Les maladies ou troubles musculosquelettiques peuvent affecter les os, les muscles, les articulations, le cartilage, les tendons, les ligaments, et un autre tissu conjonctif qui soutient et relie les tissus et organes conjointement. Ces maladies peuvent se développer au cours du temps ou peuvent résulter, par exemple, d’une utilisation excessive du système musculosquelettique ou d’un traumatisme. Les maladies musculosquelettiques peuvent être difficiles à diagnostiquer et/ou traiter en raison de la relation étroite du système musculosquelettique avec les autres systèmes internes.
Une approche possible et prometteuse pour le traitement des maladies musculosquelettiques et en particulier des maladies osseuses est la transplantation de cellules souches mésenchymateuses (CSM) capables de subir une différenciation ostéogénique ou de cellules qui sont dirigées vers le lignage ostéoblastique.
Les CSM ont été utilisées précédemment pour traiter des troubles osseux (Gangji et al. Expert Opin Biol Ther, 2005, vol. 5, 437-42). Cependant, bien que de telles cellules souches relativement indifférenciées puissent être transplantées, elles ne sont pas dirigées vers le lignage ostéoblastique et par conséquent, une proportion considérable de cellules souches ainsi transplantées ne peuvent pas contribuer finalement à la formation du tissu souhaité. De plus, la quantité de telles cellules souches pouvant être obtenues à partir de tissus de source possible quelconque est souvent insatisfaisante.
WO 2007/093431 décrit un procédé visant à obtenir un degré suffisant d’expansion in vitro de CSM isolées et à produire des cellules qui présentent un phénotype ostéoblastique. Dans ledit procédé, en particulier, des CSM humaines ont été cultivées en présence de sérum ou de plasma et de facteur de croissance des fibroblastes basique (FGF-2).
WO 2009/087213 décrit un procédé pour la différenciation ostéogénique de CSM humaines, en particulier, en utilisant du plasma ou du sérum humain, FGF-2 et TGFß-Ι.
Cependant, il existe un besoin de procédés fiables supplémentaires et/ou améliorés pour produire des ostéoprogéniteurs, ou cellules ostéoblastiques, utiles ou des populations de cellules comprenant des ostéoprogéniteurs et/ou des cellules ostéoblastiques, à partir de CSM.
Il existe en outre un besoin de modifier des cellules, tissus ou matériaux utiles pour administration à des patients, par exemple, en particulier, pour réduire l’immunogénicité ou le risque de rejet de ceux-ci par les patients.
RÉSUMÉ
Comme exemplifié dans la section expérimentale, les inventeurs ont réalisé que le facteur de croissance et différenciation 8 (GDF-8) réduit avantageusement l’immunogénicité de cellules, telles que, par exemple, des cellules souches mésenchymateuses (CSM), cultivées ou différenciées (par exemple, différenciées en cellules de lignages cellulaires mésenchymateux, par exemple, entre autres, en ostéoprogéniteurs ou cellules ostéoblastiques ou populations de cellules comprenant des ostéoprogéniteurs et/ou des cellules ostéoblastiques) en présence de GDF-8.
En étendant les découvertes mentionnées ci-dessus, les inventeurs ont reconnu la capacité de GDF-8 à réduire l’immunogénicité de cellules. En conséquence, un aspect de l’invention concerne l’utilisation du facteur de croissance et différenciation 8 (GDF-8) pour réduire l’immunogénicité de cellules in vitro. Une telle utilisation est avantageuse parce qu’elle permet la transplantation des cellules, par exemple, chez un sujet allogénique. Des modes de réalisation particuliers concernent l’utilisation de GDF-8 pour réduire l’immunogénicité de cellules in vitro, les cellules étant choisies dans le groupe constitué de cellules souches mésenchymateuses (CSM), cellules obtenues par différenciation de CSM, cellules de lignage ostéocytaire, cellules de lignage chondrocytaire, cellules de lignage adipocytaire, cellules de lignage myocytaire, cellules de lignage tendonocytaire, cellules de lignage fibroblastique, et cellules de lignage stromatogène. Des cellules de lignages ostéocytaire, chondrocytaire, adipocytaire, myocytaire, tendonocytaire, fibroblastique, ou stromatogène peuvent être considérées comme appartenant à la catégorie des lignages cellulaires mésenchymateux, par conséquent l’utilité de GDF-8 pour réduire l’immunogénicité de telles cellules est mise en évidence.
Dans certains modes de réalisation, les cellules de lignage ostéocytaire, cellules de lignage chondrocytaire, cellules de lignage adipocytaire, cellules de lignage myocytaire, cellules de lignage tendonocytaire, cellules de lignage fibroblastique, ou cellules de lignage stromatogène peuvent être obtenues par différenciation de CSM, plus particulièrement les cellules peuvent être obtenues par différenciation in vitro ou ex vivo de CSM. La différenciation de CSM peut mettre en œuvre la culture de CSM dans des conditions capables d’induire la différenciation de CSM vers le type de cellules souhaité, plus typiquement la culture de CSM dans un milieu comprenant un ou plusieurs facteurs (par exemple, des facteurs de croissance) capables d’induire la différenciation de CSM vers le type de cellules souhaité. Des protocoles pour la différenciation de CSM sont connus en tant que tels (voir, entre autres, WO 2007/093431 ; et en outre REGER, R.L. et al. « Differentiation and Characterization of Human MSCs ». Dans : Mesenchymal Stem Cells : Methods and Protocole (Methods in Molecular Biology), édité par DJ. Prockop et al. Humana Press, 2008, vol. 449, p. 93-107 ; VERMURI, M.C. et al. (éd.). Mesenchymal Stem Cell Assays and Applications (Methods in Molecular Biology). Humana Press, 2011, vol. 698, en particulier les pages 201 à 352).
Afin de réduire l’immunogénicité des cellules obtenues par différenciation de CSM in vitro ou ex vivo, les cellules peuvent être exposées à (c’est-à-dire, mises en contact avec ou cultivées dans un milieu contenant) GDF-8 après que les cellules souhaitées aient été obtenues par différenciation de CSM, et/ou les cellules (CSM) peuvent être exposées à GDF-8 dans le cadre d’une ou plusieurs étapes du procédé ou protocole respectif pour différencier les CSM en cellules souhaitées. Au moyen d’un exemple, comme décrit par ailleurs dans la présente spécification, les CSM peuvent être différenciées en ostéoprogéniteurs ou cellules ostéoblastiques ou en une population de cellules comprenant des ostéoprogéniteurs et/ou des cellules ostéoblastiques par un procédé comprenant l’étape de culture des CSM dans un milieu comprenant du plasma ou du sérum, GDF-8 et le facteur de croissance des fîbroblastes 2 (FGF-2), de sorte que l’immunogénicité des cellules résultantes soit réduite.
Réciproquement, des cellules obtenues par différenciation de CSM peuvent donc désigner particulièrement des cellules de lignage ostéocytaire, des cellules de lignage chondrocytaire, des cellules de lignage adipocytaire, des cellules de lignage myocytaire, des cellules de lignage tendonocytaire, des cellules de lignage fibroblastique, ou des cellules de lignage stromatogène.
Dans d’autres modes de réalisation, les cellules peuvent être des CSM, des ostéoprogéniteurs, des cellules ostéoblastiques, des ostéocytes, des cellules chondroblastiques, des chondrocytes, des cellules adipoblastiques, des adipocytes, des cellules myoblastiques, ou des myocytes. Encore plus préférablement, les cellules peuvent être des CSM, des ostéoprogéniteurs, des cellules ostéoblastiques, des cellules chondroblastiques, ou des chondrocytes. Encore plus préférablement, les cellules peuvent être des CSM. De façon particulièrement préférable, en outre, les cellules peuvent être des ostéoprogéniteurs ou des cellules ostéoblastiques. Dans de tels types de cellules, l’effet avantageux de GDF-8 sur la réduction de l’immunogénicité des cellules tend à être particulièrement démontrable.
Par conséquent, dans certains modes de réalisation, des cellules peuvent être des CSM, de préférence des CSM humaines adultes. De telles cellules CSM peuvent être, de manière appropriée mais sans limitation, cultivées dans un milieu comprenant du sérum ou du plasma et facultativement FGF-2. En particulier, FGF-2 peut être inclus lorsque la différenciation des CSM en cellules de lignage ostéocytaire, par exemple, des ostéoprogéniteurs ou des cellules ostéoblastiques, est prévu. Les cellules peuvent être destinées à une utilisation autologue ou allogénique, de préférence, les cellules peuvent être destinées à une utilisation allogéniqueDans d’autres modes de réalisation, les cellules peuvent être des ostéoprogéniteurs ou des cellules ostéoblastiques. De tels ostéoprogéniteurs ou cellules ostéoblastiques peuvent être, de manière appropriée mais sans limitation, cultivés dans un milieu comprenant du sérum ou du plasma et facultativement FGF-2. Les cellules peuvent être destinées à une utilisation autologue ou allogénique, de préférence, les cellules peuvent être destinées à une utilisation allogénique.
Les utilisations mentionnées ci-dessus peuvent être appliquées à des cellules animales, de préférence à des cellules d’animal à sang chaud. Encore plus préférablement, les cellules destinées à ces utilisations sont des cellules de mammifère, telles que des cellules humaines ou des cellules de mammifère non humain, encore plus préférablement des cellules humaines.
Dans certains modes de réalisation, la présente invention concerne l’utilisation de GDF-8 pour réduire l’immunogénicité de cellules in vitro, dans laquelle GDF-8 réduit le récepteur de complexe de surface cellulaire de CMH de classe II sur les cellules et réduit facultativement un ou plusieurs facteurs costimulants sur lesdites cellules.
L’expression « réduit le récepteur de complexe de surface cellulaire de CMH de classe II sur les cellules », dans le présent contexte, désigne une quantité et/ou une disponibilité réduites (par exemple, la disponibilité pour exercer son activité biologique) de récepteur de complexe de surface cellulaire de CMH de classe II sur les cellules. Ces quantité et/ou disponibilité réduites couvrent une quantité réduite de récepteur de complexe de surface cellulaire de CMH de classe II sur les cellules et/ou une fraction réduite des cellules exprimant le récepteur de complexe de surface cellulaire de CMH de classe II dans une population de cellules. Par exemple, sur des cellules humaines, le récepteur de complexe de surface cellulaire de CMH de classe II peut être un récepteur de complexe de surface cellulaire de CMH de classe Π codé par le complexe HLA tel que HLA-DR, HLA-DQ, HLA-DP, HLA-DO, ou HLA-DM. De préférence, sur des cellules humaines, le récepteur de complexe de surface cellulaire de CMH de classe II peut être HLA-DR. Par conséquent, il est en outre présentement décrit l’utilisation de GDF-8 pour réduire l’immunogénicité de cellules humaines in vitro, dans laquelle GDF-8 réduit HLA-DR sur les cellules humaines.
L’expression « réduit un ou plusieurs facteurs costimulants sur les cellules » dans le présent contexte, désigne une quantité et/ou une disponibilité réduites (par exemple, la disponibilité pour exercer leur activité biologique) d’un ou plusieurs facteurs costimulants sur les cellules. Ces quantités et/ou disponibilités réduites comprennent une quantité réduite d’un ou plusieurs facteurs costimulants sur les cellules et/ou une fraction réduite des cellules exprimant un ou plusieurs facteurs costimulants dans une population de cellules.
De plus, sans limitation, l’un quelconque et tous parmi (i) à (viii) tels que présentement décrits ci-dessous sont particulièrement inclus dans cet aspect de l’invention: (i) l’utilisation de GDF-8 pour réduire l’immunogénicité de cellules in vitro ; (ii) l’utilisation telle que décrite dans (i) ci-dessus, dans laquelle GDF-8 réduit le récepteur de complexe de surface cellulaire de CMH de classe II sur lesdites cellules et réduit facultativement un ou plusieurs facteurs costimulants sur lesdites cellules ; (iii) l’utilisation telle que décrite dans (i) ou (ii) ci-dessus, dans laquelle lesdites cellules sont des cellules animales, de préférence des cellules de mammifère telles que des cellules humaines ou des cellules de mammifère non humain ; (iv) l’utilisation telle que décrite dans (ii) ou (iii) ci-dessus, dans laquelle, sur des cellules humaines, ledit récepteur de surface cellulaire de CMH de classe II est un antigène de leucocyte humain DR (HLA-DR) ; (v) l’utilisation telle que décrite dans l’un quelconque de (i) à (iv) ci-dessus, dans laquelle lesdites cellules sont des CSM, de préférence des CSM humaines adultes ; (vi) l’utilisation telle que décrite dans l’une quelconque des revendications (i) à (iv) ci-dessus, dans laquelle lesdites cellules sont des ostéoprogéniteurs ou des cellules ostéoblastiques.
Dans certains modes de réalisation, les cellules telles que spécifiées ci-dessus peuvent être comprises dans un matériau à administrer au sujet, tel que, de préférence, dans un implant ou une greffe (plus préférablement dans un implant ou une greffe de tissu osseux et/ou articulaire (par exemple, un implant ou une greffe de moelle osseuse ou de tissu osseux)), ou dans une formulation pharmaceutique. En réduisant l’immunogénicité des cellules comprises dans lesdits matériaux, tels que des implants, des greffes ou des formulations pharmaceutiques, le risque de rejet de tels produits ou compositions thérapeutiquement adaptés par des sujets auxquels ils sont administrés peut être réduit.
Un autre aspect de l’invention concerne GDF-8 pour utilisation dans la réduction de l’immunogénicité de cellules, GDF-8 devant être administré in vivo. GDF-8 peut être administré localement, par exemple, à un site de lésion musculosquelettique, par exemple par injection. GDF-8 peut être administré seul ou en combinaison avec des cellules telles que des cellules souches, de préférence des CSM, de préférence avec des CSM humaines adultes, et/ou avec des cellules telles que des ostéoprogéniteurs ou des cellules ostéoblastiques ou avec une population de cellules comprenant des ostéoprogéniteurs et/ou des cellules ostéoblastiques, de préférence de telles cellules pouvant être humaines. De préférence, GDF-8 peut être administré en combinaison avec des CSM, plus préférablement des CSM humaines adultes. Par conséquent, il est décrit en outre GDF-8 pour utilisation dans la réduction de l’immunogénicité de cellules, GDF-8 devant être administré avec des CSM, de préférence avec des CSM humaines adultes, in vivo. GDF-8, facultativement en combinaison avec des cellules comme décrit ci-dessus, peut en outre être co-administré avec FGF-2. De préférence, le sujet auquel ladite administration doit être effectuée peut être humain. De préférence, les cellules ou populations de cellules devant recevoir l’administration peuvent être autologues ou allogéniques pour ledit sujet. GDF-8 et les cellules ou populations de cellules respectives telles que des CSM peuvent être administrés simultanément in vivo, ou peuvent être administrés séquentiellement dans un ordre quelconque in vivo, par exemple, les cellules ou populations de cellules respectives telles que des CSM peuvent être administrées in vivo et ensuite GDF-8 peut être administré in vivo, ou GDF-8 peut être administré in vivo et ensuite les cellules ou populations de cellules respectives telles que des CSM peuvent être administrées in vivo. En conséquence, il est décrit en outre l’utilisation de GDF-8 pour la fabrication d’un médicament pour réduire l’immunogénicité de cellules, GDF-8 devant être administré in vivo ; il est également décrit un procédé pour réduire l’immunogénicité de cellules chez un sujet nécessitant celui-ci, comprenant l’administration de GDF-8 audit sujet.
Un autre aspect de l’invention concerne GDF-8 pour utilisation en tant que médicament, de préférence pour utilisation dans le traitement d’une maladie musculosquelettique comprenant des maladies osseuses et des maladies ostéo-articulaires. En conséquence, il est décrit en outre l’utilisation de GDF-8 pour la fabrication d’un médicament pour le traitement de maladies musculosquelettiques, comprenant des maladies osseuses et des maladies ostéo-articulaires. Il est décrit en outre un procédé pour traiter des maladies musculosquelettiques, comprenant des maladies osseuses et des maladies ostéo-articulaires, chez un sujet nécessitant un tel traitement, comprenant l’administration audit sujet de GDF-8. Il est particulièrement décrit un procédé pour traiter des maladies musculosquelettiques chez un sujet nécessitant un tel traitement, comprenant l’administration audit sujet d’une quantité efficace sur le plan thérapeutique ou prophylactique de GDF-8. Lorsqu’il est utilisé en tant que médicament, GDF-8 peut être administré seul ou en combinaison avec des cellules telles que des cellules souches, de préférence des CSM, de préférence avec des CSM humaines adultes, et/ou avec des cellules telles que des ostéoprogéniteurs ou des cellules ostéoblastiques ou avec une population de cellules comprenant des ostéoprogéniteurs et/ou des cellules ostéoblastiques, de préférence de telles cellules pouvant être humaines. De préférence, GDF-8 peut être administré en combinaison avec des CSM, plus préférablement des CSM humaines adultes. Par conséquent, il est décrit en particulier GDF-8 pour utilisation en tant que médicament, de préférence pour utilisation dans le traitement de maladies musculosquelettiques comprenant des maladies osseuses et des maladies ostéo-articulaires, GDF-8 devant être administré in vivo conjointement avec des CSM, de préférence avec des CSM humaines adultes. GDF-8, facultativement en combinaison avec des cellules comme décrit ci-dessus, peut en outre être co-administré avec FGF-2. Il est décrit en outre un procédé pour traiter des maladies musculosquelettiques, comprenant des maladies osseuses et des maladies ostéo-articulaires, chez un sujet nécessitant un tel traitement, comprenant l’administration audit sujet de GDF-8 avec des CSM, de préférence avec des CSM humaines adultes. De préférence, le sujet auquel ladite administration doit être effectuée peut être humain. De préférence, les cellules ou populations de cellules auxquelles l’administration doit être effectuée peuvent être autologues ou allogéniques pour ledit sujet.
Un aspect de l’invention concerne donc GDF-8 pour utilisation dans un procédé de réduction de l’immunogénicité de cellules, GDF-8 devant être administré in vivo, et les cellules étant choisies dans le groupe constitué de CSM, cellules obtenues par différenciation de CSM, cellules de lignage ostéocytaire, cellules de lignage chondrocytaire, cellules de lignage adipocytaire, cellules de lignage myocytaire, cellules de lignage tendonocytaire, cellules de lignage fibroblastique, et cellules de lignage stromatogène. De préférence, les cellules peuvent être telles que décrites de manière plus détaillée en ce qui concerne des utilisations in vitro de GDF-8 (ci-dessus). Cet aspect couvre également l’utilisation de GDF-8 pour la fabrication d’un médicament pour réduire l’immunogénicité de cellules, GDF-8 devant être administré in vivo, et les cellules étant choisies dans le groupe constitué de CSM, cellules obtenues par différenciation de CSM, cellules de lignage ostéocytaire, cellules de lignage chondrocytaire, cellules de lignage adipocytaire, cellules de lignage myocytaire, cellules de lignage tendonocytaire, cellules de lignage fibroblastique, et cellules de lignage stromatogène ; ainsi qu’un procédé pour réduire l’immunogénicité de cellules chez un sujet nécessitant celui-ci, comprenant l’administration de GDF-8 audit sujet, les cellules étant choisies dans le groupe constitué de CSM, cellules obtenues par différenciation de CSM, cellules de lignage ostéocytaire, cellules de lignage chondrocytaire, cellules de lignage adipocytaire, cellules de lignage myocytaire, cellules de lignage tendonocytaire, cellules de lignage fibroblastique, et cellules de lignage stromatogène.Certains modes de réalisation concernent GDF-8 pour utilisation dans le procédé de réduction de l’immunogénicité de cellules comme décrit ci-dessus (ou les procédés ou utilisations correspondants), GDF-8 et les cellules devant être administrés en combinaison in vivo. De tels modes de réalisation permettent avantageusement de réduire l’immunogénicité et le risque de rejet des cellules qui sont administrées à un sujet. Bien que ces effets de GDF-8 puissent être utiles dans des procédés de thérapie cellulaire utilisant des cellules qui sont autologues, allogéniques ou même xénogéniques pour ledit sujet, plus typiquement autologues ou allogéniques, les effets peuvent en particulier faciliter l’administration de cellules allogéniques, étant donné qu’il est attendu que la réduction de l’immunogénicité de cellules allogéniques diminue considérablement le risque de leur rejet par le sujet, et permette éventuellement d’éviter ou diminuer la thérapie immunosuppressive que des sujets reçoivent typiquement en cas d’administration de matériau cellulaire allogénique. En conséquence, certains modes de réalisation concernent GDF-8 pour utilisation dans le procédé de réduction de l’immunogénicité de cellules comme décrit ci-dessus (ou les procédés ou utilisations correspondants), les cellules étant allogéniques pour un sujet auquel elles doivent être administrées.Il doit être entendu que GDF-8 et les cellules peuvent être administrées simultanément in vivo, ou peuvent être administrés séquentiellement dans un ordre quelconque in vivo, par exemple, les cellules peuvent être administrées in vivo et ensuite GDF-8 peut être administré in vivo, ou GDF-8 peut être administré in vivo et ensuite les cellules peuvent être administrées in vivo. Dans un exemple, l’administration de GDF-8 peut être prescrite chez un sujet qui a précédemment reçu les cellules, lorsque des signes de réaction immunitaire contre les cellules ou de rejet des cellules sont détectés chez le sujet. Dans un autre exemple, l’administration de GDF-8 peut être prescrite chez un sujet qui a précédemment reçu, reçoit, ou recevra dans le futur les cellules, lorsqu’il existe une probabilité augmentée que le sujet présente une réaction immunitaire contre les cellules ou un rejet des cellules (par exemple, une faible correspondance de HLA). Dans un autre exemple supplémentaire, l’administration de GDF-8 peut être prescrite chez un sujet qui a précédemment reçu, reçoit, ou recevra dans le futur les cellules, indépendamment d’une observation réelle quelconque ou probabilité augmentée prévisible de réaction immunitaire contre les cellules ou de rejet des cellules.
Dans certains modes de réalisation, GDF-8 peut être administré de façon systémique, indépendamment du fait que les cellules sont administrées localement ou de façon systémique. Dans d’autres modes de réalisation, GDF-8 peut être administré localement. Par exemple, lorsque les cellules sont administrées localement (par exemple, de façon intra- ou péri-osseuse ou intra- ou péri-articulaire, par exemple lorsque les cellules sont destinées à la réparation de tissu osseux ou articulaire), GDF-8 peut également être administré de préférence localement, plus spécifiquement à proximité des cellules (par exemple, également de façon intra- ou péri-osseuse ou intra- ou péri-articulaire, suivant les cas). De manière appropriée, GDF-8 peut être formulé dans une formulation à libération prolongée au site de son administration, afin de prolonger ses effets sur les cellules.
Dans certains modes de réalisation, les cellules peuvent être comprises dans un matériau administré au sujet, tel que, de préférence, dans un implant ou une greffe (plus préférablement dans un implant ou une greffe de tissu osseux et/ou articulaire (par exemple, un implant ou une greffe de moelle osseuse ou de tissu osseux)), ou dans une formulation pharmaceutique. En réduisant l’immunogénicité des cellules comprises dans lesdits matériaux, tels que des implants, des greffes ou des formulations pharmaceutiques, le risque de rejet de tels produits ou compositions thérapeutiquement adaptés par des sujets auxquels ils sont administrés peut être réduit.
Un autre aspect de l’invention concerne donc des combinaison de GDF-8 et de cellules pour utilisation en tant que médicament, de préférence pour utilisation dans le traitement (c’est-à-dire, pour utilisation dans un procédé de traitement) d’une maladie musculosquelettique, plus préférablement la maladie musculosquelettique étant une maladie osseuse ou une maladie ostéoarticulaire, les cellules étant choisies dans le groupe constitué de CSM, cellules obtenues par différenciation de CSM, cellules de lignage ostéocytaire, cellules de lignage chondrocytaire, cellules de lignage adipocytaire, cellules de lignage myocytaire, cellules de lignage tendonocytaire, cellules de lignage fibroblastique, et cellules de lignage stromatogène. Cet aspect concerne en outre l’utilisation d’une combinaison de GDF-8 et de cellules pour la fabrication d’un médicament pour le traitement d’une maladie musculosquelettique, plus préférablement la maladie musculosquelettique étant une maladie osseuse ou une maladie ostéo-articulaire, les cellules étant choisies dans le groupe constitué de CSM, cellules obtenues par différenciation de CSM, cellules de lignage ostéocytaire, cellules de lignage chondrocytaire, cellules de lignage adipocytaire, cellules de lignage myocytaire, cellules de lignage tendonocytaire, cellules de lignage fibroblastique, et cellules de lignage stromatogène ; ainsi qu’un procédé pour traiter une maladie musculosquelettique, plus préférablement la maladie musculosquelettique étant une maladie osseuse ou une maladie ostéo-articulaire, chez un sujet nécessitant ledit traitement, comprenant 1 administration d une combinaison de GDF-8 et de cellules (en particulier une quantité efficace sur le plan thérapeutique ou prophylactique de la combinaison) audit sujet, les cellules étant choisies dans le groupe constitué de CSM, cellules obtenues par différenciation de CSM, cellules de lignage ostéocytaire, cellules de lignage chondrocytaire, cellules de lignage adipocytaire, cellules de lignage myocytaire, cellules de lignage tendonocytaire, cellules de lignage fibroblastique, et cellules de lignage stromatogène. De préférence, les cellules peuvent être telles que décrites de manière plus détaillée en ce qui concerne les utilisations in vitro de GDF-8 (ci-dessus). Certains modes de réalisation concernent une combinaison de GDF-8 et de cellules pour utilisation dans le traitement d une maladie musculosquelettique (ou les procédés ou utilisations correspondants), de préférence la maladie musculosquelettique étant une maladie osseuse ou une maladie ostéoarticulaire, les cellules étant choisies dans le groupe constitué de CSM, cellules de lignage ostéocytaire, cellules de lignage chondrocytaire, cellules de lignage myocytaire, et cellules de lignage tendonocytaire, plus préférablement les cellules étant des CSM, ostéoprogéniteurs, cellules ostéoblastiques, ostéocytes, cellules chondroblastiques, chondrocytes, cellules myoblastiques, ou myocytes, encore plus préférablement les cellules étant des CSM, des ostéoprogéniteurs, des cellules ostéoblastiques, des cellules chondroblastiques, ou des chondrocytes, encore plus préférablement les cellules étant des CSM ou les cellules étant des ostéoprogéniteurs ou des cellules ostéoblastiques.
Les combinaisons de GDF-8 et de cellules telles que décrites dans le paragraphe précédent peuvent avantageusement permettre de réduire l’immunogénicité et le risque de rejet des cellules administrées à un sujet en tant que médicament, de préférence dans le but de traiter la maladie musculosquelettique. Bien que ces effets de GDF-8 dans la combinaison puissent être utiles dans des procédés de thérapie cellulaire utilisant des cellules qui sont autologues, allogéniques ou même xénogéniques pour ledit sujet, plus typiquement autologues ou allogéniques, les effets peuvent en particulier faciliter l’administration de cellules allogéniques, étant donné que la réduction de l’immunogénicité de cellules allogéniques devrait diminuer considérablement le risque de leur rejet par le sujet, et éventuellement permettre d’éviter ou diminuer une thérapie immunosuppressive que les sujets reçoivent typiquement lors de l’administration d’un matériau cellulaire allogénique. En conséquence, certains modes de réalisation concernent la combinaison de GDF-8 et de cellules pour utilisation en tant que médicament, de préférence pour utilisation dans le traitement d’une maladie musculosquelettique, comme décrit ci-dessus (ou les procédés ou utilisations correspondants), les cellules étant allogéniques pour un sujet auquel elles doivent être administrées.
Il doit être entendu que GDF-8 et les cellules comprises dans la combinaison peuvent être administrés simultanément in vivo, ou peuvent être administrés séquentiellement dans un ordre quelconque in vivo, par exemple, les cellules peuvent être administrées in vivo et ensuite GDF-8 peut être administré in vivo, ou GDF-8 peut être administré in vivo et ensuite les cellules peuvent être administrées in vivo. Dans un exemple, 1 ’administration de GDF-8 peut être prescrite chez un sujet qui a précédemment reçu les cellules, lorsque des signes de réaction immunitaire contre les cellules ou de rejet des cellules sont détectés chez le sujet. Dans un autre exemple, l’administration de GDF-8 peut être prescrite chez un sujet qui a précédemment reçu, reçoit, ou recevra dans le futur les cellules, lorsqu’il existe une probabilité augmentée que le sujet présente une réaction immunitaire contre les cellules ou un rejet des cellules (par exemple, une faible correspondance de HLA). Dans un autre exemple supplémentaire, l’administration de GDF-8 peut être prescrite chez un sujet qui a précédemment reçu, reçoit, ou recevra dans le futur les cellules, indépendamment d’une observation réelle quelconque ou probabilité augmentée prévisible de réaction immunitaire contre les cellules ou de rejet des cellules.
Dans certains modes de réalisation, GDF-8 peut être administré de façon systémique, indépendamment du fait que les cellules sont administrées localement ou de façon systémique. Dans d’autre modes de réalisation, GDF-8 peut être administré localement. Par exemple, lorsque les cellules sont administrées localement (par exemple, de façon intra- ou péri-osseuse ou intra- ou péri-articulaire, par conséquent lorsque les cellules sont destinées à une réparation de tissu osseux ou articulaire), GDF-8 peut également être de préférence administré localement, plus spécifiquement à proximité des cellules (par exemple, également de façon intra- ou péri-osseuse ou intra- ou péri-articulaire, suivant les cas). De manière appropriée, GDF-8 peut être formulé dans une formulation à libération prolongée au site de son administration, afin de prolonger ses effets sur les cellules.
Dans certains modes de réalisation, les cellules dans la combinaison de GDF-8 et de cellules peuvent être comprises dans un matériau administré au sujet, tel que de préférence dans un implant ou une greffe (plus préférablement dans un implant ou une greffe de tissu osseux et/ou articulaire (par exemple, un implant ou une greffe de moelle osseuse ou de tissu osseux)), ou dans une formulation pharmaceutique. En réduisant l’immunogénicité des cellules comprises dans lesdits matériaux, tel que des implants, des greffes ou des formulations pharmaceutiques, le risque de rejet de tels produits ou compositions thérapeutiquement adaptés par des sujets auxquels ils sont administrés peut être réduit.
En conséquence de l’observation de la capacité de GDF-8 à réguler l’immunogénicité et un rejet immunitaire, un autre aspect de l’invention concerne GDF-8 pour utilisation dans la réduction du risque de rejet par un sujet d’un matériau administré, implanté ou transplanté chez le sujet. Cet aspect concerne en outre l’utilisation de GDF-8 pour la fabrication d’un médicament pour réduire le risque de rejet par un sujet d’un matériau administré, implanté ou transplanté chez le sujet ; ainsi qu’un procédé pour réduire le risque de rejet par un sujet d’un matériau administré, implanté ou transplanté chez le sujet, comprenant l’administration de GDF-8 audit sujet. Dans le contexte de ces aspects et des aspects et modes de réalisation précédents, la référence à un matériau (destiné à être) administré au sujet est destinée à couvrir généralement tous les matériaux, qui peuvent être bénéfiques lorsqu’ils sont administrés au sujet, par exemple mais sans limitation, qui peuvent présenter un bénéfice thérapeutique ou prophylactique chez le sujet (par exemple, qui peuvent être utiles pour traiter une maladie musculosquelettique, plus préférablement la maladie musculosquelettique étant une maladie osseuse ou une maladie ostéo-articulaire, chez le sujet). Certains modes de réalisation concernent GDF-8 pour l’utilisation spécifiée (ou les procédés ou utilisations correspondants), le matériau comprenant un tissu osseux et/ou articulaire (par exemple, un tissu médullaire ou osseux).
Dans certains modes de réalisation, le matériau peut comprendre des cellules choisies dans le groupe constitué de CSM, cellules obtenues par différenciation de CSM, cellules de lignage ostéocytaire, cellules de lignage chondrocytaire, cellules de lignage adipocytaire, cellules de lignage myocytaire, cellules de lignage tendonocytaire, cellules de lignage fibroblastique, et cellules de lignage stromatogène. De préférence, les cellules peuvent être telles que décrites de manière plus détaillée en ce qui concerne des utilisations in vitro de GDF-8 (ci-dessus). De préférence, lorsque le matériau est destiné au traitement d’une maladie musculosquelettique, la maladie musculosquelettique étant de préférence une maladie osseuse ou une maladie ostéoarticulaire, et le matériau contenant des cellules, les cellules peuvent être choisies dans le groupe constitué de CSM, cellules de lignage ostéocytaire, cellules de lignage chondrocytaire, cellules de lignage myocytaire, et cellules de lignage tendonocytaire, plus préférablement choisies dans le groupe constitué de CSM, ostéoprogéniteurs, cellules ostéoblastiques, ostéocytes, cellules chondroblastiques, chondrocytes, cellules myoblastiques, ou myocytes, encore plus préférablement choisies dans le groupe constitué de CSM, ostéoprogéniteurs, cellules ostéoblastiques, cellules chondroblastiques, ou chondrocytes, encore plus préférablement choisies dans le groupe constitué de CSM ou choisies dans le groupe constitué d’ostéoprogéniteurs ou cellules ostéoblastiques.
Les effets de GDF-8 sur la diminution du risque de rejet du matériau par un sujet peuvent être particulièrement prononcés dans certains modes de réalisation, lorsque le matériau présente un risque significatif de rejet, par exemple, lorsque le matériau contient un ou plusieurs composants, par exemple, des tissus, des cellules, des biomolécules ou d’autres substances, allogéniques ou même xénogéniques pour le sujet, plus typiquement allogéniques.
Il doit être entendu que GDF-8 et le matériau peuvent être administrés simultanément in vivo, ou peuvent être administrés séquentiellement dans un ordre quelconque in vivo, par exemple, le matériau peut être administré in vivo et ensuite GDF-8 peut être administré in vivo, ou GDF-8 peut être administré in vivo et ensuite le matériau peut être administré in vivo. Dans un exemple, l’administration de GDF-8 peut être prescrite chez un sujet qui a précédemment reçu le matériau, lorsque des signes de rejet du matériau sont détectés chez le sujet. Dans un autre exemple, l’administration de GDF-8 peut être prescrite chez un sujet qui a précédemment reçu, reçoit, ou recevra dans le futur le matériau, lorsqu’il existe une probabilité augmentée que le sujet présente un rejet du matériau (par exemple, une faible correspondance de HLA). Dans un autre exemple supplémentaire, l’administration de GDF-8 peut être prescrite chez un sujet qui a précédemment reçu, reçoit, ou recevra dans le futur le matériau, indépendamment d’une observation réelle quelconque ou probabilité augmentée prévisible de rejet du matériau.
Dans certains modes de réalisation, GDF-8 peut être administré de façon systémique, indépendamment du fait que le matériau est administré localement ou de façon systémique. Dans d autres modes de réalisation, GDF-8 peut être administré localement. Par exemple, lorsque le matériau est administré localement (par exemple, de façon intra- ou péri-osseuse ou intra- ou péri-articulaire, par exemple lorsque le matériau est destiné à une réparation de tissu osseux ou articulaire), GDF-8 peut également être de préférence administré localement, plus spécifiquement à proximité du matériau (par exemple, également de façon intra- ou péri-osseuse ou intra- ou péri-articulaire, suivant les cas). De manière appropriée, GDF-8 peut être formulé dans une formulation à libération prolongée au site de son administration, afin de prolonger ses effets sur le matériau.
En conséquence, un autre aspect de l’invention concerne une composition pharmaceutique comprenant un matériau destiné à être administré, implanté ou transplanté chez un sujet et GDF-8, et comprenant facultativement en outre un ou plusieurs excipients pharmaceutiquement acceptables. De préférence, il est décrit une composition pharmaceutique comprenant des cellules choisies dans le groupe constitué de CSM, cellules obtenues par différenciation de CSM, cellules de lignage ostéocytaire, cellules de lignage chondrocytaire, cellules de lignage adipocytaire, cellules de lignage myocytaire, cellules de lignage tendonocytaire, cellules de lignage fibroblastique, et cellules de lignage stromatogène, et GDF-8, et comprenant facultativement en outre un ou plusieurs excipients pharmaceutiquement acceptables (en d’autres termes, il peut être dit, que le matériau destiné à être administré, implanté ou transplanté chez le sujet comprend les cellules mentionnées). De préférence, les cellules peuvent être telles que décrites de manière plus détaillée en ce qui concerne les utilisations in vitro de GDF-8 (ci-dessus). De préférence il est décrit en outre une composition pharmaceutique comprenant du tissu osseux et/ou articulaire (par exemple, du tissu médullaire ou osseux) et GDF-8, et comprenant facultativement en outre un ou plusieurs excipients pharmaceutiquement acceptables (en d’autres termes, il peut être dit, que le matériau destiné à être administré, implanté ou transplanté chez le sujet comprend le tissu osseux et/ou articulaire mentionné).
Dans l’ensemble de la présente spécification, les produits, procédés et utilisations réalisant les principes de l’invention peuvent utiliser de préférence des cellules animales, plus préférablement des cellules d’animal à sang chaud, encore plus préférablement des cellules de mammifère, telles que des cellules humaines ou des cellules de mammifère non humain, encore plus préférablement des cellules humaines.
De plus, dans l’ensemble de la présente spécification, les produits, procédés et utilisations réalisant les principes de l’invention peuvent être appliqués à des sujets animaux, plus préférablement des sujets animaux à sang chaud, encore plus préférablement des sujets mammifères, tels que des sujets humains ou des sujets mammifères non humains, encore plus préférablement des sujets humains.
Il doit également être noté que les cellules, tissus ou autre matériaux provenant d’une certaine espèce (par exemple, une espèce de mammifère donnée, ou un humain) seraient typiquement administrés à un sujet de la même espèce, c’est-à-dire, une administration autologue ou allogénique.
Les présents inventeurs ont désormais découvert un procédé pour différencier des cellules souches mésenchymateuses (CSM) qui résout un ou plusieurs des problèmes mentionnés ci-dessus de l’art antérieur.
Par conséquent, un aspect additionnel de la présente invention concerne un procédé pour différencier des CSM adultes in vitro ou ex vivo en ostéoprogéniteurs ou cellules ostéoblastiques ou une population de cellules comprenant des ostéoprogéniteurs et/ou des cellules ostéoblastiques, le procédé comprenant l’étape de culture desdites CSM dans un milieu comprenant du plasma ou du sérum, du facteur de croissance et différenciation 8 (GDF-8) et du facteur de croissance des fibroblastes 2 (FGF-2). Les procédés appliquant les principes de la présente invention permettent avantageusement d’obtenir des ostéoprogéniteurs ou des cellules ostéoblastiques ou des populations de cellules comprenant des ostéoprogéniteurs et/ou des cellules ostéoblastiques ayant une immunogénicité réduite.
Par exemple, les présents procédés produisent des ostéoprogéniteurs, ou des cellules ostéoblastiques ou des populations de cellules comprenant des ostéoprogéniteurs et/ou des cellules ostéoblastiques ayant une expression réduite de récepteur de surface cellulaire de CMH de classe II, par exemple avec une expression réduite de HLA-DR. Une telle immunogénicité réduite permet avantageusement la transplantation de cellules par exemple chez des sujets allogéniques.
De plus, les inventeurs ont découvert que les procédés de la présente invention stimulent la prolifération cellulaire. De tels procédés présentent par conséquent l’avantage de générer des cellules adaptées pour la transplantation en une quantité qui est satisfaisante ou améliorée pour la transplantation de cellules. Cela permet également de réduire la quantité de tissu qui doit être prélevée à partir d’un sujet pour obtenir les CSM de départ.
Par conséquent, les procédés de la présente invention produisent avantageusement des ostéoprogéniteurs ou des cellules ostéoblastiques ou des populations de cellules comprenant des ostéoprogéniteurs et/ou des cellules ostéoblastiques avec un potentiel de transplantation amélioré.
Les inventeurs ont vérifié que les procédés de la présente invention maintiennent le phénotype ostéoblastique souhaité des ostéoprogéniteurs ou des cellules ostéoblastiques ou populations de cellules comprenant des ostéoprogéniteurs et/ou des cellules ostéoblastiques obtenus. Cela est inattendu entre autres parce qu’une augmentation de la différenciation ostéogénique de CSM a été précédemment documentée chez des souris déficientes en GDF-8 (Hamrick et al., Bone, 2007, vol. 40(6), 1544-53).
Dans un mode de réalisation, le procédé de la présente invention peut comprendre les étapes consistant à : (a) laisser des cellules récupérées à partir d’un échantillon biologique d’un sujet et comprenant des CSM adhérer à une surface de substrat ; et (b) cultiver les cellules adhérentes Hans un milieu comprenant du plasma ou du sérum, GDF-8 et FGF-2, de manière à permettre de différencier des CSM in vitro ou ex vivo en ostéoprogéniteurs ou cellules ostéoblastiques ou la population de cellules comprenant des ostéoprogéniteurs et/ou des cellules ostéoblastiques.
Dans certains procédés, réalisant les principes de la présente invention, les cellules peuvent être cultivées dans le milieu tel que défini dans l’étape (b) pendant une durée comprise entre environ 10 et environ 18 jours. Une telle durée permet de produire une quantité d’ostéoprogéniteurs ou de cellules ostéoblastiques ou de populations de cellules comprenant des ostéoprogéniteurs et/ou des cellules ostéoblastiques particulièrement satisfaisante pour la transplantation de cellules.
Certains procédés selon la présente invention peuvent comprendre en outre l’étape (c) de passage (par exemple, passage une ou plusieurs fois) et ensuite de culture des ostéoprogéniteurs ou des cellules ostéoblastiques ou populations de cellules comprenant des ostéoprogéniteurs et/ou des cellules ostéoblastiques de l’étape (b) dans le milieu tel que défini dans (b). Par exemple mais sans limitation, les cellules peuvent être cultivées dans l’étape (c) pendant une durée comprise entre environ 3 et environ 18 jours, afin de permettre la production d’une quantité d’ostéoprogéniteurs ou cellules ostéoblastiques ou populations de cellules comprenant des ostéoprogéniteurs et/ou des cellules ostéoblastiques particulièrement satisfaisante pour la thérapie cellulaire.
Dans d’autres modes de réalisation, le procédé de la présente invention peut comprendre les étapes consistant à : (a) laisser des cellules récupérées à partir d’un échantillon biologique d’un sujet et comprenant des CSM adhérer à une surface de substrat ; (b’) cultiver les cellules adhérentes dans un milieu comprenant du plasma ou du sérum et FGF-2 ; et (b”) ensuite, cultiver les cellules adhérentes dans un milieu comprenant du plasma ou du sérum, GDF-8 et FGF-2, de manière à permettre la différenciation de CSM in vitro ou ex vivo en ostéoprogéniteurs ou cellules ostéoblastiques ou la population de cellules comprenant des ostéoprogéniteurs et/ou des cellules ostéoblastiques. Dans certains modes de réalisation, le procédé de la présente invention peut comprendre en outre entre l’étape (b’) et (b”), l’étape (c’) de passage et consistant à laisser les cellules adhérer à une surface de substrat.
Il doit être noté que les procédés réalisant les principes de la présente invention peuvent comprendre en outre une ou plusieurs étapes de passage des cellules, c’est-à-dire des passages, tels qu’un, deux, trois, quatre passages ou plus. Dans des modes de réalisation préférés, le procédé peut comprendre en outre un, deux ou trois passages, plus préférablement, un ou deux passages, encore plus préférablement, un passage.
Dans ce contexte, les termes « culture primaire », « culture secondaire » et « culture tertiaire », tels que présentement utilisés, désignent des cellules récupérées à partir d’un échantillon biologique d’un sujet et comprenant des CSM qui, pendant le présent procédé n’ont subi aucun passage, ont subi un passage ou ont subi deux passages respectivement. Dans les présents procédés, la culture de CSM dans un milieu comprenant du plasma ou du sérum, GDF-8 et FGF-2, peut être typiquement, mais sans limitation, effectuée à partir de la culture primaire, par exemple, à partir du démarrage (ou début) de culture primaire ou à partir de la culture primaire en cours ; à partir de culture secondaire, par exemple, à partir du démarrage (ou début) de la culture secondaire ou à partir de la culture secondaire en cours ; ou à partir de culture tertiaire, par exemple, à partir du démarrage (ou début) de la culture tertiaire ou à partir de la culture tertiaire en cours. De préférence, la culture de CSM dans un milieu comprenant du plasma ou du sérum, GDF-8 et FGF-2 peut être effectuée à partir de culture primaire, par exemple, à partir du début d’une culture primaire ou à partir d’une culture primaire en cours, de préférence, à partir du début d’une culture primaire.
Comme illustré dans les exemples, la culture de CSM dans un milieu comprenant du plasma ou du sérum, GDF-8 et FGF-2 à partir du début d’une culture primaire permet d’obtenir des ostéoprogéniteurs ou des cellules ostéoblastiques ou des populations de cellules comprenant des ostéoprogéniteurs et/ou des cellules ostéoblastiques ayant une immunogénicité particulièrement réduite, plus spécifiquement une expression réduite de récepteur de surface cellulaire de CMH de classe II. Comme illustré plus avant dans les exemples, la culture de CSM dans un milieu comprenant du plasma ou du sérum, GDF-8 et FGF-2 à partir du début d’une culture primaire stimule en outre particulièrement la prolifération cellulaire. De tels procédés illustrant la présente invention sont donc particulièrement avantageux parce qu’ils obtiennent un degré supérieur d’expansion de cellules et peuvent produire des ostéoprogéniteurs ou des cellules ostéoblastiques ou des populations de cellules comprenant des ostéoprogéniteurs et/ou des cellules ostéoblastiques ayant une immunogénicité réduite particulièrement adaptée pour transplantation, telles que, par exemple, des cellules causant moins de rejet dans des sujets allogéniques.
Dans d autres modes de réalisation, les procédés tels que présentement décrits peuvent comprendre 1 étape de mise en contact (par exemple, assemblage ou mélange) des ostéoprogéniteurs ou des cellules ostéoblastiques résultants ou de la population de cellules comprenant des ostéoprogéniteurs et/ou des cellules ostéoblastiques avec un composant ayant des propriétés ostéogéniques, ostéo-inductrices et/ou ostéoconductrices. Une telle étape peut en particulier permettre la préparation de compositions pharmaceutiques adaptées pour transplantation, par exemple chez un sujet allogénique.
Les procédés et utilisations tels que présentement envisagés peuvent être, de façon particulièrement préférable, appliqués à des cellules animales, de préférence des cellules d’animal à sang chaud, plus préférablement à des cellules de mammifère, telles que des cellules humaines ou des cellules de mammifère non humain, et de manière préférée entre toutes des cellules humaines. Un autre aspect de la présente invention concerne des ostéoprogéniteurs ou des cellules ostéoblastiques ou une population de cellules comprenant des ostéoprogéniteurs et/ou des cellules ostéoblastiques pouvant être obtenus par l’un quelconque des présents procédés. Il est décrit en particulier des ostéoprogéniteurs ou des cellules ostéoblastiques ou des populations de cellules comprenant des ostéoprogéniteurs et/ou des cellules ostéoblastiques pouvant être obtenus par un procédé tel que défini ci-dessus pour différencier des CSM adultes in vitro ou ex vivo, comprenant l’étape de culture des CSM dans un milieu comprenant du plasma ou du sérum, GDF-8 et FGF-2. Il apparaîtra que les présents procédés peuvent généralement produire des populations de cellules comprenant une partie substantielle, par exemple, une majorité, d’ostéoprogéniteurs ou de cellules ostéoblastiques. De telles populations de cellules peuvent comprendre en outre d’autres types de cellules.
Il est également décrit, dans un aspect de l’invention, une composition pharmaceutique comprenant les ostéoprogéniteurs ou cellules ostéoblastiques ou la population de cellules comprenant des ostéoprogéniteurs et/ou des cellules ostéoblastiques tels que présentement décrits et comprenant en outre de manière appropriée un excipient, de préférence au moins un desdits excipients étant un composant ayant des propriétés ostéogéniques, ostéo-inductrices et/ou ostéoconductrices.
Un autre aspect de l’invention concerne les ostéoprogéniteurs ou cellules ostéoblastiques ou la population de cellules comprenant des ostéoprogéniteurs et/ou des cellules ostéoblastiques tels que présentement décrits ou la composition pharmaceutique telle que définie ci-dessus pour utilisation en tant que médicament, de préférence pour utilisation dans le traitement (comprenant dans l’ensemble de la présente spécification des mesures thérapeutiques et/ou préventives) d’une maladie musculosquelettique. De préférence, ladite maladie musculosquelettique peut être une maladie osseuse ou une maladie ostéo-articulaire. Par conséquent, il est de préférence décrit des ostéoprogéniteurs ou des cellules ostéoblastiques ou une population de cellules comprenant des ostéoprogéniteurs et/ou des cellules ostéoblastiques, pouvant être obtenus par le procédé de la présente invention, pour utilisation dans le traitement de maladies musculosquelettiques, telles que, sans limitation, des maladies osseuses et/ou des maladies ostéo-articulaires.
L’utilisation desdits ostéoprogéniteurs ou cellules ostéoblastiques ou de la population de cellules comprenant des ostéoprogéniteurs et/ou des cellules ostéoblastiques dans le traitement de maladies musculosquelettiques est avantageuse, par exemple, parce qu’elle permet la transplantation chez un sujet allogénique grâce à l’immunogénicité réduite de telles cellules ou populations de cellules.
La présente invention concerne en outre l’utilisation des ostéoprogéniteurs ou des cellules ostéoblastiques ou de la population de cellules comprenant des ostéoprogéniteurs et/ou des cellules ostéoblastiques tels que présentement décrits pour la fabrication d’un médicament pour le traitement de maladies musculosquelettiques, comprenant, entre autres, des maladies osseuses et des maladies ostéo-articulaires. Par conséquent, il est envisagé l’utilisation des ostéoprogéniteurs ou des cellules ostéoblastiques ou de la population de cellules comprenant des ostéoprogéniteurs et/ou des cellules ostéoblastiques pouvant être obtenus par le procédé de la présente invention pour la fabrication d’un médicament pour le traitement de maladies musculosquelettiques, par exemple, sans limitation, des maladies osseuses et/ou des maladies ostéo-articulaires.
La présente invention concerne en outre un procédé pour traiter des maladies musculosquelettiques, comprenant, entre autres, des maladies osseuses et des maladies ostéo-articulaires, chez un sujet nécessitant un tel traitement, comprenant l’administration audit sujet des ostéoprogéniteurs ou des cellules ostéoblastiques ou de la population de cellules comprenant des ostéoprogéniteurs et/ou des cellules ostéoblastiques tels que présentement décrits ou des compositions pharmaceutiques tels que définis ci-dessus. Il est particulièrement envisagé un procédé pour traiter des maladies musculosquelettiques chez un sujet nécessitant un tel traitement, comprenant l’administration audit sujet d’une quantité efficace sur le plan thérapeutique ou prophylactique des ostéoprogéniteurs ou des cellules ostéoblastiques ou de la population de cellules comprenant des ostéoprogéniteurs et/ou des cellules ostéoblastiques pouvant être obtenus par le procédé de la présente invention.
Par conséquent, sans limitation, l’un quelconque et tous de (i’) à (viii’) comme présentement décrit ci-dessous sont décrits par cet aspect de l’invention : (i’) Un procédé pour différencier des cellules souches mésenchymateuses (CSM) adultes in vitro ou ex vivo en ostéoprogéniteurs ou cellules ostéoblastiques ou une population de cellules comprenant des ostéoprogéniteurs et/ou des cellules ostéoblastiques, ledit procédé comprenant l’étape de culture desdites CSM dans un milieu comprenant du plasma ou du sérum, du facteur de croissance et différenciation 8 (GDF-8) et du facteur de croissance des fibroblastes 2 (FGF-2) ; (Ü’) Le procédé comme décrit dans (i’) ci-dessus, comprenant les étapes consistant à : (a) laisser des cellules récupérées à partir d’un échantillon biologique d’un sujet et comprenant des CSM adhérer à une surface de substrat ; et (b) cultiver les cellules adhérentes dans un milieu comprenant du plasma ou du sérum, GDF-8 et FGF-2, de manière à permettre de différencier des CSM in vitro ou ex vivo en ostéoprogéniteurs ou cellules ostéoblastiques ou la population de cellules comprenant des ostéoprogéniteurs et/ou des cellules ostéoblastiques ; (iii’) Le procédé comme décrit dans (ii’) ci-dessus, comprenant en outre l’étape (c) de passage et ensuite culture des ostéoprogéniteurs ou des cellules ostéoblastiques ou de la population de cellules comprenant des osteoprogemteurs et/ou des cellules ostéoblastiques de l’étape (b) dans le milieu tel que défini dans (b) ; (iv’) Le procédé comme décrit dans (i’) ci-dessus, comprenant les étapes consistant à : (a) laisser des cellules récupérées à partir d’un échantillon biologique d’un sujet et comprenant des CSM adhérer à une surface de substrat ; (b’) cultiver des cellules adhérentes dans un milieu comprenant du plasma ou du sérum et FGF-2 ; et (b”) cultiver ensuite les cellules adhérentes dans un milieu comprenant du plasma ou du sérum, GDF-8 et FGF-2, de manière à permettre de différencier des CSM in vitro ou ex vivo en ostéoprogéniteurs ou cellules ostéoblastiques ou la population de cellules comprenant des ostéoprogéniteurs et/ou des cellules ostéoblastiques ; (ν’) Le procédé comme décrit dans (iv’) ci-dessus, comprenant en outre entre l’étape (b’) et (b”), l’étape (c’) de passage et consistant à laisser les cellules adhérer à une surface de substrat.
(vi’) Le procédé comme décrit dans l’un quelconque de (i’) à (ν’) ci-dessus, comprenant en outre l’étape de mise en contact desdites ostéoprogéniteurs ou cellules ostéoblastiques ou la population de cellules comprenant des ostéoprogéniteurs et/ou des cellules ostéoblastiques avec un composant ayant des propriétés ostéogéniques, ostéo-inductrices et/ou ostéoconductrices ; (vii’) Des ostéoprogéniteurs ou cellules ostéoblastiques ou population de cellules comprenant des ostéoprogéniteurs et/ou des cellules ostéoblastiques pouvant être obtenus par le procédé de l’un quelconque de (i’) à (vi’) ci-dessus ou une composition pharmaceutique comprenant ceux-ci ; (viii’) Les ostéoprogéniteurs ou cellules ostéoblastiques ou la population de cellules comprenant des ostéoprogéniteurs et/ou des cellules ostéoblastiques tels que définis dans (vii’) ci-dessus ou la composition pharmaceutique telle que définie dans (vii) ci-dessus pour utilisation en tant que médicament, de préférence pour utilisation dans le traitement d’une maladie musculosquelettique, plus préférablement la maladie musculosquelettique étant une maladie osseuse ou une maladie ostéo-articulaire.
Les aspects et modes de réalisation préférés de l’invention ci-dessus et autres sont décrits dans les sections suivantes et dans les revendications annexées. Le sujet des revendications annexées est présentement spécifiquement incorporé dans cette spécification.
BRÈVE DESCRIPTION DES DESSINS
La figure 1 représente un graphique illustrant le rendement global moyen (%) de cellules cultivées dans un milieu comprenant (1) du sérum et FGF-2 (témoin), (2) du sérum, FGF-2 et TGF-bêta 1 et (3) du sérum, FGF-2 et GDF-8.
La figure 2 représente un graphique illustrant l’expression de HLA-DR (%) par des cellules cultivées à partir du début d’une culture primaire dans un milieu comprenant (1) du sérum et FGF-2 (témoin), (2) du sérum, FGF-2 et TGF-bêta 1 ou (3) du sérum, FGF-2 et GDF-8.
La figure 3 représente un graphique illustrant l’expression (%) de phosphatase alcaline (ALP) de cellules cultivées à partir du début d’une culture primaire dans un milieu comprenant (1) du sérum et FGF-2, (2) du sérum, FGF-2 et TGF-bêta 1 ou (3) du sérum, FGF-2 et GDF-8.
La figure 4 représente un graphique illustrant la concentration (en pg/ml) de (4) IL6, (5) VEGF, (6) décorine et (7) ostéoprotégérine, respectivement, dans le surnageant de cellules cultivées à partir du début d’une culture primaire dans un milieu comprenant (1) du sérum et FGF-2 (témoin), (2) du sérum, FGF-2 et TGF-bêta 1 ou (3) du sérum, FGF-2 et GDF-8.
La figure 5 représente un essai illustrant la minéralisation après culture secondaire de cellules cultivées à partir du début d’une culture primaire dans un milieu comprenant du sérum et FGF-2 (FGF-2) ; du sérum, FGF-2 et TGF-bêta 1 (TGF-bêta 1) ; ou du sérum, FGF-2 et GDF-8 (GDF-8). C : milieu témoin, M : milieu ostéogénique.
La figure 6 représente un graphique illustrant le pourcentage de cellules positives (5) avant culture des cellules pendant 4 jours et après culture des cellules de culture tertiaire pendant 4 jours dans un milieu comprenant (6) du sérum et FGF-2 (témoin), (7) du sérum, FGF-2 et TGF-bêta 1 ou (8) du sérum, FGF-2 et GDF-8. 1 : CD45, 2 : CD105, 3 : HLA-DR.
La figure 7 représente un graphique illustrant l’expression de HLA-DR (%) de cellules après culture des cellules de culture tertiaire pendant 6 jours dans un milieu comprenant (1) du sérum et FGF-2 (témoin), (2) du sérum, FGF-2 et 1 ng/ml de TGF-bêta 1 (3) du sérum, FGF-2 et 50 ng/ml de GDF-8, (4) du sérum, FGF-2 et 100 ng/ml de GDF-8, ou (5) du sérum, FGF-2 et 200 ng/ml de GDF-8.
La figure 8 représente un graphique illustrant le rendement global de culture primaire et secondaire (%) de cellules d’un lot cultivé à partir du début d’une culture primaire dans un milieu comprenant (1) du sérum, FGF-2 et GDF-8 et (2) du sérum et GDF-8.
La figure 9 représente un graphique illustrant l’expression (%) de phosphatase alcaline (ALP) de cellules d’un lot cultivé à partir du début d’une culture primaire dans un milieu comprenant (1) du sérum et FGF-2, (2) du sérum, FGF-2 et GDF-8 ou (3) du sérum et GDF-8.
La figure 10 représente un graphique illustrant l’expression de HLA-DR (%) de cellules d’un lot cultivé à partir du début d’une culture primaire dans un milieu comprenant (1) du sérum et FGF-2, (2) du sérum, FGF-2 et GDF-8 ou (3) du sérum et GDF-8.
DESCRIPTION DETAILLEE DE L’INVENTION
Dans le présent contexte, les formes au singulier « un », « une », et « le/la » comprennent à la fois les références au singulier et au pluriel sauf spécification contraire dans le contexte.
Les termes « comprenant », « comprend » et « constitué de » tels que présentement utilisés sont synonymes de « incluant », « inclut » ou « contenant », « contient », et sont inclusifs ou ouverts et n’excluent pas des membres, éléments ou étapes de procédé additionnels, non mentionnés. Les termes couvrent en outre « constitué de » et « essentiellement constitué de ».
La mention de plages numériques par des points d’extrémité comprend tous les nombres et fractions sous-sommés dans les plages respectives, ainsi que les points d’extrémité mentionnés.
Le terme « environ » dans le présent contexte en référence à une valeur mesurable telle qu’un paramètre, une quantité, une durée temporelle, et similaire, est destiné à couvrir des variations de et par rapport à la valeur spécifiée, en particulier des variations de +/-10 % ou moins, de préférence +/-5 % ou moins, plus préférablement +/-1 % ou moins, et encore plus préférablement +/-0,1 % ou moins de et par rapport à la valeur spécifiée, dans la mesure où de telles variations sont appropriées pour être utiles dans l’invention décrite. Il doit être entendu que la valeur à laquelle le modificateur « environ » s’applique est elle-même également spécifiquement, et de préférence, décrite.
Bien que le terme « un ou plusieurs », tel qu’un ou plusieurs membres d’un groupe de membres, soit clair en tant que tel, à titre d’exemplification supplémentaire, le terme couvre entre autres une référence à l’un quelconque desdits membres, ou à deux quelconques ou plus desdits membres, tels que, par exemple, >3, >4, >5, >6 ou >7 quelconques, etc., desdits membres, et jusqu’à l’ensemble desdits membres.
Tous les documents cités dans la présente spécification sont présentement incorporés en référence dans leur intégralité.
Sauf indication contraire, tous les termes utilisés dans la description de l’invention, comprenant les termes techniques et scientifiques, ont la définition telle que couramment entendue par l’homme du métier à laquelle cette invention appartient. À titre d’orientation supplémentaire, les définitions des termes peuvent être incluses afin de mieux apprécier l’enseignement de la présente invention.
Les techniques générales en culture de cellules et les milieux utilisés sont décrits, entre autres, dans Large Scale Mammalian Cell Culture (Hu et al. 1997. Curr Opin Biotechnol 8: 148) ; Serum-free Media (K. Kitano. 1991. Biotechnology 17: 73) ; ou Large Scale Mammalian Cell Culture (Curr Opin Biotechnol 2: 375, 1991).
Comme indiqué, les présents inventeurs ont découvert selon un aspect de la présente invention un procédé pour différencier des cellules souches mésenchymateuses (CSM) adultes in vitro ou ex vivo en osteoprogemteurs ou cellules ostéoblastiques ou une population de cellules comprenant des ostéoprogéniteurs et/ou des cellules ostéoblastiques, comprenant l’étape de culture desdites CSM dans un milieu comprenant du plasma ou du sérum, le facteur de croissance et différenciation 8 (GDF-8) et le facteur de croissance des fibroblastes 2 (FGF-2).
En se basant sur ces observations, les inventeurs ont en outre reconnu la capacité de GDF-8 à réduire l’immunogénicité de cellules, et dans certains aspects de l’invention décrivent des utilisations, des procédés et des produits qui utilisent GDF-8 pour réduire l’immunogénicité de cellules in vitro ou in vivo. Dans des aspects associés de l’invention, les inventeurs envisagent des utilisations, des procédés et des produits qui utilisent GDF-8 pour réduire le risque de rejet par un sujet d’un matériau administré, implanté ou transplanté chez le sujet.
Le terme «immunogénicité», dans le présent contexte, désigne la capacité d’une substance particulière, telle qu’une cellule pour provoquer une réponse immunitaire dans le corps d’un humain ou d’un animal. Cette capacité dépend d’immunogènes tels qu’un antigène ou un épitope présenté sur les cellules. Un tel immunogène peut être, par exemple, mais sans limitation un complexe de récepteur de surface cellulaire de complexe d’histocompatibilité (CMH) de classe II, tel qu’un antigène de leucocyte humain (HLA) quelconque, de préférence HLA-DR. Le terme « HLA-DR », dans le présent contexte, est connu en tant que tel et désigne en particulier un récepteur de complexe de surface cellulaire de CMH de classe II codé par le complexe d’antigène de leucocyte humain sur la région du chromosome 6 6p21.31. L’immunogénicité peut dépendre en outre de facteurs costimulants pour produire un signal costimulant dans la réponse immunitaire. Un tel facteur costimulant peut être, par exemple, mais sans limitation l’un ou plusieurs du cluster de différenciation 80 (CD80 ou B7-1) ou du cluster de différenciation 86 (CD86 ou B7-2).
En conséquence, dans un autre aspect, l’invention concerne l’utilisation de GDF-8 pour réduire l’immunogénicité de cellules in vitro. L’immunogénicité réduite peut comprendre le récepteur de complexe de surface cellulaire de CMH de classe II réduit par rapport à une/des valeur(s) de référence respective(s) représentant le récepteur de complexe de surface cellulaire de CMH de classe II dans des cellules cultivées sans GDF-8. Par exemple, sur des cellules humaines, l’immunogénicité réduite peut comprendre le récepteur de complexe de surface cellulaire de CMH de classe II HLA réduit par rapport à une/des valeur(s) de référence respective(s) représentant le récepteur de complexe de surface cellulaire de CMH de classe II HLA dans des cellules cultivées sans GDF-8. De préférence, l’immunogénicité réduite comprend HLA-DR réduit par rapport à une/des valeur(s) de référence respective(s) représentant HLA-DR dans des cellules cultivées sans GDF-8. Les termes « réduire », « diminuer » ou « abaisser » peuvent être utilisés de façon interchangeable présentement.
Les expressions «récepteur de complexe de surface cellulaire de CMH de classeII réduit», « récepteur de complexe de surface cellulaire de CMH de classe II HLA réduit » ou « HLA-DR réduit » désignent une quantité et/ou une disponibilité réduites (par exemple, la disponibilité pour exercer son activité biologique) sur les cellules de récepteur de complexe de surface cellulaire de CMH de classe II, récepteur de complexe de surface cellulaire de CMH de classe II HLA ou HLA-DR, respectivement.
L’expression « HLA-DR réduit sur les cellules », dans le présent contexte, désigne une quantité et/ou une disponibilité réduites (par exemple la disponibilité pour exercer son activité biologique) de HLA-DR sur des cellules. Ces quantité et/ou disponibilité réduites couvrent une quantité réduite de HLA-DR sur les cellules et/ou une fraction réduite des cellules exprimant HLA-DR dans une population de cellules.
Par exemple et sans limitation, lorsque la quantité et/ou la disponibilité réduites couvre une fraction réduite des cellules exprimant HLA-DR dans une population de cellules par rapport à une/des valeur(s) de référence respective(s) représentant HLA-DR dans des cellules cultivées sans GDF-8, moins de 25 A> des cellules, de préférence moins de 20 % des cellules et encore plus préférablement moins de 15 % des cellules peuvent exprimer HLA-DR.
Un autre aspect de l’invention concerne GDF-8 pour utilisation dans la réduction de l’immunogénicité de cellules, GDF-8 devant être administré in vivo, GDF-8 pouvant être administré localement, par exemple, à un site de lésion musculosquelettique, par exemple par injection. GDF-8 peut être administré seul ou en combinaison avec des cellules telles que des cellules souches, de préférence des CSM, de préférence avec des CSM humaines adultes, et/ou avec des cellules telles que des ostéoprogeniteurs ou des cellules ostéoblastiques ou avec une population de cellules comprenant des ostéoprogéniteurs et/ou des cellules ostéoblastiques, de préférence de telles cellules pouvant être humaines. De préférence, GDF-8 peut être administré en combinaison avec des CSM, plus préférablement des CSM humaines adultes. Par conséquent, la presente invention concerne en outre GDF-8 pour utilisation dans la réduction de l’immunogénicité de cellules, GDF-8 devant être administré avec des CSM, de préférence avec des CSM humaines adultes, in vivo. GDF-8, facultativement en combinaison avec des cellules telles que décrites ci-dessus, peut en outre être co-administré avec FGF-2. De préférence, le sujet chez lequel ladite administration doit etre effectuée peut etre un humain. De preference, les cellules ou populations de cellules devant recevoir 1 administration peuvent être autologues ou allogéniques pour ledit sujet. GDF-8 et les cellules respectives ou populations de cellules telles que des CSM peuvent être administrées simultanément in vivo, ou peuvent être administrées séquentiellement dans un ordre quelconque in vivo, par exemple, les cellules ou populations de cellules respectives telles que des CSM peuvent être administrées in vivo et ensuite GDF-8 peut être administré in vivo, ou GDF-8 peut être administré in vivo et ensuite les cellules ou populations de cellules respectives telles que des CSM peuvent être administrées in vivo. En conséquence, il est décrit en outre l’utilisation de GDF-8 pour la fabrication d’un médicament pour réduire l’immunogénicité de cellules, GDF-8 devant être administré in vivo ; il est décrit en outre un procédé pour réduire l’immunogénicité de cellules chez un sujet nécessitant celui-ci, comprenant l’administration de GDF-8 audit sujet.
Un autre aspect de l’invention concerne GDF-8 pour utilisation en tant que médicament, de préférence pour utilisation dans le traitement d’une maladie musculosquelettique comprenant des maladies osseuses et des maladies ostéo-articulaires. En conséquence, il est décrit en outre l’utilisation de GDF-8 pour la fabrication d’un médicament pour le traitement de maladies musculosquelettiques, comprenant des maladies osseuses et des maladies ostéo-articulaires. Il est décrit en outre un procédé pour traiter des maladies musculosquelettiques, comprenant des maladies osseuses et des maladies ostéo-articulaires, chez un sujet nécessitant un tel traitement, comprenant l’administration audit sujet de GDF-8. Il est décrit en particulier un procédé pour traiter des maladies musculosquelettiques chez un sujet nécessitant un tel traitement, comprenant l’administration audit sujet d’une quantité efficace sur le plan thérapeutique ou prophylactique de GDF-8. Lorsqu’il est utilisé en tant que médicament, GDF-8 peut être administré seul ou en combinaison avec des cellules telles que des cellules souches, de préférence des CSM, de préférence avec des CSM humaines adultes, et/ou avec des cellules telles que des ostéoprogéniteurs ou des cellules ostéoblastiques ou avec une population de cellules comprenant des ostéoprogéniteurs et/ou des cellules ostéoblastiques, de préférence de telles cellules quelconques pouvant être humaines. De préférence, GDF-8 peut être administré en combinaison avec des CSM, plus préférablement des CSM humaines adultes. Par conséquent, il est décrit en particulier GDF-8 pour utilisation en tant que médicament, de préférence pour utilisation dans le traitement de maladies musculosquelettiques comprenant des maladies osseuses et des maladies ostéoarticulaires, GDF-8 devant être administré in vivo conjointement avec des CSM, de préférence avec des CSM humaines adultes. GDF-8, facultativement en combinaison avec des cellules telles que décrites ci-dessus, peut en outre être co-administré avec FGF-2. Il est décrit en outre un procédé pour traiter des maladies musculosquelettiques, comprenant des maladies osseuses et des maladies ostéo-articulaires, chez un sujet nécessitant un tel traitement, comprenant l’administration audit sujet de GDF-8 avec des CSM, de préférence avec des CSM humaines adultes. De préférence, le sujet chez lequel ladite administration doit être effectuée peut être humain. De préférence, les cellules ou populations de cellules à administrer peuvent être autologues ou allogéniques pour ledit sujet.
Comme mentionné ci-dessus, la présente invention concerne dans un aspect un procédé pour différencier des cellules souches mésenchymateuses (CSM) adultes in vitro ou ex vivo en osteoprogemteurs ou cellules ostéoblastiques ou une population de cellules comprenant des ostéoprogéniteurs et/ou des cellules ostéoblastiques. L’invention concerne en outre des applications de GDF-8 in vitro ou in vivo pour réduire l’immunogénicité de cellules, en particulier les cellules étant choisies dans le groupe constitué de CSM, cellules obtenues par différenciation de CSM, cellules de lignage ostéocytaire, cellules de lignage chondrocytaire, cellules de lignage adipocytaire, cellules de lignage myocytaire, cellules de lignage tendonocytaire, cellules de lignage fibroblastique, et cellules de lignage stromatogène.
L expression « une population de cellules comprenant des ostéoprogéniteurs et/ou des cellules ostéoblastiques », dans le présent contexte, désigne une population de cellules comprenant l’un quelconque ou les deux types de cellules mentionnés et contenant facultativement en outre d’autres types de cellules non mentionnés.
Dans le présent contexte, « ostéoprogéniteurs » peut comprendre en particulier des ostéoprogéniteurs précoces et tardifs. « Cellules ostéoblastiques » peut comprendre en particulier des pré-ostéoblastes, des ostéoblastes et des ostéocytes. Tous ces termes sont connus en tant que tels et dans le présent contexte peuvent désigner typiquement des cellules ayant un phénotype ostéogénique, et qui peuvent contribuer à, ou sont capables de se développer en cellules qui peuvent contribuer à, la formation de matériau osseux ou de matrice osseuse. En particulier, les présents procédés conduisent à des cellules et des populations de cellules qui sont avantageusement utiles pour transplantation ou pour le traitement de maladies musculosquelettiques par exemple pour restaurer la formation osseuse dans des contextes thérapeutiques. Par conséquent, les termes «ostéoprogéniteurs» (comprenant des ostéoprogéniteurs précoces et tardifs) et «cellules ostéoblastiques » (comprenant des pré-ostéoblastes, des ostéoblastes et des ostéocytes) doivent être considérés comme visant à couvrir toutes ces cellules utiles du lignage ostéogénique résultant des procédés appliquant les principes de la présente invention. Les cellules utiles du lignage ostéogénique peuvent donc couvrir des cellules à un stade quelconque de différenciation ostéogénique en cellules de formation osseuse matures.
A titre d orientation supplémentaire et non de limitation, des ostéoprogéniteurs et des cellules ostéoblastiques, ainsi que des populations de cellules comprenant des ostéoprogéniteurs et/ou des cellules ostéoblastiques peuvent présenter les caractéristiques suivantes : a) les cellules comprennent l’expression de Runx2, un facteur de transcription multifonctionnel qui régule la différenciation des ostéoblastes et l’expression de nombreux gènes de protéine de matrice extracellulaire pendant la différenciation d’ostéoblastes ; b) les cellules comprennent l’expression d’au moins l’un des suivants : phosphatase alcaline (ALP), plus spécifiquement ALP du type os-foie-rein ; et plus préférablement comprennent en outre 1 expression d un ou plusieurs marqueurs osseux additionnels tels que l’ostéocalcine (OCN), le propeptide aminoterminal de procollagène de type 1 (P1NP), l’ostéonectine (ON), l’ostéopontine (OP) et/ou la sialoprotéine osseuse (BSP), et/ou une ou plusieurs protéines de matrice osseuse additionnelles telles que la décorine et/ou l’ostéoprotégérine (OPG) ; c) les cellules n’expriment sensiblement pas CD45 (par exemple, moins d’environ 10%, de préférence moins d’environ 5 %, plus préférablement moins d’environ 2 % des cellules peuvent exprimer CD45) ; d) les cellules présentent des signes indiquant une capacité à minéraliser l’environnement externe, ou synthétiser une matrice extracellulaire contenant du calcium (par exemple, lorsqu’elles sont exposées à un milieu ostéogénique ; voir Jaiswal et al. J Cell Biochem, 1997, vol. 64, 295-312). L accumulation de calcium à l’intérieur de cellules et le dépôt dans des protéines de matrice peuvent être mesurés conventionnellement par exemple par culture dans 45Ca2+, lavage et reculture, et ensuite détermination de la radioactivité présente à l’intérieur de la cellule ou déposée dans la matrice extracellulaire (US 5 972 703), ou utilisation d’un essai de minéralisation à base de rouge d’alizarine (voir, par exemple, Gregory et al. Analytical Biochemistry, 2004, vol. 329, 77-84); e) les cellules ne se différencient sensiblement pas en cellules de lignage adipocytaire (par exemple, des adipocytes) ou de lignage chondrocytaire (par exemple, des chondrocytes). L’absence de différenciation vers de tels lignages cellulaires peut être testée en utilisant des conditions d’induction de différenciation standard établies dans l’art (par exemple, voir Pittenger et al. Science, 1999, vol. 284, 143-7), et des procédés d’essai (par exemple, lorsqu’ils sont induits, des adipocytes se colorent typiquement avec le rouge d’huile O indiquant l’accumulation de lipides ; les chondrocytes se colorent typiquement avec le bleu alcian ou la safranineO). L’absence substantielle de propension à une différenciation adipogénique et/ou chondrogénique peut typiquement signifier que moins de 20 %, ou moins de 10 %, ou moins de 5 %, ou moins de 1 % des cellules testées présentent des signes de différenciation adipogénique ou chondrogénique lorsque celles-ci sont appliquées au test respectif.
Les cellules peuvent comprendre en outre l’expression d’un ou plusieurs facteurs de recrutement cellulaire tels que VEGF. Les cellules peuvent comprendre en outre l’expression de IL6.
Les cellules classées comme constituant ou appartenant au lignage ostéocytaire (os), lignage chondrocytaire (cartilage), lignage adipocytaire (graisse), lignage myocytaire (muscle), lignage tendonocytaire (tendon), lignage fibroblastique (tissu conjonctif), ou lignage stromatogène (stroma), sont connues de l’homme du métier. Elles comprennent des cellules qui ont les phénotypes respectifs, et qui peuvent contribuer à, ou sont capables de se développer en cellules qui peuvent contribuer à, la formation des types de'tissu respectifs. À titre d’orientation supplémentaire et d’exemple, les cellules de lignage ostéocytaire comprennent les ostéoprogéniteurs, tels que les ostéoprogéniteurs précoces et tardifs, les pré-ostéoblastes, les ostéoblastes et les ostéocytes ; les cellules de lignage chondrocytaire comprennent les chondroblastes et les chondrocytes, ces derniers comprenant les chondrocytes hypertrophiques ; les cellules de lignage adipocytaire comprennent les adipoblastes (ou les préadipocytes) et les adipocytes ; les cellules de lignage myocytaire comprennent les cellules satellites, les myoblastes, et les myocytes (les cellules de type quelconque de tissu musculaire, c’est-à-dire, de tissu musculaire cardiaque, squelettique, et de muscle lisse, sont incluses, plus préférablement les cellules de tissu musculaire squelettique) ; les cellules de lignage tendonocytaire comprennent les ténoblastes et les ténocytes ; les cellules de lignage fibroblastique comprennent les fibrocytes et les fibroblastes ; les cellules de lignage stromatogène comprennent les cellules stromales, telles que, en particulier, les cellules stromales de moelle osseuse.
Lorsqu’une cellule est dite positive pour (ou exprime ou comprend l’expression de) un marqueur particulier, cela signifie que l’homme du métier conclura à la présence ou la preuve d’un signal distinct, par exemple, détectable par anticorps ou la détection par réaction de polymérase en chaîne par transcription inverse, pour ce marqueur lors de la conduite de la mesure appropriée, par rapport à des témoins adaptés. Lorsque le procédé permet une évaluation quantitative du marqueur, les cellules positives peuvent en moyenne générer un signal qui est significativement différent du témoin, par exemple, mais sans limitation, au moins 1,5 fois plus élevé qu’un tel signal généré par des cellules témoins, par exemple, au moins 2 fois, au moins 4 fois, au moins 10 fois, au moins 20 fois, au moins 30 fois, au moins 40 fois, au moins 50 fois plus élevé ou encore plus élevé.
L’expression des marqueurs spécifiques de cellules ci-dessus peut être détectée en utilisant une technique immunologique adaptée quelconque connue dans l’art, telle que l’immunocytochimie ou l’adsorption d’affinité, l’analyse par transfert Western, FACS, ELISA, etc., ou par un dosage biochimique adapté quelconque de l’activité enzymatique (par exemple, pour ALP), ou par une technique adaptée quelconque de mesure de la quantité de l’ARNm de marqueur, par exemple, transfert Northern, RT-PCR semi-quantitative ou quantitative, etc. Les données de séquence pour les marqueurs répertoriés dans cette description sont connues et peuvent être obtenues à partir de bases de données publiques telles que GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/).
Comme indiqué, l’invention concerne en outre des populations de cellules comprenant des ostéoprogéniteurs ou des cellules ostéoblastiques. Une population de cellules exemplaire peut comprendre au moins 10 %, de préférence au moins 30 %, plus préférablement au moins 50 %, par exemple, au moins 60 %, encore plus préférablement au moins 70 %, par exemple, au moins 80 %, et encore plus préférablement au moins 90 %, par exemple, au moins 95 % d’ostéoprogéniteurs et/ou cellules ostéoblastiques tels que présentement décrits. Par exemple, la population de cellules peut comprendre moins de 50 %, de préférence moins de 40 %, encore plus préférablement moins de 30 %, encore plus préférablement moins de 20 % et encore plus préférablement moins de 10%, par exemple, moins de 7 %, moins de 5 % ou moins de 2 % de types de cellules autre que les ostéoprogéniteurs et les cellules ostéoblastiques tels que présentement définis.
Le terme « cellule souche » désigne généralement une cellule non spécialisée ou relativement moins spécialisée et compétente pour prolifération, qui est capable d’autorenouvellement, c’est-à-dire qu’elle peut proliférer sans différenciation, et qui peut, ou dont la descendance peut conduire à au moins un type de cellules relativement plus spécialisé. Le terme couvre les cellules souches capables d’autorenouvellement sensiblement illimité, c’est-à-dire que la descendance d’une cellule souche ou au moins une partie de celle-ci conserve sensiblement le phénotype non spécialisé ou relativement moins spécialisé, le potentiel de différenciation, et la capacité de prolifération de la cellule souche mère, ainsi que les cellules souches qui présentent un autorenouvellement limité, c’est-à-dire que la capacité de la descendance ou un partie de celle-ci de prolifération et/ou différenciation ultérieure est réduite de façon démontrable par rapport à la cellule mère. À titre d’exemple et non de limitation, une cellule souche peut conduire à des descendants qui peuvent se différencier en un ou plusieurs lignages pour produire des cellules de plus en plus relativement spécialisées, de tels descendants et/ou cellules de plus en plus relativement spécialisées peuvent eux-mêmes être des cellules souches telles que présentement définies, ou même produire des cellules différenciées de façon terminale, c’est-à-dire, des cellules totalement spécialisées, qui peuvent être post-mitotiques.
Le terme « cellule souche adulte » dans le présent contexte désigne une cellule souche présente dans ou obtenue à partir (par exemple, sous forme isolée) d’un organisme au stade fœtal ou après la naissance, tel que, par exemple après avoir atteint l’âge adulte.
Les cellules souches préférables selon l’invention ont le potentiel pour générer des cellules d’au moins le lignage ostéogénique (os), telles que, par exemple, des cellules ostéogéniques et/ou des ostéoprogéniteurs et/ou des pré-ostéoblastes et/ou des ostéoblastes et/ou des ostéocytes, etc.
De préférence, au moins certaines cellules souches selon l’invention peuvent également avoir le potentiel pour générer d’autres cellules comprises dans les populations de cellules résultant des présents procédés, telles que, par exemple, des cellules de lignage endothélial, par exemple des cellules progénitrices endothéliales et/ou des cellules endothéliales.
Le terme « cellule souche mésenchymateuse » ou « CSM », dans le présent contexte, désigne une cellule souche dérivée de mésoderme adulte qui est capable de générer des cellules de lignages mésenchymateux, typiquement de deux lignages mésenchymateux ou plus, par exemple, de lignage osteocytaire (os), chondrocytaire (cartilage), myocytaire (muscle), tendonocytaire (tendon), fibroblastique (tissu conjonctif), adipocytaire (graisse) et stromatogène (stroma médullaire). Les CSM peuvent être isolées à partir de, par exemple, moelle osseuse, os trabéculaire, sang, cordon ombilical, placenta, sac vitellin fœtal, peau (derme), spécifiquement de peau fœtale et adolescente, de périoste et de tissu adipeux. Les CSM humaines, leurs isolement, expansion in vitro, et différenciation, ont été décrits dans, par exemple, le brevet U.S. n° 5 486 359 ; le brevet U.S. n° 5 811 094; le brevet U.S. n° 5 736 396 ; le brevet U.S. n° 5 837 539 ; ou le brevet U.S. n° 5 827 740. Des CSM quelconques décrites dans l’art et isolées par un procédé quelconque décrit dans l’art peuvent être adaptées dans les présents procédés, à condition que de telles CSM soient capables de générer des cellules d’au moins le lignage ostéocytaire (os).
Le terme CSM comprend en outre la descendance de CSM, par exemple, la descendance obtenue par propagation in vitro ou ex vivo de CSM obtenues à partir d’un échantillon biologique d’un sujet animal ou humain.
Potentiellement, mais sans limitation, au moins certaines CSM pourraient également être en mesure de générer d’autres cellules comprises dans les populations de cellules résultant des présents procédés.
Comme décrit dans les exemples, le procédé de certains aspects de l’invention peut permettre la sélection des cellules souches de moelle osseuse (BMSC) qui, dans les conditions de culture spécifiées, adhérent à une surface de substrat. Il est connu dans l’art que des CSM peuvent être isolées à partir de moelle osseuse (ou d’autres sources) par sélection des cellules (mononucléaires) qui peuvent adhérer à une surface de substrat, par exemple, une surface en plastique. Par conséquent, de préférence, des CSM, dans le présent contexte, peuvent être isolées à partir de moelle osseuse. Un échantillon de moelle osseuse (BMSC) peut être obtenu, par exemple, à partir de crête iliaque, de fémur, de tibia, de colonne vertébrale, de cote, ou d’autres espaces médullaires d’un sujet.
Le terme « isolement » en référence à un composant particulier désigne la séparation de ce composant d’au moins un autre composant d’une composition à partir de laquelle le premier composant est isolé. Le terme « isolé » dans le présent contexte en ce qui concerne un type de cellules ou une population de cellules quelconque implique également qu’une telle population de cellules ne fait pas partie d’un corps animal ou humain.
Des CSM peuvent être comprises dans un échantillon biologique, par exemple, dans un échantillon comprenant des BMSC, ou peuvent être au moins partiellement isolées à partir de celui-ci comme il est connu dans l’art. De plus, des CSM peuvent être au moins partiellement isolées à partir de moelle osseuse ou de sources adaptées quelconques comprenant des CSM autres que la moelle osseuse, par exemple, le sang, le cordon ombilical, le placenta, le sac vitellin foetal, la peau (derme), spécifiquement la peau fœtale et adolescente, le périoste et le tissu adipeux.
Le terme « in vitro » signifie généralement à l’extérieur de, ou externe à, un corps animal ou humain. Le terme « ex vivo » désigne typiquement des tissus ou des cellules enlevés d’un corps animal ou humain et maintenus ou propagés à l’extérieur du corps, par exemple, dans une cuve de culture. Le terme « in vitro », dans le présent contexte, doit être entendu comme comprenant « ex vivo ». Le terme « in vivo » signifie généralement à l’intérieur de, ou interne à, un corps animal ou humain.
Dans un mode de réalisation, des CSM ou d’autres types de cellules présentement envisagés peuvent être obtenus à partir d’un échantillon biologique d’un sujet.
Les termes « sujet » ou « patient » sont utilisés de façon interchangeable et désignent des animaux, de préférence des animaux à sang chaud, plus préférablement des vertébrés, et encore plus préférablement des mammifères comprenant spécifiquement des humains et des mammifères non humains, qui ont été l’objet du traitement, de l’observation ou de l’essai. Le terme « mammifère » comprend un animal quelconque classé en tant que tel, comprenant, mais non limité à, des humains, des animaux domestiques et d’élevage, des animaux de zoo, des animaux de sport, des animaux domestiques, des animaux de compagnie et des animaux de laboratoire, tels que, par exemple, des souris, des rats, des hamsters, des lapins, des chiens, des chats, des cobayes, des bovins, des vaches, des moutons, des chevaux, des porcs et des primates, par exemple, des singes et des grands singes. Il est particulièrement préféré des sujets humains, comprenant les deux sexes et toutes les classes d’âge de ceux-ci.
Par conséquent, il est décrit en outre un procédé pour différencier des CSM humaines adultes in vitro ou ex vivo en ostéoprogéniteurs ou cellules ostéoblastiques ou une population de cellules comprenant des ostéoprogéniteurs et/ou des cellules ostéoblastiques, le procédé comprenant l’étape de culture desdites CSM dans un milieu comprenant du plasma humain ou du sérum, GDF-8 et FGF-2.
Des sujets animaux non humains peuvent comprendre en outre des formes prénatales d’animaux, telles que, par exemple, des embryons ou des fœtus. Des sujets humains peuvent comprendre en outre des fœtus, mais de préférence pas des embryons.
Le terme « échantillon biologique » ou « échantillon » dans le présent contexte désigne généralement un échantillon obtenu à partir d’une source biologique, par exemple, d’un organisme, un organe, un tissu ou une culture de cellules, etc. Un échantillon biologique d’un animal ou sujet humain désigne un échantillon prélevé sur un sujet animal ou humain et comprenant des cellules de celui-ci. L échantillon biologique d’un sujet animal ou humain peut comprendre un ou plusieurs types de tissu et des cellules d un ou plusieurs types de tissu. Des procédés d’obtention d’échantillons biologiques d’un sujet animal ou humain sont connus dans l’art, par exemple, une biopsie de tissu ou un prélèvement sanguin.
Un échantillon biologique utile d’un sujet comprend des CSM de celui-ci ou d’autres types de cellules présentement envisagés du sujet. Un échantillon comprenant des CSM peut être typiquement obtenu à partir de moelle osseuse, par exemple, de crête iliaque, de fémur, de tibia, de colonne vertébrale, de cote, ou d’autres espaces médullaires d’un sujet. Un autre échantillon biologique utile comprenant des CSM peut être dérivé, par exemple, de sang, de cordon ombilical, de placenta, de sac vitellin fœtal, de peau (derme), spécifiquement de peau fœtale et adolescente, de périoste, d’os trabéculaire ou de tissu adipeux d’un sujet. D’autres types de cellules comme présentement décrit peuvent être isolés en utilisant des protocoles disponibles des tissus correspondants dans lesquels ils résident, par exemple, des cellules de lignage ostéocytaire de tissu osseux, des cellules de lignage chondrocytaire de tissu de cartilage, des cellules de lignage adipocytaire de tissu adipeux, des cellules de lignage myocytaire de tissu de muscle lisse, cardiaque ou squelettique (de préférence squelettique), des cellules de lignage tendonocytaire de tissu tendineux, des cellules de lignage fibroblastique de tissu conjonctif, ou des cellules de lignage stromatogène de tissu stromal, tel que le stroma de moelle osseuse. En variante, de tels types de cellules peuvent être différenciés à partir de CSM en utilisant des protocoles connus en tant que tel.
Dans un mode de réalisation, des CSM peuvent être obtenues à partir d’un sujet sain, qui peut contribuer à assurer la fonctionnalité des ostéoprogéniteurs ou des cellules ostéoblastiques ou de la population de cellules comprenant des ostéoprogéniteurs et/ou des cellules ostéoblastiques ou d’autres types de cellules présentement envisagés, qui sont différenciés à partir desdites CSM. Dans un autre mode de réalisation, des CSM ou d’autres types de cellules présentement envisagés peuvent être obtenus à partir d’un sujet sain, ce qui peut contribuer à assurer la fonctionnalité de telles cellules.
Dans un autre mode de réalisation, des CSM peuvent être obtenues à partir d’un sujet qui est à risque de ou a une maladie musculosquelettique telle que, par exemple, une maladie osseuse, et qui peut donc particulièrement bénéficier de l’administration des ostéoprogéniteurs ou des cellules ostéoblastiques ou de la population de cellules comprenant des ostéoprogéniteurs et/ou des cellules ostéoblastiques, différenciés à partir desdites CSM selon les procédés de la présente invention.
Dans un autre mode de réalisation, des CSM ou d’autres types de cellules présentement envisagés peuvent être obtenus à partir d’un sujet qui est à risque de ou a une maladie affectant de façon délétère un tissu qui peut bénéficier de l’administration des CSM ou des un ou plusieurs autres types de cellules présentement envisagés.
Le terme « maladie musculosquelettique », dans le présent contexte désigne un type quelconque de maladie osseuse, de maladie musculaire, de maladie ostéo-articulaire, ou de chondrodystrophie, dont le traitement peut bénéficier de l’administration de cellules de lignage ostéogénique, par exemple, des ostéoprogéniteurs ou des cellules ostéoblastiques ou une population de cellules comprenant des ostéoprogéniteurs et/ou des cellules ostéoblastiques à un sujet ayant la maladie. En particulier, une telle maladie peut être caractérisée, par exemple, par une formation osseuse diminuée ou une résorption osseuse excessive, par un nombre, une viabilité ou une fonction réduits des ostéoblastes ou des ostéocytes présents dans l’os, une masse osseuse réduite chez un sujet, un épaississement des os, une résistance ou une élasticité osseuse altérée, etc.
Des exemples non limitatifs de maladies musculosquelettiques qui peuvent bénéficier de l’administration d’ostéoprogéniteurs ou de cellules ostéoblastiques ou une population de cellules comprenant des ostéoprogéniteurs et/ou des cellules ostéoblastiques tels que présentement décrits peuvent comprendre des troubles locaux ou systémiques, tels que, un type quelconque d’ostéoporose ou d’ostéopénie, par exemple, primaire, postménopause, sénile, induite par les corticoïdes, induite par les biphosphonates, et induite par radiothérapie ; une ostéonécrose secondaire, mono- ou multisite ; un type quelconque de fracture, par exemple, des fractures non consolidées, à consolidation vicieuse, à consolidation retardée ou une compression, des affections nécessitant une fusion osseuse (par exemple, des fusions et line reconstruction vertébrales), des fractures maxillo-faciales, un défaut osseux congénital, une reconstruction osseuse, par exemple, après lésion traumatique ou une chirurgie du cancer, et une reconstruction osseuse crânio-faciale ; l’arthrite traumatique, le cartilage focal et/ou un défaut articulaire, l’arthrite dégénérative focale ; l’arthrose, l’arthrite dégénérative, la gonarthrose, et la coxarthrose ; l’ostéogenèse imparfaite ; un cancer des os ostéolytique ; la maladie de Paget, des troubles endocrinologiques, l’hypophosphatémie, l’hypocalcémie, l’ostéodystrophie rénale, l’ostéomalacie, une maladie osseuse adynamique, l’hyperparathyroïdisme, l’hyperparathyroïdisme primaire, l’hyperparathyroïdisme secondaire ; un maladie parodontique ; la maladie de Gorham-Stout et le syndrome de McCune-Albright ; la polyarthrite rhumatoïde ; les spondyloarthropathies, comprenant la spondylarthrite ankylosante, l’arthrite psoriasique, une arthropathie entéropathique, et une spondylarthrite indifférenciée et une arthrite réactive ; le lupus érythémateux disséminé et des syndromes apparentés ; la sclérodermie et des troubles associés ; le syndrome de Sjogren ; une angéite systémique, comprenant l’artérite à cellules géantes (maladie de Horton), l’artérite de Takayasu, la polymyalgie rhumatismale, une angéite associée à ANCA (telle que la granulomatose de Wegener, une polyangéite microscopique, et le syndrome de Churg-Strauss), le syndrome de Behcet, et d’autres polyartérites et troubles associés (tels que la polyartérite noueuse, le syndrome de Cogan, et la maladie de Buerger) ; l’arthrite accompagnant d’autres maladies inflammatoires systémiques, comprenant l’amyloïdose et la sarcoïdose ; les arthropathies cristallines, comprenant la goutte, la maladie a pyrophosphate de calcium dihydraté, les troubles ou syndromes associés à un dépôt articulaire de cristaux de phosphate de calcium ou d’oxalate de calcium ; la chondrocalcinose et une arthropathie neuropathique ; le syndrome de Felty et le syndrome de Reiter ; la maladie de Lyme et la fièvre rhumatismale.
Les procédés et utilisations appliquant les principes de la présente invention peuvent concerner la culture (par exemple, le maintien, la propagation et/ou la différenciation) de cellules ou populations de cellules en présence de milieux de culture de cellule ou tissu tels que ceux connus en tant que tel, tel que par exemple Γutilisation de milieux de culture liquides ou semi-solides (par exemple, gélatineux), et de préférence des milieux de culture de cellules ou de tissu liquides. De tels milieux de culture peuvent maintenir de façon souhaitable la maintenance (par exemple, la survie, la stabilité génotypique, phénotypique et/ou fonctionnelle) et la propagation des cellules ou populations de cellules.
En particulier, des procédés mettant en œuvre les principes de la présente invention peuvent comprendre l’étape de culture de CSM dans un milieu comprenant du plasma ou du sérum et GDF-8 et FGF-2. Par conséquent, de façon générale, des cellules peuvent être cultivées dans un milieu comprenant un ou plusieurs agents, tels que des facteurs de croissance et du plasma ou du sérum, au moyen de leur inclusion dans le milieu.
Il apparaîtra à l’homme du métier que le plasma et le sérum sont des compositions biologiques complexes, qui peuvent comprendre un ou plusieurs facteurs de croissance, cytokines ou hormones. Par conséquent, il est attendu que les facteurs de croissance mentionnés, en particulier GDF-8 et FGF-2, soient fournis en plus de, c’est-à-dire, de façon exogène à ou en supplément à, le plasma ou sérum.
Il est également décrit des procédés pour différencier des cellules souches mésenchymateuses (CSM) adultes in vitro ou ex vivo en ostéoprogéniteurs ou cellules ostéoblastiques ou une population de cellules comprenant des ostéoprogéniteurs et/ou des cellules ostéoblastiques, le procédé comprenant l’étape de culture desdites CSM dans un milieu constitué essentiellement de ou constitué de milieu basal, plasma ou sérum, GDF-8 et FGF-2.
Par conséquent, dans un mode de réalisation, GDF-8 et FGF-2 peuvent être les seuls facteurs de croissance ajoutés au milieu.
Dans un autre mode de réalisation, CSM peut être cultivé avec, en plus GDF-8 et FGF-2, un ou plusieurs facteurs de croissance autres que GDF-8 et FGF-2 additionnels, ajoutés de façon exogène.
Dans un mode de réalisation préféré, un ou plusieurs quelconques ou tous les facteurs de croissance utilisés dans le présent procédé (la référence générale à un facteur de croissance dans le présent contexte comprend en particulier les facteurs de croissance GDF-8 et FGF-2, ainsi que les un ou plusieurs autres facteurs de croissance facultatifs) sont un facteur de croissance humain. Dans le présent contexte, le terme « facteur de croissance humain » désigne un facteur de croissance sensiblement identique à un facteur de croissance humain d’origine naturelle. Par exemple, lorsque le facteur de croissance est une entité protéique, le(s) peptide(s) ou polypeptide(s) constituant(s) de celui-ci peut avoir une séquence d’acides aminés primaire identique à un facteur de croissance humain d’origine naturelle. L’utilisation de facteurs de croissance humains est préférée étant donné qu’il est attendu que des facteurs de croissance induisent un effet souhaitable sur une fonction cellulaire humaine.
Le terme « d’origine naturelle » est utilisé pour décrire un objet ou une entité qui peut être observée dans la nature comme étant distincte d’une entité artificielle produite par l’homme. Par exemple, une séquence polypeptidique présente dans un organisme, qui peut être isolée à partir d’une source dans la nature et qui n’a pas été intentionnellement modifiée par l’homme au laboratoire, est d’origine naturelle. Lorsqu’il est fait référence à une entité particulière, par exemple, à un polypeptide ou une protéine, le terme couvre toutes les formes et variantes de ceux-ci qui sont présentes dans la nature, par exemple, en raison d’une variation normale entre espèces et individus. Par exemple, lorsqu’il est fait référence à un facteur de croissance protéique, le terme « d’origine naturelle » couvre des facteurs de croissance ayant des différences dans la séquence primaire de leur(s) peptide(s) ou polypeptide(s) constituant(s) en raison d’une divergence génétique entre des espèces et d’une variation allélique normale entre des individus.
FGF-2 ou facteur de croissance des fibroblastes 2 est également couramment appelé facteur de croissance des fibroblastes basique, FGFb, bFGF, prostatropine, ou précurseur de facteur de croissance 2 se liant à l’héparine (HBGF-2). FGF-2 humain exemplaire comprend, sans limitation, FGF-2 ayant une séquence d’acides aminés primaire comme indiqué sous le numéro d’accession Uniprot/Swissprot P09038 (http://www.uniprot.org/uniprot/). Il apparaîtra à l’homme du métier que ladite séquence est d’un précurseur de FGF-2 et peut comprendre des parties qui sont dérivées de FGF-2 mature. Une séquence de protéine humaine exemplaire de FGF-2 peut être telle que décrite sous le numéro d’accession NCBI Genbank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) NP_001997.5. FGF-2 humain exemplaire a également été décrit, entre autres, par Abraham et al. 1986 (EMBO J 5: 2523-8) et Kurokawa et al 1987 (FEBS Lett 213: 189-94).
GDF-8 ou facteur de croissance et différenciation 8 est également couramment appelé myostatine (MSTN). Un GDF-8 humain exemplaire comprend, sans limitation, GDF-8 ayant une séquence d’acides aminés primaire telle que décrite sous le numéro d’accession Uniprot/Swissprot 014793. Une séquence de précurseur de protéine GDF-8 humaine exemplaire peut être telle que décrite sous le numéro d’accession NCBI Genbank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) NP 005250.1. GDF-8 murin exemplaire a également été décrit, entre autres, par McPherron et al. 1997 (Nature 387 (6628): 83-90).
GDF-8 et FGF-2 sont compris dans un milieu tel que défini présentement à des concentrations suffisantes pour induire la différenciation de CSM en ostéoprogéniteurs ou cellules ostéoblastiques ou une population de cellules comprenant des ostéoprogéniteurs et/ou des cellules ostéoblastiques. Typiquement, FGF-2 peut être inclus dans le milieu à une concentration comprise entre 0,1 et 100 ng/ml, de préférence entre 0,5 et 20 ng/ml, par exemple, à environ 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7 ou 6 ng/ml, ou à environ 5 ng/ml ou moins, par exemple, à environ 4, 3, 2, 1 ou 0,5 ng/ml. Typiquement, GDF-8 peut être inclus dans le milieu à une concentration comprise entre 0,1 et 1000 ng/ml, par exemple entre 1 et 500 ng/ml, par exemple, à environ 450, 400, 350, 300, 250 ou 200 ng/ml, ou à environ 150 ng/ml ou moins, par exemple, à environ 100, 75, 50, 25 ou 10 ng/ml, ou de préférence à environ 5 ng/ml ou moins, par exemple, à environ 4, 3, 2, 1, 0,75 0,5 ou 0,25 ng/ml. Lesdites valeurs sont destinées à désigner des concentrations des facteurs de croissance respectifs comme étant supplémentées de façon exogène dans les milieux.
La présente référence à une protéine, un polypeptide ou un peptide quelconque tel qu’un facteur de croissance quelconque, comprenant GDF-8 et FGF-2, peut également couvrir des fragments de ceux-ci. Le terme « fragment » d’une protéine, un polypeptide ou un peptide désigne généralement des formes délétées ou tronquées en position N-terminale et/ou C-terminale desdits protéine, polypeptide ou peptide. Sans limitation, un fragment d’un acide nucléique, une protéine, un polypeptide ou un peptide peut représenter au moins environ 5 %, ou au moins environ 10 %, par exemple, > 20 %, > 30 % ou > 40 %, tel que de préférence > 50 %, par exemple, > 60 %, > 70 % ou > 80 %, ou plus préférablement > 90 % ou > 95 % de la séquence nucléotidique dudit acide nucléique ou de la séquence d’acides aminés desdits protéine, polypeptide ou peptide.
La présente référence à une protéine, un polypeptide ou un peptide quelconque tel qu’un facteur de croissance quelconque comprenant GDF-8 et FGF-2 peut également couvrir des variants de ceux-ci. Le terme « variant » d’un acide nucléique, une protéine, un polypeptide ou un peptide désigne un acide nucléique, des protéines, des polypeptides ou des peptides dont la séquence (c’est-à-dire, une séquence nucléotidique ou une séquence d’acides aminés, respectivement) est sensiblement identique (c’est-à-dire, en grande partie mais pas totalement identique) à la séquence desdits acide nucléique, protéine ou polypeptide mentionnés, par exemple, au moins environ 80 % identique ou au moins environ 85 % identique, par exemple, de préférence au moins environ 90 % identique, par exemple, au moins 91 % identique, 92 % identique, plus préférablement au moins environ 93 % identique, par exemple, au moins 94 % identique, encore plus préférablement au moins environ 95 % identique, par exemple, au moins 96 % identique, encore plus préférablement au moins environ 97 % identique, par exemple, au moins 98 % identique, et de manière préférée entre toutes au moins 99 % identique. De préférence, un variant peut présenter de tels degrés d’identité à un acide nucléique, une protéine, un polypeptide ou un peptide spécifié lorsque la séquence totale de l’acide nucléique, la protéine, le polypeptide ou le peptide mentionné est recherchée dans l’alignement de séquence (c’est-à-dire, une identité de séquence totale). Il est également inclus parmi des fragments et variants d’un acide nucléique, une protéine, un polypeptide ou un peptide des produits de fusion desdits acide nucléique, protéine, polypeptide ou peptide avec un autre acide nucléique, protéine, polypeptide ou peptide généralement non apparenté.
L’identité de séquence peut être déterminée en utilisant des algorithmes adaptés pour effectuer des alignements de séquence et une détermination d’identité de séquence comme étant connue en tant que telle. Des algorithmes exemplaires mais non limitatifs comprennent ceux basés sur le système BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) initialement décrit par Altschul et al. 1990 (J Mol Biol 215: 403-10), tel que l’algorithme « Blast 2 sequences » décrit par Tatusova et Madden 1999 (FEMS Microbiol Lett 174: 247-250), par exemple en utilisant les réglages par défaut publiés ou d’autres réglages adaptés (tels que, par exemple, pour l’algorithme BLASTN : pénalité d’ouverture de brèche = 5, pénalité d’extension de brèche = 2, pénalité de mésappariement = -2, prime de correspondance = 1, brèche x_dropoff = 50, valeur de prévision = 10,0, taille de mot = 28 ; ou pour l’algorithme BLASTP : matrice = Blosum62, pénalité d’ouverture de brèche = 11, pénalité d’extension de brèche = 1, valeur de prévision = 10,0, taille de mot = 3).
Un variant d’une protéine, un polypeptide ou un peptide peut être un homologue (par exemple, un orthologue ou un paralogue) desdits protéine, polypeptide ou peptide. Dans le présent contexte, le terme « homologie » désigne généralement une similarité structurale entre deux macromolécules, en particulier entre deux protéines ou polypeptides, de taxons identiques ou différents, ladite similarité étant due à des ancêtres communs.
Lorsque la présente spécification désigne ou couvre des fragments et/ou variants de protéines, polypeptides ou peptides, cela désigne de préférence des variants et/ou fragments qui sont « fonctionnels », c’est-à-dire, qui conservent au moins partiellement l’activité biologique ou la fonctionnalité prévue des protéines, polypeptides ou peptides respectifs. À titre d’exemple et non de limitation, un fragment et/ou variant fonctionnel de GDF-8 ou FGF-2 doit au moins partiellement conserver l’activité biologique de GDF-8 ou FGF-2, respectivement. Par exemple, il peut conserver un ou plusieurs aspects de l’activité biologique de GDF-8 ou FGF-2, tels que, par exemple, la capacité à se lier à un ou plusieurs récepteurs apparentés, afin de participer à une ou plusieurs voies cellulaires, etc. De préférence, un fragment et/ou variant fonctionnel peuvent conserver au moins environ 20 %, par exemple, au moins 30 %, ou au moins environ 40 %, ou au moins environ 50 %, par exemple, au moins 60 %, plus préférablement au moins environ 70 %, par exemple, au moins 80 %, encore plus préférablement au moins environ 85 %, encore plus prererablement au moins environ 90 %, et de manière préférée entre toutes au moins environ 95 % ou même environ 100 % ou plus de l’activité biologique ou fonctionnalité prévue par rapport aux protéine, polypeptide ou peptide correspondants. En particulier, un fragment ou variant fonctionnel conserverait, au moins à un certain degré, la capacité à stimuler la différenciation ostéogénique de cellules CSM dans les présents procédés ou utilisations.
Lorsqu’une protéine, un polypeptide ou un peptide tel qu’un facteur de croissance exerce ses effets par liaison à son récepteur apparenté, un fragment et/ou variant fonctionnel de la protéine, du polypeptide ou du peptide peut conserver au moins environ 20 %, par exemple, au moins 30 %, ou au moins environ 40 %, ou au moins environ 50 %, par exemple, au moins 60 %, plus préférablement au moins environ 70 %, par exemple, au moins 80 %, encore plus préférablement au moins environ 85 %, encore plus préférablement au moins environ 90 %, et de manière préférée entre toutes au moins environ 95 % ou même environ 100 % ou plus de l’affinité et/ou la spécificité de la protéine, du polypeptide ou du peptide respectif pour liaison à ce récepteur. Les paramètres ci-dessus de la liaison peuvent être aisément déterminés par l’homme du métier en utilisant des essais in vitro ou cellulaires qui sont connus en tant que tel.
Lorsque l’activité d’une protéine, un polypeptide ou un peptide donné tel qu’un facteur de croissance donné peut être aisément mesurée dans un essai établi, par exemple, un essai in vitro ou cellulaire (tel que, par exemple, la mesure de l’activité mitogène dans une culture de cellules), un fragment et/ou variant fonctionnel de la protéine, du polypeptide ou du peptide peut présenter une activité dans de tels essais, qui est au moins environ 20 %, par exemple, au moins 30 %, ou au moins environ 40 %, ou au moins environ 50 %, par exemple, au moins 60 %, plus préférablement au moins environ 70 %, par exemple, au moins 80 %, encore plus préférablement au moins environ 85 %, encore plus préférablement au moins environ 90 %, et de manière préférée entre toutes au moins environ 95 % ou même environ 100 % ou plus de l’activité de la protéine, du polypeptide ou du peptide respectif.
Une référence à 1’« activité » d’une protéine, un polypeptide ou un peptide tel qu’un facteur de croissance peut généralement couvrir l’un quelconque ou plusieurs aspects de l’activité biologique de la protéine, du polypeptide ou du peptide, tels que, sans limitation, l’un quelconque ou plusieurs aspects de son activité biochimique, activité enzymatique, activité de signalisation, activité d’interaction, activité de ligand, et/ou activité structurale, par exemple, dans une cellule, un tissu, un organe ou un organisme. À titre d’exemple et non de limitation, une référence à l’activité de GDF-8 ou FGF-2 peut désigner en particulier leur activité en tant que ligand, c’est-à-dire, leur capacité à se lier à un ou plusieurs récepteurs apparentés, et/ou leur activité en tant que molécule de signalisation, c’est-à-dire, leur capacité à participer à une ou plusieurs voies de signalisation cellulaire, etc.
La référence présentement à une protéine, un polypeptide ou un peptide quelconque tel qu’un facteur de croissance quelconque comprenant GDF-8 et FGF-2 peut également couvrir des dérivés de ceux-ci. Le terme « dérivé » d’une protéine, un polypeptide ou un peptide désigne généralement une protéine, un polypeptide ou un peptide dérivé par modification chimique d’un ou plusieurs résidus d’acide aminé et/ou addition d’un ou plusieurs fragments à un ou plusieurs résidus d’acide aminé, par exemple, par glycosylation, phosphorylation, acylation, acétylation, sulfatation, lipidation, alkylation, etc. Typiquement, moins de 50 %, par exemple, moins de 40 %, de préférence moins de 30 %, par exemple, moins de 20 %, plus préférablement moins de 15 %, par exemple, moins de 10 % ou moins de 5 %, par exemple, moins de 4 %, 3 %, 2 % ou 1 % d’acides aminés dans la protéine, le polypeptide ou le peptide peuvent être dérivés. Un dérivé protéique peut être constitué d’une ou plusieurs protéine(s), polypeptide(s) ou peptide(s), dont au moins un peut être dérivé sur au moins un résidu d’acide aminé. Lorsque la présente spécification désigne ou couvre des dérivés de protéines, polypeptides ou peptides, cela désigne de préférence des dérivés qui sont fonctionnels.
Dans un mode de réalisation préféré, le facteur de croissance peut être recombinant, c’est-à-dire, produit par un organisme hôte par l’expression d’une molécule d’acide nucléique recombinante, qui a été introduite dans l’organisme hôte (par exemple, des bactéries telles que, sans limitation, E. coli, S. tymphimurium, Serratia marcescens, Bacillus subtilis ; une levure telle que par exemple S. cerevisiae et Pichia pastoris ; des cellules de plante cultivée telles que, entre autres, des cellules d’Arabidopsis thaliana et Nicotiana tobaccum ; des cellules animales telles que des cellules de mammifère et d’insecte ; ou des organismes multicellulaires tels que des plantes ou des animaux) ou un ancêtre de ceux-ci, et qui comprend une séquence codant pour le facteur de croissance. L’utilisation de facteurs de croissance exprimés de façon recombinante diminue le risque de transmission d’agents pathogènes.
Le terme « plasma » est tel que conventionnellement défini. Du plasma est généralement obtenu à partir d’un échantillon de sang total, fourni ou mis en contact avec un anticoagulant (par exemple, héparine, citrate, oxalate ou EDTA). Ensuite, des composants cellulaires de l’échantillon de sang sont séparés du composant liquide (plasma) par une technique appropriée, typiquement par centrifugation. Le terme « plasma », désigne par conséquent une composition qui ne fait pas partie d’un corps humain ou animal.
Le terme « sérum » est tel que conventionnellement défini. Du sérum peut généralement être obtenu à partir d’un échantillon de sang total en laissant dans un premier temps la coagulation se produire dans l’échantillon et ensuite en séparant le caillot ainsi formé et des composants cellulaires de l’échantillon de sang du composant liquide (sérum) par une technique appropriée, typiquement par centrifugation. La coagulation peut être facilitée par un catalyseur inerte, par exemple, des billes de verre ou une poudre, bn venante, du serum peut être obtenu a partir de plasma par élimination de l’anticoagulant et de fibrine. Le terme « sérum », par conséquent, désigne une composition qui ne fait pas partie d’un corps humain ou animal.
Le plasma ou sérum isolé peut être utilisé directement dans le présent procédé. Ceux-ci peuvent également être stockés de manière appropriée pour utilisation ultérieure (par exemple, pendant des temps plus courts, par exemple, jusqu’à environ 1 à 2 semaines, à une température au-dessus des points de congélation respectifs du plasma ou du sérum, mais au-dessous de la température ambiante, cette température est généralement d’environ 4 °C à 5 °C ; ou pendant des durées plus longues par stockage au congélateur, généralement entre environ -70 °C et environ -80 °C).
Le plasma ou sérum isolé peut être inactivé par la chaleur comme il est connu dans l’art, en particulier pour éliminer le complément. Lorsque le présent procédé utilise du plasma ou du sérum autologue aux cellules cultivées en présence de celles-ci, il peut être inutile d’inactiver par la chaleur le plasma ou le sérum. Lorsque le plasma ou le sérum est au moins partiellement allogénique pour les cellules cultivées, il peut être avantageux d’inactiver par la chaleur le plasma ou le sérum.
Facultativement, le plasma ou sérum peut également être stérilisé avant conservation ou utilisation, en utilisant des filtres microbiologiques conventionnels, de préférence avec une taille de pore de 0,2 pm ou plus petite.
Le procédé de la présente invention peut utiliser du plasma ou du sérum qui est autologue pour des CSM ou d’autres types de cellules mis en contact avec celui-ci. Le terme « autologue » en référence à du plasma ou du sérum signifie que le plasma ou le sérum est obtenu à partir du même sujet que les CSM ou d’autres types de cellules à mettre en contact avec le plasma ou le sérum. Le procédé de la présente invention peut utiliser en outre du plasma ou du sérum qui est « homologue » ou « allogénique » pour des CSM ou d’autres types de cellules mis en contact avec ceux-ci, c’est-à-dire, obtenus à partir d’un ou plusieurs sujets (groupés) autres que le sujet à partir duquel les CSM ou d’autres types de cellules sont obtenues. Le procédé de la présente invention peut également utiliser un mélange de plasma autologue et homologue (allogénique) ou de sérums tels que définis ci-dessus.
Il est décrit en outre des procédés pour différencier des CSM adultes in vitro ou ex vivo en ostéoprogéniteurs ou cellules ostéoblastiques ou une population de cellules comprenant des ostéoprogéniteurs et/ou des cellules ostéoblastiques, le procédé comprenant l’étape de culture desdites CSM dans un milieu comprenant du plasma ou du sérum et GDF-8. Comme illustré dans la section d’exemples, un procédé comprenant l’étape de culture de CSM dans un milieu comprenant du plasma ou du sérum et GDF-8 produit au moins partiellement les effets avantageux tels qu’obtenus avec les présents procédés comprenant l’étape de culture desdites CSM dans un milieu comprenant du plasma ou du sérum et GDF-8 et FGF-2.
Dans un mode de réalisation, les procédés de la présente invention comprennent les étapes consistant à : (a) laisser des cellules récupérées à partir d’un échantillon biologique d’un sujet et comprenant des CSM adhérer à une surface de substrat ; et (b) cultiver des cellules adhérentes dans un milieu comprenant du plasma ou du sérum, GDF-8 et FGF-2.
L’un quelconque des procédés de la présente invention peut facultativement comprendre l’étape d’isolement de cellules mononucléaires à partir des cellules récupérées à partir d’un échantillon biologique d’un sujet et comprenant des CSM avant de laisser les cellules mononucléaires ainsi isolées adhérer à la surface du substrat. L’isolement de cellules mononucléaires peut être effectué en utilisant des procédés conventionnels tels que, par exemple, la centrifugation à gradient de densité.
La culture de cellules, telles que, en particulier, des cellules adhérentes, est effectuée en présence d’un milieu, couramment un milieu de culture de cellules liquide. Typiquement, le milieu comprend une formulation de milieu basal telle que connue dans l’art. Un grand nombre de formulations de milieu basal (commercialisées, par exemple, par l’American Type Culture Collection, ATCC ; ou par Invitrogen, Carlsbad, Californie) peuvent être utilisées pour cultiver les cellules présentement, comprenant, mais non limitées à, le milieu essentiel minimal Eagle (MEM), le milieu Eagle modifié de Dulbecco (DMEM), le milieu essentiel minimal modifié alpha (alpha-MEM), le milieu de base essentiel (BME), BGJb, le mélange de nutriments F-12 (Ham), le milieu de Dulbecco modifié par Iscove (IMDM), commercialisé par Invitrogen ou Cambrex (New Jersey), et des modifications et/ou combinaisons de ceux-ci. Des compositions des milieux de base ci-dessus sont généralement connues dans l’art et il est dans la portée de l’homme du métier de modifier ou moduler des concentrations de milieux et/ou suppléments de milieux comme requis pour les cellules cultivées.
On peut laisser les cellules adhérer à une surface de substrat comme présentement décrit en présence dudit milieu.
De telles formulations de milieux de base contiennent des composants nécessaires pour le développement de cellules de mammifère, qui sont connus en tant que tel. A titre d’illustration et non de limitation, ces composants peuvent comprendre des sels inorganiques (en particulier des sels contenant Na, K, Mg, Ca, Cl, P et éventuellement Cu, Fe, Se et Zn), des tampons physiologiques (par exemple, HEPES, bicarbonate), des nucléotides, des nucléosides et/ou des bases d’acide nucléique, le ribose, le désoxyribose, des acides aminés, des vitamines, des antioxydants (par exemple, le glutathion) et des sources de carbone (par exemple le glucose, le pyruvate de sodium, l’acétate de sodium), etc.
Pour utilisation en culture, des milieux de base peuvent être complétés avec un ou plusieurs composants supplémentaires. Par exemple, des suppléments additionnels peuvent être utilisés pour fournir aux cellules les oligo-éléments nécessaires et des substances pour croissance et expansion optimales. De plus, des suppléments d’antioxydant peuvent être ajoutés, par exemple, du ß-mercaptoéthanol. Bien que de nombreux milieux de base contiennent déjà des acides aminés, des acides aminés peuvent être supplémentés plus tard, par exemple, la L-glutamine, qui est connue pour être moins stable lorsqu’elle est en solution. Un milieu peut en outre être complété avec des composés antibiotiques et/ou antimycotiques, tels que, typiquement, des mélanges de pénicilline et de streptomycine, et/ou d’autres composés, exemplifiés mais non limités à, l’amphotéricine, l’ampicilline, la gentamicine, la bléomycine, l’hygromycine, la kanamycine, la mitomycine, l’acide mycophénolique, l’acide nalidixique, la néomycine, la nystatine, la paromomycine, la polymyxine, la puromycine, la rifampicine, la spectinomycine, la tétracycline, la tylosine, et la zéocine.
Des lipides et des vecteurs lipidiques peuvent également être utilisés pour supplémenter des milieux de culture de cellules. De tels lipides et vecteurs peuvent comprendre, mais ne sont pas limités à la cyclodextrine, le cholestérol, l’acide linoléique conjugué à l’albumine, l’acide linoléique et l’acide oléique conjugué à l’albumine, l’acide linoléique non conjugué, l’acide linoléique-oléique-arachidonique conjugué à l’albumine, l’acide oléique non conjugué et conjugué à l’albumine, entre autres. L’albumine peut de manière similaire être utilisée dans des formulations sans acide gras.
Du plasma ou du sérum peut également être compris dans lesdits milieux à une proportion (volume de plasma ou sérum/volume de milieu) entre environ 0,5 % et environ 30 %, de préférence entre environ 1 % et environ 15 %. Les présents procédés peuvent présenter des performances satisfaisantes avec des quantités relativement faibles de plasma ou de sérum, par exemple, environ 5 ou 10 % en volume ou au-dessous, par exemple environ 1, environ 2, environ 3 ou environ 4 % en volume, ce qui réduit avantageusement le coût ou permet de diminuer le volume de plasma ou de sérum qui doit être obtenu afin de cultiver les CSM.
Dans un mode de réalisation de la présente invention, les cellules (en particulier les cellules de (a)) peuvent être déposées pour adhérence entre 5 x 102 et 5 x 107 cellules/cm2, de préférence entre 5 x 103 et 5 x 105 cellules/cm2.
La cuve de culture peut présenter une surface en plastique pour permettre l’adhérence des cellules. La surface peut être une surface en verre ou peut être revêtue avec un matériau approprié conducteur pour l’adhérence et la croissance de cellules, par exemple, Matrigel(R), la laminine ou le collagène.
Les cellules peuvent être cultivées dans le milieu tel que défini dans (b) pendant une durée comprise entre environ 10 et environ 18 jours. Par exemple, les cellules peuvent être cultivées dans l’étape (b) ou dans les étapes (a) et (b) conjointement pendant une durée comprise entre environ 10 et environ lôjours, généralement entre environ 12 et 14jours. Sinon, les cellules peuvent être cultivées dans l’étape (b) ou dans l’étape (a) et (b) conjointement jusqu’à ce que leur confluence atteigne environ 60 % ou plus, ou environ 80 % ou plus, ou environ 90 % ou plus, ou même jusqu’à 100%.
Dans un mode de réalisation, après l’étape (b) le procédé peut comprendre la collecte des cellules ou population de cellules obtenues ainsi.
Dans un autre mode de réalisation, après l’étape (b) les cellules acquises peuvent être soumises à passage une ou plusieurs fois, par exemple une, deux, trois, quatre fois ou plus et de préférence, les cellules peuvent être soumises à passage une, deux ou trois fois, plus préférablement, une ou deux fois, encore plus préférablement, les cellules peuvent être soumises à passage une fois. Le nombre de passages désigne le nombre de fois qu’une population de cellules a été enlevée d’une cuve de culture et a subi une sous-culture, c’est-à-dire, un passage. Par exemple, un passage peut généralement comprendre le détachement de cellules en utilisant un chélateur d’ion bivalent (par exemple, EDTA ou EGTA) et/ou de la trypsine ou une protéase adaptée ; la remise en suspension des cellules détachées ; et le re-dépôt des cellules dans la même cuve de culture ou une nouvelle cuve de culture à une densité de cellules souhaitée.
Dans un mode de réalisation préféré, après l’étape (b), le procédé comprend en outre l’étape (c) de passage, en particulier une fois, et ensuite culture des cellules ou population de cellules de l’étape (b) dans le milieu tel que défini dans (b). Après cette étape (c), les cellules ou populations de cellules peuvent être collectées.
Dans l’étape de passage (c), les cellules sont de préférence déposées pour culture plus avant entre 5 x 101 et 5 x 106 cellules/cm2, de préférence entre 5 x 102 et 5 x 104 cellules/cm2, plus typiquement à environ 5 x 103 cellules/cm2.
Typiquement, les cellules sont en outre cultivées dans l’étape (c) pendant une durée comprise entre environ 3 et environ 18 jours. Cette durée permet une expansion satisfaisante des cellules.
Dans un autre mode de réalisation, les procédés de la présente invention comprennent les étapes consistant à : (a) laisser des cellules récupérées à partir d’un échantillon biologique d’un sujet et comprenant des CSM adhérer à une surface de substrat ; (b’) cultiver des cellules adhérentes dans un milieu comprenant du plasma ou du sérum et FGF-2 ; et (b”) cultiver ensuite les cellules adhérentes dans un milieu comprenant du plasma ou du sérum, GDF-8 et FGF-2.
Les cellules peuvent être cultivées dans le milieu tel que défini dans (b’) ou dans les étapes (a) et (b’) conjointement pendant une durée comprise entre environ 10 et environ 24 jours. Par exemple, les cellules peuvent être cultivées dans l’étape (b’) ou dans les étapes (a) et (b’) conjointement pendant une durée comprise entre environ 10 et environ 22 jours, généralement entre environ 14 et 21 jours. Sinon, les cellules peuvent être cultivées dans l’étape (b’) ou dans l’étape (a) et (b’) conjointement jusqu’à ce que leur confluence atteigne environ 60 % ou plus, ou environ 80 % ou plus, ou environ 90 % ou plus, ou même jusqu’à 100 %.
Les cellules peuvent être cultivées dans le milieu tel que défini dans (b”) pendant une durée comprise entre environ 1 jour et environ 10 jours. Par exemple, les cellules peuvent être cultivées dans l’étape (b”) pendant une durée comprise entre environ 2 jours et environ 8 jours, généralement entre environ 4 et 6 jours. Sinon, les cellules peuvent être cultivées dans l’étape (b”) jusqu’à ce que leur confluence atteigne environ 60 % ou plus, ou environ 80 % ou plus, ou environ 90 % ou plus, ou même jusqu’à 100 %.
Dans un autre mode de réalisation, le procédé de la présente invention comprend en outre entre l’étape (b’) et l’étape (b”) l’étape (c’) de passage des cellules et consistant à laisser les cellules adhérer à une surface de substrat. Dans l’étape (c’), les cellules peuvent être soumises à un passage une ou plusieurs fois, par exemple une, deux ou trois fois, de préférence, les cellules peuvent être soumises à un passage une ou deux fois.
Dans l’étape de passage (c’), les cellules sont de préférence déposées pour culture plus avant entre 5 x 101 et 5 x 106 cellules/cm2, de préférence entre 5 x 102 et 5 x 104 cellules/cm2, plus typiquement à environ 5 x 103 cellules/cm2.
Dans un autre mode de réalisation, après l’étape (b”) le procédé selon l’invention peut comprendre la collecte des cellules ou population de cellules obtenues ainsi.
Les procédés de la présente invention produisent des ostéoprogéniteurs ou des cellules ostéoblastiques ou une population de cellules comprenant des ostéoprogéniteurs et/ou des cellules ostéoblastiques, ayant des caractéristiques supérieures, telles que, en particulier, un taux d’expansion élevé et une faible expression de récepteur de complexe de surface cellulaire de CMH de classe II, lesdites cellules et populations de cellules sont adaptées pour des traitements prophylactiques ou thérapeutiques, par exemple pour implantation.
En conséquence, dans un autre aspect, l’invention concerne des ostéoprogéniteurs ou des cellules ostéoblastiques ou une population de cellules comprenant des ostéoprogéniteurs et/ou des cellules ostéoblastiques, pouvant être obtenus ou directement obtenus en utilisant les présents procédés tels que décrits ci-dessus.
Il est décrit en outre une population de cellules isolées comprenant des ostéoprogéniteurs ou des cellules ostéoblastiques ou une population de cellules comprenant des ostéoprogéniteurs et/ou des cellules ostéoblastiques pouvant être obtenus ou directement obtenus en utilisant les présents procédés tels que décrits ci-dessus.
Les ostéoprogéniteurs ou cellules ostéoblastiques ou la population de cellules définis comprenant des ostéoprogéniteurs et/ou des cellules ostéoblastiques réalisant les principes de l’invention présentent des caractéristiques, telles que, en particulier, un taux d’expansion élevé et une expression faible de récepteur de complexe de surface cellulaire de CMH de classe II, lesdites cellules et populations de cellules étant adaptées pour transplantation prophylactique ou thérapeutique.
En conséquence, les ostéoprogéniteurs ou cellules ostéoblastiques ou la population de cellules comprenant des ostéoprogéniteurs et/ou des cellules ostéoblastiques tels que présentement décrits, peuvent être utilisés pour administration autologue ou allogénique à des sujets ayant une maladie musculosquelettique (par exemple, telle que définie par ailleurs dans cette spécification). De préférence, des ostéoprogéniteurs ou cellules ostéoblastiques humains ou la population de cellules comprenant des ostéoprogéniteurs et/ou des cellules ostéoblastiques, peuvent être administrés à des sujet humains pour traiter des maladies musculosquelettiques.
Dans le présent contexte, une phrase telle que « un sujet nécessitant un traitement » comprend des sujets qui bénéficieraient du traitement d’une affection donnée, en particulier des maladies musculosquelettiques. De tels sujets peuvent comprendre, sans limitation, ceux qui ont été diagnostiqués avec ladite affection, ceux susceptibles de contracter ou développer ladite affection et/ou ceux chez qui ladite affection doit être prévenue.
Les termes « traiter » ou « traitement » couvrent à la fois le traitement thérapeutique d’une maladie ou affection déjà développée, telle que la thérapie de maladies musculosquelettiques déjà développées, ainsi que des mesures prophylactiques ou préventives, le but étant de prévenir ou réduire la probabilité d’incidence d’une affection indésirable, de manière à prévenir l’occurrence, le développement et la progression de maladies musculosquelettiques. Des résultats cliniques bénéfiques ou souhaités peuvent comprendre, sans limitation, l’atténuation d’un ou plusieurs symptômes ou un ou plusieurs marqueurs biologiques, la diminution de l’étendue de la maladie, l’état stabilisé (c’est-à-dire, sans aggravation) de la maladie, le retardement ou le ralentissement de la progression, l’amélioration ou la palliation de l’état pathologique, et similaire. « Traitement » peut également signifier la prolongation de la survie par rapport à la survie prévue sans recevoir aucun traitement.
Le terme « quantité efficace sur le plan prophylactique » désigne une quantité d’un composé actif ou agent pharmaceutique qui inhibe ou retarde chez un sujet l’apparition d’un trouble comme étant recherché par un chercheur, un vétérinaire, un médecin ou un autre clinicien. Le terme « quantité thérapeutiquement efficace » dans le présent contexte, désigne une quantité de composé actif ou d’agent pharmaceutique qui induit la réponse biologique ou médicinale chez un sujet qui est recherchée par un chercheur, un vétérinaire, un médecin ou un autre clinicien, qui peut comprendre entre autres l’atténuation des symptômes de la maladie ou affection étant traitée. Des procédés sont connu dans l’art pour déterminer des doses efficaces sur le plan thérapeutique et prophylactique pour les présents ostéoprogéniteurs ou cellules ostéoblastiques ou la population de cellules comprenant des ostéoprogéniteurs et/ou des cellules ostéoblastiques.
Dans un mode de réalisation de la présente invention, les ostéoprogéniteurs ou cellules ostéoblastiques ou la population de cellules comprenant des ostéoprogéniteurs et/ou des cellules ostéoblastiques, ou les autres types de cellules présentement envisagés, peuvent être différenciés des CSM d’un sujet chez lequel les ostéoprogéniteurs ou cellules ostéoblastiques ou la population de cellules comprenant des ostéoprogéniteurs et/ou des cellules ostéoblastiques, ou les autres types de cellules présentement envisagés, doivent être introduits (c’est-à-dire, des cellules autologues). Selon un autre mode de réalisation, qui peut être présentement disponible entre autres en raison de la faible expression de récepteur de complexe de surface cellulaire de CMH de classe II des présentes cellules, les ostéoprogéniteurs ou cellules ostéoblastiques ou la population de cellules comprenant des ostéoprogéniteurs et/ou des cellules ostéoblastiques, ou les autres types de cellules présentement envisagés, peuvent être différenciés à partir de CSM d’un ou plusieurs sujets autres que le sujet dans lequel les ostéoprogéniteurs ou cellules ostéoblastiques ou la population de cellules comprenant des ostéoprogéniteurs et/ou des cellules ostéoblastiques, ou les autres types de cellules présentement envisagés, doivent être introduits (c’est-à-dire, des cellules allogéniques).
Selon un autre aspect de la présente invention, les ostéoprogéniteurs ou cellules ostéoblastiques ou la population de cellules comprenant des ostéoprogéniteurs et/ou des cellules ostéoblastiques présentement définis peuvent être formulés dans et administrés sous la forme de compositions pharmaceutiques.
Selon un autre aspect de la présente invention, GDF-8 peut être formulé dans et administré sous forme de compositions pharmaceutiques. Lorsque des cellules dont l’immunogénicité doit être réduite par administration in vivo de GDF-8 doivent également être administrées à un sujet, de telles cellules peuvent être formulées de manière appropriée dans et administrées sous forme de compositions pharmaceutiques. Dans certains modes de réalisation, la même composition pharmaceutique peut comprendre à la fois GDF-8 et les cellules, tandis que dans d’autres modes de réalisation, GDF-8 et les cellules peuvent être inclus dans des compositions pharmaceutiques séparées. De plus, un matériau quelconque dont le risque de rejet doit être réduit par administration in vivo de GDF-8 peut être formulé de manière appropriée dans et administré sous forme de compositions pharmaceutiques. Dans certains modes de réalisation, la même composition pharmaceutique peut comprendre à la fois GDF-8 et le matériau, tandis que dans d’autre modes de réalisation, GDF-8 et le matériau peuvent être inclus dans des compositions pharmaceutiques séparées.
Les compositions pharmaceutiques comprendront typiquement les une ou plusieurs substances actives (par exemple, GDF-8, des cellules et/ou des matériaux) et un ou plusieurs véhicules/excipients pharmaceutiquement acceptables. Par exemple, des compositions pharmaceutiques peuvent typiquement comprendre les ostéoprogéniteurs ou cellules ostéoblastiques ou la population de cellules comprenant des ostéoprogéniteurs et/ou des cellules ostéoblastiques tels que décrits présentement en tant que substance active, et un ou plusieurs véhicules/excipients pharmaceutiquement acceptables. Dans le présent contexte, « véhicule » ou « excipient » comprend l’un quelconque et tous les solvants, diluants, tampons (tels que, par exemple, un soluté tamponné neutre ou un soluté tamponné par les phosphates), des solubilisants, des colloïdes, des milieux de dispersion, des véhicules, des charges, des agents chélateurs (tels que, par exemple, EDTA ou le glutathion), des acides aminés (tels que, par exemple, la glycine), des protéines, des délitants, des liants, des lubrifiants, des agents mouillants, des émulsifiants, des édulcorants, des colorants, des arômes, des aromatisants, des épaississants, des agents pour obtenir un effet de dépôt, des enrobages, des agents antifongiques, des conservateurs, des stabilisants, des antioxydants, des agents contrôlant la tonicité, des agents retardant l’absorption, et similaire. L’utilisation de tels milieux et agents pour des substances actives pharmaceutiques est connue dans l’art. De tels matériaux doivent être non toxiques et ne doivent pas interférer avec l’activité des cellules.
La nature précise du véhicule ou autre matériau dépendra de la voie d’administration. Par exemple, la composition peut être sous la forme d’une solution aqueuse acceptable par voie parentérale, qui est apyrogène et a un pH, une isotonicité et une stabilité. Pour des principes généraux en formulation médicinale, le lecteur est renvoyé au Handbook of Pharmaceutical Excipients 6eme édition 2009, éd. Rowe et al. ; Remington's Pharmaceutical Sciences, 18eme éd., Mack Publishing Co., Easton, PA (1990) ; Cell Therapy: Stem Cell Transplantation, Gene Therapy, and Cellular Immunotherapy, par G. Morstyn & W. Sheridan éd., Cambridge University Press, 1996 ; et Hematopoietic Stem Cell Therapy, E. D. Ball, J. Lister & P. Law, Churchill Livingstone, 2000.
De telles compositions pharmaceutiques peuvent contenir d’autres composants assurant la viabilité des cellules dans celles-ci. Par exemple, les compositions peuvent comprendre un système tampon adapté (par exemple, un système tampon phosphate ou carbonate) pour obtenir un pH souhaitable, le plus souvent à proximité du pH neutre, et peut comprendre suffisamment de sel pour assurer des conditions iso-osmotiques pour les cellules afin de prévenir un stress osmotique. Par exemple, une solution adaptée pour ces applications peut être un soluté tamponné par les phosphates (PBS), une solution de chlorure de sodium, le liquide pour injection de Ringer ou le liquide pour injection de Ringer-lactate, comme il est connu dans l’art. De plus, la composition peut comprendre une protéine vectrice, par exemple, l’albumine, qui peut augmenter la viabilité des cellules.
Les compositions pharmaceutiques selon la présente invention peuvent comprendre en outre d’autres composants ayant des propriétés ostéogéniques (formant un os par eux-mêmes), ostéo-inductrices et/ou ostéoconductrices.
Le terme « ostéo-inducteur » désigne la capacité d’un composant tel qu’un facteur de croissance peptidique à recruter des cellules immatures telles que des cellules souches, des CSM et stimuler ces cellules pour se différencier en pré-ostéoblastes et ostéoblastes matures, de manière à former du tissu osseux. Les compositions pharmaceutiques peuvent comprendre en outre un composant ayant des propriétés ostéo-inductrices telles qu’une protéine ou un peptide ostéo-inducteur, par exemple une protéine morphogénétique osseuse, telle que BMP-2, BMP-7 ou BMP-4 ; un hydrogel ou un biopolymère tel que le collagène, l’acide hyaluronique ou des dérivés de celui-ci, l’ostéonectine, le fibrinogène, ou l’ostéocalcine. De préférence, les compositions pharmaceutiques peuvent comprendre en outre de l’acide hyaluronique ou des dérivés de celui-ci, du collagène ou du fibrinogène.
Le terme « ostéoconducteur » désigne la capacité d’un composant à servir d’échafaudage sur lequel des cellules osseuses peuvent se fixer, migrer, croître et produire du nouvel os. Les compositions pharmaceutiques peuvent comprendre en outre un composant ayant des propriétés ostéoconductrices, par exemple, un échafaudage ou matrice ou surface ostéoconducteur tel que, sans limitation, du phosphate tricalcique, de l’hydroxyapatite, une combinaison de particules de d’hydroxyapatite/phosphate tricalcique (HA/TCP), la gélatine, le poly(acide lactique), le poly(acide lactique-acide glycolique), l’acide hyaluronique, le chitosan, la poly-L-lysine, ou le collagène.
Les compositions pharmaceutiques selon la présente invention peuvent, comme mentionné ci-dessus, comprendre des composants utiles dans la réparation de plaies et défauts osseux. Les compositions pharmaceutiques peuvent comprendre un échafaudage ou une matrice ayant des propriétés ostéoconductrices. Les ostéoprogéniteurs ou cellules ostéoblastiques ou la population de cellules comprenant des ostéoprogéniteurs et/ou des cellules ostéoblastiques peuvent être combinés avec de la matrice osseuse déminéralisée (DBM) ou d’autres matrices pour rendre le composite ostéogénique ainsi qu’ostéoconducteur et ostéo-inducteur. Des procédés similaires utilisant des cellules de moelle osseuse autologues avec de la DBM allogénique ont donné de bons résultats (Connolly et al. 1995. Clin Orthop 313: 8-18).
Les compositions pharmaceutiques selon la présente invention peuvent comprendre en outre ou être co-administrées avec un facteur bioactif complémentaire ou une protéine ostéo-inductrice telle qu’une protéine morphogénétique osseuse, telle que BMP-2, BMP-7 ou BMP-4, ou un autre facteur de croissance quelconque. D’autres composants auxiliaires potentiels comprennent des sources inorganiques de calcium ou de phosphate adaptées pour favoriser la régénération osseuse (WO 00/07639). Le cas échéant, une préparation de cellules peut être administrée sur une matrice ou un matériau de support pour produire une régénération de tissu améliorée. Par exemple, le matériau peut être un hydrogel, ou un biopolymère tel que la gélatine, le collagène, l’acide hyaluronique ou des dérivés de ceux-ci, l’ostéonectine, le fibrinogène, ou l’ostéocalcine. Des biomatériaux peuvent être synthétisés selon des techniques standard (par exemple, Mikos et al., Biomaterials 14:323, 1993 ; Mikos et al., Polymer 35:1068, 1994 ; Cook et al., J. Biomed. Mater. Res. 35:513, 1997).
Sans limitation, suivant le type et la gravité de la maladie, une dose journalière typique de GDF-8 peut être dans la plage d’environ 1 ng/kg à 100 mg/kg de poids corporel ou plus. Pour des administrations répétées sur plusieurs jours ou plus, suivant la condition, le traitement est prolonge jusqu’à ce qu’une suppression souhaitée des symptômes pathologiques survienne. Une dose préférée de GDF-8 peut être dans la plage d’environ 10 ng/kg à environ 10mg/kg de poids corporel. Par conséquent, une ou plusieurs doses d’environ 10 ng/kg, 100 ng/kg, 500 ng/kg, 1 mg/kg ou 10 mg/kg (ou une combinaison quelconque de celles-ci) peuvent être administrées au patient. De telles doses peuvent être administrées de façon intermittente, par exemple, chaque semaine ou toutes les deux ou trois semaines.
Sans limitation, une dose typique de, par exemple, la composition de cellules à administrer peut être dans la plage d’environ 0,05 x 106 cellules à 5 x 109 cellules par injection. Par exemple, la dose à administrer peut être dans la plage d’environ 0,5 x 106 cellules à 1 x 109 cellules par injection. De préférence, la dose à administrer est dans la plage d’environ 4 x 106 cellules à 250 x 10 cellules par injection.
Dans le présent contexte le terme « implant » désigne généralement des dispositifs médicaux fabriqués pour remplacer une structure biologique manquante, soutenir ou compléter une structure endommagée, ou renforcer une structure biologique existante. Des implants, tels que présentement décrits, peuvent comprendre un/des composant(s) biologique(s), tels que des cellules et/ou des tissus. Des implants médicaux exemplaires comprennent, par exemple, des aiguilles, des tiges, des vis, des plaques et d’autres structures utilisées en chirurgie osseuse et cicatrisation osseuse.
Le terme « greffe » désigne généralement du tissu biomédical transplante, par exemple, comprenant un organe, un tissu, ou des cellules.
En variante ou en outre, les cellules CSM ou les présents ostéoprogéniteurs ou cellules ostéoblastiques ou la population de cellules comprenant des ostéoprogéniteurs et/ou des cellules ostéoblastiques, ou d’autres types de cellules présentement envisagés, peuvent être transformés de façon stable ou transitoire avec un acide nucléique d’intérêt avant administration au sujet. Les séquences d’acide nucléique d’intérêt comprennent, mais ne sont pas limitées à celles codant pour des produits géniques qui augmentent plus avant la croissance, la différenciation et/ou la minéralisation de populations de cellules ostéoblastiques. Par exemple, un système d’expression pour BMP-2, peut être introduit dans les CSM d’une façon stable ou transitoire dans le but de traiter des fractures non cicatrisées ou l’ostéoporose. Des procédés de transformation de CSM et d’ostéoprogéniteurs ou cellules ostéoblastiques ou une population de cellules comprenant des ostéoprogéniteurs et/ou des cellules ostéoblastiques sont connus de l’homme du métier.
Il est décrit en outre des procédés de production desdites compositions pharmaceutiques par mélange des cellules ou d’autres substances pharmaceutiquement actives de l’invention avec un ou plusieurs composants additionnels tels que décrits ci-dessus ainsi qu’avec un ou plusieurs excipients pharmaceutiques tels que décrits ci-dessus.
La présente invention concerne en outre un agencement ou kit de composants comprenant un instrument ou dispositif chirurgical pour administration des ostéoprogéniteurs ou des cellules ostéoblastiques ou de la population de cellules comprenant des ostéoprogéniteurs et/ou des cellules ostéoblastiques, ou d’autres types de cellules, tels que présentement décrits ou les compositions pharmaceutiques telles que présentement définies à un sujet, tel que, par exemple, de façon systémique ou localement, par exemple à un site de lésion musculosquelettique, par exemple, par injection, et comprenant en outre les ostéoprogéniteurs ou cellules ostéoblastiques ou la population de cellules comprenant des ostéoprogéniteurs et/ou des cellules ostéoblastiques, ou d’autres types de cellules, tels que présentement décrits ou les compositions pharmaceutiques telles que présentement définies.
Par exemple mais sans limitation, un tel agencement ou kit de composants peut comprendre : un flacon avec des ostéoprogéniteurs ou des cellules ostéoblastiques ou une population de cellules comprenant des ostéoprogéniteurs et/ou des cellules ostéoblastiques, ομ d’autres types de cellules, pouvant être obtenus avec les présents procédés ou un flacon comprenant les ostéoprogéniteurs ou cellules ostéoblastiques ou la population de cellules comprenant des ostéoprogéniteurs et/ou des cellules ostéoblastiques, ou d’autres types de cellules, comme présentement prévu ; et un dispositif pour administrer lesdits ostéoprogéniteurs ou cellules ostéoblastiques ou la population de cellules comprenant des ostéoprogéniteurs et/ou des cellules ostéoblastiques, ou d’autres types de cellules, à un sujet et ayant des moyens de reservoir pour stocker lesdits osteoprogemteurs ou cellules ostéoblastiques ou la population de cellules comprenant des ostéoprogéniteurs et/ou des cellules ostéoblastiques, ou d’autres types de cellules, des moyens de piston mobiles le long de l’axe longitudinal du réservoir pour distribuer lesdits ostéoprogéniteurs ou cellules ostéoblastiques ou la population de cellules comprenant des ostéoprogéniteurs et/ou des cellules ostéoblastiques, ou d’autres types de cellules, et une aiguille creuse installée sur lesdits moyens de réservoir pour administrer lesdits ostéoprogéniteurs ou cellules ostéoblastiques ou la population de cellules comprenant des ostéoprogéniteurs et/ou des cellules ostéoblastiques, ou d’autres types de cellules, au sujet.
Les ostéoprogéniteurs ou cellules ostéoblastiques ou la population de cellules comprenant des ostéoprogéniteurs et/ou des cellules ostéoblastiques, ou d’autres types de cellules, peuvent être administrés d’une manière qui leur permet de se greffer à ou de migrer vers le site tissulaire prévu et reconstituer ou régénérer la zone fonctionnellement déficiente. L’administration de la composition dépendra du site musculosquelettique étant réparé. Par exemple, l’ostéogenèse peut être facilitée concomitamment avec une procédure chirurgicale pour remodeler du tissu ou insérer un dédoublement, ou un dispositif prosthétique, tel qu’une prothèse de la hanche. Dans d’autres circonstances, une chirurgie invasive n’est pas requise, et la composition peut être administrée par injection ou (par exemple, pour une réparation de la colonne vertébrale) en utilisant un endoscope guidable.
Dans un mode de réalisation, la préparation de cellules telle que définie ci-dessus peut être administrée sous la forme de composition liquide ou visqueuse. Dans des modes de réalisation, les cellules ou une composition pharmaceutique comprenant celles-ci peuvent être administrées de façon systémique, topique ou à un site de lésion.
Dans un autre mode de réalisation, les cellules ou populations de cellules peuvent être transférées vers et/ou cultivées sur un substrat adapté pour produire des implants. Le substrat sur lequel les cellules peuvent être appliquées et cultivées peut être un métal, tel que le titane, un alliage cobalt/chrome ou de l’acier inoxydable, une surface bioactive telle qu’un phosphate de calcium, des surfaces en polymère telles que le polyéthylène, et similaire. Bien que cela soit moins préféré, un matériau siliceux tel que des céramiques vitreuses, peut également être utilisé en tant que substrat. Il est préféré entre tous des métaux, tels que des phosphates de titane, et de calcium, bien que le phosphate de calcium ne soit pas un composant indispensable du substrat. Le substrat peut être poreux ou non poreux.
Par exemple, des cellules qui ont proliféré, ou qui sont différenciées dans des boîtes de culture, peuvent être transférées sur des supports solides tridimensionnels afin de les amener à se multiplier et/ou continuer le processus de différenciation par incubation du support solide dans un milieu de nutriment liquide de l’invention, si nécessaire. Les cellules peuvent être transférées sur un support solide tridimensionnel, par exemple par imprégnation dudit support avec une suspension liquide contenant lesdites cellules. Les supports imprégnés obtenus de cette manière peuvent être implantés chez un sujet humain. De tels supports imprégnés peuvent également être recultivés par immersion de ceux-ci dans un milieu de culture liquide, avant d’être finalement implantés.
Le support solide tridimensionnel doit être biocompatible de manière à permettre qu’il soit implanté chez un humain. Il peut être d’une forme adaptée quelconque telle qu’un cylindre, une sphère, une plaque, ou une pièce de forme arbitraire. Parmi les matériaux adaptés pour le support solide tridimensionnel biocompatible, il peut être mentionné particulièrement le carbonate de calcium, et en particulier l’aragonite, spécifiquement sous la forme de squelette de corail, de céramiques poreuses à base d’alumine, d’oxyde de zirconium, on de phosphate tricalcique, et/ou d’hydroxyapatite, d’un squelette d’imitation de corail obtenu par échange hydrothermique permettant que du carbonate de calcium soit transformé en hydroxyapatite, ou sinon de céramiques vitreuses d’apatite-wollastonite, de céramiques vitreuses bioactives telles que des verres Bioglass™.
Bien que l’invention ait été décrite en référence à des modes de réalisation spécifiques de celle-ci, il est évident que de nombreuses variantes, modifications, et variations apparaîtront à l’homme du métier à la lecture de la description ci-dessus. En conséquence, elle est destinée à couvrir toutes ces variantes, modifications, et variations comme étant dans l’esprit et la portée générale des revendications annexées.
Les aspects et modes de réalisation ci-dessus sont en outre illustrés par les exemples non limitatifs suivants.
EXEMPLES
Exemple 1 : culture de cellules de sujets
De la moelle osseuse est collectée à partir de la crête iliaque de donneurs sains humains. De la moelle osseuse héparinée est soumise à un fractionnement sur une solution à gradient de densité (plaque Ficoll™ Premium, GE Healthcare). La solution à gradient de densité permet la purification de cellules mononucléaires (CMN). Les CMN sont ensuite déposées sur plaque à une densité comprise entre 5 x 103 et 5 x 105 cellules/cm2. Les cellules sont cultivées dans du milieu de culture en présence de sérum et FGF-2. Les cultures primaires sont maintenues pendant 10 à 18 jours en culture, avec un changement de milieu total entre le jour 1 et le jour 5, et changement périodique par la suite. Pendant la culture primaire, les cellules hématopoïétiques non adhérentes sont prélevées par l’intermédiaire du changement de milieu, et les cellules d’origine mésenchymateuse acquièrent une morphologie similaire aux fibroblastes. Après culture primaire, les cellules d’origine mésenchymateuse sont collectées par traitement avec de la trypsine, et redéposees sur plaque pour culture secondaire de cellules. La culture secondaire est effectuée pendant une durée de 3 jours à 18 jours.
Exemple 2 : culture de cellules dans du milieu comprenant du sérum, GDF-8 et FGF-2 à partir de culture de cellules primaire
Après Ficoll, les cellules CMN sont cultivées pendant la culture primaire comme décrit dans l’exemple 1, mais en présence de GDF-8 (myostatine humaine recombinante, Peprotech) ou en l’absence de GDF-8 (témoin). À confluence, les cellules de culture primaire sont soumises à passage, redéposées sur plaque pour culture secondaire à différentes densités et cultivées en présence de GDF-8 (GDF-8) ou en l’absence de GDF-8 (témoin). La concentration de GDF-8 utilisée est comprise entre 1 et 100 ng/ml.
À la fin de la culture, les cellules sont caractérisées par leurs prolifération, phénotype (FACS), sécrétion de protéine (IL6, VEGF, décorine, ostéoprotégérine), capacité de minéralisation et activité ALP enzymatique.
Effet sur le rendement de culture
Afin d’évaluer l’impact sur la croissance cellulaire de la culture des cellules de culture primaire dans un milieu comprenant du sérum, FGF-2 et GDF-8, le rendement de culture global de culture primaire et secondaire est déterminé pour des cellules cultivées en présence de GDF-8 (GDF-8) ou en l’absence de GDF-8 (témoin).
Le rendement de culture est déterminé comme suit : nombre de cellules collectées à la fin de culture ou traitement avec facteur de croissance divisé par nombre de cellules déposées sur plaque pour culture. La viabilité des cellules est évaluée par un procédé d’exclusion au bleu Trypan et le nombre de cellules est déterminé par comptage de la suspension de cellules dans une chambre Bürker.
Les rendements de culture primaire et secondaire représentent la prolifération cellulaire pendant les cultures de cellules primaire et secondaire, respectivement.
Les données moyennes sont présentées dans le tableau 1 et la figure 1. Les rendements de culture montrent que la culture de cellules dans un milieu comprenant du sérum, FGF-2 et GDF-8 augmentent la prolifération cellulaire par rapport à une culture de cellules dans un tel milieu sans GDF-8 (tableau 1, figure 1).
Tableau 1 : rendements moyens de culture de cellules (%) après culture de cellules en présence de GDF-8 (GDF-8), en l’absence de GDF-8 (témoin) ou en présence de TGF-bêta 1 (TGF-bêta 1)
Afin de caractériser les cellules, le phénotype cellulaire est déterminé en utilisant l’analyse FACS après détachement des cellules. Les marqueurs mesurés sont CD45 (marqueur hématopoïétique), CD 105 (marqueur mésenchymateux), ALP (marqueur ostéogénique) et HLA-DR (marqueur immunogène).
Le phénotype cellulaire est déterminé par analyse FACS en utilisant des anticorps contre CD45, CD105, ALP et HLA-DR, couplés avec l’isothiocyanate de fluorescéine (FFTC), la phycoérythrine (PE), ou l’allophycocyanine (APC) de BD Biosciences (anti-CD45, anti-CD105, anti-HLA-DR) et R&D Systems (anti-ALP). Les cellules sont analysées avec le cytomètre de flux BD FACS Canto II (Becton Dickinson). L’expression des marqueurs est exprimée en pourcentage, c’est-à-dire, sous la forme du nombre de cellules exprimant le marqueur divisé par le nombre total de cellules évalué par FACS.
Les données moyennes sont présentées dans le tableau 2 et les figures 2 et 3. Les données montrent que la culture de cellules en présence de GDF-8 diminue l’expression de HLA-DR par rapport au témoin (tableau 2 et figure 2). Les résultats montrent en outre que la culture de cellules en présence de GDF-8 maintient un niveau élevé d’expression d’ALP par opposition à une culture de cellules en présence de TGF-bêta 1 (tableau 2 et figure 3).
Les résultats montrent également que la culture de cellules en présence de GDF-8 maintient une expression similaire du marqueur hématopoïétique CD45 (tableau 2), du marqueur mésenchymateux CD105 (tableau 2), et des autres marqueurs d’immunogénicité CD28/ CD80/CD83/CD86 (résultats non présentés) par rapport à des cellules témoins cultivées en l’absence de GDF-8.
Tableau 2 : expression de marqueurs (%) après culture de cellules en présence de GDF-8 (GDF-8), en l’absence de GDF-8 (témoin) ou en présence de TGF-bêta 1 (TGF-bêta 1)
Sécrétion de marqueurs dans le surnageant
La sécrétion de protéine est étudiée pour évaluer l’implication ostéoblastique de cellules et leur capacité à recruter des cellules impliquées dans la réparation osseuse. La sécrétion de protéine est étudiée par ELISA. Plus particulièrement, les surnageants de culture sont collectés après culture pour évaluer la production de IL6 et VEGF (recrutement cellulaire), et de décorine et d’ostéoprotégérine (protéines de matrice osseuse et facteurs osseux).
La sécrétion de IL6, VEGF, décorine et ostéoprotégérine est évaluée dans des surnageants de culture collectés à chaque changement de milieu. Les essais sont effectués conformément aux instructions du fabricant (R&D Systems kit ELISA IL6 humain n° DY206, R&D Systems kit ELISA VEGF humain n° DY293b, R&D Systems kit ELISA décorine humaine n° DY143, R&D Systems kit ELISA ostéoprotégérine humaine n° DY805). L’absorbance est mesurée avec un lecteur de plaque Multiskan à 450 nm.
Les données moyennes sont présentées dans le tableau 3 et sur la figure 4. Les taux de IL6, VEGF, décorine et ostéoprotégérine (OPG) dans les cultures GDF-8 sont similaires à ceux du témoin ou ceux des cultures de TGF-bêta 1 (tableau 3 et figure 4).
Tableau 3 : sécrétion de protéines dans le surnageant après culture de cellules en présence de GDF-8 (GDF-8), en l’absence de GDF-8 (témoin) ou en présence de TGF-bêta 1 (TGF-bêta 1)
Minéralisation de cultures secondaire et tertiaire
La minéralisation est utilisée pour évaluer la capacité de cellules à former une matrice minéralisée. A cette fin, les cellules sont déposées à la fin de la culture secondaire dans une plaque de 24 puits à une densité comprise entre de 5 x 103 et 5 x 104 cellules/cm2 et cultivées dans du milieu comprenant du sérum, FGF-2 et GDF-8 (FGF-2/GDF-8) ou dans un tel milieu sans GDF-8 (FGF-2) ou dans un milieu comprenant du sérum, FGF-2 et TGF-bêta 1 (FGF-2/TGF-bêta 1). Le jour suivant, la minéralisation est induite par remplacement du milieu de culture par du milieu ostéogénique, c’est-à-dire alpha-MEM supplémenté avec 15 % de FBS, 1 % de pénicilline/streptomycine, bêta-glycérophosphate (10 mM), acide ascorbique (vitamine C) (50 pg/ml), et dexaméthasone (10'8 M).
Le milieu témoin est constitué d’alpha-MEM supplémenté avec 15% de FBS et 1% de pénicilline/streptomycine. Après 3 semaines de culture, les cellules sont fixées dans 4 % de paraformaldéhyde/PBS et colorées avec le rouge d’alizarine S qui colore des dépôts de calcium inorganique. Finalement, la capacité de minéralisation est évaluée par un score semi-quantitatif dans la plage de zéro pour toute minéralisation observée à 2,5 pour la minéralisation maximale observée.
La minéralisation est observée dans toutes les conditions de culture comprenant du sérum, FGF-2 et GDF-8 (FGF-2/GDF-8) ou FGF-2 et TGFß-1 (FGF-2/TGF-bêta 1) comparées à des conditions sans GDF-8 (FGF-2) (tableau 4 et figure 5). Par conséquent, GDF-8 ne semble pas altérer la capacité de minéralisation de cellules cultivées selon un procédé illustrant la présente invention.
Tableau 4 : scores semi-quantitatifs de minéralisation après culture de cellules en présence de GDF-8 (GDF-8), en l’absence de GDF-8 (témoin) ou en présence de TGF-bêta 1 (TGF-bêta 1)
Activité phosphatase alcaline
L’activité de la phosphatase alcaline, une enzyme clé dans la formation de matrice osseuse, est déterminée par un dosage biochimique basé sur l’hydrolyse du groupe phosphate d’un substrat synthétique phosphate de p-nitrophényle (pNPP) et détection du produit de réaction à 415 nm. L’activité enzymatique ALP des cellules est déterminée par comparaison à une courbe d’étalonnage basée sur l’activité de phosphatase alcaline intestinale de veau purifiée. L’activité ALP est exprimée en unités d’ALP/mg de protéine. La teneur en protéine est déterminée par le dosage de Bradford. Une unité d’ALP hydrolyse 1 pmole de pNPP par min à 37 °C.
Les cellules cultivées en présence de GDF-8 semblent avoir une activité ALP plus élevée (tableau 5). Ces résultats corroborent l’analyse FACS (tableau 2).
Tableau 5 : activité enzymatique de phosphatase alcaline (ALP) après culture de cellules en présence de GDF-8 (GDF-8), en l’absence de GDF-8 (témoin) ou en présence de TGF-bêta 1 (TGF-bêta 1)
Les observations non limitatives suivantes peuvent être faites :
La culture de cellules de culture primaire dans un milieu comprenant du sérum, FGF-2 et GDF-8 stimule la prolifération cellulaire par rapport à une culture de cellules dans un tel milieu sans GDF-8.
La culture de cellules de culture primaire dans un milieu comprenant du sérum, FGF-2 et GDF-8 diminue l’expression de HLA-DR. Par conséquent, GDF-8 réduit l’immunogénicité de cellules.
Des cellules cultivées dans un milieu comprenant du sérum, FGF-2 et GDF-8 présentent un phénotype ostéogénique similaire à des cellules cultivées témoins dans un tel milieu sans GDF-8. La culture de cellules dans un milieu comprenant du sérum, FGF-2 et GDF-8 ne semble pas affecter l’expression d’ALP pendant la culture. De plus, la culture de cellules dans un milieu comprenant du sérum, FGF-2 et GDF-8 n’affecte pas la sécrétion de protéines de matrice osseuse telles que la décorine et l’ostéoprotégérine et de protéines impliquées dans le recrutement de cellules telles que VEGF. De plus, les cellules cultivées dans un milieu comprenant du sérum, FGF-2 et GDF-8 sont capables de synthétiser une matrice minéralisée.
Exemple 3 : culture de cellules dans du milieu comprenant du sérum, GDF-8 et FGF-2 à partir de culture tertiaire
Afin d’explorer l’effet de la culture de cellules dans un milieu comprenant du sérum, FGF-2 et GDF-8 sur des cellules cultivées pendant des cultures primaires et secondaires avec FGF-2 comme décrit dans l’exemple 1, les cellules sont déposées dans une plaque de 6 puits pour culture tertiaire et laissées pendant 24 heures pour permettre la fixation à la surface de substrat. Le jour suivant, les cellules sont cultivées dans du milieu comprenant du sérum et FGF-2 et en présence de GDF-8 (GDF-8) ou en l’absence de GDF-8 (témoin).
Phénotype cellulaire après 4 jours de culture
Le phénotype de cellules cultivées de culture tertiaire pendant 4 jours dans du milieu comprenant du sérum, FGF-2 et GDF-8, est mesuré par FACS comme décrit présentement. L’expression des marqueurs est présentée en pourcentage de cellules positives, c’est-à-dire sous la forme du nombre de cellules exprimant le marqueur divisé par le nombre total de cellules déposées sur plaque pour culture. L’expression du marqueur hématopoïétique CD45 et du marqueur mésenchymateux CD 105 est similaire dans toutes les conditions (tableau 6 et figure 6). Comme décrit dans le tableau 6 et la figure 6, l’expression de HLA-DR est plus faible après culture de cellules de culture tertiaire pendant 4 jours dans du milieu comprenant du sérum, FGF-2 et GDF-8 par rapport à une culture de cellules de culture tertiaire pendant 4 jours dans du milieu comprenant du sérum, FGF-2 et TGF-bêtal. En conclusion, l’utilisation d’un procédé illustrant la présente invention peut avantageusement améliorer les caractéristiques des cellules obtenues ou populations de cellules.
Tableau 6 : expression de marqueurs (%) avant et après culture de cellules pendant 4 jours en présence de GDF-8 (GDF-8), en l’absence de GDF-8 (témoin) ou en présence de TGF-bêta 1 (TGF-bêta 1)
Phénotype cellulaire après 6 jours de culture avec différentes concentrations de GDF-8
Les cellules sont également cultivées à partir de culture tertiaire pendant 6 jours dans du milieu comprenant du sérum, FGF-2 et GDF-8, GDF-8 étant présent dans le milieu à des doses croissantes de 50 ng/ml, 100 ng/ml ou 200 ng/ml.
Le phénotype de cellules cultivées à partir de culture tertiaire pendant 6 jours dans du milieu comprenant du sérum, FGF-2 et GDF-8, est analysé par FACS comme décrit présentement. L’expression des marqueurs est présentée en pourcentage de cellules positives, c’est-à-dire sous la forme du nombre de cellules exprimant le marqueur divisé par le nombre total de cellules déposées sur plaque pour culture.
Dans toutes les conditions de culture de cellules de culture tertiaire pendant 6 jours dans du milieu comprenant du sérum, FGF-2 et GDF-8, l’expression de HLA-DR est plus faible que dans les conditions témoins. De plus, l’expression de HLA-DR semble diminuer avec des concentrations croissantes de GDF-8 (tableau 7 et figure 7).
Tableau 7 : expression de marqueurs (%) après culture de cellules pendant 6 jours en présence de GDF-8 (GDF-8), en l’absence de GDF-8 (témoin) ou en présence de TGF-bêta 1 (TGF-bêta 1)
Les observations non limitatives suivantes peuvent être faites :
La culture de cellules de culture tertiaire dans un milieu comprenant du sérum, FGF-2 et GDF-8, induit une diminution de l’expression de HLA-DR par les cellules. La diminution de l’expression de HLA-DR est plus prononcée avec des concentrations plus élevées de GDF-8.
Exemple 4 : culture de cellules dans du milieu comprenant du sérum et GDF-8 à partir de culture primaire
Des cellules de moelle osseuse sont cultivées dans un milieu comprenant (1) du sérum, FGF-2 et GDF-8 ou (2) du sérum et GDF-8. Après culture primaire, les cellules sont soumises à passage et re-dépôt sur plaque pour culture secondaire dans des milieux correspondants. La concentration de GDF-8 utilisée est de 100 ng/ml. À la fin de la culture, les cellules sont caractérisées par leur prolifération et phénotype (FACS).
Effet sur le rendement de culture
Les rendements de culture sont déterminés par numération cellulaire. Les données sont présentées dans le tableau 8 et la figure 8. Les données montrent que les rendements de culture sont diminués en l’absence de FGF-2 dans le milieu par rapport à la culture en présence de FGF-2 avec ou sans GDF-8.
Tableau 8 : rendements de culture globaux (%) après culture de cellules de cultures primaires dans du milieu contenant GDF-8 avec où sans FGF-2
Dans des essais additionnels du même type, le nombre d’échantillons a été augmenté, pour obtenir les résultats présentés dans le tableau 9.
Tableau 9 : rendements de culture globaux moyens (%) après culture de cellules de cultures primaires dans du milieu contenant GDF-8 avec ou sans FGF-2
Expression de HLA-DR et ALPpar FACS
Le phénotype cellulaire après culture primaire et secondaire est déterminé par analyse FACS comme décrit dans l’exemple 2. L’expression des marqueurs ALP et HLA-DR est exprimée en pourcentage de cellules positives. Les niveaux d’expression d’ALP dans des cultures primaires comprenant GDF-8 sont similaires dans des cultures en présence ou en l’absence de FGF-2, tandis que dans des cultures secondaires, une diminution de l’expression ri’ALP est observée dans des cultures comprenant FGF-2 par rapport à des cultures sans FGF-2 (tableau 10 et figure 9). Les cultures dans des milieux comprenant GDF-8 présentent une diminution de l’expression de HLA-DR, avec ou sans FGF-2, par rapport à des cultures dans du milieu comprenant FGF-2 sans GDF-8. La diminution est plus prononcée en présence de GDF-8 et FGF-2 (tableau 10 et figure 10).
Tableau 10 : expression de marqueurs (%) après culture de cellules dans du milieu comprenant FGF-2 (témoin) ou dans du milieu comprenant GDF-8 avec ou sans FGF-2
Dans des essais additionnels du même type, le nombre d’échantillons a été augmenté, pour obtenir les résultats présentés dans le tableau 11.
Tableau 11 : expression de marqueurs (%) après culture de cellules dans du milieu comprenant FGF-2 (témoin) ou dans du milieu comprenant GDF-8 avec ou sans FGF-2
Les observations non limitatives suivantes peuvent être effectuées :
Comme prévu, l’absence du facteur de croissance FGF-2 dans du milieu de culture de cellules diminue le rendement de culture primaire et secondaire, mais n’affecte pas la diminution de l’expression de HLA-DR des cellules. La présence de GDF-8 dans du milieu de culture de cellules peut induire la différenciation ostéoblastique de CSM avec un profil de faible immunogénicité, indépendamment de la présence de FGF-2.
Collectivement, les exemples ci-dessus montrent que la culture de cellules dans un milieu comprenant du sérum, FGF-2 et GDF-8 augmente la croissance de cellules, diminue l’expression de HLA-DR et ne réduit pas la différenciation ostéogénique par rapport à une culture de cellules de culture primaire dans un tel milieu sans GDF-8. En particulier, la culture de cellules de culture primaire dans un milieu comprenant du sérum, FGF-2 et GDF-8 ne modifie pas l’expression d’ALP et l’expression de protéines de matrice osseuse telles que la décorine et l’ostéoprotégérine ou de protéines impliquées dans le recrutement de cellules telles que VEGF.
De plus, les exemples ci-dessus montrent que la culture de cellules de culture tertiaire dans un milieu comprenant du sérum, FGF-2 et GDF-8 n’a aucun effet sur l’expression d’ALP par rapport à une culture de cellules de culture primaire dans un tel milieu sans GDF-8. Avantageusement, il a été observé qu’une culture de cellules de culture secondaire ou tertiaire dans un milieu comprenant du sérum, FGF-2 et GDF-8 diminue l’expression de HLA-DR, en particulier pour des traitements plus longs par rapport à une culture de cellules de culture primaire dans un tel milieu sans GDF-8.
Exemple 5 : culture de cellules dans du milieu comprenant GDF-8
De la moelle osseuse est collectée à partir de la crête iliaque de donneurs sains humains. De la moelle osseuse est soumise à un fractionnement sur une solution à gradient de densité (plaque
Ficoll™ Premium, GE Healthcare). La solution à gradient de densité permet la purification de cellules mononucléaires (CMN). Les CMN sont ensuite déposées sur plaque à une densité comprise entre 5 x 103 et 5 x 105 cellules/cm2 et cultivées selon un protocole de culture de CSM standard. Les essais suivants sont effectués :
Les CSM sont soumis à un protocole de différenciation de lignage chondrocytaire standard, avec ou sans ajout de GDF-8 dans le milieu de culture primaire ou secondaire ou, le cas échéant, culture tertiaire. Les cellules de lignage chondrocytaire résultantes, en particulier les chondroblastes et les chondrocytes, présentent une expression réduite de HLA-DR lorsque GDF-8 est inclus par rapport au cas dans lequel GDF-8 n’est pas inclus.
Les CSM sont soumis à un protocole de différenciation de lignage adipocytaire standard, avec ou sans ajout de GDF-8 dans le milieu de culture à partir de culture primaire ou secondaire ou, le cas échéant, culture tertiaire. Les cellules de lignage adipocytaire résultantes, en particulier les adipoblastes et les adipocytes, présentent une expression réduite de HLA-DR lorsque GDF-8 est inclus par rapport au cas dans lequel GDF-8 n’est pas inclus.
Les CSM sont soumises à un protocole de différenciation de lignage myocytaire standard, avec ou sans ajout de GDF-8 dans le milieu de culture à partir de culture primaire ou secondaire ou, le cas échéant, culture tertiaire. Les cellules de lignage myocytaire résultantes, en particulier les myoblastes et les myocytes, présentent une expression réduite de HLA-DR lorsque GDF-8 est inclus par rapport au cas dans lequel GDF-8 n’est pas inclus.
Les CSM sont soumises à un protocole de différenciation de lignage tendonocytaire standard, avec ou sans ajout de GDF-8 dans le milieu de culture à partir de culture primaire ou secondaire ou, le cas échéant, culture tertiaire. Les cellules de lignage tendonocytaire résultantes, en particulier les ténoblastes et ténocytes, présentent une expression réduite de HLA-DR lorsque GDF-8 est inclus par rapport au cas dans lequel GDF-8 n’est pas inclus.
Les CSM sont soumis à un protocole de différenciation de lignage stromatogène, avec ou sans ajout de GDF-8 dans le milieu de culture à partir de culture primaire ou secondaire ou, le cas échéant, culture tertiaire. Les cellules de lignage stromatogène résultantes, en particulier les cellules stromales, présentent une expression réduite de HLA-DR lorsque GDF-8 est inclus par rapport au cas dans lequel GDF-8 n’est pas inclus.
Claims (22)
1. Utilisation du facteur de croissance et différenciation 8 (GDF-8) pour réduire l’immunogénicité de cellules in vitro, les cellules étant choisies dans le groupe constitué de cellules souches mésenchymateuses (CSM), cellules obtenues par différenciation de CSM, cellules de lignage ostéocytaire, cellules de lignage chondrocytaire, cellules de lignage adipocytaire, cellules de lignage myocytaire, cellules de lignage tendonocytaire, cellules de lignage fibroblastique, et cellules de lignage stromatogène.
2. Utilisation selon la revendication 1, les cellules de lignage ostéocytaire, cellules de lignage chondrocytaire, cellules de lignage adipocytaire, cellules de lignage myocytaire, cellules de lignage tendonocytaire, cellules de lignage fibroblastique, ou cellules de lignage stromatogène étant obtenues par différenciation de CSM.
3. Utilisation selon l’une quelconque des revendications 1 ou 2, les cellules étant des CSM, des ostéoprogéniteurs, des cellules ostéoblastiques, des ostéocytes, des cellules chondroblastiques, des chondrocytes, des. cellules adipoblastiques, des adipocytes, des cellules myoblastiques, ou des myocytes, de préférence les cellules étant des CSM, des ostéoprogéniteurs, des cellules ostéoblastiques, des cellules chondroblastiques, ou des chondrocytes.
4. Utilisation selon la revendication 1, les cellules étant des CSM.
5. Utilisation selon l’une quelconque des revendications 1 ou 2, les cellules étant des ostéoprogéniteurs ou des cellules ostéoblastiques.
6. Utilisation selon l’une quelconque des revendications 1 à 5, les cellules étant des cellules r de mammifère telles que des cellules humaines ou des cellules de mammifère non humaines, de préférence des cellules humaines.
7. Utilisation selon l’une quelconque des revendications 1 à 6, GDF-8 réduisant le récepteur de complexe de surface cellulaire de CMH de classe II sur lesdites cellules et réduisant facultativement un ou plusieurs facteurs costimulants sur lesdites cellules.
8. Utilisation selon la revendication 7, dans laquelle, sur des cellules humaines, ledit récepteur de surface cellulaire de CMH de classe II est l’antigène de leucocytes humain DR (HLA-DR).
9. Utilisation selon l’une quelconque des revendications 1 à 8, les cellules étant comprises dans un implant ou une greffe, de préférence dans un implant ou une greffe de tissu osseux et/ou articulaire, ou dans une formulation pharmaceutique.
10. GDF-8 pour utilisation dans un procédé de réduction de l’immunogénicité de cellules, GDF-8 devant être administré in vivo, et les cellules étant choisies dans le groupe constitué de CSM, cellules obtenues par différenciation de CSM, cellules de lignage ostéocytaire, cellules de lignage chondrocytaire, cellules de lignage adipocytaire, cellules de lignage myocytaire, cellules de lignage tendonocytaire, cellules de lignage fibroblastique, et cellules de lignage stromatogène.
11. GDF-8 pour utilisation selon la revendication 10, GDF-8 et les cellules étant destinés à être administrés en combinaison in vivo.
12. GDF-8 pour utilisation selon l’une quelconque des revendications 10 ou 11, les cellules étant telles que définies dans l’une quelconque des revendications 2 à 6.
13. GDF-8 pour utilisation selon l’une quelconque des revendications 10 à 12, les cellules étant allogéniques pour un sujet auquel elles doivent être administrées.
14. Combinaison de GDF-8 et de cellules pour utilisation en tant que médicament, de préférence pour utilisation dans le traitement d’une maladie musculosquelettique, plus préférablement la maladie musculosquelettique étant une maladie osseuse ou une maladie ostéoarticulaire, les cellules étant choisies dans le groupe constitué de CSM, cellules obtenues par différenciation de CSM, cellules de lignage ostéocytaire, cellules de lignage chondrocytaire, cellules de lignage adipocytaire, cellules de lignage myocytaire, cellules de lignage tendonocytaire, cellules de lignage fibroblastique, et cellules de lignage stromatogène.
15. Combinaison de GDF-8 et de cellules pour utilisation selon la revendication 14, les cellules étant telles que définies dans l’une quelconque des revendications 2 à 6.
16. Combinaison de GDF-8 et de cellules pour utilisation selon l’une quelconque des revendications 14 ou 15, la combinaison étant pour utilisation dans le traitement d’une maladie musculosquelettique, de préférence la maladie musculosquelettique étant une maladie osseuse ou une maladie ostéo-articulaire, et les cellules étant choisies dans le groupe constitué de CSM, cellules de lignage ostéocytaire, cellules de lignage chondrocytaire, cellules de lignage myocytaire, et cellules de lignage tendonocytaire, de préférence les cellules étant des CSM, des ostéoprogéniteurs, des cellules ostéoblastiques, des ostéocytes, des cellules chondroblastiques, des chondrocytes, des cellules myoblastiques, ou des myocytes.
17. Combinaison de GDF-8 et de cellules pour utilisation selon l’une quelconque des revendications 14 à 16, les cellules étant allogéniques pour un sujet auquel elles doivent être administrées.
18. GDF-8 pour utilisation dans un procédé de réduction du risque de rejet par un sujet d’un matériau administré, implanté ou transplanté chez le sujet.
19. GDF-8 pour utilisation selon la revendication 18, le matériau comprenant du tissu osseux et/ou articulaire.
20. Composition pharmaceutique comprenant un matériau destiné à être administré, implanté ou transplanté chez un sujet et GDF-8, et facultativement comprenant en outre un ou plusieurs excipients pharmaceutiquement acceptables.
21. Composition pharmaceutique selon la revendication 20, le matériau comprenant des cellules choisies dans le groupe constitué de CSM, cellules obtenues par différenciation de CSM, cellules de lignage ostéocytaire, cellules de lignage chondrocytaire, cellules de lignage adipocytaire, cellules de lignage myocytaire, cellules de lignage tendonocytaire, cellules de lignage fibroblastique, et cellules de lignage stromatogène.
22. Composition pharmaceutique selon la revendication 20, le matériau comprenant un tissu osseux et/ou articulaire.
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