KR20140077198A - 성장 및 분화 인자 8(gdf-8)의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 구체적으로 간엽줄기세포(MSC) 같은 세포, 조직 또는 물질의 면역원성 또는 거부 위험을 저감하기 위한 시험관 내 또는 생체 내에서 성장 및 분화 인자 8 (GDF-8)의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 또한 MSC를 시험관 내 또는 생체 외에서 골전구세포 또는 골아세포, 또는 골전구세포 및/또는 골아세포를 포함하는 세포군으로 FGF-2 및 GDF-8를 사용하여 분화하는 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 이 방법으로 얻어질 수 있는 골전구세포 또는 골아세포, 또는 골전구세포 및/또는 골아세포를 포함하는 세포군, 및 근골격계 질환의 치료에서 사용하기 위한 골전구세포 또는 골아세포, 또는 골전구세포 및/또는 골아세포를 포함하는 세포군에 관한 것이다.

Description

성장 및 분화 인자 8(GDF-8)의 용도{USES OF GROWTH AND DIFFERENTIATION FACTOR 8 (GDF-8)}

본 발명은 특히 간엽줄기세포(MSC), 조직 또는 물질 같은 세포의 특성을 변성하기 위한 시험관 내 또는 생체 내에서 성장 및 분화 인자 8(GDF-8)의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 또한 MSC를 시험관 내 또는 생체 외에서 골전구세포(osteo-progenitor)(조기 및 후기 골전구세포 포함) 또는 골아세포(osteoblastic cell)(조골아세포, 골아세포 및 골세포 포함), 또는 골전구세포 및/또는 골아세포를 포함하는 세포군(cell population)으로 분화하는 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 본 발명의 방법으로 얻을 수 있는, 골전구세포 또는 골아세포, 또는 이러한 골전구세포 및/또는 골아세포를 포함하는 세포군, 및 근골격계 질환 치료에서 사용하기 위한 골전구세포 또는 골아세포(예를 들어, 동종이계 골전구세포 또는 동종이계 골아세포), 또는 골전구세포 및/또는 골아세포를 포함하는 세포군에 관한 것이다.

근골격계 질환 또는 장애는 뼈, 근육, 관절, 연골, 힘줄, 인대 및 조직과 기관을 함께 지지하고 결합하는 기타 결합 조직에 영향을 줄 수 있다. 이러한 질환들은 시간이 지남에 따라 발생하거나, 예를 들어 근골격 시스템의 과도한 사용 또는 외상에 의해 발생할 수 있다. 근골격계 질환은 근골격 시스템이 다른 내부 시스템에 밀접하게 연관되어 있기 때문에 진단 및/또는 치료가 어려울 수 있다.

근골격계 질환과, 특별히 뼈 질환의 치료를 위한 가능하고 확실한 방법은 골형성 분화를 수행할 수 있는 간엽줄기세포(MSC) 또는 골아세포 계통과 관련된 세포의 이식이다.

MSC는 이전에 골 장애의 치료에 사용되었다(Gangji et al. Expert Opin Biol Ther, 2005, vol. 5, 437-42). 그러나, 이러한 상대적으로 미분화된 줄기세포가 이식될 수는 있지만 이들이 골아세포 계통에 연관되는 것은 아니므로 그처럼 이식된 줄기세포의 상당한 부분이 실질적으로 원하는 조직의 형성에 기여할 수 없다. 게다가, 가능한 임의의 조직 공급원으로부터 얻을 수 있는 이같은 줄기세포의 양은 대개 불만족스럽다.

WO 2007/093431호에는 단리된 MSC의 적절한 범위의 시험관 내 증식을 달성하고, 이미 골아세포성 표현형을 나타내는 세포를 수득하는 방법이 기재되어 있다. 상기 방법에서는 인간 MSC를 특별히 혈청 또는 혈장 및 염기성 섬유아세포 성장인자(FGF-2)의 존재 하에서 배양하였다.

WO 2009/087213호에서는 구체적으로 인간 혈장 또는 혈청, FGF-2 및 TGFβ-1을 사용하여 인간 MSC를 골형성 분화하는 방법을 기술하고 있다.

그러나, 유용한 골전구세포 또는 골아세포, 또는 골전구세포 및/또는 골아세포를 포함하는 세포군을 MSC로부터 제조하는 추가적인 및/또는 개선된 신뢰할 수 있는 방법이 여전히 필요하다.

또한, 환자에게 투여하는데 유용한 세포, 조직 또는 물질을 변성하기 위한, 예를 들어 특히 면역원성 또는 그에 대한 환자의 거부 위험을 줄이는 것이 필요하다.

실험부에서 예시된 바와 같이, 본 발명자들은 성장 및 분화 인자 8(GDF-8)이 유리하게 GDF-8의 존재 하에서 배양 또는 분화된(예를 들어, 간엽세포 계통의 세포, 예컨대 특히 골전구세포 또는 골아세포, 또는 골전구세포 및/또는 골아세포를 포함하는 세포군으로 분화된), 세포, 예를 들어 간엽줄기세포(MSC)의 면역원성을 저하시키는 것을 발견하였다.

상기한 발견에서 나아가, 본 발명자들은 세포의 면역원성을 저하시키는 GDF-8의 작용을 인식하였다. 따라서, 본 발명의 측면은 시험관 내에서 세포의 면역원성을 저하시키는 성장 및 분화 인자 8(GDF-8)의 용도에 관한 것이다. 이러한 용도는, 예를 들어 동종이계 대상에게 세포의 이식이 가능하도록 하기 때문에 유리하다. 특정 구체예는 시험관 내에서 세포 면역원성을 저하시키기 위한 GDF-8의 용도를 제공하며, 여기에서 세포는 간엽줄기세포(MSC), MSC의 분화로 얻어진 세포, 골세포 계통의 세포, 연골세포 계통의 세포, 지방세포 계통의 세포, 근세포 계통의 세포, 힘줄세포 계통(tendonocytic lineage)의 세포, 섬유아세포 계통의 세포 및, 스트로모젠 계통(stromogenic lineage)의 세포로 구성되는 군에서 선택된다. 골세포, 연골세포, 지방세포, 근세포, 힘줄세포, 섬유아세포 또는 스트로모젠 계통의 세포는 간엽세포 계통 범주에 속하는 것으로 생각할 수 있으며, 그에 따라 이러한 세포들의 면역원성을 저감하는 GDF-8의 유용성이 강조된다.

특정 구체예에서, 골세포 계통의 세포, 연골세포 계통의 세포, 지방세포 계통의 세포, 근세포 계통의 세포, 힘줄세포 계통의 세포, 섬유아세포 계통의 세포 및, 또는 스트로모젠 계통의 세포는 MSC 분화에 의해 얻어질 수 있으며, 더욱 구체적으로 이 세포들은 시험관 내 또는 생체 외 MSC 분화에 의해 얻어질 수 있다. MSC의 분화는 바람직한 세포 종류로 MSC 분화를 유도할 수 있는 조건 하의 MSC 배양, 보다 전형적으로 바람직한 세포 종류로 MSC 분화를 유도할 수 있는 하나 이상의 인자(예를 들어, 성장인자)를 포함하는 배지에서의 MSC 배양을 포함할 수 있다. MSC 분자에 대한 프로토콜은 그 자체가 공지되어 있다(특히, WO 2007/093431; REGER, R.L. et al. 'Differentiation and Characterization of Human MSCs'. In: Mesenchymal Stem Cells : Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology), Edited by D.J. Prockop et al. Humana Press, 2008, Vol. 449, p. 93-107; VERMURI, M.C. et al. (Eds.). Mesenchymal Stem Cell Assays and Applications (Methods in Molecular Biology). Humana Press, 2011, Vol. 698, 특히 201 - 352페이지 참조).

MSC의 시험관 내 또는 생체 외 분화로 얻어진 세포의 면역원성을 저감하기 위해, 바람직한 세포가 MSC의 분화로 얻어진 후에 세포를 GDF-8에 노출(즉, GDF-8을 함유하는 배지와 접촉 또는 배양)하거나/하고 MSC를 원하는 세포로 분화하기 위한 개별 공정 또는 프로토콜의 하나 이상의 단계 일부로서 (MSC)세포를 GDF-8에 노출시킬 수 있다. 예를 들어, 본 명세서의 다른 부분에서 언급된 바와 같이 MSC는 혈장 또는 혈청, GDF-8 및 섬유아세포 성장인자 2(FGF-2)를 포함하는 배지에서 MSC를 배양하는 단계를 포함하는 방법으로 골전구세포 또는 골아세포, 또는 골전구세포 및/또는 골아세포를 포함하는 세포군으로 분화되어 얻어진 세포의 면역원성을 저감할 수 있다.

역으로, MSC 분화로 얻어진 세포는 그에 따라 골세포 계통의 세포, 연골세포 계통의 세포, 지방세포 계통의 세포, 근세포 계통의 세포, 힘줄세포 계통의 세포, 섬유아세포 계통의 세포 및, 또는 스트로모젠 계통의 세포로 특별히 지칭될 수 있다.

다른 구체예에서, 세포는 MSC, 골전구세포, 골아세포, 골세포, 연골아세포, 연골세포, 지방아세포, 지방세포, 근아세포 또는 근세포일 수 있다. 보다 더 바람직하게 세포는 MSC, 골전구세포, 골아세포, 연골아세포, 또는 연골세포일 수 있다. 보다 더 바람직하게, 세포는 MSC일 수 있다. 또한 특히 바람직하게, 세포는 골전구세포 또는 골아세포일 수 있다. 이러한 세포 종류에서, 세포의 면역원성 감소에 대한 GDF-8의 유리한 효과가 구체적으로 입증될 수 있다.

따라서, 일부 구체예에서, 세포는 MSC, 바람직하게 성체 인간 MSC일 수 있다. 이러한 MSC 세포는 제한적인 것은 아니나, 혈청 또는 혈장 및 임의로 FGF-2를 포함하는 배지에서 적합하게 배양될 수 있다. 특히, MSC를 골세포 계통의 세포, 예를 들어 골전구세포 또는 골아세포로 분화하고자 할 때 FGF-2를 포함할 수 있다. 세포는 자기유래 또는 동종이계 사용이 가능하고, 바람직하게 세포는 동종이계에 사용할 수 있다. 다른 구체예에서, 세포는 골전구세포 또는 골아세포일 수 있다. 이러한 골전구세포 또는 골아세포는 제한적인 것은 아니나, 혈청 또는 혈장 및 임의로 FGF-2를 포함하는 배지에서 적합하게 배양될 수 있다. 세포는 자기유래 또는 동종이계 사용이 가능하고, 바람직하게 세포는 동종이계에 사용할 수 있다.

상기한 용도는 동물 세포, 바람직하게 온혈동물 세포에 적용할 수 있다. 더 더욱 바람직하게, 이러한 용도를 위한 세포는 포유동물 세포, 예컨대 인간 세포 또는 비인간 포유동물 세포, 보다 더 바람직하게 인간 세포이다.

일부 구체예에서, 본 발명은 시험관 내에서 세포의 면역원성을 감소시키기 위한 GDF-8의 용도에 관한 것으로, 여기에서 GDF-8은 세포 상의 MHC 클래스 II 세포 표면 수용체 복합체를 감소시키고, 임의로 세포 상의 하나 이상의 공동자극 인자를 감소시킨다.

여기에서 사용된 "세포 상의 MHC 클래스 II 세포 표면 수용체 복합체를 감소한다"는 것은 세포 상의 MHC 클래스 II 세포 표면 수용체 복합체의 감소된 양 및/또는 이용가능성(예를 들어, 그의 생물학적 활성을 수행하는 가능성)을 지칭한다. 이러한 감소된 양 및/또는 이용가능성은 세포 상에서 감소된 양의 MHC 클래스 II 세포 표면 수용체 복합체 및/또는 세포군에서 MHC 클래스 II 세포 표면 수용체 복합체를 발현하는 세포의 감소된 분획을 포함한다. 예를 들어, 인간 세포 상에서 MHC 클래스 II 세포 표면 수용체 복합체는 HLA-DR, HLA-DQ, HLA-DP, HLA-DO, 또는 HLA-DM 같은 HLA 복합체로 코딩되는 MHC 클래스 II 세포 표면 수용체 복합체일 수 있다. 바람직하게, 인간 세포에서 MHC 클래스 II 세포 표면 수용체 복합체는 HLA-DR일 수 있다. 따라서, 여기에 인간 세포에서 HLA-DR을 감소시키는 GDF-8의 시험관 내에서 인간 세포의 면역원성을 감소시키기 위한 용도를 추가로 기술하였다.

여기에 사용된 "세포 상에서 하나 이상의 공동자극 인자를 감소시킨다"는 것은 세포 상에서 하나 이상의 공동자극 인자의 감소된 양 및/또는 이용가능성(예를 들어, 그의 생물학적 활성을 수행하는 가능성)을 지칭한다. 이러한 감소된 양 및/또는 이용가능성은 세포 상에서 감소된 양의 하나 이상의 공동자극 인자 및/또는 세포군에서 하나 이상의 공동자극 인자를 발현하는 세포의 감소된 분획을 포함한다.

또한, 비제한적으로 이하에 상술된 (i) 내지 (viii) 중 어느 하나 및 전체가 본 발명의 측면에서 특별히 제공된다:

(i) 시험관 내에서 세포의 면역원성을 저감하기 위한 GDF-8의 용도;

(ii) GDF-8이 상기한 세포들에서 MHC 클래스 II 세포 표면 수용체 복합체를 감소하고, 임의로 상기한 세포들에서 하나 이상의 공동자극 인자들을 감소하는, 상기한 (i)에 기재된 용도;

(iii) 세포가 동물 세포, 바람직하게 포유동물 세포, 예컨대 인간 세포 또는 비인간 포유동물 세포인 상기한 (i) 또는 (ii)에 기재된 용도;

(iv) 인간 세포에서 MHC 클래스 II 세포 표면 수용체가 인간 백혈구 항원 DR (HLA-DR)인 상기한 (ii) 또는 (iii)에 기재된 용도;

(v) 세포가 MSC, 바람직하게 인간 성체 MSC인 상기한 (i) 내지 (iv) 중 어느 하나에 기재된 용도;

(vi) 세포가 골전구세포 또는 골아세포인 상기한 (i) 내지 (iv) 중 어느 하나에 기재된 용도.

특정 구체예에서, 앞서 특정된 세포들은 대상에게 투여될 물질, 예컨대 바람직하게 임플란트 또는 이식물(더욱 바람직하게 뼈 및/또는 관절 조직 임플란트 또는 이식물(예를 들어, 골수 또는 골 조직 임플란트 또는 이식물)), 또는 약학적 제제 내에 포함될 수 있다. 임플란트, 이식물 같은 물질 또는 약학 제제 내에 포함된 세포의 면역원성을 저감하므로써 이같은 치료적으로 관련된 제품 또는 조성물이 투여되는 대상의 이들에 대한 거부 위험을 줄일 수 있다.

본 발명의 다른 측면은 세포 면역원성을 감소시키는데 사용하기 위한 생체 내 투여될 GDF-8에 관한 것이다. GDF-8은, 예를 들어 근골격 병소 부위에, 예를 들어 주사에 의해 국소적으로 투여될 수 있다. GDF-8은 단독으로 또는 줄기세포 같은 세포, 바람직하게 MSC, 바람직하게 인간 성체 MSC, 및/또는 골전구세포 또는 골아세포 같은 세포, 또는 골전구세포 및/또는 골아세포를 포함하는 세포군과 조합하여 투여될 수 있고, 바람직하게 이러한 세포들은 인간일 수 있다. 바람직하게, GDF-8은 MSC, 더욱 바람직하게 인간 성체 MSC와 조합하여 투여될 수 있다. 그러므로, GDF-8이 MSC, 바람직하게 인간 성체 MSC와 생체 내로 투여되는, 세포의 면역원성을 줄이는데 사용하기 위한 GDF-8이 추가로 제공된다. GDF-8은 또한, 임의로 상기한 세포들과 조합하여 FGF-2와 동시 투여될 수 있다. 바람직하게, 이러한 투여가 수행되는 대상은 인간일 수 있다. 바람직하게, 투여될 세포 또는 세포군은 대상에 대해 자기유래이거나 동종이계일 수 있다. GDF-8과 개별 세포 또는 MSC 같은 세포군을 생체 내에 동시 투여하거나, 생체 내에 순서에 상관없이 순차적으로 투여할 수 있으며, 예를 들어 개별 세포 또는 MSC 같은 세포군을 생체 내 투여하고 이어서 GDF-8을 생체 내 투여하거나, GDF-8을 생체 내 투여한 다음 개별 세포 또는 MSC 같은 세포군을 생체내 투여할 수 있다. 따라서, 또한 GDF-8이 생체 내 투여되는, 세포의 면역원성을 저감하는 의약 제조를 위한 GDF-8의 용도를 기재하였으며; 대상에게 GDF-8의 투여를 포함하는, 세포의 면역원성 저감이 필요한 대상에서 세포 면역원성을 저감하는 방법도 기재하였다.

본 발명의 또다른 측면은 의약으로서, 바람직하게 뼈 질환 및 골관절 질환을 포함한 근골격계 질환의 치료용 의약으로서 사용하기 위한 GDF-8을 제공한다. 따라서, 뼈 질환 및 골관절 질환을 포함한 근골격계 질환의 치료용 의약 제조를 위한 GDF-8의 용도를 제공한다. 또한, 대상에게 GDF-8을 투여하는 것을 포함하는, 뼈 질환 및 골관절 질환을 포함한 근골격계 질환의 치료가 필요한 대상에서 상기한 질환을 치료하는 방법을 제공한다. 특히, GDF-8의 치료적 또는 예방적 유효량을 대상에게 투여하는 것을 포함하는, 근골격계 질환 치료가 필요한 대상에서 근골격계 질환을 치료하는 방법을 목적으로 한다. 의약으로 사용하는 경우, GDF-8은 단독으로 또는 줄기세포 같은 세포, 바람직하게 MSC, 바람직하게 인간 성체 MSC, 및/또는 골전구세포 또는 골아세포 같은 세포, 또는 골전구세포 및/또는 골아세포를 포함하는 세포군과 조합하여 투여될 수 있고, 바람직하게 이러한 세포들은 인간일 수 있다. 바람직하게, GDF-8은 MSC, 더욱 바람직하게 인간 성체 MSC와 조합하여 투여할 수 있다. 따라서, 특히 GDF-8이 MSC, 바람직하게 인간 성체 MSC와 함께 생체 내 투여되는, 의약으로서, 바람직하게 뼈 질환 및 골관절 질환을 포함하는 근골격계 질환 치료에서 사용하기 위한 GDF-8을 기재하였다. GDF-8은, 임의로 상기한 세포들과 조합하여 FGF-2와 동시 투여될 수 있다. 또한, GDF-8을 MSC, 바람직하게 인간 성체 MSC와 함께 대상에게 투여하는 것을 포함하는, 뼈 질환 및 골관절 질환을 포함하는 근골격계 질환의 치료가 필요한 대상에서 상기 질환을 치료하는 방법을 제공한다. 바람직하게 이러한 투여가 수행되어야 하는 대상은 인간일 수 있다. 바람직하게 투여될 세포 또는 세포군은 상기 대상에 대하여 자기유래 또는 동종이계일 수 있다.

따라서, 본 발명의 측면은 세포의 면역원성을 저감하는 방법에서 사용하기 위한 GDF-8을 제공하는 것으로, 여기에서 GDF-8은 생체 내로 투여될 수 있고, 세포는 MSC, MSC 분화로 얻어진 세포, 골세포 계통의 세포, 연골세포 계통의 세포, 지방세포 계통의 세포, 근세포 계통의 세포, 힘줄세포 계통의 세포, 섬유아세포 계통의 세포 및, 또는 스트로모젠 계통의 세포로 구성되는 군에서 선택된다. 바람직하게, 세포는 (상기한)GDF-8의 시험관 내 사용과 관련하여 더욱 상세하게 처리될 수 있다. 이 측면은 세포의 면역원성을 저감하는 의약의 제조를 위한 GDF-8의 용도를 포함하며, 여기서 GDF-8은 생체 내 투여될 수 있고 세포는 MSC, MSC 분화로 얻어진 세포, 골세포 계통의 세포, 연골세포 계통의 세포, 지방세포 계통의 세포, 근세포 계통의 세포, 힘줄세포 계통의 세포, 섬유아세포 계통의 세포 및, 또는 스트로모젠 계통의 세포로 구성되는 군에서 선택되며; 뿐만 아니라 대상에게 GDF-8을 투여하는 것을 포함하는, 세포 면역원성의 저감을 필요로 하는 대상에서 세포 면역원성을 저감하는 방법을 포함하고, 여기서 세포는 MSC, MSC 분화로 얻어진 세포, 골세포 계통의 세포, 연골세포 계통의 세포, 지방세포 계통의 세포, 근세포 계통의 세포, 힘줄세포 계통의 세포, 섬유아세포 계통의 세포 및, 또는 스트로모젠 계통의 세포로 구성되는 군에서 선택된다. 특정 구체예는 상기한 세포들의 면역원성을 저감하는 방법(또는 상응하는 방법 또는 용도)에서 사용하기 위한 GDF-8을 제공하며, 여기에서 GDF-8과 세포들은 생체내에서 조합하여 투여될 수 있다. 이러한 구체예는 유리하게 대상에게 투여되는 세포의 면역원성과 거부 위험을 줄일 수 있다. 이러한 GDF-8의 작용은 대상에 대해 자기유래, 동종이계 또는 심지어 이종발생성인, 보다 전형적으로 자기유래 또는 동종이계인 세포를 적용하는 세포 치료 방법에서 유용할 수 있지만, 효과는 특히 동종이계 세포의 투여를 용이하게 할 수 있는데, 왜냐하면 동종이계 세포의 면역원성을 저하시키면 대상에 의한 거부 위험을 상당히 저하시키고 동종이계 세포 물질을 제공할 때 대상이 전형적으로 받는 면역억제 요법을 회피하거나 약화시킬 것으로 예상되기 때문이다. 따라서, 일부 구체예는 세포가 투여될 대상에게 동종이계인, 세포들의 면역원성을 저감하는 방법(또는 상응하는 방법 또는 용도)에서 사용하기 위한 GDF-8을 제공한다.

GDF-8과 세포는 생체 내에 동시 투여하거나 생체 내에 순서에 상관없이 순차적으로 투여될 수 있으며, 예를 들어 세포를 생체 내 투여하고 이어서 GDF-8을 생체 내 투여하거나, GDF-8을 생체 내 투여하고 이어서 세포를 생체내 투여할 수 있음을 이해하여야 한다. 일 예로, GDF-8 투여는 세포에 대한 면역반응 또는 세포의 거부 징후가 대상에서 검출되었을 때 이전에 세포를 받은 대상에서 처방될 수 있다. 다른 예로, GDF-8 투여는 대상이 세포에 대한 면역반응 또는 거부(예를 들어, 불량한 HLA 매칭)를 보일 가능성이 증가하는 경우 세포를 이미 받았거나, 받고 있거나, 앞으로 받게 될 대상에게 처방할 수 있다. 또다른 예에서, 세포에 대한 면역반응 또는 세포의 거부에 대한 실질적 관찰 또는 예상대로 증가된 가능성과 상관없이 세포를 이미 받았거나, 받고 있거나, 앞으로 받게 될 대상에게 처방할 수 있다.

특정 구체예에서, GDF-8은 세포가 국소적으로 또는 전신적으로 투여되는지와 상관없이 전신적으로 투여될 수 있다. 다른 구체예에서, GDF-8은 국소적으로 투여될 수 있다. 예를 들어, 세포가 국소적으로 투여될 때(예를 들어, 뼈내 또는 뼈주위, 또는 관절내 또는 관절주위로, 예컨대 세포가 뼈 또는 관절 조직 복구용일 경우), GDF-8은 바람직하게 국소적으로, 보다 구체적으로 세포에 근접하여(예를 들어, 경우에 따라 또한 뼈내 또는 뼈주위, 또는 관절내 또는 관절주위로) 투여될 수 있다. 적합하게, GDF-8은 그의 투여 부위에서 서방성 제제로 제형화되어 세포에서 그의 효능을 지속할 수 있다.

특정 구체예에서, 세포는 대상에 투여된 물질, 예컨대 바람직하게 임플란트 또는 이식물(더욱 바람직하게 뼈 조직 및/또는 관절 조직 임플란트 또는 이식물(예를 들어, 골수 또는 뼈 조직 임플란트 또는 이식물)) 내, 또는 약학적 제제 내에 포함될 수 있다. 상기한 물질, 예컨대 임플란트, 이식물 또는 약학적 제제 내에 포함된 세포의 면역원성을 저하하여 치료학적 관련 생성물 또는 조성물이 투여된 대상에 의한 그에 대한 거부 위험을 줄일 수 있다.

따라서, 본 발명의 다른 측면은 의약, 바람직하게 근골격계 질환의 치료에서 사용(예를 들어, 치료방법에서 사용)하기 위한 GDF-8과 세포 조합물을 제공하며, 더욱 바람직하게 여기에서 근골격계 질환은 뼈 질환 또는 골관절 질환이며, 세포는 MSC, MSC의 분화로 얻어진 세포, 골세포 계통의 세포, 연골세포 계통의 세포, 지방세포 계통의 세포, 근세포 계통의 세포, 힘줄세포 계통의 세포, 섬유아세포 계통의 세포, 및 스트로모젠 계통의 세포로 구성되는 군에서 선택된다. 또한 이 측면은 근골격계 질환의 치료용 의약의 제조를 위한 GDF-8과 세포 조합물의 용도를 포함하며, 더욱 바람직하게 여기에서 근골격계 질환은 뼈 질환 또는 골관절 질환이며, 세포는 MSC, MSC의 분화로 얻어진 세포, 골세포 계통의 세포, 연골세포 계통의 세포, 지방세포 계통의 세포, 근세포 계통의 세포, 힘줄세포 계통의 세포, 섬유아세포 계통의 세포, 및 스트로모젠 계통의 세포로 구성되는 군에서 선택되며; 뿐만 아니라, 대상에게 GDF-8과 세포의 조합물을 (특히 조합물의 치료학적 또는 예방학적 유효량을)투여하는 것을 포함하는, 근골격계 질환, 더욱 바람직하게 뼈 질환 또는 골관절 질환의 치료가 필요한 환자에서 상기 질환을 치료하는 방법을 포함하고, 여기에서 세포는 MSC, MSC의 분화로 얻어진 세포, 골세포 계통의 세포, 연골세포 계통의 세포, 지방세포 계통의 세포, 근세포 계통의 세포, 힘줄세포 계통의 세포, 섬유아세포 계통의 세포, 및 스트로모젠 계통의 세포로 구성되는 군에서 선택된다. 바람직하게, 세포는 (상기의)GDF-8의 시험관 내 용도와 관련하여 보다 상세하게 처리될 수 있다. 특정 구체예는 근골격계 질환의 치료(또는 상응하는 방법 또는 용도)에서 사용하기 위한 GDF-8과 세포의 조합물을 제공하며, 바람직하게 여기에서 근골격계 질환은 뼈 질환 또는 골관절 질환이고, 세포는 MSC, 골세포 계통의 세포, 연골세포 계통의 세포, 근세포 계통의 세포, 및 힘줄세포 계통의 세포로 구성되는 군에서 선택되고, 더욱 바람직하게 세포는 MSC, 골전구세포, 골아세포, 골세포, 연골아세포, 연골세포, 근아세포, 또는 근세포이고, 더욱 더 바람직하게 세포는 MSC, 골전구세포, 골아세포, 연골아세포 또는 연골세포이고, 보다 더 바람직하게 세포는 MSC이거나, 세포는 골전구세포 또는 골아세포이다.

상기 단락에 기재된 GDF-8과 세포의 조합은 의약으로서, 바람직하게 근골격계 질환을 치료하는 목적으로 대상에게 투여된 세포의 면역원성과 거부의 위험을 유리하게 저감할 수 있다. 조합물 중에서 GDF-8의 이러한 효능이 대상에 대해 자기유래, 동종이계 또는 이종발생성인, 보다 전형적으로 자기유래 또는 동종이계인 세포를 적용하는 세포 치료 방법에서 유용할 수 있지만, 효과는 특히 동종이계 세포의 투여를 용이하게 할 수 있는데, 왜냐하면 동종이계 세포의 면역원성을 저하시키면 대상에 의한 거부 위험을 상당히 저하시키고 동종이계 세포 물질을 제공할 때 대상이 전형적으로 받는 면역억제 요법을 회피하거나 약화시킬 것으로 예상되기 때문이다. 따라서, 특정 구체예는 의약으로서, 바람직하게 세포가 투여될 대상에 대해 동종이계인, 상기한 근골격계 질환의 치료(또는 상응하는 방법 또는 용도)에서 사용하기 위한 GDF-8 및 세포 조합물을 제공한다.

조합물 내에 포함된 GDF-8과 세포는 생체 내에 동시 투여하거나 생체 내에 순서에 상관없이 순차적으로 투여될 수 있으며, 예를 들어 세포를 생체 내 투여하고 이어서 GDF-8을 생체 내 투여하거나, GDF-8을 생체 내 투여하고 이어서 세포를 생체내 투여할 수 있음을 이해하여야 한다. 일 예로, GDF-8 투여는 세포에 대한 면역반응 또는 세포의 거부 징후가 대상에서 검출되었을 때 이전에 세포를 받은 대상에 처방될 수 있다. 다른 예로, GDF-8 투여는 대상이 세포에 대한 면역반응 또는 거부(예를 들어, 불량한 HLA 매칭)를 보일 가능성이 증가하는 경우 세포를 이미 받았거나, 받고 있거나, 앞으로 받게 될 대상에게 처방할 수 있다. 또다른 예에서, 세포에 대한 면역반응 또는 세포의 거부에 대한 실질적 관찰 또는 예상대로 증가된 가능성과 상관없이 세포를 이미 받았거나, 받고 있거나, 앞으로 받게 될 대상에게 GDF-8 투여를 처방할 수 있다.

특정 구체예에서, GDF-8은 세포가 국소적으로 또는 전신적으로 투여되는지와 상관없이 전신적으로 투여될 수 있다. 다른 구체예에서, GDF-8은 국소적으로 투여될 수 있다. 예를 들어, 세포가 국소적으로 투여될 때(예를 들어, 뼈내 또는 뼈주위, 또는 관절내 또는 관절주위로, 예컨대 세포가 뼈 또는 관절 조직 복구용일 경우), GDF-8은 바람직하게 국소적으로, 보다 구체적으로 세포에 근접하여(예를 들어, 경우에 따라 또한 뼈내 또는 뼈주위, 또는 관절내 또는 관절주위로) 투여될 수 있다. 적합하게, GDF-8은 그의 투여 부위에서 서방성 제제로 제형화되어 세포에서 그의 효능을 지속할 수 있다.

특정 구체예에서, GDF-8과 세포 조합물 내의 세포는 대상에 투여된 물질, 예컨대 바람직하게 임플란트 또는 이식물(더욱 바람직하게 뼈 조직 및/또는 관절 조직 임플란트 또는 이식물(예를 들어, 골수 또는 뼈 조직 임플란트 또는 이식물)) 내, 또는 약학적 제제 내에 포함될 수 있다. 상기한 물질, 예컨대 임플란트, 이식물 또는 약학적 제제 내에 포함된 세포의 면역원성을 저하하여 치료학적 관련 생성물 또는 조성물이 투여된 대상에 의한 그에 대한 거부 위험을 줄일 수 있다.

면역원성과 면역 거부를 조절하는 GDF-8의 능력을 관찰함에 따라, 본 발명의 다른 측면은 대상에게 투여되거나 임플란트되거나 이식된 물질의 대상에 의한 거부 위험을 줄이는데 사용하기 위한 GDF-8을 제공한다. 또한 이 측면은 대상에게 투여되거나 임플란트되거나 이식된 물질의 대상에 의한 거부 위험을 줄이는 의약의 제조를 위한 GDF-8의 용도; 및 GDF-8을 대상에게 투여하는 것을 포함하는, 대상에 투여, 임플란트 또는 이식된 물질의 대상에 의한 거부 위험을 줄이는 방법을 포함한다. 이 내용과 상기한 측면 및 구체예에서, 대상에게 투여된(될) 물질이란 임의 물질을 광범위하게 포함하는 의미인 것으로, 이것은 대상에게 투여되었을 때 이점을 가지며, 예를 들어 비제한적으로 대상에서 치료적 또는 예방적 이점을 가질 수 있다(예를 들어, 대상에서 근골격계 질환, 더욱 바람직하게 근골격계 질환이 뼈 질환 또는 골관절 질환인 경우의 치료에 유용할 수 있다). 특정 구체예는 언급된 용도(또는 상응하는 방법 또는 용도)를 위해 GDF-8을 제공하며, 여기에서 물질은 뼈 조직 및/또는 관절 조직(예를 들어, 골수 조직 또는 뼈 조직)을 포함한다.

특정 구체예에서, 물질은 MSC, MSC의 분화로 얻어진 세포, 골세포 계통의 세포, 연골세포 계통의 세포, 지방세포 계통의 세포, 근세포 계통의 세포, 힘줄세포 계통의 세포, 섬유아세포 계통의 세포, 및 스트로모젠 계통의 세포로 구성되는 군에서 선택된 세포를 포함할 수 있다. 바람직하게, 세포는 보다 상세하게 (전술한)GDF-8의 시험관 내 사용과 관련하여 처리된 것일 수 있다. 바람직하게 물질이 근골격계 질환의 치료를 위한 것이고, 바람직하게 근골격게 질환이 뼈 질환 또는 골관절 질환이고, 물질이 세포를 함유하는 경우, 세포는 MSC, 골세포 계통의 세포, 연골세포 계통의 세포, 근세포 계통의 세포, 및 힘줄세포 계통의 세포로 구성되는 군, 더욱 바람직하게 MSC, 골전구세포, 골아세포, 골세포, 연골아세포, 연골세포, 근아세포 또는 근세포로 구성되는 군, 더욱 더 바람직하게 MSC, 골전구세포, 골아세포, 연골아세포, 또는 연골세포로 구성되는 군, 더욱 더 바람직하게 MSC로 구성되는 군, 또는 골전구세포 또는 골아세포로 구성되는 군에서 선택될 수 있다.

물질이 심각한 거부 위험을 가질 때, 예를 들어 물질이 하나 이상의 성분, 예를 들어 대상에 대해 동종이계 또는 심지어 이종인, 보다 전형적으로 동종이계인 조직, 세포, 생체분자 또는 다른 물질을 함유할 경우, 특정 구체예에서 물질에 대한 대상의 거부 위험을 약화하는 GDF-8의 효과가 나타날 수 있다.

GDF-8과 물질은 생체 내에 동시 투여하거나 생체 내에 순서에 상관없이 순차적으로 투여될 수 있으며, 예를 들어 물질을 생체 내 투여하고 이어서 GDF-8을 생체 내 투여하거나, GDF-8을 생체 내 투여하고 이어서 물질을 생체 내 투여할 수 있음을 이해하여야 한다. 일 예로, GDF-8 투여는 물질에 대한 거부 징후가 대상에서 검출되었을 때 이전에 물질을 받은 대상에 처방될 수 있다. 다른 예로, GDF-8 투여는 대상이 물질에 대한 거부(예를 들어, 불량한 HLA 매칭)를 나타낼 가능성이 증가하는 경우 물질을 이미 받았거나, 받고 있거나, 앞으로 받게 될 대상에게 처방할 수 있다. 또다른 예에서, GDF-8 투여는 물질에 대한 거부의 실질적 관찰 또는 예상대로 증가된 가능성과 상관없이 물질을 이미 받았거나, 받고 있거나, 앞으로 받게 될 대상에게 처방할 수 있다.

특정 구체예에서, GDF-8은 물질이 국소적으로 또는 전신적으로 투여되는지와 상관없이 전신적으로 투여될 수 있다. 다른 구체예에서, GDF-8은 국소적으로 투여될 수 있다. 예를 들어, 물질이 국소적으로 투여될 때(예를 들어, 뼈내 또는 뼈주위, 또는 관절내 또는 관절주위로, 예컨대 물질이 뼈 또는 관절 조직 복구용일 경우), GDF-8은 바람직하게 국소적으로, 보다 구체적으로 물질에 근접하여(예를 들어, 경우에 따라 또한 뼈내 또는 뼈주위, 또는 관절내 또는 관절주위로) 투여될 수 있다. 적합하게, GDF-8은 그의 투여 부위에서 서방성 제제로 제형화되어 물질에서 그의 효능을 지속할 수 있다.

따라서, 본 발명의 다른 측면은 대상에 투여, 임플란트 또는 이식될 물질 및 GDF-8을 포함하고, 임의로 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 부형제를 추가로 포함하는 약학 조성물을 제공한다. 바람직하게, MSC, MSC의 분화로 얻어진 세포, 골세포 계통의 세포, 연골세포 계통의 세포, 지방세포 계통의 세포, 근세포 계통의 세포, 힘줄세포 계통의 세포, 섬유아세포 계통의 세포, 및 스트로모젠 계통의 세포로 구성되는 군에서 선택된 세포, GDF-8, 및 임의로 추가적으로 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는 약학 조성물을 제공한다(즉, 대상에 투여, 임플란트 또는 이식될 물질이 열거된 세포를 포함한다고 할 수 있다). 바람직하게, 세포는 보다 상세하게 (전술한)GDF-8의 시험관 내 사용과 관련하여 처리된 것일 수 있다. 또한, 뼈 조직 및/또는 관절 조직(예를 들어, 골수 또는 뼈 조직), GDF-8, 및 임의로 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 부형제를 추가로 포함하는 약학 조성물을 제공한다(즉, 대상에 투여, 임플란트 또는 이식될 물질이 열거된 뼈 조직 및/또는 관절 조직을 포함한다고 할 수 있다).

본 명세서 전체에서, 본 발명의 원리를 구현하는 생성물, 방법 및 용도는 바람직하게 동물 세포, 더욱 바람직하게 온혈동물 세포, 더욱 더 바람직하게 포유동물 세포, 예컨대 인간 세포 또는 비인간 포유동물 세포, 보다 더 바람직하게 인간 세포를 사용할 수 있다.

또한, 본 명세서 전체에서, 본 발명의 원리를 구현하는 생성물, 방법 및 용도는 동물 대상, 더욱 바람직하게 온혈동물 대상, 더욱 더 바람직하게 포유동물 대상, 예컨대 인간 대상 또는 비인간 포유동물 대상, 보다 더 바람직하게 인간 대상에 적용할 수 있다.

임의의 종(예를 들어, 제공된 포유동물 종, 또는 인간)으로부터 유래한 세포, 조직 또는 다른 물질들은 전형적으로 동일 종의 대상에게 투여, 즉 자기유래 또는 동종이계 투여할 수 있음을 알 수 있다.

본 발명자들은 또한 상기한 종래기술이 가진 문제들 중 하나 이상을 해결하는 간엽줄기세포(MSC)를 분화하는 방법을 발견하였다.

그러므로, 본 발명의 추가 측면은 성체 MSC를 시험관 내 또는 생체 외에서 골전구세포 또는 골아세포, 또는 골전구세포 및/또는 골아세포를 포함하는 세포군으로 분화하는 방법에 관한 것으로, 이 방법은 상기 MSC를 혈장 또는 혈청, 성장 및 분화 인자 8(GDF-8) 및 섬유아세포 성장인자 2(FGF-2)를 포함하는 배지에서 배양하는 단계를 포함한다. 본 발명의 원리를 적용한 방법은 유리하게 감소된 면역원성을 갖는, 골전구세포 또는 골아세포, 또는 골전구세포 및/또는 골아세포를 포함하는 세포군을 얻을 수 있다.

예를 들어, 본 방법은 MHC 클래스 II 세포 표면 수용체의 발현이 감소된, 예를 들어 HLA-DR의 발현이 감소된, 골전구세포 또는 골아세포, 또는 골전구세포 및/또는 골아세포를 포함하는 세포군을 제공한다. 이렇게 감소된 면역원성으로 유리하게, 예를 들어 동종이계 대상에 대한 세포 이식을 가능하게 한다.

또한, 본 발명자들은 본 발명의 방법이 세포 증식을 자극하는 것을 발견하였다. 따라서, 이 방법은 세포 이식에 만족스러운 또는 개선된 양으로 이식에 적합한 세포를 생산하는 이점이 있다. 이는 또한 출발 MSC를 얻기 위해 대상으로부터 취해야하는 조직의 양을 감소시킬 수 있다.

따라서, 본 발명의 방법은 향상된 이식 가능성을 갖는 골전구세포 또는 골아세포, 또는 골전구세포 및/또는 골아세포를 포함하는 세포군을 유리하게 제공한다.

본 발명자들은 본 발명의 방법이 얻어진 골전구세포 또는 골아세포, 또는 골전구세포 및/또는 골아세포를 포함하는 세포군의 목적하는 골아세포 표현형을 유지하는 것을 입증하였다. 이것은 특히 MSC의 골형성 분화의 증가가 이미 GDF-8 결핍 마우스에서 보고(Hamrick et al., Bone, 2007, vol. 40(6), 1544-53)되었기 때문에 예상치 못한 것이다.

일 구체예에서, 본 발명의 방법은 (a) MSC를 포함하는, 대상의 생물학적 샘플에서 회수된 세포를 기질 표면에 부착시키고; (b) 부착 세포를 혈장 또는 혈청, GDF-8 및 FGF-2를 포함하는 배지에서, 예컨대 MSC를 시험관 내 또는 생체 외에서 골전구세포 또는 골아세포, 또는 골전구세포 및/또는 골아세포를 포함하는 세포군으로 분화할 수 있도록 배양하는 단계를 포함할 수 있다.

본 발명의 원리를 구현하는 특정 방법에서, 세포는 단계 (b)에 정의된 배지에서 약 10 내지 약 18일 동안 배양할 수 있다. 이 기간은 세포 이식에 특히 만족스러운 골전구세포 또는 골아세포, 또는 골전구세포 및/또는 골아세포를 포함하는 세포군의 양을 생산할 수 있다.

본 발명에 따른 일부 방법은 단계 (b)의 골전구세포 또는 골아세포, 또는 골전구세포 및/또는 골아세포를 포함하는 세포군을 (b)에서 정의된 배지에 통과(passaging)(예를 들어, 1회 이상 통과)시키고 추가 배양하는 단계 (c)를 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, 비제한적으로 세포는 단계 (c)에서 약 3 내지 18일 동안 배양되어 세포 요법에 특히 만족스러운 골전구세포 또는 골아세포, 또는 골전구세포 및/또는 골아세포를 포함하는 세포군의 양을 생산할 수 있다.

다른 구체예에서, 본 발명의 방법은 (a) MSC를 포함하는, 대상의 생물학적 샘플에서 회수된 세포를 기질 표면에 부착시키고; (b') 부착 세포를 혈장 또는 혈청 및 FGF-2를 포함하는 배지에서 배양하고; (b") 부착 세포를 혈장 또는 혈청, GDF-8 및 FGF-2를 포함하는 배지에서, 예컨대 MSC를 시험관 내 또는 생체 외에서 골전구세포 또는 골아세포, 또는 골전구세포 및/또는 골아세포를 포함하는 세포군으로 분화할 수 있도록 추가로 배양하는 단계를 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 본 발명의 방법은 단계 (b')과 (b") 사이에, 세포를 통과(passaging)시켜 기질 표면에 부착하는 단계 (c')을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 원리를 구현하는 방법은 세포를 통과시키는 1 이상의 단계, 즉 통과를, 예컨대 1, 2, 3, 4 이상의 통과를 추가로 포함할 수 있다. 바람직한 구체예에서, 본 방법은 1, 2 또는 3 통과, 더욱 바람직하게 1 또는 2 통과, 더욱 더 바람직하게 1 통과를 추가로 포함할 수 있다.

이 측면에서, 여기서 사용된 "1차 배양", "2차 배양" 및 "3차 배양"이란 용어는 본 방법에서 각각 통과를 수행하지 않았거나, 1 통과를 수행했거나 2 통과를 수행한, MSC를 포함하는 대상의 생물학적 샘플에서 회수된 세포를 지칭한다. 본 방법에서, 혈장 또는 혈청, GDF-8 및 FGF-2를 포함하는 배지에서 MSC를 배양하는 것은 전형적으로 제한적인 것은 아니나, 1차 배양, 예를 들어 1차 배양의 출발(또는 시작) 또는 1차 배양 내에서부터; 2차 배양, 예를 들어 2차 배양의 출발(또는 시작) 또는 2차 배양 내에서부터; 3차 배양, 예를 들어 3차 배양의 출발(또는 시작) 또는 3차 배양 내에서부터 수행될 수 있다. 바람직하게, 혈장 또는 혈청, GDF-8 및 FGF-2를 포함하는 배지에서 MSC를 배양하는 것은 1차 배양, 예를 들어 1차 배양의 시작 또는 1차 배양 내, 바람직하게 1차 배양의 시작부터 수행될 수 있다.

실시예에 예시된 바와 같이, MSC를 혈장 또는 혈청, GDF-8 및 FGF-2를 포함하는 배지에서 1차 배양의 시작부터 배양하므로써 특별히 감소된 면역원성으로, 보다 구체적으로 감소된 MHC 클래스 II 세포 표면 수용체 발현으로 골전구세포 또는 골아세포, 또는 골전구세포 및/또는 골아세포를 포함하는 세포군을 얻을 수 있다. 실시예에 추가로 예시된 바와 같이, MSC를 혈장 또는 혈청, GDF-8 및 FGF-2를 포함하는 배지에서 1차 배양의 시작부터 배양하는 것은 또한 특히 세포 증식을 자극한다. 따라서, 이같은 본 발명을 예시하는 방법은 대량의 세포체적증대를 이루고, 이식에 특별히 적합한 감소된 면역원성을 갖는 골전구세포 또는 골아세포, 또는 골전구세포 및/또는 골아세포를 포함하는 세포군을 제조하여, 예를 들어 세포가 동종이계 대상에서 거부반응을 거의 유발하지 않기 때문에 특히 유리하다.

다른 구체예에서, 여기에 적시된 방법은 얻어진 골전구세포 또는 골아세포, 또는 골전구세포 및/또는 골아세포를 포함하는 세포군을 골형성, 골유도성 및/또는 골전도성 특성을 갖는 성분과 접촉하는 단계를 포함할 수 있다. 이러한 단계로 특히, 예를 들어 동종이계 대상에 대한 이식에 적합한 약학 조성물의 제조가 가능하다.

여기에서 목적하는 방법과 용도는 특히 바람직하게 동물 세포, 바람직하게 온혈동물 세포, 더욱 바람직하게 포유동물 세포, 예컨대 인간 세포 또는 비인간 포유동물 세포, 가장 바람직하게 인간 세포에 적용할 수 있다. 본 발명의 다른 측면은 본 방법으로 얻어질 수 있는 골전구세포 또는 골아세포, 또는 골전구세포 및/또는 골아세포를 포함하는 세포군을 제공한다. 특히 혈장 또는 혈청, GDF-8 및 FGF-2를 포함하는 배지에서 MSC를 배양하는 단계를 포함하는, 시험관 내 또는 생체 외에서 성체 MSC를 분화하는 위에서 정의된 방법으로 얻어질 수 있는 골전구세포 또는 골아세포, 또는 골전구세포 및/또는 골아세포를 포함하는 세포군을 기술하였다. 본 방법은 일반적으로 골전구세포 또는 골아세포의 실질적 부분, 예를 들어 대부분을 포함하는 세포군을 제조할 수 있다. 이러한 세포군은 또한 다른 세포 종류를 포함할 수 있다.

또한, 본 발명의 측면에서 여기에 기재된 골전구세포 또는 골아세포, 또는 골전구세포 및/또는 골아세포를 포함하는 세포군, 및 적합하게 부형제를 추가로 포함하는 약학 조성물을 제공하며, 바람직하게 적어도 하나의 상기한 부형제는 골형성, 골유도성 및/또는 골전도성 특성을 갖는 성분이다.

본 발명의 다른 측면은 의약으로서, 바람직하게 근골격계 질환의 치료(본 명세서 전체에서 치료적 및/또는 예방적 방법 포함)에서 사용하기 위한 여기에 기재된 골전구세포 또는 골아세포, 또는 골전구세포 및/또는 골아세포를 포함하는 세포군 또는 위에 정의된 약학 조성물을 제공한다. 바람직하게 상기 근골격계 질환은 뼈 질환 또는 골관절 질환일 수 있다. 따라서, 바람직하게 근골격계 질환, 예컨대 비제한적으로 뼈 질환 및/또는 골관절 질환의 치료에서 사용하기 위한, 본 발명의 방법으로 얻어질 수 있는 골전구세포 또는 골아세포, 또는 골전구세포 및/또는 골아세포를 포함하는 세포군을 목적으로 한다.

근골격계 질환의 치료에서 상기한 골전구세포 또는 골아세포, 또는 골전구세포 및/또는 골아세포를 포함하는 세포군의 사용은, 예를 들어 상기한 세포 또는 세포군의 감소된 면역원성으로 인하여 이들이 동종이계 대상에 이식가능하기 때문에 유리하다.

또한, 본 발명에 따라 근골격계 질환, 예를 들어 특히 뼈 질환과 골관절 질환의 치료용 의약의 제조를 위한 여기에 적시된 골전구세포 또는 골아세포, 또는 골전구세포 및/또는 골아세포를 포함하는 세포군의 용도를 제공한다. 따라서, 특별히 근골격계 질환, 예를 들어 비제한적으로 뼈 질환 및/또는 골관절 질환의 치료용 의약 제조를 위한 본 발명의 방법으로 얻어질 수 있는 골전구세포 또는 골아세포, 또는 골전구세포 및/또는 골아세포를 포함하는 세포군의 용도를 목적으로 한다.

또한 본 발명에 따라, 여기에 적시된 골전구세포 또는 골아세포, 또는 골전구세포 및/또는 골아세포를 포함하는 세포군 또는 위에서 정의된 약학 조성물을 근골격계 질환, 특히 뼈 질환 및 골관절 질환의 치료가 필요한 대상에게 투여하는 것을 포함하는, 상기한 치료가 필요한 대상에서 근골격계 질환, 특히 뼈 질환 및 골관절 질환을 치료하는 방법을 제공한다. 특별히 본 발명의 방법으로 얻어질 수 있는 골전구세포 또는 골아세포, 또는 골전구세포 및/또는 골아세포를 포함하는 세포군의 치료적 또는 예방적 유효량을 근골격계 질환의 치료가 필요한 대상에게 투여하는 것을 포함하는, 상기한 대상에서 근골격계 질환을 치료하는 방법을 목적으로 한다.

그러므로, 비제한적으로 하기한 (i') 내지 (viii') 중 어느 하나 및 모두가 본 발명의 이 측면에 의해 제공된다.

(i') 혈장 또는 혈청, 성장 및 분화 인자 8(GDF-8) 및 섬유아세포 성장인자 2(FGF-2)를 포함하는 배지에서 성체 간엽줄기세포(MSC)를 배양하는 단계를 포함하는, 성체 MSC를 시험관 내 또는 생체 외에서 골전구세포 또는 골아세포, 또는 골전구세포 및/또는 골아세포를 포함하는 세포군으로 분화하는 방법;

(ii') (a) MSC를 포함하는, 대상의 생물학적 샘플에서 회수된 세포를 기질 표면에 부착하고;

(b) 부착 세포를 혈장 또는 혈청, GDF-8 및 FGF-2를 포함하는 배지에서, 예컨대 MSC를 시험관 내 또는 생체 외에서 골전구세포 또는 골아세포, 또는 골전구세포 및/또는 골아세포를 포함하는 세포군으로 분화하도록 배양하는 단계를 포함하는 상기 (i')에 기재된 방법;

(iii') 단계 (b)의 골전구세포 또는 골아세포, 또는 골전구세포 및/또는 골아세포를 포함하는 세포군을 (b)에서 정의된 배지에서 통과하고 추가 배양하는 단계 (c)를 추가로 포함하는 상기 (ii')에 기재된 방법;

(iv') (a) MSC를 포함하는, 대상의 생물학적 샘플에서 회수된 세포를 기질 표면에 부착하고;

(b') 부착 세포를 혈장 또는 혈청 및 FGF-2를 포함하는 배지에서 배양하고;

(b") 부착 세포를 혈장 또는 혈청, GDF-8 및 FGF-2를 포함하는 배지에서, 예컨대 MSC를 시험관 내 또는 생체 외에서 골전구세포 또는 골아세포, 또는 골전구세포 및/또는 골아세포를 포함하는 세포군으로 분화하도록 추가 배양하는 단계를 포함하는 상기 (i')에 기재된 방법;

(v') 단계 (b')과 (b") 사이에 세포를 통과시키고 기질 표면에 부착되도록 하는 단계 (c')을 추가로 포함하는 상기 (iv')에 기재된 방법;

(vi') 골전구세포 또는 골아세포, 또는 골전구세포 및/또는 골아세포를 포함하는 세포군을 골형성, 골유도성 및/또는 골전도성 특성을 갖는 성분과 접촉시키는 단계를 추가로 포함하는 상기 (i') 내지 (v') 중 어느 하나에 기재된 방법;

(vii') (i') 내지 (vi') 중 어느 하나의 방법으로 얻어질 수 있는 골전구세포 또는 골아세포, 또는 골전구세포 및/또는 골아세포를 포함하는 세포군 또는 이를 포함하는 약학 조성물;

(viii') 의약으로서, 바람직하게 근골격계 질환, 더욱 바람직하게 근골격계 질환이 뼈 질환 또는 골관절 질환인 경우의 치료에서 사용하기 위한 (vii')에 정의된 골전구세포 또는 골아세포, 또는 골전구세포 및/또는 골아세포를 포함하는 세포군, 또는 (vii)에 정의된 약학 조성물.

본 발명의 상기 및 추가 측면과 바람직한 구체예를 첨부된 특허청구범위와 이하에 기술하였다. 첨부된 특허청구범위의 요지는 본 명세서에 구체적으로 포함되었다.

도 1은 (1) 혈청 및 FGF-2 (대조용), (2) 혈청, FGF-2 및 TGF-베타 1, 및 (3) 혈청, FGF-2 및 GDF-8을 포함하는 배지에서 배양된 세포의 평균 전체 수율(%)을 나타내는 그래프이다.
도 2는 (1) 혈청 및 FGF-2 (대조용), (2) 혈청, FGF-2 및 TGF-베타 1, 또는 (3) 혈청, FGF-2 및 GDF-8을 포함하는 배지에서 1차 배양의 시작부터 배양된 세포의 HLA-DR 발현율(%)을 나타내는 그래프이다.
도 3은 (1) 혈청 및 FGF-2, (2) 혈청, FGF-2 및 TGF-베타 1, 또는 (3) 혈청, FGF-2 및 GDF-8을 포함하는 배지에서 1차 배양의 시작부터 배양된 세포의 알칼리 포스파타제(ALP)의 발현율(%)을 나타낸 그래프이다.
도 4는 (1) 혈청 및 FGF-2 (대조용), (2) 혈청, FGF-2 및 TGF-베타 1, 또는 (3) 혈청, FGF-2 및 GDF-8을 포함하는 배지에서 1차 배양의 시작부터 배양된 세포의 상징액에서, (4) IL6, (5) VEGF, (6) 데코린(decorin) 및 (7) 오스테오프로테게린(osteoprotegerin) 각각의 농도(pg/ml)를 나타낸 그래프이다.
도 5는 혈청 및 FGF-2 (FGF-2); 혈청, FGF-2 및 TGF-베타 1 (TGF-베타 1); 또는 혈청, FGF-2 및 GDF-8 (GDF-8)을 포함하는 배지에서 1차 배양의 시작부터 배양된 세포의 2차 배양 후의 미네랄화(mineralization)를 나타낸 어세이이다. C: 대조용 배지, M: 골형성 배지.
도 6은 (6) 혈청 및 FGF-2 (대조용), (7) 혈청, FGF-2 및 TGF-베타 1, 또는 (8) 혈청, FGF-2 및 GDF-8을 포함하는 배지에서 (5) 4일 동안 세포를 배양하기 전과 3차 배양의 세포를 4일 동안 배양한 후 포지티브 세포의 백분율을 나타내는 그래프이다. 1: CD45, 2: CD105, 3: HLA-DR.
도 7은 (1) 혈청 및 FGF-2 (대조용), (2) 혈청, FGF-2 및 1 ng/ml TGF-베타 1 (3) 혈청, FGF-2 및 50 ng/ml GDF-8, (4) 혈청, FGF-2 및 100 ng/ml GDF-8, 또는 (5) 혈청, FGF-2 및 200 ng/ml GDF-8을 포함하는 배지에서 3차 배양의 세포를 6일 동안 배양한 후 세포의 HLA-DR 발현율(%)을 나타낸 그래프이다.
도 8은 (1) 혈청, FGF-2 및 GDF-8, 및 (2) 혈청 및 GDF-8을 포함하는 배지에서 1차 배양의 시작부터 배양된 1 뱃치 세포의 1차 및 2차 배양의 전체 수율(%)을 나타낸 그래프이다.
도 9는 (1) 혈청 및 FGF-2, (2) 혈청, FGF-2 및 GDF-8, 또는 (3) 혈청 및 GDF-8을 포함하는 배지에서 1차 배양의 시작부터 배양된 1 뱃치로부터의 세포의 알칼리 포스파타제(ALP) 발현율(%)을 나타낸 그래프이다.
도 10은 (1) 혈청 및 FGF-2, (2) 혈청, FGF-2 및 GDF-8, 또는 (3) 혈청 및 GDF-8을 포함하는 배지에서 1차 배양의 시작부터 배양된 1 뱃치로부터의 세포의 HLA-DR 발현율(%)을 나타낸 그래프이다.

여기서 사용된, 단수 형태는 내용상 명백하게 달리 지적하지 않는 한 단수와 복수 지시대상 모두를 포함한다.

여기서 사용된, "포함하는", "포함하다" 및 "포함되는"이란 용어는 "함유하는", "함유하다" 또는 "이루어지는", "이루어지다"와 동의어이며, 포괄적이거나 개방형이고, 추가적인 인용되지 않은 부재, 요소 또는 방법 단계를 배제하지 않는다. 또한 이 용어는 "구성하는" 및 "본질적으로 구성하는"을 포괄한다.

종결점에 의한 수치 범위 한정에는 언급된 종결점뿐 아니라 각 범위 내에 포함되는 모든 숫자 및 분수가 포함된다.

파라미터, 양, 시간적 기간 등과 같은 측정값을 언급하는 경우 여기서 사용된 "약"이란 용어는, 구체적인 값의 그리고 그로부터의 변화값, 특히 구체적인 값의 그리고 그로부터의 +/-10% 이하, 바람직하게 +/-5% 이하, 더욱 바람직하게 +/-1% 이하, 더욱 더 바람직하게 +/-0.1% 이하의 변화값을, 이러한 변화값이 기술된 발명에서 수행하기에 적합하다면 포함하는 것을 의미한다. 수식어 "약"으로 언급되는 값은 그 자체가 또한 구체적으로, 그리고 바람직하게 기술되는 것으로 이해되어야 한다.

예컨대 일 군의 멤버 중 하나 이상의 멤버처럼 "하나 이상"이란 용어는 그 자체가 명확하지만, 다른 예를 들자면 이 용어는 특히 상기한 멤버들 중 어느 하나, 또는 이들 중 둘 이상, 예컨대 이들 중 ≥3, ≥4, ≥5, ≥6 또는 ≥7 등, 및 이들 전체를 지칭한다.

본 명세서에서 인용된 모든 문헌은 여기에 그 전체가 참조로 포함되었다.

달리 명시되지 않는 한, 본 발명을 기술하는데 사용된 모든 용어는 기술적 및 과학적 용어를 포함하여 본 발명이 속하는 분야에서 숙련된 사람들이 통상적으로 이해하는 의미를 갖는다. 추가적인 정보의 수단으로 용어 정의를 포함시켜서 본 발명의 요지를 보다 잘 이해시킬 수 있다.

세포 배양 및 배지 사용의 일반적 기술은 특히 대량의 포유동물 세포 배양(Large Scale Mammalian Cell Culture, Hu et al. 1997. Curr Opin Biotechnol 8: 148); 무혈청 배지(Serum-free Media, K. Kitano. 1991. Biotechnology 17: 73); 또는 대량의 포유동물 세포 배양(Large Scale Mammalian Cell Culture, Curr Opin Biotechnol 2: 375, 1991)에 요약되어 있다.

언급한 바와 같이, 본 발명자들은 본 발명의 측면에 따라 혈장 또는 혈청, 성장 및 분화 인자 8(GDF-8) 및 섬유아세포 성장인자 2(FGF-2)를 포함하는 배지에서 성체 간엽줄기세포(MSC)를 배양하는 단계를 포함하는, 성체 MSC를 시험관 내 또는 생체 외에서 골전구세포 또는 골아세포, 또는 골전구세포 및/또는 골아세포를 포함하는 세포군으로 분화하는 방법을 발견하였다.

이러한 발견에서 나아가, 본 발명자들은 세포의 면역원성을 감소하는 GDF-8의 능력을 인식하였고, 본 발명의 특정 측면에서 GDF-8을 사용하여 세포의 면역원성을 시험관 내 또는 생체 내에서 감소하는 용도, 방법 및 생성물을 제공하였다. 관련된 본 발명의 측면에 있어서, 본 발명자들은 GDF-8을 사용하여 대상에 투여, 임플란트 또는 이식된 물질에 대한 대상의 거부 위험을 저감하는 용도, 방법 및 생성물을 고려하였다.

여기서 사용된 "면역원성"이란 용어는 인간 또는 동물의 체내에서 면역반응을 일으키는 세포 같은 특정 물질의 작용을 지칭한다. 이러한 작용은 세포 상의 항원 또는 에피토프 같은 면역원에 의존한다. 이러한 면역원은, 예를 들어 비제한적으로 주조직적합성 복합체(major histocompatibility complex (MHC)) 클래스 II 세포 표면 수용체 복합체, 예컨대 인간백혈구항원(HLA), 바람직하게 HLA-DR일 수 있다. 여기서 사용된 "HLA-DR"이란 용어는 그 자체로 공지되어 있으며, 구체적으로 염색체 6 영역 6p21.31 상의 인간백혈구항원 복합체로 코딩되는 MHC 클래스 II 세포 표면 수용체 복합체를 지칭한다. 면역원성은 또한 면역반응에서 공동자극 신호를 제공하는 공동자극인자에 따라 다를 수 있다. 이러한 공동자극인자는, 예를 들어 하나 이상의 분화 80의 클러스터(CD80 또는 B7-1) 또는 분화 86의 클러스터(CD86 또는 B7-2)일 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.

따라서, 다른 측면에서, 본 발명은 시험관 내에서 세포의 면역원성을 감소하는 GDF-8의 용도를 제공한다. 감소된 면역원성은 GDF-8 없이 배양된 세포에서 MHC 클래스 II 세포 표면 수용체 복합체를 나타내는 개별 참고치와 비교하여 감소된 MHC 클래스 II 세포 표면 수용체 복합체를 포함할 수 있다. 예를 들어, 인간 세포에서 감소된 면역원성은 GDF-8 없이 배양된 세포에서 HLA MHC 클래스 II 세포 표면 수용체 복합체를 나타내는 개별 참고치와 비교하여 감소된 HLA MHC 클래스 II 세포 표면 수용체 복합체를 포함할 수 있다. 바람직하게, 감소된 면역원성은 GDF-8 없이 배양된 세포에서 HLA-DR을 나타내는 개별 참고치와 비교하여 감소된 HLA-DR을 포함한다. "저하된", "감소하는", "약화한" 또는 "저감된"은 여기에서 상호교환적으로 사용될 수 있다.

"감소된 MHC 클래스 II 세포 표면 수용체 복합체", "감소된 HLA MHC 클래스 II 세포 표면 수용체 복합체" 또는 "감소된 HLA-DR"이란 MHC 클래스 II 세포 표면 수용체 복합체, HLA MHC 클래스 II 세포 표면 수용체 복합체 또는 HLA-DR 각각의 세포 상에서 감소된 양 및/또는 이용가능성(availability)(예를 들어, 그의 생물학적 활성을 수행하는 이용가능성)을 지칭한다.

여기서 사용된 "세포 상에서 HLA-DR을 감소한다"란 세포 상에서 HLA-DR의 감소된 양 및/또는 이용가능성(예를 들어, 그의 생물학적 활성을 수행하는 이용가능성)을 지칭한다. 감소된 양 및/또는 이용가능성은 세포 상에서 HLA-DR의 감소된 양 및/또는 세포군에서 HLA-DR을 발현하는 세포의 감소된 분율을 포함한다.

예를 들어, 비제한적으로, 감소된 양 및/또는 이용가능성이 GDF-8 없이 배양된 세포에서 HLA-DR을 나타내는 개별 참고치와 비교하여 세포군에서 HLA-DR을 발현하는 세포의 감소된 분율을 포함하는 경우, 25% 미만의 세포, 바람직하게 20% 미만의 세포, 더욱 더 바람직하게 15% 미만의 세포가 HLA-DR을 발현할 수 있다.

본 발명의 다른 측면은 세포의 면역원성을 감소하는데 사용하기 위한 GDF-8에 관한 것으로, 여기서 GDF-8은 생체 내에 투여될 수 있다. GDF-8은 국소적으로, 예를 들어 근골격계 병소 부위에, 예를 들어 주사로 투여될 수 있다. GDF-8은 단독으로 또는 세포, 예컨대 줄기세포, 바람직하게 MSC, 바람직하게 인간의 성체 MSC, 및/또는, 골전구세포 또는 골아세포 같은 세포, 또는 골전구세포 및/또는 골아세포를 포함하는 세포군과 조합하여 투여할 수 있고, 바람직하게 여기에서 이러한 세포들은 인간 유래일 수 있다. 바람직하게, GDF-8은 MSC, 더욱 바람직하게 인간의 성체 MSC와 조합하여 투여할 수 있다. 그러므로, GDF-8이 MSC, 바람직하게 인간의 성체 MSC와 생체 내 투여될 수 있는, 세포의 면역원성을 감소하는데 사용하기 위한 GDF-8을 추가로 제공한다. GDF-8은 또한, 임의로 상기한 세포와 조합하여 FGF-2와 동시 투여될 수 있다. 바람직하게, 상기 투여가 수행될 수 있는 대상은 인간일 수 있다. 바람직하게, 투여될 세포 또는 세포군은 대상에 대해 자기유래이거나 동종이계일 수 있다. GDF-8과, MSC 같은 각 세포 또는 세포군은 동시에 생체 내 투여되거나, 순차적으로 임의 순서로 생체 내 투여될 수 있으며, 예를 들어 각 세포 또는 세포군, 예컨대 MSC를 생체 내 투여하고 이어서 GDF-8을 생체 내 투여하거나, GDF-8을 생체 내 투여하고 이어서 각 세포 또는 세포군, 예컨대 MSC를 생체 내 투여할 수 있다. 따라서, 세포의 면역원성을 감소하는 의약의 제조를 위한 GDF-8의 용도를 기술하였으며, 여기서 GDF-8은 생체 내 투여할 수 있고; 또한 GDF-8을 대상에게 투여하는 것을 포함하는 세포 면역원성의 감소가 필요한 대상에서 세포의 면역원성을 감소하는 방법을 기술하였다.

본 발명의 다른 측면은 의약, 바람직하게 근골격계 질환, 예를 들어 뼈 질환 및 골관절 질환의 치료에 사용하기 위한 GDF-8을 제공하는 것이다. 따라서, 또한 근골격계 질환, 예를 들어 뼈 질환 및 골관절 질환의 치료용 의약의 제조를 위한 GDF-8의 용도를 제공한다. 추가로 대상에게 GDF-8을 투여하는 것을 포함하는, 근골격계 질환, 예를 들어 뼈 질환 및 골관절 질환의 치료가 필요한 대상에서 이를 치료하는 방법을 제공한다. 특히 대상에게 치료학적 또는 예방학적으로 유효한 양의 GDF-8을 투여하는 것을 포함하는, 근골격계 질환의 치료가 필요한 대상에서 근골격계 질환을 치료하는 방법을 목적으로 한다. 의약으로서 사용할 경우, GDF-8은 단독으로, 또는 줄기세포 같은 세포, 바람직하게 MSC, 바람직하게 인간의 성체 MSC, 및/또는 골전구세포 또는 골아세포, 또는 골전구세포 및/또는 골아세포를 포함하는 세포군과 조합하여 투여할 수 있고, 바람직하게 여기에서 이러한 세포는 인간일 수 있다. 바람직하게, GDF-8은 MSC, 더욱 바람직하게 인간의 성체 MSC와 조합하여 투여할 수 있다. 그러므로, 특히 의약으로서, 바람직하게 근골격계 질환, 예를 들어 뼈 질환 및 골관절 질환의 치료에서 사용하기 위한 GDF-8을 기술하였으며, 여기에서 GDF-8은 MSC, 바람직하게 인간의 성체 MSC와 함께 생체 내 투여될 수 있다. GDF-8은 임의로 상기한 세포와 조합하여 추가로 FGF-2와 동시 투여될 수 있다. 또한, 대상에게 GDF-8을 MSC, 바람직하게 인간의 성체 MSC와 함께 투여하는 것을 포함하는, 근골격계 질환, 예를 들어 뼈 질환 및 골관절 질환의 치료가 필요한 대상에서 이를 치료하는 방법을 제공한다. 바람직하게, 투여가 수행될 대상은 인간일 수 있다. 바람직하게, 투여될 세포 또는 세포군은 대상에 대해 자기유래 또는 동종이계일 수 있다.

상기한 바와 같이, 본 발명은 일 측면에서 성체 간엽줄기세포(MSC)를 시험관 내 또는 생체 외에서 골전구세포 또는 골아세포, 또는 골전구세포 및/또는 골아세포를 포함하는 세포군으로 분화하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 GDF-8을 시험관 내 또는 생체 내에서 세포의 면역원성을 감소하는데 적용하는 것에 관한 것으로, 특히 세포는 MSC, MSC의 분화로 얻어진 세포, 골세포 계통의 세포, 연골세포 계통의 세포, 지방세포 계통의 세포, 근세포 계통의 세포, 힘줄세포 계통의 세포, 섬유아세포 계통의 세포, 및 스트로모젠 계통의 세포로 구성되는 군에서 선택된다.

여기서 사용된, "골전구세포 및/또는 골아세포를 포함하는 세포군"은 언급된 세포 종류 중 어느 하나 또는 둘 다를 포함하고 임의로 다른 언급되지 않은 세포 종류를 추가로 함유하는 세포군을 지칭한다.

여기서 사용된, "골전구세포(osteoprogenitor)"는 특히 조기 및 후기 골전구세포를 포함할 수 있다. "골아세포(osteoblastic cell)"는 특히 조골아세포, 골아세포 및 골세포를 포함할 수 있다. 이 용어들은 모두 그 자체로 공지되어 있으며, 여기서 사용될 경우 전형적으로 골형성 표현형을 갖고, 뼈 물질 또는 뼈 매트릭스의 형성에 기여하거나, 기여할 수 있는 세포로 발달할 수 있는 세포를 지칭한다. 구체적으로, 본 방법은 유리하게 이식, 또는 근골격계 질환의 치료, 예를 들어 치료적 세팅에서 뼈 형성을 회복하는데 유용한 세포와 세포군을 생성한다. 따라서, "골전구세포"(조기 및 후기 골전구세포 포함)와 "골아세포"(조골아세포, 골아세포 및 골세포 포함)라는 용어는 본 발명의 원리를 적용한 방법에서 얻어진 골형성 계통의 상기한 유용한 세포를 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 골형성 계통의 유용한 세포는 그리하여 성숙한 뼈 형성 세포로의 골형성 분화 단계의 세포를 포함할 수 있다.

추가 정보의 의미로 및 비제한적으로, 골전구세포 및 골아세포, 및 골전구세포 및/또는 골아세포를 포함하는 세포군은 이하의 특징을 나타낼 수 있다:

a) 세포는 골아세포 분화를 조절하는 다작용성 전사인자인 Runx2의 발현과 골아세포 분화 동안 수많은 세포외 매트릭스 단백질 유전자의 발현을 포함한다;

b) 세포는 알칼리 포스파타제 (ALP), 보다 구체적으로 뼈-간-신장 타입의 ALP 중 적어도 하나의 발현을 포함하며; 또한 더욱 바람직하게 하나 이상의 추가적 뼈 마커, 예컨대 오스테오칼신(osteocalcin)(OCN), 프로콜라겐(procollagen) 타입 1 아미노-말단 프로펩티드(P1NP), 오스테오넥틴(osteonectin)(ON), 오스테오폰틴(osteopontin)(OP) 및/또는 뼈 시알로프로테인 (BSP), 및/또는 하나 이상의 추가적 뼈 매트릭스 단백질, 예컨대 데코린 및/또는 오스테오프로테게린(OPG)의 발현을 포함한다;

c) 세포는 CD45를 실질적으로 발현하지 않는다(예를 들어, 약 10% 미만, 바람직하게 약 5% 미만, 더욱 바람직하게 약 2% 미만의 세포가 CD45를 발현할 수 있다);

d) 세포는 외부 환경을 미네랄화하거나, 칼슘을 함유하는 세포외 매트릭스를 합성하는 능력의 증거를 나타내고 있다(예를 들어, 골형성 배지에 노출된 경우; Jaiswal et al. J Cell Biochem, 1997, vol. 64, 295-312 참조). 세포 내부의 칼슘 축적과 매트릭스 단백질로의 침착은 일반적으로, 예를 들어 ⁴⁵Ca^{2 +}에서의 배양, 세척 및 재배양한 다음, 세포 내부에 존재하거나 세포외 매트릭스에 퇴적된 방사능을 측정(US 5,972,703)하거나 알리자린 레드(Alizarin red)에 기초한 미네랄화 어세이(예를 들어, Gregory et al. Analytical Biochemistry, 2004, vol. 329, 77-84 참조)를 사용하여 측정할 수 있다;

e) 세포는 지방세포 계통(예를 들어, 지방세포) 또는 연골세포 계통(예를 들어 연골세포)의 세포 중 어떤 것으로도 실질적으로 분화하지 않는다. 이러한 세포 계통들로의 분화가 없다는 것은 당업계에서 구축된 표준 분화 유도 조건(예를 들어, Pittenger et al. Science, 1999, vol. 284, 143-7 참조) 및 어세이 방법(예를 들어, 유도될 때 지방세포는 전형적으로 오일 레드 O로 염색되어 지방 축적을 나타내고; 연골세포는 전형적으로 알시안 블루(alcian blue) 또는 사프라닌(safranin) O로 염색된다)을 사용하여 시험할 수 있다. 실질적으로 지방세포화 및/또는 연골세포화 분화 경향의 결핍은 전형적으로 시험된 세포 20% 미만, 또는 10% 미만, 또는 5% 미만, 또는 1% 미만이 각각의 시험에 적용될 때 지방세포화 또는 연골세포화 분화 신호를 나타낸다는 것을 의미할 수 있다.

세포는 또한 하나 이상의 세포 보충인자, 예컨대 VEGF의 발현을 포함할 수 있다. 세포는 또한 IL6의 발현을 포함할 수 있다.

골세포(뼈) 계통, 연골세포(연골) 계통, 지방세포(지방) 계통, 근세포(근육) 계통, 힘줄세포(힘줄) 계통, 섬유아세포(결합조직) 계통, 또는 스트로모젠(스트로마) 계통을 구성하거나 이에 속하는 것으로 분류된 세포들은 당업자들에게 잘 알려져 있다. 이들은 각각의 표현형을 가지며, 개별 조직 종류의 형성에 기여할 수 있거나, 기여할 수 있는 세포로 발달할 수 있는 세포를 포함한다. 추가 정보 및 실시예의 방법으로, 골세포 계통의 세포는 골전구세포, 예컨대 조기 및 후기 골전구세포, 조골아세포, 골아세포 및 골세포를 포함하고; 연골세포 계통의 세포는 연골아세포 및 연골세포를 포함하고, 후자는 또한 비후성 연골세포를 포함하며; 지방세포 계통의 세포는 지방아세포(또는 전(pre)-지방세포) 및 지방세포를 포함하고; 근세포 계통의 세포는 위성 세포, 근아세포, 및 근세포(모든 근육 조직 종류의 세포. 즉 심장, 골격 및 평활근 조직, 더욱 바람직하게 골격근 조직의 세포가 예상된다)를 포함하며; 힘줄세포 계통의 세포는 힘줄아세포 및 힘줄세포를 포함하고; 섬유아세포 계통의 세포는 섬유세포 및 섬유아세포를 포함하고; 스트로모젠 계통의 세포는 스트로말(stromal) 세포, 예컨대 특히 골수 스트로말 세포를 포함한다.

세포가 특정 마커에 대해 포지티브라고 할 경우(또는 특정 마커를 발현하거나 그의 발현을 포함한다고 할 경우), 이것은 당업자들이 그 마커에 대한, 별개 시그널의 존재 또는 증거를, 예를 들어 역전사 폴리머라제 사슬 반응에 의한 항체 검출가능한 또는 검출을 적합한 대조군과 비교하여 적절한 측정을 수행할 때 결론지을 수 있다는 것을 의미한다. 이 방법으로 마커의 정량적 평가가 가능할 경우, 포지티브 세포는 평균적으로 대조군과는 상당히 다른 시그널, 예를 들어 비제한적으로 대조용 세포로 생성된 시그널보다 적어도 1.5 배 더 높은, 예를 들어 적어도 2 배, 적어도 4 배, 적어도 10 배, 적어도 20 배, 적어도 30 배, 적어도 40 배, 적어도 50 배 더 높은 시그널을 생성할 수 있다.

상기한 세포 특이적 마커의 발현은 당분야에서 공지된 적합한 면역학적 기술, 예컨대 면역세포화학 또는 친화성 흡착, 웨스턴 블롯 분석, FACS, ELISA, 등에 의해, 또는 효소 활성(예를 들어, ALP용)의 적합한 생화학적 어세이, 또는 마커 mRNA의 양을 측정하는 적합한 기술, 예를 들어 노던 블롯, 반정량 또는 정량 RT-PCR, 등을 사용하여 검출할 수 있다. 본 명세서에 나열된 마커에 대한 서열 데이터는 공지되어 있으며 GenBank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) 같은 공개 데이터베이스로부터 얻을 수 있다.

언급된 바와 같이, 본 발명은 또한 골전구세포 또는 골아세포를 포함하는 세포군에 관한 것이다. 예시적인 세포군은 적어도 10%, 바람직하게 적어도 30%, 더욱 바람직하게 적어도 50%, 예를 들어 적어도 60%, 더 더욱 바람직하게 적어도 70%, 예를 들어 적어도 80%, 보다 더 바람직하게 적어도 90%, 예를 들어 적어도 95%의 여기서 적시된 골전구세포 및/또는 골아세포를 포함할 수 있다. 예를 들어, 세포군은 50% 미만, 바람직하게 40% 미만, 더 더욱 바람직하게 30% 미만, 보다 더 바람직하게 20% 미만, 보다 더 바람직하게 10% 미만, 예를 들어 7% 미만, 5% 미만 또는 2% 미만의 여기서 정의된 골전구세포 및 골아세포 이외의 세포 종류를 포함할 수 있다.

"줄기세포" 라는 용어는 일반적으로, 자가-부활할 수 있는, 즉 분화 없이 증식가능한 비특화된 또는 비교적 덜 특화된 증식-잠재능 세포를 지칭하고, 이것 또는 이의 후손은 적어도 하나의 상대적으로 더 특화된 세포 종류를 발생시킬 수 있다. 상기 용어는 실질적으로 비제한된 자가-부활이 가능한, 즉 줄기세포의 후손 또는 적어도 그의 일부가 모 줄기세포의 비특화된 또는 비교적 덜 특화된 표현형, 분화 가능성, 및 증식 능력을 실질적으로 보유하는 줄기세포뿐 아니라, 제한된 자가-부활을 나타내는, 즉 추가의 증식 및/또는 분화에 대한 후손 또는 그의 일부의 능력이 모 세포와 비교하여 현저하게 감소된 줄기세포를 포함한다. 예를 들어 비제한적으로, 줄기세포는 하나 이상의 계통을 따라 분화할 수 있는 자손을 발생하여, 점점 더 상대적으로 더욱 특화된 세포를 생성하며, 심지어 후-유사분열일 수 있는 종결적으로 분화된 세포, 즉 완전히 특화된 세포를 생성할 수 있으며, 상기 자손 및/또는 점점 더 비교적 더욱 특화된 세포는 그들 자체가 본원에서 정의되는 바와 같은 줄기세포일 수 있다.

여기서 사용되는 "성체 줄기세포" 라는 용어는 태아 단계에서 또는 출생 후, 예를 들어 성년에 이른 후 유기체 내에 존재하는 또는 이로부터 수득(예컨대 이로부터 단리)된 줄기세포를 지칭한다.

본 발명에 따른 바람직한 줄기세포는 적어도 골형성(뼈) 계통, 예컨대 골형성 세포 및/또는 골전구세포 및/또는 조골아세포 및/또는 골아세포 및/또는 골세포 등의 세포를 생성하는 잠재력을 갖는다.

바람직하게, 본 발명에 따른 줄기세포의 적어도 일부는 또한 본 방법으로부터 얻어진 세포군으로 이루어진 다른 세포, 예컨대 내피 계통의 세포, 예를 들어 내피 전구세포 및/또는 내피 세포를 생성하는 잠재력을 갖는다.

여기서 사용되는 "간엽줄기세포" 또는 "MSC" 라는 용어는, 예를 들어 골세포성(뼈), 연골세포성(연골), 근육세포성(근육), 힘줄세포성(힘줄), 섬유아세포성(결합조직), 지방세포성(지방) 및 스트로모젠(골수 스트로마) 계통인 간엽 계통의 세포, 전형적으로 둘 이상의 간엽 계통의 세포를 발생시킬 수 있는 성체, 중배엽-유래 줄기세포를 지칭한다. MSC는, 예를 들어 골수, 해면골, 혈액, 탯줄, 태반, 태아 난황 주머니, 피부(진피), 특히 태아 및 청년기 피부, 골막 및 지방 조직으로부터 단리될 수 있다. 인간 MSC, 그의 단리, 시험관 내 증식 및 분화는, 예를 들어 미국 특허 제5,486,359호; 미국 특허 제5,811,094호; 미국 특허 제5,736,396호; 미국 특허 제5,837,539호; 또는 미국 특허 제5,827,740호에서 기술되었다. 당분야에서 기술되고 당분야에서 기술된 방법으로 단리된 MSC는 본 방법에 적합할 수 있으나, 단 이러한 MSC는 적어도 골세포(뼈) 계통의 세포를 생성할 수 있다.

MSC라는 용어는 또한 MSC의 후손, 예를 들어 동물 또는 사람 대상의 생물학적 샘플에서 얻어진 MSC의 시험관 내 또는 생체 외 증식으로 얻어진 후손을 포함한다.

잠재적으로, 그러나 비제한적으로, 적어도 일부 MSC는 또한 본 방법으로부터 얻어진 세포군 내에 포함된 다른 세포를 생성할 수 있다.

실시예에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 특정 측면의 방법은 특화된 배양 조건 하에서 기질 표면에 부착하는 골수 줄기세포(BMSC)의 선별을 수반할 수 있다. MSC를 기질 표면, 예를 들어 플라스틱 표면에 부착할 수 있는 이러한 (단핵)세포를 선별하여 골수(또는 다른 공급원)로부터 단리할 수 있다는 것은 당분야에 공지되어 있다. 따라서, 바람직하게 여기서 사용된 MSC는 골수로부터 단리할 수 있다. 골수 샘플(BMSC)은, 예를 들어 장골능, 대퇴골, 경골, 척추, 갈비뼈 또는 대상의 다른 골수 공간으로부터 얻을 수 있다.

특정 성분과 관련하여 "단리하는"이란 용어는 그 성분을 이 성분이 단리되고 있는 조성물의 하나 이상의 다른 성분으로부터 분리하는 것을 나타낸다. 임의의 세포 종류 또는 세포군과 관련하여 여기에서 사용된 "단리된"이란 용어는 또한 그러한 세포군이 동물 또는 인간 신체의 일부를 형성하지 않는 것을 의미한다.

MSC는 생물학적 샘플, 예를 들어 BMSC를 포함하는 샘플 내에 포함되어 있거나, 당분야에서 알려진 바와 같이 이들로부터 적어도 부분적으로 단리될 수 있다. 또한, MSC는 골수로부터, 또는 골수 이외의 MSC를 포함하는 적합한 공급원, 예를 들어 혈액, 탯줄, 태반, 태아 난황 주머니, 피부(진피), 특히 태아 및 청년기 피부, 골막 및 지방 조직으로부터 적어도 부분적으로 단리될 수 있다.

"시험관 내(in vitro)"라는 용어는 일반적으로 동물 또는 인간 신체의 외면, 또는 외부를 나타낸다. "생체 외(ex vivo)"라는 용어는 전형적으로 동물 또는 인간 신체에서 떼어내어 신체 외부, 예를 들어 배양 용기에서 유지 또는 증식된 조직 또는 세포를 지칭한다. 여기서 사용된 "시험관 내"라는 용어는 "생체 외"를 포함하는 것으로 이해되어야 한다. "생체 내(in vivo)"라는 용어는 일반적으로 동물 또는 사람 신체의 내면, 내측 또는 내부를 나타낸다.

일 구체예에서, 여기에서 고려된 MSC 또는 다른 세포 종류는 대상의 생물학적 샘플에서 얻을 수 있다.

"대상" 또는 "환자"라는 용어는 상호교환적으로 사용되며, 치료, 관찰 또는 실험의 목적이 되는 동물, 바람직하게 온혈동물, 더욱 바람직하게 척추동물, 더 더욱 바람직하게 구체적으로 인간 및 비-인간 포유동물을 포함한 포유동물을 지칭한다. "포유동물"이란 용어에는 인간, 가축 및 농장 동물, 동물원 동물, 스포츠 동물, 애완 동물, 반려 동물 및 실험 동물처럼 분류된 동물, 예를 들어 마우스, 래트, 햄스터, 토끼, 개, 고양이, 기니아 피그, 소, 젖소, 양, 말, 돼지 및 영장류, 예를 들어 원숭이 및 유인원이 포함되나, 이에 제한되지 않는다. 특히 바람직한 것은 양 성별 및 모든 연령 카테고리가 포함되는 인간 대상이다.

따라서, 인간 성체 MSC를 시험관 내 또는 생체 외에서 골전구세포 또는 골아세포, 또는 골전구세포 및/또는 골아세포를 포함하는 세포군으로 분화하는 방법을 제공하고, 이 방법은 MSC를 인간 혈장 또는 혈청, GDF-8 및 FGF-2를 포함하는 배지에서 배양하는 단계를 포함한다.

비인간 동물 대상들은 또한 동물의 태어나긴 전 형태, 예를 들어 배아 또는 태아를 포함할 수 있다. 인간 대상들 또한 태아를 포함하지만, 바람직하게 배아는 포함하지 않는다.

여기에서 사용된 "생물학적 샘플" 또는 "샘플"이란 용어는 일반적으로, 예를 들어 유기체, 기관, 조직 또는 세포 배양물 등의 생물학적 공급원에서 얻어진 샘플을 지칭한다. 동물 또는 인간 대상의 생물학적 샘플은 동물 또는 인간 대상에서 떼어낸 이들의 세포를 포함하는 샘플을 지칭한다. 동물 또는 인간 대상의 생물학적 샘플은 하나 이상의 조직 종류와 하나 이상의 조직 종류의 세포를 포함할 수 있다. 동물 또는 인간 대상의 생물학적 샘플을 얻는 방법은 당분야에 공지되어 있으며, 예를 들어 조직 생검 또는 채혈이 있다.

대상의 유용한 생물학적 샘플은 그의 MSC 또는 여기에서 고려된 대상의 다른 세포 종류를 포함한다. MSC를 포함하는 샘플은 전형적으로 골수, 예를 들어 장골능, 대퇴골, 경골, 척추, 갈비뼈 또는 대상의 다른 골수 공간으로부터 얻을 수 있다. MSC를 포함하는 다른 유용한 생물학적 샘플은, 예를 들어 대상에서 얻어진 혈액, 탯줄, 태반, 태아 난황 주머니, 피부(진피), 특히 태아 및 청년기 피부, 골막, 해면골(trabecular bone) 또는 지방 조직에서 유도될 수 있다. 여기서 언급된 다른 세포 종류들은 입수할 수 있는 방법을 사용하여 그들이 있는 상응하는 조직으로부터 단리할 수 있으며, 예를 들어 뼈 조직으로부터 골세포 계통 세포, 연골조직으로부터 연골세포 계통 세포, 지방 조직으로부터 지방세포 계통 세포, 평활근, 심장근 또는 골격근(바람직하게 골격) 조직에서 근세포 계통 세포, 힘줄 조직에서 힘줄세포 계통 세포, 결합조직에서 섬유아세포 계통 세포, 또는 골수 스트로마 같은 스트로마 조직에서 스트로모젠 계통 세포를 단리할 수 있다. 선택적으로, 이러한 세포 종류는 공지된 방법 그 자체를 사용하여 MSC로부터 분화할 수 있다.

일 구체예에서, MSC는 건강한 대상으로부터 얻을 수 있으며, 이렇게 함으로써 상기 MSC로부터 분화된, 골전구세포 또는 골아세포 또는, 골전구세포 및/또는 골아세포를 포함하는 세포군, 또는 여기서 고려된 다른 세포 종류들의 작용성을 확보할 수 있다. 다른 구체예에서, MSC 또는 여기서 고려된 다른 세포 종류는 건강한 대상으로부터 얻어질 수 있으며, 이렇게 하여 세포들의 작용성을 확보할 수 있다.

다른 구체예에서, MSC는 근골격계 질환, 예컨대 뼈 질환의 위험이 있거나, 이 질환을 갖는, 그리하여 본 발명의 방법에 따라 상기 MSC로부터 분화된, 골전구세포 또는 골아세포, 또는 골전구세포 및/또는 골아세포를 포함하는 세포군의 투여가 특히 유리할 수 있는 대상에서 얻어질 수 있다.

또다른 구체예에서, MSC 또는 여기에서 고려된 다른 세포 종류는 MSC 또는 여기서 고려된 다른 세포 종류 하나 이상의 투여로 유리할 수 있는 조직에 불리하게 영향을 미치는 질환의 위험에 있거나 이 질환이 있는 대상에서 얻어질 수 있다.

여기서 사용된, "근골격계 질환"이란 용어는 임의 종류의 뼈 질환, 근육 질환, 골관절 질환 또는 연골 위축증(chondrodystrophy)을 지칭하며, 그의 치료는 골형성 계통 세포, 예를 들어 골전구세포 또는 골아세포, 또는 골전구세포 및/또는 골아세포를 포함하는 세포군을 이 질환이 있는 대상에게 투여하므로써 유리해질 수 있다. 구체적으로, 이러한 질환은, 예를 들어 골형성 감소 또는 과도한 골흡수, 뼈에 존재하는 골아세포 또는 골세포의 수, 생존력 또는 작용 감소, 대상의 골질량 감소, 뼈의 박화(thinning), 뼈 강도 또는 탄성 약화 등을 특징으로 할 수 있다.

여기서 적시된 골전구세포 또는 골아세포, 또는 골전구세포 및/또는 골아세포를 포함하는 세포군의 투여로 유리해질 수 있는 근골격계 질환의 비제한적 예는 국소적 또는 전신적 장애, 예컨대 골다공증 또는 골감소증(예를 들어 원발성, 폐경, 치매, 코르티코이드(corticoid) 유도성, 비스포스포네이트 유도성 및 방사선 치료로 유도된); 2차, 모노 - 또는 다점 골괴사증; 모든 유형의 골절, 예를 들어 유합불능(non-union), 부정유합, 지연 유합 골절 또는 압축, 뼈 융합을 필요로 하는 상태(예를 들어, 척추 융합 및 재구축), 악골(maxillo) - 안면 골절, 선천성 골 결손, 골 재건, 예를 들어 외상성 손상 또는 암 수술 후, 및 두개 및 안면 뼈 재건; 외상성 관절염, 초점 연골 및/또는 관절 결함, 초점 퇴행성 관절염; 골관절염, 퇴행성 관절염, 무릎관절증(gonarthrosis) 및 고관절증(coxarthrosis); 골 형성 부전증; 골 용해 뼈 암; Paget병, 내분비 장애, 저인산혈증, 저칼슘혈증, 신성 골이영양증, 골연화증, 무형성 골 질환, 부갑상선기능항진증, 원발성 부갑상선기능항진증, 2차 부갑상선기능항진증; 치주 질환; 고햄-스타우트(Gorham-Stout) 질환 및 맥퀸-올브라이트(McCune-Albright) 증후군; 류마티스 관절염 ; 강직성 척추염, 건선성 관절염, 장병증성 관절병증, 및 미분화 척추관절염 및 반응성 관절염 등의 척추관절 병증; 전신성 홍반성 낭창 및 관련 증후군; 경피증 및 관련 장애; 쇼그렌 (Sjogren) 증후군; 거대 세포 동맥염(호튼(Horton) 질환), 타카야수(Takayasu) 동맥염, 류마티스성 다발성 근육통, ANCA 관련 혈관염(예: 베게너(Wegener) 육아종증, 현미경적다발성혈관염, 및 처그-스트라우스(Churg-Strauss) 증후군), 베체트 증후군, 및 기타 다발성 동맥염 및 관련 질환(예: 결절성다발성동맥염, 코건(Cogan) 증후군 및 버거(Buerger)병)을 포함한 전신성 혈관염; 아밀로이드증과 유육종증 등의 다른 전신성 염증 질환을 동반하는 관절염; 통풍, 칼슘 파이로포스페이트 이수화 질환, 칼슘 포스페이트 또는 칼슘 옥살레이트 결정의 관절 침착과 연관된 장애 또는 증후군 등의 결정성 관절증; 연골 석회화 및 신경병증성 관절증; 펠티(Felty) 증후군과 라이터(Reiter) 증후군; 라임 질환과 류마티스성 열을 포함할 수 있다.

본 발명의 원리를 적용한 방법과 용도는 알려진 그 자체로 세포 또는 조직 배양 배지의 존재 하에서, 예를 들어 액체 또는 반고체(예를 들어, 젤라틴성), 바람직하게 액체 세포 또는 조직 배양 배지를 사용하여 세포 또는 세포군을 배양(예를 들어, 유지, 증식 및/또는 분화)하는 것을 고려할 수 있다. 이러한 배양 배지는 세포 또는 세포군의 유지(예를 들어, 생존, 유전자형, 표현형 및/또는 작용 안정성) 및 증식을 바람직하게 지속할 수 있다.

구체적으로, 본 발명의 원리를 구현하는 방법은 혈장 또는 혈청 및 GDF-8 및 FGF-2를 포함하는 배지에서 MSC를 배양하는 단계를 포함할 수 있다. 따라서, 일반적으로 세포는 하나 이상의 제제, 예컨대 성장인자 및 혈장 또는 혈청을 포함하는 배지에서 배지에 이들을 포함시키는 방법으로 배양할 수 있다.

당업자라면 혈장과 혈청이 생물학적 복합 조성물이고, 하나 이상의 성장인자, 사이토킨 또는 호르몬을 함유할 수 있다는 것을 알고 있다. 그러므로, 열거된 성장인자, 특히 GDF-8과 FGF-2는 혈장 또는 혈청에 추가로, 즉 외인성으로, 또는 보충하여 제공될 수 있다.

또한, 기본 배지, 혈장 또는 혈청, GDF-8 및 FGF-2로 구성되거나 본질적으로 구성되는 배지에서 성체 간엽줄기세포(MSC)를 배양하는 단계를 포함하는, 성체 MSC를 시험관 내 또는 생체 외에서 골전구세포 또는 골아세포, 또는 골전구세포 및/또는 골아세포를 포함하는 세포군으로 분화하는 방법을 제공한다.

따라서, 일 구체예에서 GDF-8 및 FGF-2는 배지에 첨가된 단독 성장인자일 수 있다.

다른 구체예에서, MSC는 GDF-8 및 FGF-2 이외에 하나 이상의 외인성으로 첨가된 GDF-8 및 FGF-2가 아닌 추가 성장인자와 배양될 수 있다.

바람직한 구체예에서, 본 방법에서 사용된 하나 이상, 또는 모든 성장인자(여기에서 사용된 성장인자에 대한 일반적 언급은 특히 GDF-8 및 FGF-2 성장인자뿐만 아니라 선택적인 하나 이상의 추가 성장인자를 포함한다)는 인간 성장인자이다. 여기서 사용된 "인간 성장인자"란 용어는 자연적으로 발생한 인간 성장인자와 실질적으로 동일한 성장인자를 지칭한다. 예를 들어, 성장인자가 단백질성일 경우, 그의 구성 펩티드 또는 폴리펩티드는 자연적으로 발생하는 인간 성장인자와 동일한 1차 아미노산 서열을 가질 수 있다. 인간 성장인자를 사용하는 것이 바람직한데, 왜냐하면 이러한 성장인자가 인간 세포 작용에 대해 바람직한 효과를 유도할 것으로 예상되기 때문이다.

"자연적으로 발생하는"이란 용어는 사람에 의해 인공적으로 만들어지는 것과 구분되는 자연에서 발견할 수 있는 목표물 또는 물질을 기술하기 위해 사용된다. 예를 들어, 자연의 공급원으로부터 단리할 수 있고 실험실에서 사람에 의해 의도적으로 변성되지 않은, 유기체에 존재하는 폴리펩티드 서열은 자연적으로 발생한다. 구체적인 물질, 예를 들어 폴리펩티드 또는 단백질을 지칭할 때, 이 용어는, 예를 들어 종과 개체 간의 정상적 변이 때문에 자연에서 발생하는 모든 형태와 그의 변이체를 포함한다. 예를 들어, 단백질성 성장인자를 지칭하는 경우, "자연적으로 발생하는"이란 용어는 종간 유전적 분화 및 개체간 정상적 대립형질 변이로 인한 그의 구성성분 펩티드 또는 폴리펩티드의 1차 서열 내 차이를 갖는 성장인자를 포함한다.

FGF-2 또는 섬유아세포 성장인자 2는 또한 통상적으로 염기성 섬유아세포 성장인자, FGFb, bFGF, 프로스타트로핀(prostatropin), 또는 헤파린 결합 성장인자 2 전구체(HBGF-2)로서 알려져 있다. 예시적인 인간 FGF-2는 Uniprot/Swissprot 기탁번호 P09038(http://www.uniprot.org/uniprot/) 하의 1차 아미노산 서열을 갖는 FGF-2이나, 이에 한정되지는 않는다. 당업자라면 상기 서열이 전구체 FGF-2의 서열이고 성숙한 FGF-2로부터 유래하여 처리된 일부를 포함할 수 있음을 알 수 있다. 예시적인 인간 FGF-2 단백질 서열은 NCBI Genbank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) 기탁번호 NP_001997.5로 표시된 것일 수 있다. 예시적인 인간 FGF-2는 또한 특히 Abraham et al. 1986 (EMBO J 5: 2523-8) 및 Kurokawa et al. 1987 (FEBS Lett 213: 189-94)에 기술되어 있다.

GDF-8 또는 성장 및 분화인자 8은 또한 통상적으로 마이오스타틴(myostatin, MSTN)으로 알려져 있다. 예시적인 인간 GDF-8은 Uniprot/Swissprot 기탁번호 O14793 하의 1차 아미노산 서열을 갖는 GDF-8이나, 이에 한정되지는 않는다. 예시적인 인간 GDF-8 단백질 전구체 서열은 NCBI Genbank(http://www.ncbi.nlm. nih.gov/) 기탁번호 NP_005250.1로 표시된 것일 수 있다. 예시적인 마우스 GDF-8은 또한 특히 McPherron et al. 1997 (Nature 387 (6628): 83-90)에 기술되어 있다.

GDF-8 및 FGF-2는 여기서 정의된 배지에 골전구세포 또는 골아세포, 또는 골전구세포 및/또는 골아세포를 포함하는 세포군으로의 MSC 분화를 유도하는데 충분한 농도로 포함된다. 전형적으로, FGF-2는 배지에 0.1 내지 100 ng/ml, 바람직하게 0.5 내지 20 ng/ml, 예를 들어 약 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7 또는 6 ng/ml, 또는 약 5 ng/ml 이하, 예를 들어 약 4, 3, 2, 1 또는 0.5 ng/ml의 농도로 포함될 수 있다. 전형적으로, GDF-8은 배지에 0.1 내지 1000 ng/ml, 예를 들어 1 내지 500 ng/ml, 예를 들어 약 450, 400, 350, 300, 250 또는 200 ng/ml, 또는 약 150 ng/ml 이하, 예를 들어 약 100, 75, 50, 25 또는 10 ng/ml, 바람직하게 약 5 ng/ml 이하, 예를 들어 약 4, 3, 2, 1, 0.75 0.5 또는 0.25 ng/ml의 농도로 포함될 수 있다. 상기한 값들은 배지에 외인성으로 보충된 각각의 성장인자의 농도를 지칭하기 위한 것이다.

본원에서, GDF-8 및 FGF-2를 포함한 임의의 성장인자 등의 단백질, 폴리펩티드 또는 펩티드는 또한 그의 단편을 포함할 수 있다. 단백질, 폴리펩티드 또는 펩티드의 "단편"이란 용어는 일반적으로 상기한 단백질, 폴리펩티드 또는 펩티드의 N-말단 및/또는 C-말단으로 결실되거나 잘려진 형태를 지칭한다. 비제한적으로, 핵산, 단백질, 폴리펩티드 또는 펩티드의 단편은 적어도 약 5%, 적어도 약 10%, 예를 들어, ≥ 20%, ≥ 30% 또는 ≥ 40%, 예컨대 바람직하게 ≥ 50%, 예를 들어 ≥ 60%, ≥ 70% 또는 ≥ 80%, 더욱 바람직하게 ≥ 90% 또는 ≥ 95%의 상기 핵산의 뉴클레오티드 서열, 또는 상기 단백질, 폴리펩티드 또는 펩티드의 아미노산 서열일 수 있다.

본원에서, GDF-8 및 FGF-2를 포함한 임의의 성장인자 등의 단백질, 폴리펩티드 또는 펩티드는 또한 그의 변이체를 포함할 수 있다. 핵산, 단백질, 폴리펩티드 또는 펩티드의 "변이체(variant)"란 그 서열(즉, 각각 뉴클레오티드 서열 또는 아미노산 서열)이 상기한 핵산, 단백질 또는 폴리펩티드의 서열과 실질적으로 일치하는(즉, 전적으로는 아니나 대부분 일치하는), 예를 들어 적어도 약 80% 일치 또는 적어도 약 85% 일치, 예를 들어 바람직하게 적어도 약 90% 일치, 예를 들어 적어도 91% 일치, 92% 일치, 더욱 바람직하게 적어도 약 93% 일치, 예를 들어 적어도 94% 일치, 더 더욱 바람직하게 적어도 약 95% 일치, 예를 들어 적어도 96% 일치, 보다 더 바람직하게 적어도 약 97% 일치, 예를 들어 적어도 98% 일치, 가장 바람직하게 적어도 99% 일치하는 핵산, 단백질, 폴리펩티드 또는 펩티드를 지칭한다. 바람직하게, 언급된 핵산, 단백질, 폴리펩티드 또는 펩티드의 전체 서열이 서열 정렬에서 문제가 될 때, 변이체는 언급된 핵산, 단백질, 폴리펩티드 또는 펩티드에 대한 동일성 정도를 나타낼 수 있다(즉, 전체 서열 동일성). 또한 상기한 핵산, 단백질, 폴리펩티드 또는 펩티드와, 일반적으로 연관되지 않은 또다른 핵산, 단백질, 폴리펩티드 또는 펩티드의 융합 생성물도 핵산, 단백질, 폴리펩티드 또는 펩티드의 단편 및 변이체에 포함된다.

서열 동일성은 서열 정렬을 수행하고 공지된 그 자체로 서열 동일성을 결정하는 적합한 알고리즘을 사용하여 측정할 수 있다. 알고리즘은, 예를 들어 원래 Altschul et al. 1990 (J Mol Biol 215: 403-10)에 기술된 Basic Local Alignment Search Tool(BLAST)에 기초한 알고리즘, 예를 들어 공개된 디폴트 세팅 또는 다른 적합한 세팅(예컨대, 예를 들어 BLASTN 알고리즘에 대해서는: 갭 개방가 = 5, 갭 확장가 = 2, 불일치(mismatch)에 대한 페널티 = -2, 일치에 대한 보상 = 1, 갭 x_드랍오프(dropoff) = 50, 기대값 = 10.0, 단어 크기 = 28; 또는 BLASTP 알고리즘에 대해서는: 매트릭스 = Blosum62, 갭 개방가 = 11, 갭 확장가 = 1, 기대값 = 10.0, 단어 크기= 3)을 사용하는 Tatusova and Madden 1999 (FEMS Microbiol Lett 174: 247-250)에 기술된 "Blast 2 sequences" 알고리즘이 있으나, 이에 한정되지 않는다.

단백질, 폴리펩티드 또는 펩티드의 변이체는 상기한 단백질, 폴리펩티드 또는 펩티드의 동족체(예를 들어, 오르토로그(orthologue) 또는 파라로그)일 수 있다. 여기서 사용된 "상동성(homology)"은 일반적으로 두 개 거대 분자간, 특히 두 단백질 또는 폴리펩티드 간의 같거나 다른 탁손(taxon)으로부터의 구조적 유사성을 나타내며, 여기서 유사성은 공유된 전세대 때문이다.

본 명세서에서 단백질, 폴리펩티드 또는 펩티드의 단편 및/또는 변이체를 지칭하거나 포함하는 경우, 이것은 바람직하게 "작용성"이 있는, 즉 각 단백질, 폴리펩티드 또는 펩티드의 생물학적 활성 또는 의도된 작용성을 적어도 부분적으로 보유하는 변이체 및/또는 단편을 나타낸다. 예를 들어, 비제한적으로, GDF-8 또는 FGF-2의 작용성 단편 및/또는 변이체는 GDF-8 또는 FGF-2 각각의 생물학적 활성을 적어도 부분적으로 보유하여야 한다. 예를 들어, 이것은 GDF-8 또는 FGF-2의 생물학적 활성의 하나 이상의 측면, 예컨대 하나 이상의 동족 수용체에 결합하는 능력, 하나 이상의 세포 경로에 참여하는 능력 등을 유지할 수 있다. 바람직하게, 작용성 단편 및/또는 변이체는 상응하는 단백질, 폴리펩티드 또는 펩티드와 비교하여 의도된 생물학적 활성 또는 작용성을 적어도 약 20%, 예를 들어 적어도 30%, 또는 적어도 약 40%, 또는 적어도 약 50%, 예를 들어 적어도 60%, 더욱 바람직하게 적어도 약 70%, 예를 들어 적어도 80%, 더 더욱 바람직하게 적어도 약 85%, 보다 더 바람직하게 적어도 약 90%, 가장 바람직하게 적어도 약 95% 또는 심지어 약 100% 이상 유지할 수 있다. 특히 작용성 단편 또는 변이체는 적어도 일정 정도까지 본 방법 또는 용도에서 MSC 세포의 골형성 분화를 자극하는 능력을 유지한다.

성장인자 같은 단백질, 폴리펩티드 또는 펩티드가 그의 동족 수용체에 결합하여 그 효과를 나타내는 경우, 단백질, 폴리펩티드 또는 펩티드의 작용성 단편 및/또는 변이체는 수용체에 결합하는 개별 단백질, 폴리펩티드 또는 펩티드의 친화도 및/또는 특이성의 적어도 약 20%, 예를 들어 적어도 30%, 또는 적어도 약 40%, 또는 적어도 약 50%, 예를 들어 적어도 60%, 더욱 바람직하게 적어도 약 70%, 예를 들어 적어도 80%, 더 더욱 바람직하게 적어도 약 85%, 보다 더 바람직하게 적어도 약 90%, 가장 바람직하게 적어도 약 95% 또는 심지어 약 100% 이상을 보유할 수 있다. 상기한 결합 파라미터는 당업자들이 알려진 그 자체로 시험관 내 또는 세포 어세이를 사용하여 용이하게 측정할 수 있다.

제공된 단백질, 폴리펩티드 또는 펩티드, 예컨대 제공된 성장인자의 활성을 구축된 어세이, 예를 들어 시험관 내 또는 세포 어세이로 용이하게 측정할 수 있을 경우(예를 들어, 세포 배양물에서의 미토겐 활성 측정), 단백질, 폴리펩티드 또는 펩티드의 작용성 단편 및/또는 변이체는 이러한 어세이에서, 개별 단백질, 폴리펩티드 또는 펩티드 활성의 적어도 약 20%, 예를 들어 적어도 30%, 또는 적어도 약 40%, 또는 적어도 약 50%, 예를 들어 적어도 60%, 더욱 바람직하게 적어도 약 70%, 예를 들어 적어도 80%, 더 더욱 바람직하게 적어도 약 85%, 보다 더 바람직하게 적어도 약 90%, 가장 바람직하게 적어도 약 95% 또는 심지어 약 100% 이상으로 활성을 나타낼 수 있다.

성장인자 같은 단백질, 폴리펩티드 또는 펩티드의 "활성"이란 일반적으로 단백질, 폴리펩티드 또는 펩티드의 생물학적 활성의 하나 이상의 측면, 예컨대 비제한적으로, 세포, 조직, 기관 또는 유기체 내에서, 그의 생화학적 활성, 효소적 활성, 시그널링 활성, 상호작용 활성, 리간드 활성 및/또는 구조적 활성의 하나 이상의 측면을 포함할 수 있다. 예를 들어 비제한적으로, GDF-8 또는 FGF-2의 활성이란 구체적으로 리간드로서 그의 활성, 즉 하나 이상의 동족 수용체에 결합하는 그의 능력, 및/또는 시그널링 분자로서 그의 활성, 즉 하나 이상의 세포 시그널링 경로에 참여하는 그의 능력 등을 나타낼 수 있다.

여기서 GDF-8 및 FGF-2를 포함한 성장인자 같은 단백질, 폴리펩티드 또는 펩티드란 또한 그의 유도체를 포함할 수 있다. 단백질, 폴리펩티드 또는 펩티드의 "유도체"란 용어는 일반적으로 하나 이상의 아미노산 잔기의 화학적 변성 및/또는 하나 이상의 아미노산 잔기에서 하나 이상의 모이어티의 첨가, 예를 들어 글리코실화, 인산화, 아실화, 아세틸화, 설페이션(sulphation), 리피드화, 알킬화 등으로 유도된 단백질, 폴리펩티드 또는 펩티드를 지칭한다. 전형적으로 50% 미만, 예를 들어 40% 미만, 바람직하게 30% 미만, 예를 들어 20% 미만, 더욱 바람직하게 15% 미만, 예를 들어 10% 미만 또는 5% 미만, 예를 들어 4%, 3%, 2% 또는 1% 미만의 단백질, 폴리펩티드 또는 펩티드 내 아미노산이 유도될 수 있다. 단백질성 유도체는 하나 이상의 단백질(들), 폴리펩티드(들) 또는 펩티드(들)을 포함할 수 있으며, 이들 중 적어도 하나는 적어도 하나의 아미노산 잔기에 유도될 수 있다. 본 명세서에서 단백질, 폴리펩티드 또는 펩티드의 유도체를 지칭하거나 포함할 경우, 이것은 바람직하게 작용성인 유도체를 나타낸다.

바람직한 구체예에서, 성장인자는 재조합될 수 있으며, 즉 숙주 유기체(예를 들어, 박테리아, 예컨대 비제한적으로 E. coli , S. tymphimurium , Serratia marcescens, Bacillus subtilis; 효모, 예컨대 S. cerevisiae 및 Pichia pastoris; 배양된 식물 세포, 예컨대 특히 Arabidopsis thaliana 및 Nicotiana tobaccum 세포; 동물 세포, 예컨대 포유동물 및 곤충 세포; 또는 다세포 유기체, 예컨대 식물 또는 동물) 또는 그의 전신(ancestor) 내에 삽입되고, 성장인자를 코딩하는 서열을 포함하는 재조합 핵산 분자의 발현에 의해 숙주 유기체에 의해 생산될 수 있다. 재조합으로 발현된 성장인자를 사용하여 병원체 전달 위험을 줄인다.

"혈장"이란 용어는 통상적으로 정의된 바와 같다. 혈장은 일반적으로 항응고제(예: 헤파린, 시트레이트, 옥살레이트 또는 EDTA)가 제공되거나 접촉된 전혈(whole blood) 샘플로부터 얻어진다. 이어서, 혈액 샘플의 세포 성분들을 액체 성분(혈장)으로부터 적절한 기술, 전형적으로 원심분리에 의해 분리한다. 따라서, "혈장"이란 용어는 인간 또는 동물 신체의 일부를 형성하지 않는 조성물을 지칭한다.

"혈청"이란 용어는 통상적으로 정의된 바와 같다. 혈청은 일반적으로 먼저 전혈 샘플에서 응고를 발생시킨 다음, 형성된 응고물과 혈액 샘플의 세포 성분을 액체 성분(혈청)으로부터 적절한 방법, 전형적으로 원심분리에 의해 분리하여 전혈 샘플로부터 얻어질 수 있다. 응고는 불활성 촉매, 예를 들어 유리 구슬 또는 분말을 사용하여 촉진할 수 있다. 선택적으로 혈청은 혈장에서 항응고제와 피브린을 제거하여 얻을 수 있다. 따라서, "혈청"이란 용어는 인간 또는 동물 신체의 일부를 형성하지 않는 조성물을 지칭한다.

단리된 혈장 또는 혈청을 본 방법에 직접 사용할 수 있다. 이들은 또한 나중의 사용을 위해 적절하게 보관할 수 있다(예를 들어, 단기간 동안, 예를 들어 약 1-2주까지, 혈장 또는 혈청 각각의 동결점을 초과하나 주위 온도 미만의 온도에서 보관, 이 온도는 일반적으로 약 4 ℃ 내지 5 ℃이거나; 장기간의 동결저장에서는 일반적으로 약 -70 ℃ 내지 약 -80 ℃이다).

단리된 혈장 또는 혈청은, 특히 보체(complement)를 제거하기 위해 당분야에서 알려진 바와 같이 열에 의해 불활성화할 수 있다. 본 방법에서 혈장 또는 혈청의 존재 하에 배양된 세포에 대해 자기유래인 혈장 또는 혈청을 사용하는 경우, 혈장 또는 혈청을 열에 의해 불활성화할 필요는 없다. 혈장 또는 혈청이 배양된 세포에 대해 적어도 부분적으로 동종이계인 경우, 혈장 또는 혈청을 열에 의해 불활성화하는 것이 유리할 수 있다.

임의로, 혈장 또는 혈청은 또한 보관 또는 사용하기 전에 일반적인 미생물학적 필터, 바람직하게 기공 크기가 0.2μm 이하인 미생물학적 필터를 사용하여 멸균할 수 있다.

본 발명의 방법은 혈장 또는 혈청과 접촉된 MSC 또는 다른 세포 종류에 대해 자기유래인 혈장 또는 혈청을 사용할 수 있다. 혈장 또는 혈청과 관련하여 "자기유래(autologous)"란 용어는 혈장 또는 혈청이 혈장 또는 혈청과 접촉될 MSC 또는 다른 세포 종류와 같은 대상에서 얻어진 것을 나타낸다. 본 발명의 방법은 또한 혈장 또는 혈청과 접촉된 MSC 또는 다른 세포 종류에 대해 "자기유래"이거나 "동종이계"인, 즉 MSC 또는 다른 세포 종류가 얻어진 대상과는 다른 하나 이상의 (pooled)대상에서 얻어진 혈장 또는 혈청을 사용할 수 있다. 또한, 본 발명의 방법은 위에서 정의된 자기유래 및 상동성(동종이계) 혈장 또는 혈청의 혼합물을 사용할 수 있다.

본 발명에서는, 성체 MSC를 혈장 또는 혈청 및 GDF-8을 포함하는 배지에서 배양하는 단계를 포함하는, 성체 MSC를 시험관 내 또는 생체 외에서 골전구세포 또는 골아세포, 또는 골전구세포 및/또는 골아세포를 포함하는 세포군으로 분화하는 방법을 기재하였다. 실시예에 예시한 바와 같이, MSC를 혈장 또는 혈청 및 GDF-8을 포함하는 배지에서 배양하는 단계를 포함하는 방법은 상기 MSC를 혈장 또는 혈청 및 GDF-8 및 FGF-2를 포함하는 배지에서 배양하는 단계를 포함하는 본 방법으로 얻어지는 유리한 효과를 적어도 부분적으로 얻는다.

일 구체예에서, 본 발명의 방법은, (a) 대상의 생물학적 샘플에서 회수된, MSC를 포함하는 세포를 기질 표면에 부착하고; (b) 부착된 세포를 혈장 또는 혈청, GDF-8 및 FGF-2를 포함하는 배지에서 배양하는 단계를 포함한다.

본 발명의 방법은 임의로 대상의 생물학적 샘플에서 회수되고 MSC를 포함하는 세포에서 단핵 세포를 단리한 후, 단리된 단핵 세포를 기질 표면에 부착하는 단계를 포함할 수 있다. 단핵 세포는 일반적인 방법, 예컨대 밀도 그래디언트 원심분리를 사용하여 단리할 수 있다.

세포, 예컨대 구체적으로 부착된 세포는 배지, 통상적으로 액체 세포 배양배지에서 배양된다. 전형적으로, 배지는 당분야에서 알려진 기본적인 배지 제제를 포함한다. (예를 들어, American Type Culture Collection, ATCC; 또는 Invitrogen (Carlsbad, California)에서 입수가능한)다양한 기본 배지 제제를 사용하여 본 발명의 세포를 배양할 수 있고, 예를 들어 Invitrogen 또는 Cambrex(New Jersey)에서 입수가능한 이글(Eagle) 최소필수배지(MEM), 듈베코(Dulbecco)의 변성 이글 배지(DMEM), 알파 변성 최소필수배지(alpha-MEM), Basal Medium Essential(BME), BGJb, F-12 영양분 혼합물(Ham), Iscove 변성 듈베코 배지(IMDM), 및 이들의 변성 및/또는 조합이 있으나, 이에 한정되지는 않는다. 상기한 기초 배지의 조성물은 일반적으로 당분야에 공지되어 있으며, 세포를 배양하는데 필요한 배지 및/또는 배지 보충물의 농도를 변경하거나 조절하는 것은 당분야의 기술 내에 있다.

세포는 상기 배지의 존재 하에서 여기에서 목적한 바와 같이 기질 표면에 부착되도록 할 수 있다.

이러한 기본적인 배지 제형은 그 자체로 알려진 포유동물 세포 발달에 필요한 성분을 함유한다. 예를 들어 비제한적으로, 이러한 성분에는 무기염(특히 Na, K, Mg, Ca, Cl, P 및, 가능하게는 Cu, Fe, Se 및 Zn을 함유하는 염), 생리학적 완충액(예를 들어, HEPES, 중탄산염), 뉴클레오티드, 뉴클레오시드 및/또는 핵산 염기, 리보스, 데옥시리보스, 아미노산, 비타민, 항산화제(예를 들어, 글루타티온) 및 탄소원(예를 들어, 글루코스, 나트륨 피루베이트, 나트륨 아세테이트) 등이 포함될 수 있다.

배양에 사용하기 위해, 기본적인 배지에는 하나 이상의 추가 성분이 보충될 수 있다. 예를 들어, 부가적인 보충물은 필수 미량 원소와, 최적 성장 및 증식을 위한 물질을 세포에 공급하기 위해 사용될 수 있다. 또한 항산화제 보충물, 예를 들어 β-머캡토에탄올을 첨가할 수 있다. 많은 기본 배지가 이미 아미노산을 함유하지만, 일부 아미노산은 나중에 보충될 수 있고, 예를 들어 용액에서 덜 안정한 것으로 알려져 있는 L-글루타민을 보충할 수 있다. 배지에는 항생제 및/또는 항진균제 화합물, 예컨대 전형적으로 페니실린 및 스트렙토마이신의 혼합물, 및/또는 다른 화합물, 예를 들어 비제한적으로 암포테리신, 암피실린, 겐타마이신, 블레오마이신, 하이그로마이신, 카나마이신, 마이토마이신, 마이코페놀산, 날리딕산, 네오마이신, 니스타틴, 파로모마이신, 폴리마이신, 푸로마이신, 리팜피신, 스펙티노마이신, 테트라사이클린, 타일로신 및 제오신을 추가로 보충할 수 있다.

지질 및 지질 담체는 또한 세포 배양 배지를 보충하기 위해 사용될 수 있다. 이러한 지질 및 담체에는 그 중에서도 시클로덱스트린, 콜레스테롤, 알부민에 컨쥬게이트된 리놀레산, 알부민에 컨쥬게이트된 리놀레산과 올레산, 컨쥬게이트되지 않은 리놀레산, 알부민에 컨쥬게이트된 리놀레산-올레산-아라키돈산, 알부민에 컨쥬게이트된 올레산 및 미컨쥬게이트된 올레산이 포함될 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 알부민은 마찬가지로 지방산이 없는 제제에서 사용될 수 있다.

혈장 또는 혈청은 또한 약 0.5% 내지 약 30%, 바람직하게 약 1% 내지 약 15%의 비율(혈장 또는 혈청의 부피/배지의 부피)로 상기 배지에 포함될 수 있다. 본 발명의 방법은 비교적 적은 양의 혈장 또는 혈청, 예를 들어 약 5 또는 10 부피% 이하, 예를 들어 약 1, 약 2, 약 3 또는 약 4 부피%로 만족스럽게 수행되어, 유리하게 비용을 감소하거나 MSC를 배양하기 위해 수득되어야 하는 혈장 또는 혈청의 부피를 줄일 수 있다.

본 발명의 일 구체예에서, 세포(특히 (a)의 세포)는 부착을 위해 5x10² 내지 5x10⁷ 세포/cm², 바람직하게 5x10³ 내지 5x10⁵ 세포/cm²로 도포될 수 있다.

배양 용기는 세포가 부착할 수 있는 플라스틱 표면을 가질 수 있다. 표면은 유리 표면이거나, 세포의 부착과 성장에 도움이 되는 적절한 물질, 예를 들어 Matrigel(R), 라미닌 또는 콜라겐으로 코팅될 수 있다.

세포는 (b)에서 정의된 배지에서 약 10 내지 약 18일 동안 배양될 수 있다. 예를 들어, 세포는 단계 (b) 또는, 단계 (a)와 (b)를 합쳐서 약 10 내지 약 16일, 일반적으로 약 12-14일 동안 배양할 수 있다. 이와 달리, 세포는 단계 (b) 또는, 단계 (a)와 (b)를 합쳐서 세포의 융합(confluence)이 약 60% 이상, 또는 약 80% 이상, 또는 약 90% 이상, 또는 최대 100%에 이를 때까지 배양할 수 있다.

일 구체예에서, 단계 (b) 이후에 본 방법은 얻어진 세포 또는 세포군을 수집하는 것을 포함할 수 있다.

다른 구체예에서, 단계 (b) 이후에, 얻어진 세포를 1회 이상, 예컨대 1, 2, 3, 4회 이상 통과(passage)시킬 수 있고, 바람직하게 세포는 1, 2 또는 3회, 더욱 바람직하게 1 또는 2회, 더 더욱 바람직하게 세포는 1회 통과시킬 수 있다. 통과 수는 세포군이 배양 용기에서 제거되어 계대배양, 즉 통과를 수행하는 횟수를 지칭한다. 예를 들어, 통과는 일반적으로 2가 이온 킬레이터(예를 들어, EDTA 또는 EGTA) 및/또는 트립신 또는 적합한 프로테아제를 사용한 세포의 탈착; 탈착된 세포의 재현탁; 및 동일 또는 새로운 배양 용기에 원하는 세포 밀도로 세포를 재도포하는 것을 포함할 수 있다.

바람직한 구체예에서, 단계 (b) 이후에, 본 방법은 통과, 특히 1회 통과, 및 단계 (b)에서 얻어진 세포 또는 세포군을 (b)에서 정의된 배지에서 추가 배양하는 단계 (c)를 추가로 포함한다. 이러한 단계 (c) 이후에, 세포 또는 세포군을 수집할 수 있다.

통과 단계 (c)에서, 세포는 바람직하게 추가 배양을 위해 5x10¹ 내지 5x10⁶ 세포/cm², 바람직하게 5x10² 내지 5x10⁴ 세포/cm², 보다 전형적으로 약 5x10³ 세포/cm²로 도포된다.

전형적으로, 세포는 단계 (c)에서 약 3 내지 약 18일 동안 추가 배양된다. 이 기간 동안 세포는 충분히 증식될 수 있다.

다른 구체예에서, 본 발명의 방법은, (a) 대상의 생물학적 샘플에서 회수된, MSC를 포함하는 세포를 기질 표면에 부착하고; (b') 부착 세포를 혈장 또는 혈청 및 FGF-2를 포함하는 배지에서 배양하고; (b") 부착 세포를 혈장 또는 혈청, GDF-8 및 FGF-2를 포함하는 배지에서 추가 배양하는 단계를 포함한다.

세포는 단계 (b') 또는, 단계 (a)와 (b')을 합쳐서 약 10 내지 약 24일 동안 정의된 배지에서 배양할 수 있다. 예를 들어, 세포는 단계 (b')에서 또는, 단계 (a)와 (b')을 합쳐서 약 10 내지 약 22일 동안, 일반적으로 약 14-21일 동안 배양할 수 있다. 이와 달리, 세포는 단계 (b')에서 또는, 단계 (a)와 (b')을 합쳐서 세포의 융합이 약 60% 이상, 또는 약 80% 이상, 또는 약 90% 이상, 또는 최대 100%에 이를 때까지 배양할 수 있다.

세포는 단계 (b")에서 약 1 내지 약 10일 동안 정의된 배지에서 배양할 수 있다. 예를 들어, 세포는 단계 (b")에서 약 2 내지 약 8일 동안, 일반적으로 약 4-6일 동안 배양할 수 있다. 이와 달리, 세포는 단계 (b")에서 세포의 융합이 약 60% 이상, 또는 약 80% 이상, 또는 약 90% 이상, 또는 최대 100%에 이를 때까지 배양할 수 있다.

다른 구체예에서, 본 발명의 방법은 단계 (b')과 단계 (b") 사이에 세포를 통과시키고 세포를 기질 표면에 부착하는 단계 (c')을 추가로 포함한다. 단계 (c')에서 세포는 1회 이상, 예컨대 1, 2 또는 3회 통과시킬 수 있고, 바람직하게 세포는 1 또는 2회 통과시킬 수 있다.

통과 단계 (c')에서, 세포는 바람직하게 추가 배양을 위해 5x10¹ 내지 5x10⁶ 세포/cm², 바람직하게 5x10² 내지 5x10⁴ 세포/cm², 보다 전형적으로 약 5x10³ 세포/cm²로 도포된다.

다른 구체예에서, 단계 (b") 이후에 본 발명에 따른 방법은 얻어진 세포 또는 세포군을 수집하는 것을 포함할 수 있다.

본 발명의 방법에 따라, 구체적으로 높은 증식율과 낮은 MHC 클래스 II 세포 표면 수용체 복합체 발현 같은 우수한 특성을 갖는 골전구세포 또는 골아세포, 또는 골전구세포 및/또는 골아세포를 포함하는 세포군을 얻을 수 있으며, 세포 및 세포군은 임플란트 같은 예방적 또는 치료적 처치에 적합하다.

따라서, 다른 측면에서 본 발명은 상기한 본 방법을 사용하여 얻어질 수 있거나 직접 얻어진, 골전구세포 또는 골아세포, 또는 골전구세포 및/또는 골아세포를 포함하는 세포군에 관한 것이다.

또한, 상기한 본 방법을 사용하여 얻어질 수 있거나 직접 얻어진, 골전구세포 또는 골아세포, 또는 골전구세포 및/또는 골아세포를 포함하는 세포군을 포함하는 단리된 세포군을 제공한다.

본 발명의 원리를 구현하는, 위에 정의된 골전구세포 또는 골아세포, 또는 골전구세포 및/또는 골아세포를 포함하는 세포군은 구체적으로 높은 증식율과 낮은 MHC 클래스 II 세포 표면 수용체 복합체 발현 같은 우수한 특성을 나타내며, 세포 및 세포군은 예방적 또는 치료적 이식에 적합하다.

따라서, 여기서 적시된 골전구세포 또는 골아세포, 또는 골전구세포 및/또는 골아세포를 포함하는 세포군은 (예를 들어, 본 명세서의 다른 위치에서 정의된)근골격계 질환을 갖는 대상에 대한 자기유래 또는 동종이계 투여에 사용할 수 있다. 바람직하게, 인간 골전구세포 또는 골아세포, 또는 골전구세포 및/또는 골아세포를 포함하는 세포군은 인간 대상에게 근골격계 질환의 치료를 위해 투여할 수 있다.

여기서 사용된, "치료가 필요한 대상" 등의 어구는 주어진 상태, 특히 근골격계 질환의 치료로 유리할 수 있는 대상을 포함한다. 이러한 대상은, 예를 들어 상기한 상태로 진단된 대상, 상기한 상태와 접촉되거나 진행되기 쉬운 대상 및/또는 상기한 상태를 예방해야하는 대상을 포함할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.

"치료" 또는 "처치"란 용어는 이미 진행된 질환 또는 상태의 치료적 처치, 예컨대 이미 진행된 근골격계 질환의 치료뿐 아니라, 그 목적이 바람직하지 않은 병의 발생 가능성을 방지 또는 경감하는 것인, 예컨대 근골격계 질환의 발병, 진행 및 확대를 방지하는 것과 같은 예방적 또는 방지적 수단을 모두 포함한다. 유리하거나 바람직한 임상 결과에는 하나 이상의 증상 또는 하나 이상의 생물학적 마커의 경감, 질환 범위의 감소, 질환의 안정화된(즉, 악화되지 않는) 상태, 질환 확대의 지연 또는 감속, 질환 상태의 개선 또는 완화 등이 제한 없이 포함될 수 있다. "치료"는 또한 치료를 받지 않은 경우에 기대되는 생존과 비교하여 연장된 생존을 의미할 수 있다.

"예방학적 유효량" 이란 용어는 연구자, 수의사, 의사 또는 기타 임상의에 의해 탐색되는 대상에서 장애의 발생을 억제거나 지연시키는 활성 화합물 또는 약학 제제의 양을 지칭한다. 여기서 사용된 "치료학적 유효량"이란는 용어는 연구자, 수의사, 의사 또는 기타 임상의사에 의해 탐색되는 대상에서, 그중에서도 특히 치료되는 질환 또는 상태의 증상의 경감을 포함할 수 있는 생물학적 또는 의학적 반응을 유도하는 활성 화합물 또는 약학 제제의 양을 지칭한다. 본 발명의 골전구세포 또는 골아세포, 또는 골전구세포 및/또는 골아세포를 포함하는 세포군의 치료학적 및 예방학적 유효량을 결정하기 위한 방법은 당업계에 알려져 있다.

본 발명의 일 구체예에서, 골전구세포 또는 골아세포, 또는 골전구세포 및/또는 골아세포를 포함하는 세포군, 또는 여기서 예상된 다른 세포 종류는 골전구세포 또는 골아세포, 또는 골전구세포 및/또는 골아세포를 포함하는 세포군, 또는 여기서 예상된 다른 세포 종류가 도입될 대상의 MSC로부터 분화될 수 있다(즉, 자가유래의 세포). 본 세포의 낮은 MHC 클래스 II 세포 표면 수용체 복합체 발현으로 인해 특히 여기서 이용가능한 다른 구체예에 따라, 골전구세포 또는 골아세포, 또는 골전구세포 및/또는 골아세포를 포함하는 세포군, 또는 여기서 예상된 다른 세포 종류는 골전구세포 또는 골아세포, 또는 골전구세포 및/또는 골아세포를 포함하는 세포군, 또는 여기서 예상된 다른 세포 종류가 도입될 대상과는 다른 하나 이상의 대상의 MSC로부터 분화될 수 있다(즉, 동종이계의 세포).

본 발명의 다른 측면에 따라, 여기서 정의된 골전구세포 또는 골아세포, 또는 골전구세포 및/또는 골아세포를 포함하는 세포군은 약학 조성물로 제형화되어 투여될 수 있다.

본 발명의 다른 측면에 따라, GDF-8은 약학 조성물로 제형화되어 투여될 수 있다. 그 면역원성이 GDF-8의 생체 내 투여에 의해 감소되어야 하는 세포 또한 대상에 투여될 경우, 이러한 세포들은 적합하게 약학 조성물로 제형화되어 투여될 수 있다. 특정 구체예에서, 동일한 약학 조성물은 GDF-8과 세포를 모두 포함할 수 있는 반면, 다른 구체예에서 GDF-8과 세포는 별도의 약학 조성물에 포함될 수 있다. 또한, GDF-8의 생체 내 투여에 의해 거부 위험이 감소되어야 하는 물질은 약학 조성물로 적합하게 제형화되어 투여될 수 있다. 특정 구체예에서, 동일한 약학 조성물은 GDF-8과 물질을 모두 포함할 수 있는 반면, 다른 구체예에서 GDF-8과 물질은 별도의 약학 조성물에 포함될 수 있다.

약학 조성물은 전형적으로 하나 이상의 활성성분(예를 들어, GDF-8, 세포 및/또는 물질) 및 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 담체/부형제를 포함한다. 예를 들어, 약학 조성물은 전형적으로 활성성분으로서 여기에 기술된 골전구세포 또는 골아세포, 또는 골전구세포 및/또는 골아세포를 포함하는 세포군을, 그리고 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 담체/부형제를 포함할 수 있다. 여기서 사용된 "담체" 또는 "부형제"는 임의 및 모든 용매, 희석제, 완충제(예컨대, 중성 완충 식염수 또는 인산염 완충 식염수), 가용화제, 콜로이드, 분산 매질, 비히클, 충전제, 킬레이트화제(예컨대, EDTA 또는 글루타티온), 아미노산(예컨대, 글리신), 단백질, 붕해제, 결합제, 윤활제, 습윤제, 에멀젼화제, 감미제, 착색제, 풍미제, 향첨가제, 증점제, 저장소 효과(depot effect) 발생제, 코팅제, 항진균제, 보존제, 안정화제, 항산화제, 삼투압조절제, 흡수지연제 등을 포함한다. 약학적 활성물질을 위한 이러한 배지와 제제들의 사용은 당업계에 잘 알려져 있다. 이러한 물질들은 비독성이어야 하며 세포의 활성을 방해하지 않아야 한다.

담체 또는 다른 물질의 정확한 성질은 투여 경로에 따라 달라진다. 예를 들어, 조성물은 비경구적으로 허용가능한 수용액 형태일 수 있으며, 이것은 발열인자가 없고 적합한 pH, 등장성 및 안정성을 갖는다. 의약 제제의 일반적 원리에 대하여는 Handbook of Pharmaceutical Excipients 6^th Edition 2009, eds. Rowe et al; Remington's Pharmaceutical Sciences, 18^th ed., Mack Publishing Co., Easton, PA (1990); Cell Therapy: Stem Cell Transplantation, Gene Therapy, and Cellular Immunotherapy, by G. Morstyn & W. Sheridan eds., Cambridge University Press, 1996; 및 Hematopoietic Stem Cell Therapy, E. D. Ball, J. Lister & P. Law, Churchill Livingstone, 2000을 참고할 수 있다.

이러한 약학적 조성물은 세포의 생존력을 보장하는 추가의 성분을 그 안에 함유할 수 있다. 예를 들어, 조성물은 바람직한 pH, 더욱 통상적으로는 중성에 가까운 pH를 얻기 위해 적합한 완충제 시스템(예를 들어, 인산염 또는 탄산염 완충제 시스템)을 포함할 수 있고, 삼투압 스트레스를 방지하기 위해 세포의 등장성 조건을 보장하는 충분한 염을 포함할 수 있다. 예를 들어, 이러한 목적에 적합한 용액은 당업계에 알려져 있는 인산염-완충 식염수(PBS), 염화나트륨 용액, 링거 주사액(Ringer's Injection) 또는 락테이트화 링거 주사액(Lactated Ringer's Injection)일 수 있다. 또한, 조성물은 세포의 생존력을 증가시킬 수 있는 담체 단백질, 예를 들어 알부민을 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 약학 조성물은 또한 골형성(그 자체로 뼈 형성), 골유도 및/또는 골전도 특성을 갖는 추가 성분을 포함할 수 있다.

"골유도성(osteo-inductive)"이란 용어는 줄기세포, MSC 같은 미성숙 세포를 보충하고 이러한 세포들이 조골아세포 및 성숙한 골아세포로 분화하여 뼈 조직을 형성하도록 자극하는, 펩티드 성장인자 같은 성분들의 능력을 지칭한다. 약학 조성물은 골유도 특성을 갖는 성분, 예컨대 골유도성 단백질 또는 펩티드, 예를 들어 골형태형성 단백질, 예컨대 BMP-2, BMP-7 또는 BMP-4; 하이드로겔 또는 생체폴리머, 예컨대 콜라겐, 히알루론산 또는 그의 유도체, 오스테오넥틴(osteonectin), 피브리노겐, 또는 오스테오칼신을 추가로 포함할 수 있다. 바람직하게, 약학 조성물은 히알루론산 또는 그의 유도체, 콜라겐 또는 피브리노겐을 추가로 포함할 수 있다.

"골전도성(osteo-conductive)"이란 용어는 뼈 세포가 새로운 뼈를 접합, 이동, 성장 및 생산할 수 있는 스캐폴드로서 작용하는 성분의 능력을 지칭한다. 약학 조성물은 골전도 특성을 갖는 성분, 예를 들어 골전도 스캐폴드 또는 매트릭스 또는 표면, 예컨대 비제한적으로 트리칼슘 포스페이트, 하이드록시아파타이트, 하이드록시아파타이트/트리칼슘 포스페이트 입자의 조합물(HA/TCP), 젤라틴, 폴리락트산, 폴리락트 글리콜산, 히알루론산, 키토산, 폴리-L-리신 또는 콜라겐을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 약학 조성물은 뼈 부상 및 결함을 복구하는데 유용한 성분들을 상기한 바와 같이 포함할 수 있다. 약학 조성물은 골전도 특성을 갖는 스캐폴드 또는 매트릭스를 포함할 수 있다. 골전구세포 또는 골아세포, 또는 골전구세포 및/또는 골아세포를 포함하는 세포군은 탈미네랄화된 뼈 매트릭스(DBM) 또는 기타 매트릭스와 조합하여 복합물을 골형성뿐만 아니라 골전도성 및 골유도성으로 만들 수 있다. 자기유래의 골수 세포를 동종이계 DBM와 함께 사용하는 유사한 방법으로 양호한 결과를 수득하였다(Connolly et al. 1995. Clin Orthop 313: 8-18).

본 발명에 따른 약학 조성물은 보조적 생체활성 인자 또는 골유도성 단백질, 예컨대 골 형태형성 단백질, 예컨대 BMP-2, BMP-7 또는 BMP-4, 또는 임의의 기타 성장 인자를 추가로 포함하거나 이와 함께 동시-투여될 수 있다. 기타 가능한 동반 성분에는 골 재생을 돕는데 적합한 칼슘 또는 포스페이트의 무기 공급원이 포함된다(WO 00/07639). 필요하다면, 세포 제제는 개선된 조직 재생을 제공하는 담체 매트릭스 또는 물질 상에 투여될 수 있다. 예를 들어, 상기 물질은 하이드로겔, 또는 생체폴리머, 예컨대 젤라틴, 콜라겐, 히알루론산 또는 그의 유도체, 오스테오넥틴, 피브리노겐, 또는 오스테오칼신일 수 있다. 생체물질은 표준 기술에 따라 합성될 수 있다(예를 들어, Mikos et al., Biomaterials 14:323, 1993; Mikos et al., Polymer 35:1068, 1994; Cook et al., J. Biomed. Mater. Res. 35:513, 1997).

비제한적으로, 질환의 종류와 중증도에 따라 GDF-8의 전형적인 일일 투여량은 체중 1 kg 당 약 1 ng 내지 100 mg 이상의 범위일 수 있다. 수 일 또는 그 이상의 반복 투여에 있어서, 상태에 따라 질환의 증상에 대해 원하는 억제가 일어날 때까지 치료를 지속한다. GDF-8의 바람직한 투여량은 체중 1 kg 당 약 10 ng 내지 약 10 mg 범위 내일 수 있다. 따라서, 약 10 ng/kg, 100 ng/kg, 500 ng/kg, 1 mg/kg 또는 10 mg/kg(또는 이들의 조합) 중 1 이상의 용량을 환자에게 투여할 수 있다. 이러한 용량은 간헐적으로, 예를 들어 매주 또는 2주 마다 또는 3주 마다 투여될 수 있다.

비제한적으로, 예를 들어 투여될 세포 조성물의 전형적인 용량은 주사 당 약 0.05x10⁶ 세포 내지 5x10⁹ 세포의 범위일 수 있다. 예를 들어, 투여될 용량은 주사 당 약 0.5x10⁶ 세포 내지 1x10⁹ 세포의 범위일 수 있다. 바람직하게, 투여될 용량은 주사 당 약 4x10⁶ 세포 내지 250x10⁶ 세포의 범위일 수 있다.

여기서 사용된 "임플란트"란 용어는 결여된 생물학적 구조의 대체, 손상된 생물학적 구조의 지지 또는 보충, 또는 존재하고 있는 생물학적 구조의 강화를 위해 제조된 의학적 장치를 폭넓게 지칭한다. 여기서 의도하는 임플란트는 생물학적 성분(들), 예컨대 세포 및/또는 조직을 포함할 수 있다. 의학적 임플란트는, 예를 들어 핀, 봉(rod), 스크류, 평판(plate), 및 뼈 수술과 뼈 치료에 사용되는 다른 구조물을 포함한다.

"이식"이란 용어는 이식된 생체의학적 조직, 예를 들어 기관, 조직 또는 세포를 폭넓게 지칭한다.

선택적으로 또는 추가적으로, MSC 또는 본 골전구세포 또는 골아세포, 또는 골전구세포 및/또는 골아세포를 포함하는 세포군, 또는 여기서 예상된 다른 세포 종류를 대상에게 투여하기 전에 관심 있는 핵산으로 안정하게 또는 일시적으로 형질전환할 수 있다. 관심 있는 핵산 서열은 골아세포 개체군의 성장, 분화 및/또는 미네랄화를 더 강화하는 유전자 생성물을 코딩하는 것들을 포함하나, 이에 한정되지는 않는다. 예를 들어, BMP-2의 발현 시스템을 MSC에 안정적 또는 일시적 방식으로 비-치유 골절 또는 골다공증의 치료 목적으로 도입할 수 있다. MSC 및 골전구세포 또는 골아세포, 또는 골전구세포 및/또는 골아세포를 포함하는 세포군의 형질전환 방법은 당업자에게 알려져 있다.

또한, 본 발명의 세포 또는 다른 약학적 활성성분과 상기한 추가 성분 하나 이상 및 상기한 약학적 부형제 하나 이상을 혼합하여 약학 조성물을 제조하는 방법을 제공한다.

또한, 여기서 적시된, 골전구세포 또는 골아세포, 또는 골전구세포 및/또는 골아세포를 포함하는 세포군, 또는 기타 세포 종류, 또는 여기서 정의된 약학 조성물을 대상에게, 예를 들어 전신적으로 또는 국소적으로, 예를 들어 근골격 병소 부위에, 예를 들어 주사에 의해 투여하기 위한 외과적 장비 또는 디바이스를 포함하고, 추가로 여기서 적시된, 골전구세포 또는 골아세포, 또는 골전구세포 및/또는 골아세포를 포함하는 세포군, 또는 기타 세포 종류, 또는 여기서 정의된 약학 조성물을 포함하는 어레인지먼트 또는 부품 키트를 기술하였다.

예를 들어, 비제한적으로, 이러한 어레인지먼트 또는 부품 키트는 다음을 포함한다: 본 방법으로 얻을 수 있는 골전구세포 또는 골아세포, 또는 골전구세포 및/또는 골아세포를 포함하는 세포군, 또는 기타 세포 종류를 갖는 바이알, 또는 여기서 의도된 골전구세포 또는 골아세포, 또는 골전구세포 및/또는 골아세포를 포함하는 세포군, 또는 기타 세포 종류를 포함하는 바이알; 및 골전구세포 또는 골아세포, 또는 골전구세포 및/또는 골아세포를 포함하는 세포군, 또는 기타 세포 종류를 저장하는 저장소 수단, 골전구세포 또는 골아세포, 또는 골전구세포 및/또는 골아세포를 포함하는 세포군, 또는 기타 세포 종류를 분산하기 위한, 저장소의 종축을 따라 움직일 수 있는 피스톤 수단, 및 골전구세포 또는 골아세포, 또는 골전구세포 및/또는 골아세포를 포함하는 세포군, 또는 기타 세포 종류를 대상에게 전달하기 위한, 저장소 수단에 장착된 중공 니들을 갖는 골전구세포 또는 골아세포, 또는 골전구세포 및/또는 골아세포를 포함하는 세포군, 또는 기타 세포 종류를 대상에게 전달하는 디바이스.

골전구세포 또는 골아세포, 또는 골전구세포 및/또는 골아세포를 포함하는 세포군, 또는 기타 세포 종류는 이들을 의도하는 조직 부위로 이식 또는 이동하고 작용적으로 결함이 있는 영역을 재구성 또는 재생하는 방법으로 투여할 수 있다. 조성물의 투여는 복구되는 근골격 부위에 따라 달라진다. 예를 들어, 골형성 (osteogenesis)은 조직을 재건하거나 스플릿, 또는 고관절 대체물과 같은 보철물 디바이스를 삽입하기 위한 수술 절차에 따라 촉진될 수 있다. 다른 경우로, 외과적 수술이 필요하지 않다면, 조성물은 주사에 의해 또는 (예를 들어, 척주 복구( vertebral column)를 위해) 조작 내시경을 사용하여 투여될 수 있다.

일 구체예에서, 위에서 정의된 약학적 세포 제제는 액체 또는 점성 조성물의 형태로 투여될 수 있다. 구체예들에서, 세포 또는 이들을 포함하는 약학 조성물은 전신적으로, 국소적으로 또는 병소 부위에 투여될 수 있다.

또다른 구체예에서, 세포 또는 세포군은 임플란트를 제공하기에 적합한 기질로 이동되거나/되고 그 위에서 배양될 수 있다. 세포가 적용되고 배양될 수 있는 기질은 금속, 예컨대 티타늄, 코발트/크롬 합금 또는 스테인레스 스틸, 생체활성 표면, 예컨대 칼슘 포스페이트, 중합체 표면, 예컨대 폴리에틸렌 등일 수 있다. 덜 바람직하긴 하지만, 유리 세라믹 같은 규산 물질도 기질로서 사용될 수 있다. 티타늄과 같은 금속, 및 (칼슘 포스페이트가 기질의 필수 성분은 아니지만)칼슘 포스페이트가 가장 바람직하다. 기질은 다공성 또는 비-다공성일 수 있다.

예를 들어, 증식된 세포, 또는 배양 접시 내에서 분화하고 있는 세포는 필요하다면 분화 과정을 배가 및/또는 지속시키기 위해 본 발명의 액체 영양 배지 내에서 고체 지지체를 인큐베이션함으로써 3-차원 고체 지지체 상으로 이동될 수 있다. 세포는, 예를 들어 상기 세포를 함유하는 액체 현탁액으로 3-차원 고체 지지체를 함침함으로써, 3-차원 고체 지지체 상으로 이동될 수 있다. 이러한 방식으로 수득된 함침된 지지체는 인간 대상에 이식될 수 있다. 이같이 함침된 지지체는 또한 최종적으로 이식되기 전에, 액체 배양 배지에 지지체를 담금으로써 재배양될 수 있다.

3-차원 고체 지지체는 인간에게 이식될 수 있도록 하기 위해 생체적합성일 필요가 있다. 이것은 임의의 적합한 형상, 예컨대 실린더, 구형, 플레이트 또는 임의 형상의 일부일 수 있다. 생체적합성 3-차원 고체 지지체로서 적합한 물질 중에서, 특히 칼슘 카보네이트, 구체적으로, 특히 산호 뼈대 형태의 아라고나이트 (aragonite), 알루미나 기재, 지르코니아 기재, 트리칼슘 포스페이트 기재의 다공성 세라믹 및/또는 히드록시아파타이트, 칼슘 카보네이트를 히드록시아파타이트로 전환되게 할 수 있는 열수 교환에 의해 수득된 모조 산호 뼈대, 또는 그 밖의 아파타이트-규회석 유리 세라믹, Bioglass(TM) 유리와 같은 생체활성 유리 세라믹이 언급될 수 있다.

본 발명을 그의 특정 구체예와 함께 기술하였지만, 다양한 대체, 변경 및 변형은 당업자들에게 앞선 기술 내용의 측면에서 자명할 것임이 분명하다. 따라서, 다음과 같은 대체, 변경 및 변형들 모두 첨부된 청구항들의 요지와 범위 내에 포함되어야 한다.

상기한 측면과 구체예들을 이하의 비제한적 실시예에 의해 추가 설명하였다.

실시예

실시예 1: 대상에서 얻어진 세포의 배양

골수를 건강한 사람의 장골능에서 수집하였다. 헤파린 처리된 골수를 밀도 그래디언트 용액(Ficoll^TM plate Premium, GE Healthcare)에서 단편화하였다. 밀도 그래디언트 용액으로 단핵 세포(MNC)를 정제하였다. 이후, MNC를 5 x 10³ 내지 5 x 10⁵ 세포/cm²의 밀도로 도포하였다. 세포를 혈청과 FGF-2 존재 하의 배양 배지에서 배양하였다. 1일과 5일 사이에 완전 배지를 교환하고 이후 정기적으로 교환하면서 10 내지 18일 동안 배지에서 1차 배양을 유지하였다. 1차 배양 동안, 부착되지 않은 조혈 세포는 배지 교환에 의해 배출하고 간엽 유도 세포는 섬유아세포 유사 모폴로지를 얻었다. 1차 배양 후에, 간엽 유도 세포를 트립신 처리로 수집하고, 2차 세포 배양을 위해 재도포하였다. 3 내지 18일 동안 2차 배양하였다.

실시예 2: 혈청, GDF -8 및 FGF -2를 포함하는 배지에서 1차 세포 배양물에서 유래한 세포의 배양

Ficoll 후에, MNC 세포를 GDF-8(재조합 인간 마이오스타틴(myostatin), Peprotech)의 존재 하 또는 GDF-8의 부존(대조용) 하에 실시예 1에 기술된 바와 같이 1차 배양에서 배양하였다. 융합시, 1차 배양 세포를 통과시키고 2차 배양을 위해 상이한 밀도로 재도포하고, GDF-8의 존재 하(GDF-8) 또는 GDF-8의 부존 하(대조용)에서 배양하였다. 사용된 GDF-8의 농도는 1 내지 100 ng/ml였다.

배양의 종료 시기에 세포를 그의 증식, 표현형(FACS), 단백질 분비(IL6, VEGF, Decorin, Osteoprotegerin), 미네랄화 능력 및 효소적 ALP 활성으로 특성화하였다.

배양 수율에 대한 효과

혈청, FGF-2 및 GDF-8을 포함하는 배지에서 1차 배양의 세포를 배양하는 것의 세포 성장에 대한 영향을 평가하기 위해, 1차 및 2차 배양의 전체 배양 수율을 GDF-8의 존재 하(GDF-8) 또는 GDF-8의 부존 하(대조용)에서 배양된 세포에 대해 측정하였다.

배양 수율을 다음과 같이 측정하였다: 배양 또는 성장인자 처리의 말기에 수집된 세포의 수를 배양을 위해 도포된 세포의 수로 나누었다. 세포 생존력을 Trypan Blue 배제방법으로 평가하고, 세포수를 Buerker 챔버 내에서 세포 현탁액을 계수하여 측정하였다.

1차 및 2차 배양 수율은 1차 및 2차 세포 배양 각각에서의 세포 증식을 나타내었다.

평균 데이터를 표 1과 도 1에 기재하였다. 배양 수율은 혈청, FGF-2 및 GDF-8을 포함하는 배지에서의 세포 배양이 GDF-8이 없는 상기 배지에서 세포를 배양하는 것과 비교하여 세포 증식을 증가시키는 것을 나타내었다(표 1, 도 1).

FACS 에 의한 HLA - DR 및 ALP 의 발현

세포를 특성화하기 위해 세포 표현형을 세포를 탈착한 후 FACS 분석을 사용하여 측정하였다. 측정된 마커는 CD45(조혈 마커), CD105(간엽 마커), ALP(골형성 마커) 및 HLA-DR(면역원 마커)였다.

세포 표현형을 FACS 분석에 의해 BD Biosciences (항-CD45, 항-CD105, 항-HLA-DR)와 R&D Systems(항-ALP)의 플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC), 파이코에리트린(phycoerythrin)(PE), 또는 알로파이코시아닌(allophycocyanin)(APC)과 결합된 CD45, CD105, ALP 및 HLA-DR에 대한 항체를 사용하여 측정하였다. 세포를 BD FACS Canto II 유세포분석기(Becton Dickinson)로 분석하였다. 마커의 발현은 마커를 발현하는 세포수를 FACS로 기록된 전체 세포수로 나눈 백분율로 제공하였다.

평균 데이터를 표 2와 도 2 및 3에 기재하였다. 이 데이터는 GDF-8 존재 하의 세포 배양이 대조용과 비교하여 HLA-DR 발현을 감소하는 것을 나타내었다(표 2 및 도 2). 결과는 또한 GDF-8 존재 하의 세포 배양이 TGF-베타 1 존재 하의 세포 배양과 대조적으로 높은 수준의 ALP 발현을 유지하는 것을 나타냈다(표 2 및 도 3).

또한 이 결과로 GDF-8 존재 하의 세포 배양이 GDF-8 부존 하에 배양된 대조 세포와 비교하여 조혈 마커 CD45(표 2), 간엽 마커 CD105(표 2), 및 기타 면역원 마커 CD28/CD80/CD83/CD86(결과 미기재)의 유사한 발현을 유지하는 것이 입증되었다.

상징액에서 마커의 분비

세포의 골아세포성 능력과 뼈 복구와 연관된 세포를 보충하는 이들의 능력을 평가하기 위해 단백질 분비를 시험하였다. 단백질 분비는 ELISA로 시험하였다. 보다 구체적으로, 세포 상징액을 배양 후에 수집하여 IL6와 VEGF(세포 보충) 및 데코린과 오스테오프로테게린(뼈 매트릭스 단백질과 뼈 인자)의 생산을 평가하였다.

IL6, VEGF, 데코린 및 오스테오프로테게린의 분비를 각 배지 교환에서 모아진 세포 상징액에서 평가하였다. 제조자의 지시에 따라 어세이를 수행하였다(R&D Systems Human IL6 ELISA kit # DY206, R&D Systems Human VEGF ELISA kit # DY293b, R&D Systems Human Decorin ELISA kit # DY143, R&D Systems Human Osteoprotegerin ELISA kit # DY805). 흡광도는 Multiskan 플레이트 판독기를 사용하여 450 nm에서 측정하였다.

평균 데이터를 표 3과 도 4에 기재하였다. GDF-8 배양물에서 IL6, VEGF, 데코린 및 오스테오프로테게린(OPG)의 농도는 대조용 또는 TGF-베타 1 배양물의 농도와 유사하였다(표 3 및 도 4).

2차 및 3차 배양물의 미네랄화

미네랄화된 매트릭스를 형성하는 세포 능력을 평가하기 위해 미네랄화를 사용하였다. 이를 위하여 세포를 2차 배양 말기에 24-웰 플레이트에 5 x 10³ 내지 5 x 10⁴ 세포/cm²의 밀도로 도포하고, 혈청, FGF-2 및 GDF-8을 함유하는 배지(FGF-2/GDF-8) 또는 GDF-8이 없는 동일 배지(FGF-2) 또는 혈청, FGF-2 및 TGF-베타 1을 함유하는 배지(FGF-2/TGF-베타 1)에서 배양하였다. 다음 날, 배양배지를 골형성 배지, 즉 15% FBS, 1% 페니실린/스트렙토마이신, 베타-글리세로포스페이트(10 mM), 아스코르브산(비타민 C)(50 μg/ml), 및 덱사메타손(10^-8 M)이 보충된 알파-MEM으로 대체하여 미네랄화를 유도하였다. 15% FBS 및 1% 페니실린/스트렙토마이신을 보충한 알파-MEM을 대조용 배지로 하였다. 3주 배양한 후, 세포를 4% 파라포름알데히드/PBS에 고정하고 무기 칼슘 침전물을 염색하는 알리자린 레드 S로 염색하였다. 최종적으로, 미네랄화 능력을 관찰된 임의의 미네랄화에 대한 0 내지 관찰된 최대 미네랄화에 대한 2.5까지 범위의 반정량 스코어로 평가하였다.

미네랄화는 혈청, FGF-2 및 GDF-8(FGF-2/GDF-8) 또는 FGF-2 및 TGFβ-1 (FGF-2/TGF-베타 1) 등의 모든 배양 조건에서 GDF-8이 없는 조건(FGF-2)과 비교하여 관찰하였다(표 4 및 도 5). 결과적으로, GDF-8은 본 발명을 예시하는 방법으로 배양된 세포의 미네랄화 능력을 손상하는 것으로 보이지 않았다.

알칼리 포스파타제 활성

뼈 매트릭스 형성에 있어서 중요 효소인 알칼리 포스파타제의 활성을 합성 기질 p-니트로페닐 포스페이트(pNPP)의 포스페이트 그룹 가수분해와 415 nm에서의 반응 생성물 검출에 기초한 생화학적 어세이로 측정하였다. 세포의 ALP 효소 활성을 정제된 송아지 장내 알칼리 포스파타제 활성에 기초한 표준곡선과 비교하여 측정하였다. ALP 활성을 ALP/단백질 mg의 단위로 보고하였다. 단백질 함량은 브래드포드(Bradford) 어세이로 측정하였다. 1 단위의 ALP는 37 ℃에서 분당 1μmol의 pNPP를 가수분해한다.

GDF-8의 존재 하에 배양된 세포는 더 높은 ALP 활성을 갖는 것으로 보였다(표 5). 이들 결과는 FACS 분석을 입증하고 있다(표 2).

다음과 같은 비제한적 의견을 제공할 수 있다:

혈청, FGF-2 및 GDF-8을 포함하는 배지에서 1차 배양으로 배양한 세포는 GDF-8이 없는 동일 배지에서의 배양 세포와 비교하여 세포 증식을 자극하였다.

혈청, FGF-2 및 GDF-8을 포함하는 배지에서 1차 배양으로 배양한 세포는 HLA-DR의 발현을 감소시켰다. 결과적으로, GDF-8은 세포의 면역원성을 저하시켰다.

혈청, FGF-2 및 GDF-8을 포함하는 배지에서 배양된 세포는 GDF-8이 없는 동일 배지에서 배양된 대조용 세포와 유사한 골형성 표현형을 나타내었다. 혈청, FGF-2 및 GDF-8을 포함하는 배지에서 배양한 세포는 배양하는 동안 ALP 발현에 영향을 주는 것으로 보이지 않았다. 게다가, 혈청, FGF-2 및 GDF-8을 포함하는 배지에서 배양한 세포는 데코린과 오스테오프로테게린 같은 뼈 매트릭스 단백질 및 VEGF 같은 세포 보충에 연관된 단백질의 분비에 영향을 주지 않았다. 또한, 혈청, FGF-2 및 GDF-8을 포함하는 배지에서 배양된 세포는 미네랄화된 매트릭스를 합성할 수 있었다.

실시예 3: 3차 배양에서 혈청, GDF -8 및 FGF -2를 포함하는 배지에서의 세포 배양

실시예 1에 기재된 FGF-2와의 1차 및 2차 배양 동안 배양된 세포에 대한 혈청, FGF-2 및 GDF-8을 포함하는 배지에서 배양한 세포의 효과를 알아보기 위해, 세포를 3차 배양을 위해 6-웰 플레이트에 도포하고 24시간 동안 방치하여 기질 표면에 부착하였다. 다음날, 세포를 혈청과 FGF-2를 포함하는 배지에서 GDF-8의 존재 하(GDF-8) 또는 GDF-8의 부존 하(대조용)에 배양하였다.

4일 배양 후의 세포 표현형

혈청, FGF-2 및 GDF-8을 포함하는 배지에서 4일 동안 3차 배양으로 배양된 세포의 표현형을 여기서 기술된 FACS로 측정하였다. 마커의 발현은 마커를 발현하는 세포수를 배양을 위해 도포된 전체 세포수로 나눈, 포지티브 세포의 백분율로 제공되었다. 조혈 마커 CD45와 간엽 마커 CD105의 발현은 모든 조건에서 유사하였다(표 6 및 도 6). 표 6과 도 6에 나타낸 바와 같이, HLA-DR의 발현은 혈청, FGF-2 및 GDF-8을 포함하는 배지에서 4일 동안 3차 배양으로 세포를 배양한 후에 혈청, FGF-2 및 TGF-베타 1을 포함하는 배지에서 4일 동안의 3차 배양의 배양 세포와 비교하여 감소하였다. 결과적으로, 본 발명의 방법을 사용하므로써 얻어진 세포 또는 세포군의 특성을 유리하게 향상할 수 있다.

상이한 농도의 GDF -8로 배양한 6일 후의 세포 표현형

세포를 3차 배양에서 6일 동안 혈청, FGF-2 및 GDF-8을 포함하는 배지에서 배양하였고, 여기에서 GDF-8은 배지에서 50 ng/ml, 100 ng/ml 또는 200 ng/ml로 양을 증가시켰다.

혈청, FGF-2 및 GDF-8을 포함하는 배지에서 6일 동안의 3차 배양으로 배양된 세포의 표현형을 여기서 기술된 FACS로 분석하였다. 마커의 발현은 마커를 발현하는 세포수를 배양을 위해 도포된 전체 세포수로 나눈, 포지티브 세포의 백분율로 제공되었다.

혈청, FGF-2 및 GDF-8을 포함하는 배지에서 6일 동안의 3차 배양의 모든 세포 배양 조건에 있어서, HLA-DR 발현은 대조용 조건에서보다 더 낮았다. 또한 HLA-DR 발현은 GDF-8의 농도 증가에 따라 감소하는 것으로 보였다(표 7 및 도 7).

다음과 같은 비제한적 의견을 제공할 수 있다:

혈청, FGF-2 및 GDF-8을 포함하는 배지에서 3차 배양으로 배양한 세포는 세포의 HLA-DR 발현의 감소를 유도하였다. HLA-DR 발현의 감소는 GDF-8의 농도가 높을수록 더욱 뚜렷하였다.

실시예 4: 혈청 및 GDF -8을 포함하는 배지에서 1차 배양으로부터의 배양 세포

골수 세포를 (1) 혈청, FGF-2 및 GDF-8를 포함하는 배지, 또는 (2) 혈청 및 GDF-8을 포함하는 배지에서 배양하였다. 1차 배양 후에 세포를 통과시키고 2차 배양을 위해 상응하는 배지에 재도포하였다. 사용된 GDF-8의 농도는 100 ng/ml였다. 배양 말기에 세포를 그의 증식 및 표현형으로 특성화하였다(FACS).

배양 수율에 대한 효과

배양 수율은 세포 계수로 측정되었다. 데이터를 표 8과 도 8에 나타내었다. 데이터는 배양 수율이 GDF-8이 존재하거나 존재하지 않는 FGF-2 존재 하의 배양과 비교하여 배지에서 FGF-2가 없을 때 감소되는 것을 나타냈다.

동일 종류의 추가 실험에서 샘플의 수를 증가하여 표 9에 나타낸 결과를 얻었다.

FACS 에 의한 HLA - DR 및 ALP 의 발현

1차 및 2차 배양 후 세포 표현형을 실시예 2에 기술된 FACS 분석으로 측정하였다. ALP 및 HLA-DR 마커의 발현을 포지티브 세포의 백분율로 제공하였다. GDF-8을 포함하는 1차 배양에서 ALP 발현 수준은 FGF-2가 존재하거나 존재하지 않는 배양에서와 비슷하였으나, 2차 배양의 경우, FGF-2가 없는 배양과 비교하여 ALP 발현의 감소가 FGF-2를 포함하는 배양에서 관찰되었다(표 10 및 도 9). GDF-8을 포함하는 배지에서의 배양물은 FGF-2를 포함하고 GDF-8이 없는 배지에서의 배양물과 비교하여 FGF-2가 존재하거나 존재하지 않거나 HLA-DR 발현의 감소를 나타내었다. 이러한 감소는 GDF-8과 FGF-2의 존재 하에서 더욱 뚜렷하였다(표 10 및 도 10).

동일 종류의 추가 실험에서 샘플의 수를 증가하여 표 11에 나타낸 결과를 얻었다.

다음과 같은 비제한적 의견을 제공할 수 있다:

예상한 바와 같이, 세포의 배양 배지 중에 성장인자 FGF-2가 없을 경우 1차 및 2차 배양 수율을 감소하였으나, 세포의 HLA-DR 발현 감소에는 영향을 미치지 않았다. 세포의 배양 배지 중 GDF-8의 존재는 FGF-2의 존재와는 별개로 면역원성 프로필이 낮은 MSC의 골아세포성 분화를 유도할 수 있다.

종합적으로, 상기한 실시예에서는 혈청, FGF-2 및 GDF-8을 포함하는 배지에서의 배양 세포는 GDF-8이 없는 동일 배지에서의 1차 배양의 배양 세포와 비교하여 세포 성장을 증가시키고, HLA-DR 발현을 감소하며 골형성 분화를 저감하지 않는 것으로 나타났다. 구체적으로, 혈청, FGF-2 및 GDF-8을 포함하는 배지에서의 1차 배양의 배양 세포는 ALP 발현 및, 데코린과 오스테오프로테게린 같은 뼈 매트릭스 단백질 또는 VEGF 같은 세포 보충과 관련된 단백질의 발현을 변성하지 않았다.

또한, 상기 실시예에서는 혈청, FGF-2 및 GDF-8을 포함하는 배지에서의 3차 배양의 배양 세포가 GDF-8이 없는 동일 배지에서의 1차 배양의 배양 세포와 비교하여 ALP 발현에 대한 효과가 없는 것으로 나타났다. 유리하게, 혈청, FGF-2 및 GDF-8을 포함하는 배지에서의 2차 또는 3차 배양의 배양 세포가 HLA-DR 발현을 특히 장기 치료에서 GDF-8이 없는 동일 배지에서의 1차 배양의 배양 세포와 비교하여 감소시키는 것이 관찰되었다.

실시예 5: GDF -8을 포함하는 배지의 배양 세포

골수를 건강한 사람의 장골능에서 수집하였다. 골수를 밀도 그래디언트 용액(Ficoll^TM plate Premium, GE Healthcare)에서 단편화하였다. 밀도 그래디언트 용액으로 단핵 세포(MNC)를 정제하였다. 이후, MNC를 5 x 10³ 내지 5 x 10⁵ 세포/cm²의 밀도로 도포하고 표준 MSC 배양 방법에 따라 생육하였다. 다음 실험을 수행하였다:

MSC를 1차 또는 2차 배양, 또는 해당하는 경우 3차 배양의 배양 배지에 GDF-8을 첨가하거나 첨가하지 않고 표준 연골세포 계통 분화 방법을 수행하였다. 얻어진 연골세포 계통의 세포, 구체적으로 연골아세포 및 연골세포는 GDF-8이 포함되지 않은 것과 비교하여 GDF-8이 포함되었을 때 HLA-DR 발현 감소를 나타내었다.

MSC를 1차 또는 2차 배양, 또는 해당하는 경우 3차 배양의 배양 배지에 GDF-8을 첨가하거나 첨가하지 않고 표준 지방세포 계통 분화 방법을 수행하였다. 얻어진 지방세포 계통의 세포, 구체적으로 지방아세포 및 지방세포는 GDF-8이 포함되지 않은 것과 비교하여 GDF-8이 포함되었을 때 HLA-DR 발현 감소를 나타내었다.

MSC를 1차 또는 2차 배양, 또는 해당하는 경우 3차 배양의 배양 배지에 GDF-8을 첨가하거나 첨가하지 않고 표준 근세포 계통 분화 방법을 수행하였다. 얻어진 근세포 계통의 세포, 구체적으로 근아세포 및 근육세포는 GDF-8이 포함되지 않은 것과 비교하여 GDF-8이 포함되었을 때 HLA-DR 발현 감소를 나타내었다.

MSC를 1차 또는 2차 배양, 또는 해당하는 경우 3차 배양의 배양 배지에 GDF-8을 첨가하거나 첨가하지 않고 표준 힘줄세포 계통 분화 방법을 수행하였다. 얻어진 힘줄세포 계통의 세포, 구체적으로 힘줄아세포 및 힘줄세포는 GDF-8이 포함되지 않은 것과 비교하여 GDF-8이 포함되었을 때 HLA-DR 발현 감소를 나타내었다.

MSC를 1차 또는 2차 배양, 또는 해당하는 경우 3차 배양의 배양 배지에 GDF-8을 첨가하거나 첨가하지 않고 표준 스트로모젠 계통 분화 방법을 수행하였다. 얻어진 스트로모젠 계통의 세포, 구체적으로 스트로마 세포는 GDF-8이 포함되지 않은 것과 비교하여 GDF-8이 포함되었을 때 HLA-DR 발현 감소를 나타내었다.

Claims (22)

1. 간엽줄기세포(MSC), MSC의 분화로 얻어진 세포, 골세포 계통의 세포, 연골세포 계통의 세포, 지방세포 계통의 세포, 근세포 계통의 세포, 힘줄세포 계통(tendonocytic lineage)의 세포, 섬유아세포 계통의 세포 및, 스트로모젠 계통(stromogenic lineage)의 세포로 구성되는 군에서 선택된 세포의 면역원성을 시험관 내에서 감소하기 위한 성장 및 분화 인자 8(GDF-8)의 용도.
2. 제1항에 있어서, 골세포 계통의 세포, 연골세포 계통의 세포, 지방세포 계통의 세포, 근세포 계통의 세포, 힘줄세포 계통의 세포, 섬유아세포 계통의 세포 또는 스트로모젠 계통의 세포가 MSC의 분화로 얻어진 용도.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 세포가 MSC, 골전구세포, 골아세포, 골세포, 연골아세포, 연골세포, 지방아세포, 지방세포, 근아세포, 또는 근세포이고, 바람직하게 세포가 MSC, 골전구세포, 골아세포, 연골아세포, 또는 연골세포인 용도.
4. 제1항에 있어서, 세포가 MSC인 용도.
5. 제1항 또는 제2항에 있어서, 세포가 골전구세포 또는 골아세포인 용도.
6. 제1항 내지 제5항 중 어느 하나의 항에 있어서, 세포가 포유동물 세포, 예컨대 인간 세포 또는 비인간 포유동물 세포, 바람직하게 인간 세포인 용도.
7. 제1항 내지 제6항 중 어느 하나의 항에 있어서, GDF-8이 MHC 클래스 II 세포 표면 수용체 복합체를 세포 상에서 감소시키고, 임의로 하나 이상의 동시자극인자를 세포 상에서 감소시키는 용도.
8. 제7항에 있어서, 인간 세포에서 MHC 클래스 II 세포 표면 수용체가 인간 백혈구 항원 DR(HLA-DR)인 용도.
9. 제1항 내지 제8항 중 어느 하나의 항에 있어서, 세포가 임플란트 또는 이식물, 바람직하게 뼈 조직 및/또는 관절 조직 임플란트 또는 이식물, 또는 약학 제제 내에 포함된 용도.
10. MSC, MSC의 분화로 얻어진 세포, 골세포 계통의 세포, 연골세포 계통의 세포, 지방세포 계통의 세포, 근세포 계통의 세포, 힘줄세포 계통의 세포, 섬유아세포 계통의 세포 및, 스트로모젠 계통의 세포로 구성되는 군에서 선택된 세포의 면역원성을 감소하는 방법에서 사용하기 위한, 생체 내 투여될 수 있는 GDF-8.
11. 제10항에 있어서, 세포와 조합하여 생체 내 투여될 수 있는 GDF-8.
12. 제10항 또는 제11항에 있어서, 세포가 제2항 내지 제6항 중 어느 하나의 항에 정의된 GDF-8.
13. 제10항 내지 제12항 중 어느 하나의 항에 있어서, 세포가 투여될 대상에 대해 동종이계(allogeneic)인 GDF-8.
14. 의약, 바람직하게 근골격계 질환, 더욱 바람직하게 뼈 질환 및 골관절 질환의 치료용 의약으로서 사용하기 위한, MSC, MSC의 분화로 얻어진 세포, 골세포 계통의 세포, 연골세포 계통의 세포, 지방세포 계통의 세포, 근세포 계통의 세포, 힘줄세포 계통의 세포, 섬유아세포 계통의 세포 및, 스트로모젠 계통의 세포로 구성되는 군에서 선택된 세포와 GDF-8의 조합물.
15. 제14항에 있어서, 세포가 제2항 내지 제6항 중 어느 하나의 항에 정의된 GDF-8과 세포의 조합물.
16. 제14항 또는 제15항에 있어서, 근골격계 질환, 바람직하게 뼈 질환 및 골관절 질환의 치료에서 사용하기 위한, 세포가 MSC, 골세포 계통의 세포, 연골세포 계통의 세포, 근세포 계통의 세포, 및 힘줄세포 계통의 세포로 구성되는 군에서 선택되고, 바람직하게 세포가 MSC, 골전구세포, 골아세포, 골세포, 연골아세포, 연골세포, 근아세포 또는 근세포인 GDF-8과 세포의 조합물.
17. 제14항 내지 제16항 중 어느 하나의 항에 있어서, 세포가 투여될 대상에 대해 동종이계인 GDF-8과 세포의 조합물.
18. 대상에 투여, 임플란트 또는 이식된 물질에 대한 대상의 거부 위험을 감소시키는 방법에 사용하기 위한 GDF-8.
19. 제18항에 있어서, 물질이 뼈 조직 및/또는 관절 조직을 포함하는 GDF-8.
20. 대상에 투여, 임플란트 또는 이식될 물질과 GDF-8을 포함하고, 임의로 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 부형제를 추가로 포함하는 약학 조성물.
21. 제20항에 있어서, 물질이 MSC, MSC의 분화로 얻어진 세포, 골세포 계통의 세포, 연골세포 계통의 세포, 지방세포 계통의 세포, 근세포 계통의 세포, 힘줄세포 계통의 세포, 섬유아세포 계통의 세포 및, 스트로모젠 계통의 세포로 구성되는 군에서 선택된 세포를 포함하는 약학 조성물.
22. 제20항에 있어서, 물질이 뼈 조직 및/또는 관절 조직을 포함하는 약학 조성물.

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