JP2014530065A - 増殖分化因子8(gdf‐8)の使用 - Google Patents
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Abstract
本発明は、インビトロ又はインビボでの、特に間葉系幹細胞(MSC)など細胞、組織若しくは物質などの免疫原性又は拒絶の危険性の低減における増殖分化因子8(GDF‐8)の使用に関する。さらに、本発明は、FGF‐2及びGDF‐8を使用して、MSCを、前骨芽細胞若しくは骨芽細胞、又は前骨芽細胞若しくは骨芽細胞を含む細胞集団に分化させるための方法に関する。加えて、本発明は、かかる方法によって得ることができる前骨芽細胞若しくは骨芽細胞、又は前骨芽細胞若しくは骨芽細胞を含む細胞集団、並びに、筋骨格系疾患の治療に使用される、前骨芽細胞若しくは骨芽細胞、又は前骨芽細胞若しくは骨芽細胞を含む細胞集団に関する。
Description
本発明は、インビトロ又はインビボにおいて、特に間葉系幹細胞(MSC)、組織又は物質などの細胞の特性を変えるための、増殖分化因子8(GDF‐8)の適用に関する。また、本発明は、インビトロ若しくはエクスビボにおいて、MSCを、前骨芽細胞(osteoprogenitor)(初期及び後期前骨芽細胞を含む。)若しくは骨芽細胞(osteoblastic cell)(前骨芽細胞、骨芽細胞(osteoblast)及び骨細胞を含む。)、又は前骨芽細胞及び/又は骨芽細胞を含む細胞集団に分化させるための方法に関する。さらに、本発明は、当該方法によって得ることが可能な、前骨芽細胞若しくは骨芽細胞、又はかかる前骨芽細胞及び/又は骨芽細胞を含む細胞集団、並びに、筋骨格系疾患の治療に使用される、前述の前骨芽細胞若しくは骨芽細胞(例えば、同種異系前骨芽細胞、同種異系骨芽細胞など)、又は前骨芽細胞及び/又は骨芽細胞を含む細胞集団に関する。
筋骨格系疾患又は障害は、骨格、筋肉、関節、軟骨、腱、靭帯、及び組織と器官をともに支持し結合する他の結合組織に影響を及ぼす場合がある。これらの疾患は経時的に進行するか、又は、例えば、筋骨格系の過度の使用によって若しくは外傷から生じる場合がある。筋骨格系疾患は、筋骨格系と他の身体内部の系との近似した関係により、診断及び/又は治療するのが困難である場合がある。
筋骨格系疾患の治療のための、特に骨疾患の考えられ得る有望なアプローチは、骨形成分化の可能性のある間葉系幹細胞(MSC)、又は骨芽細胞系統に作用し得る細胞の移植である。
MSCは、骨障害を治療するのに以前に使用されていた(Gangji et al. Expert Opin Biol Ther, 2005, vol. 5, 437-42)。しかしながら、かかる比較的未分化の幹細胞を移植
することができるが、これらは、骨芽細胞系統に作用せず、このため、このように移植された幹細胞の相当な割合は、最終的に、所望の組織の形成に寄与することができない。さらに、考えられ得る組織源から得ることが可能なかかる幹細胞の量は、不十分であることが多い。
することができるが、これらは、骨芽細胞系統に作用せず、このため、このように移植された幹細胞の相当な割合は、最終的に、所望の組織の形成に寄与することができない。さらに、考えられ得る組織源から得ることが可能なかかる幹細胞の量は、不十分であることが多い。
国際公開公報第2007/093431号には、単離されたMSCのインビトロにおける十分な増殖を達成し、骨芽細胞の表現型を示す細胞を得ることを目的とする方法が開示されている。前述の方法において、ヒトMSCは、特に、血清又は血漿及び塩基性線維芽細胞増殖因子(FGF‐2)の存在下で培養される。
国際公開公報第2009/087213号には、特に、ヒト血漿又は血清、FGF‐2及びTGFβ‐1を使用する、ヒトMSCの骨形成分化のための方法が記載されている。
しかしながら、MSCから、有用な前骨芽細胞若しくは骨芽細胞、又は前骨芽細胞及び/又は骨芽細胞を含む細胞集団を生産するための、更なる方法及び/又は改良された信頼性のある方法の必要性が存在する。
さらに、患者への投与に有用な細胞、組織又は物質を改良する必要性、特に、免疫原性又は患者による投与の危険性を低減するなどの必要性が存在する。
Gangji et al. Expert Opin Biol Ther, 2005, vol. 5, 437-42
試験の節に例示するように、本発明者らは、増殖分化因子8(GDF‐8)が、細胞、例えば、GDF‐8の存在下で培養した又は分化させる(例えば、間葉系幹細胞系統に、特に、前骨芽細胞若しくは骨芽細胞、又は前骨芽細胞及び/又は骨芽細胞を含む細胞集団の細胞に分化させる)間葉系幹細胞(MSC)の免疫原性を有利に低減することを実現した。
上述の知見を発展させ、本発明者らは、GDF‐8が細胞の免疫原性を低減する能力を認識した。したがって、本発明の態様は、インビトロでの細胞の免疫原性の低減における増殖分化因子8(GDF‐8)の使用に関する。かかる使用は、例えば同種対象に対して細胞の移植を可能にするので有利である。特定の実施形態では、細胞が、間葉系幹細胞(MSC)、MSCの分化によって得られる細胞、骨細胞系統の細胞、軟骨細胞系統の細胞、脂肪細胞系統の細胞、筋細胞系統の細胞、腱細胞(tendonocytic)系統の細胞、線維芽細胞系統の細胞及び間質発生細胞(stromogenic)系統の細胞からなる群より選択される、イ
ンビトロでの細胞の免疫原性の低減における増殖分化因子8の使用を提供する。骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、筋細胞、腱細胞、線維芽細胞又は間質発生細胞系統は、間葉系幹細胞系統のカテゴリーに属すると考えることができ、これによって、かかる細胞の免疫原性の低減におけるGDF‐8の有用性が強調される。
ンビトロでの細胞の免疫原性の低減における増殖分化因子8の使用を提供する。骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、筋細胞、腱細胞、線維芽細胞又は間質発生細胞系統は、間葉系幹細胞系統のカテゴリーに属すると考えることができ、これによって、かかる細胞の免疫原性の低減におけるGDF‐8の有用性が強調される。
特定の実施形態において、骨細胞系統の細胞、軟骨細胞系統の細胞、脂肪細胞系統の細胞、筋細胞系統の細胞、腱細胞系統の細胞、線維芽細胞系統の細胞又は間質発生細胞系統の細胞は、MSCの分化によって得ることができ、具体的には、インビトロ又はエクスビボにおいてMSCの分化によって得ることができる。MSCの分化は、MSCの所望の細胞型への分化を誘導することが可能な条件下でMSCを培養すること、一般に、MSCの所望の細胞型への分化を誘導することが可能な1以上の因子(例えば、増殖因子)を含む培地でMSCを培養することを含み得る。MSC分化のプロトコールはそれ自体公知である(とりわけ、国際公開公報第2007/093431号;及び、更にREGER, R.L. et al.「Differentiation and Characterization of Human MSCs」:Mesenchymal Stem Cells:Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology), D.J. Prockopら編, Humana
Press, 2008, Vol. 449, p. 93-107;VERMURI, M.C.ら(編)Mesenchymal Stem Cell Assays and Applications (Methods in Molecular Biology). Humana Press, 2011, Vol. 698, 特に第201〜352頁を参照)。
Press, 2008, Vol. 449, p. 93-107;VERMURI, M.C.ら(編)Mesenchymal Stem Cell Assays and Applications (Methods in Molecular Biology). Humana Press, 2011, Vol. 698, 特に第201〜352頁を参照)。
MSCのインビトロ又はエクスビボにおける分化によって得られる細胞の免疫原性を低減するために、所望の細胞がMSCの分化によって得られた後、細胞を、GDF‐8に暴露することができ(すなわち、GDF‐8を含有する培地に接触させるか若しくは当該培地で培養することができ)、及び/又は、(MSC)細胞を、所望の細胞へMSCを分化させる1以上の段階のそれぞれの方法若しくはプロトコールの一部として、GDF‐8に暴露することができる。本明細書の他の箇所で論じるように、例えば、血漿又は血清、GDF‐8及び線維芽細胞増殖因子2(FGF‐2)を含んだ培地でMSCを培養することを含む方法により、MSCを、前骨芽細胞若しくは骨芽細胞、又は前骨芽細胞及び/又は骨芽細胞を含む細胞集団に分化させることができ、これによって、得られた細胞の免疫原
性が低減する。
性が低減する。
逆に、MSCの分化によって得られる細胞とは、特に、骨細胞系統の細胞、軟骨細胞系統の細胞、脂肪細胞系統の細胞、筋細胞系統の細胞、腱細胞系統の細胞、線維芽細胞系統の細胞、又は間質発生細胞系統の細胞をいうこともある。
更なる実施形態において、細胞は、MSC、前骨芽細胞、骨芽細胞、骨細胞、軟骨芽細胞、軟骨細胞、脂肪芽細胞、脂肪細胞、筋芽細胞又は筋細胞であり得る。さらに、より好ましくは、細胞は、MSC、前骨芽細胞、骨芽細胞、軟骨芽細胞又は軟骨細胞であり得る。さらにまた、より好ましくは、細胞はMSCであり得る。また、特に好ましくは、細胞は、前骨芽細胞又は骨芽細胞であり得る。かかる細胞型において、細胞の免疫原性の低減に対するGDF‐8の有利な効果は、特に証明可能な傾向がある。
ここで、一部の実施形態において、細胞は、MSC、好ましくは、成人MSCであり得る。かかるMSC細胞は、血清又は血漿、必要に応じてFGF‐2を含む培地で適切に培養することができるが、これに限定されない。具体的には、骨細胞系統の細胞、例えば、前骨芽細胞又は骨芽細胞へのMSCの分化を意図する場合、FGF‐2を含めることができる。細胞は、自家又は同種の使用を意図し、好ましくは、細胞は、同種の使用を意図し得る。他の実施形態において、細胞は、前骨芽細胞又は骨芽細胞であり得る。かかる前骨芽細胞又は骨芽細胞は、血清又は血漿、必要に応じてFGF‐2を含む培地で適切に培養することができるが、これに限定されない。細胞は、自家又は同種の使用を意図し、好ましくは、細胞は、同種の使用を意図し得る。
前述の使用は、動物細胞、好ましくは温血動物に適用することができる。さらに、より好ましくは、これらの使用を意図する細胞は、ヒト細胞又は非ヒト哺乳動物細胞などの哺乳動物細胞であり、更に好ましくはヒト細胞である。
一部の実施形態において、本発明は、GDF‐8が、細胞におけるMHCクラスII細胞表面受容体複合体を低減し、場合により、前述した細胞における1以上の共刺激因子を低減する、インビトロでの細胞の免疫原性の低減におけるGDF‐8の使用に関する。
本明細書に使用される、「細胞におけるMHCクラスII細胞表面受容体複合体を低減する」という記載は、細胞におけるMHCクラスII細胞表面受容体複合体の量及び/又は有効性(例えば、生物活性を機能させる有効性)を低減することを指す。このような量及び/又は有効性の低減は、細胞におけるMHCクラスII細胞表面受容体複合体の量の減少、及び/又は細胞集団におけるMHCクラスII細胞表面受容体複合体を発現する細胞画分の減少を包含する。例えば、ヒト細胞におけるMHCクラスII細胞表面受容体複合体は、HLA‐DR、HLA‐DQ、HLA‐DP、HLA‐DO又はHLA‐DMなどのHLA複合体によってコードされるMHCクラスII細胞表面受容体複合体であってもよい。好ましくは、ヒト細胞におけるMHCクラスII細胞表面受容体複合体は、HLA‐DRであり得る。このため、ヒト細胞におけるHLA‐DRを低減する、インビトロでのヒト細胞の免疫原性の低減におけるGDF‐8の使用が、本明細書に更に開示されている。
本明細書に使用される、「細胞における1以上の共刺激因子を低減する」という記載は、細胞における1以上の共刺激因子の量及び/又は有効性(例えば、生物活性を機能させる有効性)を低減することを指す。このような量及び/又は有効性の低減は、細胞における1以上の共刺激因子の量の減少、及び/又は細胞集団における1以上の共刺激因子を発現する細胞画分の減少を包含する。
さらに、ここで以下に詳述するような(i)〜(viii)のうちの1つ及びすべてが、特に、本発明の本態様によって提供されるが、これらに限定されない。
(i)インビトロでの細胞の免疫原性の低減におけるGDF‐8の使用。
(ii)GDF‐8細胞が、前述の細胞におけるMHCクラスII細胞表面受容体複合体を低減し、場合により、前述した細胞における1以上の共刺激因子を低減する、上述の(i)に記載の使用。
(iii)前述の細胞が、動物細胞、好ましくは、ヒト細胞若しくは非ヒト哺乳動物細胞などの哺乳動物細胞である、上述の(i)又は(ii)に記載の使用。
(iv)前述のヒト細胞におけるMHCクラスII細胞表面受容体がヒト白血球抗原DR(HLA‐DR)である、上述の(ii)又は(iii)に記載の使用。
(v)前述の細胞がMSC、好ましくは成人MSCである、上述の(i)〜(iv)のうちのいずれかに記載の使用。
(vi)前述の細胞が前骨芽細胞又は骨芽細胞である、上述の(i)〜(iv)のうちのいずれかに記載の使用。
(i)インビトロでの細胞の免疫原性の低減におけるGDF‐8の使用。
(ii)GDF‐8細胞が、前述の細胞におけるMHCクラスII細胞表面受容体複合体を低減し、場合により、前述した細胞における1以上の共刺激因子を低減する、上述の(i)に記載の使用。
(iii)前述の細胞が、動物細胞、好ましくは、ヒト細胞若しくは非ヒト哺乳動物細胞などの哺乳動物細胞である、上述の(i)又は(ii)に記載の使用。
(iv)前述のヒト細胞におけるMHCクラスII細胞表面受容体がヒト白血球抗原DR(HLA‐DR)である、上述の(ii)又は(iii)に記載の使用。
(v)前述の細胞がMSC、好ましくは成人MSCである、上述の(i)〜(iv)のうちのいずれかに記載の使用。
(vi)前述の細胞が前骨芽細胞又は骨芽細胞である、上述の(i)〜(iv)のうちのいずれかに記載の使用。
特定の実施形態において、上に特定した細胞は、対象に投与される物質、好ましくはインプラント若しくは移植片(より好ましくは、骨及び/又は関節組織インプラント若しくは移植片(例えば、骨髄若しくは骨組織インプラント若しくは移植片))、又は医薬製剤などに含まれ得る。インプラント、移植片又は医薬製剤などの前述した物質に含まれる細胞の免疫原性の低減によって、これらが投与される対象による、かかる治療に関連する生成物又は組成物の拒絶の危険性を低減することができる。
本発明の更なる態様は、インビボで投与され、細胞の免疫原性を低減するのに使用されるGDF‐8に関する。GDF‐8は、例えば注入によって、局所的に、例えば筋骨格病変の部位に投与することができる。GDF‐8は、単独で、又は、幹細胞、好ましくはMSC、好ましくは成人MSCなどの細胞、及び/又は前骨芽細胞若しくは骨芽細胞などの細胞、若しくは前骨芽細胞及び/又は骨芽細胞を含む細胞集団(好ましくは、かかる細胞はヒト由来であり得る。)と組み合わせて投与することができる。GDF‐8は、好ましくは、MSCと組み合わせて投与することができ、より好ましくは、成人MSCと組み合わせて投与することができる。このため、インビボにおいて、MSC、好ましくは成人MSCとともに投与され、細胞の免疫原性の低減に使用されるGDF‐8が更に提供される。GDF‐8は、必要に応じて、上述のように細胞と組み合わせて、更にFGF‐2と同時投与することができる。好ましくは、前述の投与が行われる対象はヒトであり得る。好ましくは、投与される細胞又は細胞集団は、前述の対象に対し自家又は同種であり得る。GDF‐8とそれぞれの細胞若しくは細胞集団、例えばMSCは、インビボで同時に投与してもよいし、又は、いずれかの順序でインビボにおいて連続して投与してもよく、例えば、それぞれの細胞若しくは細胞集団、例えばMSCは、インビボで投与することができ、その後、GDF‐8は、インビボで投与することができるか、又は、GDF‐8は、インビボで投与することができ、その後、それぞれの細胞若しくは細胞集団、例えばMSCは、インビボで投与することができる。したがって、インビボで投与される、細胞の免疫原性を低減するための医薬品の製造におけるGDF‐8の使用も開示し、さらに、細胞の免疫原性の低減を必要とする対象にGDF‐8を投与することを含む、前述の対象における細胞の免疫原性を低減するための方法も開示する。
本発明の別の態様は、医薬品として使用され、好ましくは、骨疾患及び骨関節疾患を含む筋骨格系疾患の治療に使用されるGDF‐8を提供する。したがって、骨疾患及び骨関節疾患を含む筋骨格系疾患の治療のための医薬品の製造におけるGDF‐8の使用も提供される。さらに、骨疾患及び骨関節疾患を含んだ筋骨格系疾患の治療を必要とする対象において、GDF‐8を投与することを含む、骨疾患及び骨関節疾患を含んだ筋骨格系疾患を治療するための方法が提供される。筋骨格系疾患の治療を必要とする対象において、治
療有効量又は予防有効量のGDF‐8を投与することを含む、筋骨格系疾患を治療するための方法が特に意図される。医薬品として使用される場合、GDF‐8は、単独で、又は、幹細胞、好ましくはMSC、好ましくは成人MSCなどの細胞、及び/又は前骨芽細胞若しくは骨芽細胞などの細胞、若しくは前骨芽細胞及び/又は骨芽細胞を含む細胞集団(好ましくは、かかる細胞はヒト由来であり得る。)と組み合わせて投与することができる。GDF‐8は、好ましくは、MSCと組み合わせて投与することができ、より好ましくは、成人MSCと組み合わせて投与することができる。このため、インビボでMSCとともに、好ましくは成人MSCとともに投与され、医薬品として使用され、好ましくは、骨疾患及び骨関節疾患を含む筋骨格系疾患の治療に使用されるGDF‐8が特に開示されている。GDF‐8は、必要に応じて、上述のように細胞と組み合わせて、更にFGF‐2と同時投与することができる。さらに、骨疾患及び骨関節疾患を含んだ筋骨格系疾患の治療を必要とする対象において、GDF‐8とMSC、好ましくは成人MSCとを投与することを含む、骨疾患及び骨関節疾患を含んだ筋骨格系疾患を治療するための方法が提供される。好ましくは、前述の投与が行われる対象はヒトであり得る。好ましくは、投与される細胞又は細胞集団は、前述の対象に対し自家又は同種であり得る。
療有効量又は予防有効量のGDF‐8を投与することを含む、筋骨格系疾患を治療するための方法が特に意図される。医薬品として使用される場合、GDF‐8は、単独で、又は、幹細胞、好ましくはMSC、好ましくは成人MSCなどの細胞、及び/又は前骨芽細胞若しくは骨芽細胞などの細胞、若しくは前骨芽細胞及び/又は骨芽細胞を含む細胞集団(好ましくは、かかる細胞はヒト由来であり得る。)と組み合わせて投与することができる。GDF‐8は、好ましくは、MSCと組み合わせて投与することができ、より好ましくは、成人MSCと組み合わせて投与することができる。このため、インビボでMSCとともに、好ましくは成人MSCとともに投与され、医薬品として使用され、好ましくは、骨疾患及び骨関節疾患を含む筋骨格系疾患の治療に使用されるGDF‐8が特に開示されている。GDF‐8は、必要に応じて、上述のように細胞と組み合わせて、更にFGF‐2と同時投与することができる。さらに、骨疾患及び骨関節疾患を含んだ筋骨格系疾患の治療を必要とする対象において、GDF‐8とMSC、好ましくは成人MSCとを投与することを含む、骨疾患及び骨関節疾患を含んだ筋骨格系疾患を治療するための方法が提供される。好ましくは、前述の投与が行われる対象はヒトであり得る。好ましくは、投与される細胞又は細胞集団は、前述の対象に対し自家又は同種であり得る。
このように、本発明の態様は、細胞の免疫原性を低減する方法に使用されるGDF‐8を提供し、GDF‐8はインビボで投与され、細胞は、MSC、MSCの分化によって得られる細胞、骨細胞系統の細胞、軟骨細胞系統の細胞、脂肪細胞系統の細胞、筋細胞系統の細胞、腱細胞系統の細胞、線維芽細胞系統の細胞及び間質発生細胞系統の細胞からなる群より選択される。好ましくは、細胞は、インビトロにおいて、GDF‐8の使用(上記)に関連して同様により詳細に扱われ得る。また、細胞の免疫原性を低減するための医薬品の製造におけるGDF‐8の使用であって、GDF‐8がインビボで投与され、細胞が、MSC、MSCの分化によって得られる細胞、骨細胞系統の細胞、軟骨細胞系統の細胞、脂肪細胞系統の細胞、筋細胞系統の細胞、腱細胞系統の細胞、線維芽細胞系統の細胞及び間質発生細胞系統の細胞からなる群より選択される方法とともに、細胞の免疫原性の低減を必要とする対象にGDF‐8を投与することを含む、前述の対象における細胞の免疫原性を低減するための方法であって、細胞が、MSC、MSCの分化によって得られる細胞、骨細胞系統の細胞、軟骨細胞系統の細胞、脂肪細胞系統の細胞、筋細胞系統の細胞、腱細胞系統の細胞、線維芽細胞系統の細胞及び間質発生細胞系統の細胞からなる群より選択される方法も本態様に包含される。特定の実施形態は、細胞と組み合わせてインビボで投与され、細胞の免疫原性を低減する上述の方法に使用されるGDF‐8(又は対応する方法若しくは使用)を提供する。かかる実施形態によって、対象に投与される細胞の免疫原性及び拒絶の危険性が有利に低減される。GDF‐8のこれらの効果は、前述の対象に対し自家、同種又は更に異種のうちのいずれかであり、より一般には自家又は同種である細胞を使用する細胞療法に価値があり得るが、同種異系細胞の免疫原性の低減が、対象による同種異系細胞の拒絶の危険性を大幅に下げることに対して期待され、また、同種異系細胞物質を与える場合に通常対象が受ける免疫抑制療法を回避又は減らすことが可能であると考えられるので、この効果は、特に同種異系細胞の投与を容易にすることができる。したがって、一部の実施形態は、対象に投与される細胞が同種である、上述した細胞の免疫原性を低減する方法に使用されるGDF‐8(又は対応する方法若しくは使用)を提供する。
GDF‐8及び細胞は、インビボで同時に投与してもよいし、又は、いずれかの順序でインビボにおいて連続して投与してもよく、例えば、細胞はインビボで投与でき、その後、GDF‐8はインビボで投与できるか、又は、GDF‐8はインビボで投与でき、その後、細胞はインビボで投与できることが理解される。一例において、細胞に対する免疫反応又は細胞の拒絶の徴候が対象に検出される場合、先に細胞を受け入れた対象にGDF‐8の投与を指示してもよい。更なる例において、対象において、細胞に対する免疫反応又は細胞の拒絶(例えば、不十分なHLA一致)を示す可能性が増加した場合、細胞を先に
受け入れたか、受け入れているか又は将来受け入れる対象にGDF‐8の投与を指示してもよい。更なる例において、細胞に対する免疫反応若しくは細胞の拒絶の可能性が増加することを実際に観察したか又は予想していたかにかかわらず、細胞を先に受け入れたか、受け入れているか又は将来受け入れる対象にGDF‐8の投与を指示してもよい。
受け入れたか、受け入れているか又は将来受け入れる対象にGDF‐8の投与を指示してもよい。更なる例において、細胞に対する免疫反応若しくは細胞の拒絶の可能性が増加することを実際に観察したか又は予想していたかにかかわらず、細胞を先に受け入れたか、受け入れているか又は将来受け入れる対象にGDF‐8の投与を指示してもよい。
特定の実施形態において、GDF‐8は、細胞が局所的に又は全身に投与されているか否かにかかわらず、全身に投与することができる。他の実施形態において、GDF‐8は、局所的に投与することができる。例えば、細胞が局所的に(例えば、細胞が骨若しくは関節組織修復を意図するような場合、骨内若しくは骨周囲、又は関節内若しくは関節周囲に)投与される場合、GDF‐8も、好ましくは局所的に投与することができ、具体的には、細胞に近接して投与することができる(例えば、場合によって、骨内若しくは骨周囲、又は関節内若しくは関節周囲も考えられる。)。適切には、GDF‐8は、細胞に対するその効果を延長させるために、その投与部位における徐放製剤に製剤され得る。
特定の実施形態において、細胞は、対象に投与される物質、好ましくはインプラント若しくは移植片(より好ましくは、骨及び/又は関節組織インプラント若しくは移植片(例えば、骨髄若しくは骨組織インプラント若しくは移植片))、又は医薬製剤などに含まれ得る。インプラント、移植片又は医薬製剤などの前述した物質に含まれる細胞の免疫原性の低減によって、これらが投与される対象による、かかる治療に関連する生成物又は組成物の拒絶の危険性を低減することができる。
このように、本発明の更なる態様は、医薬品として使用され、好ましくは、筋骨格系疾患(骨疾患又は骨関節疾患であることがより好ましい。)の治療に使用される(すなわち、筋骨格系疾患の治療方法に使用される)、GDF‐8と細胞の組合せを提供し、細胞は、MSC、MSCの分化によって得られる細胞、骨細胞系統の細胞、軟骨細胞系統の細胞、脂肪細胞系統の細胞、筋細胞系統の細胞、腱細胞系統の細胞、線維芽細胞系統の細胞及び間質発生細胞系統の細胞からなる群より選択される。また、筋骨格系疾患(骨疾患又は骨関節疾患であることがより好ましい。)の治療のための医薬品の製造におけるGDF‐8と細胞の併用であって、細胞が、MSC、MSCの分化によって得られる細胞、骨細胞系統の細胞、軟骨細胞系統の細胞、脂肪細胞系統の細胞、筋細胞系統の細胞、腱細胞系統の細胞、線維芽細胞系統の細胞及び間質発生細胞系統の細胞からなる群より選択される併用とともに、筋骨格系疾患(骨疾患又は骨関節疾患であることがより好ましい。)の治療を必要とする対象にGDF‐8と細胞の組合せ(特に、治療有効量又は予防有効量の組合せ)を投与することを含む、前述の対象における筋骨格系疾患を治療するための方法であって、細胞が、MSC、MSCの分化によって得られる細胞、骨細胞系統の細胞、軟骨細胞系統の細胞、脂肪細胞系統の細胞、筋細胞系統の細胞、腱細胞系統の細胞、線維芽細胞系統の細胞及び間質発生細胞系統の細胞からなる群より選択される方法も包含される。好ましくは、細胞は、インビトロにおいて、GDF‐8の使用(上記)に関連して同様により詳細に扱われ得る。特定の実施形態は、筋骨格系疾患(骨疾患又は骨関節疾患であることがより好ましい。)の治療に使用されるGDF‐8と細胞の組合せ(又は対応する方法若しくは使用)であって、細胞が、MSC、骨細胞系統の細胞、軟骨細胞系統の細胞、筋細胞系統の細胞及び腱細胞系統の細胞からなる群より選択されるか、細胞が、MSC、前骨芽細胞、骨芽細胞、骨細胞、軟骨芽細胞、軟骨細胞、筋芽細胞若しくは筋細胞がより好ましいか、細胞が、MSC、前骨芽細胞、骨芽細胞、軟骨芽細胞若しくは軟骨細胞が更により好ましいか、細胞がMSCであることが更により好ましいか、又は細胞が前骨芽細胞若しくは骨芽細胞である組合せを提供する。
先の段落に示したGDF‐8と細胞の組合せによって、医薬品として、好ましくは、筋骨格系疾患を治療する目的で、対象に投与される細胞の免疫原性及び拒絶の危険性が有利に低減される。この組合せにおけるGDF‐8のこれらの効果は、前述の対象に対し自家
、同種又は更に異種のうちのいずれかであり、より一般には自家又は同種である細胞を使用する細胞療法に価値があり得るが、同種異系細胞の免疫原性の低減が、対象による拒絶の危険性を大幅に下げることに対して期待され、また、同種異系細胞物質を与える場合に通常対象が受ける免疫抑制療法を回避又は減らすことが可能であると考えられるので、この効果は、特に同種異系細胞の投与を容易にすることができる。したがって、特定の実施形態は、対象に投与される細胞が同種である、上述した医薬品として使用され、好ましくは、筋骨格系疾患を治療するのに使用されるGDF‐8と細胞の組合せ(又は対応する方法若しくは使用)を提供する。
、同種又は更に異種のうちのいずれかであり、より一般には自家又は同種である細胞を使用する細胞療法に価値があり得るが、同種異系細胞の免疫原性の低減が、対象による拒絶の危険性を大幅に下げることに対して期待され、また、同種異系細胞物質を与える場合に通常対象が受ける免疫抑制療法を回避又は減らすことが可能であると考えられるので、この効果は、特に同種異系細胞の投与を容易にすることができる。したがって、特定の実施形態は、対象に投与される細胞が同種である、上述した医薬品として使用され、好ましくは、筋骨格系疾患を治療するのに使用されるGDF‐8と細胞の組合せ(又は対応する方法若しくは使用)を提供する。
組合せに含まれるGDF‐8及び細胞は、インビボで同時に投与してもよいし、又は、いずれかの順序でインビボにおいて連続して投与してもよく、例えば、細胞はインビボで投与でき、その後、GDF‐8はインビボで投与できるか、又は、GDF‐8はインビボで投与でき、その後、細胞はインビボで投与できることが理解される。一例において、細胞に対する免疫反応又は細胞の拒絶の徴候が対象に検出される場合、先に細胞を受け入れた対象にGDF‐8の投与を指示してもよい。更なる例において、対象において、細胞に対する免疫反応又は細胞の拒絶(例えば、不十分なHLA一致)を示す可能性が増加した場合、細胞を先に受け入れたか、受け入れているか又は将来受け入れる対象にGDF‐8の投与を指示してもよい。更なる例において、細胞に対する免疫反応若しくは細胞の拒絶の可能性が増加することを実際に観察したか又は予想していたかにかかわらず、細胞を先に受け入れたか、受け入れているか又は将来受け入れる対象にGDF‐8の投与を指示してもよい。
特定の実施形態において、GDF‐8は、細胞が局所的に又は全身に投与されているか否かにかかわらず、全身に投与することができる。他の実施形態において、GDF‐8は、局所的に投与することができる。例えば、細胞が局所的に(例えば、細胞が骨若しくは関節組織修復を意図するような場合、骨内若しくは骨周囲、又は関節内若しくは関節周囲に)投与される場合、GDF‐8も、好ましくは局所的に投与することができ、具体的には、細胞に近接して投与することができる(例えば、場合によって、骨内若しくは骨周囲、又は関節内若しくは関節周囲も考えられる。)。適切には、GDF‐8は、細胞に対するその効果を延長させるために、その投与部位における徐放製剤に製剤され得る。
特定の実施形態において、GDF‐8と細胞の組合せにおける細胞は、対象に投与される物質、好ましくはインプラント若しくは移植片(より好ましくは、骨及び/又は関節組織インプラント若しくは移植片(例えば、骨髄若しくは骨組織インプラント若しくは移植片))、又は医薬製剤などに含まれ得る。インプラント、移植片又は医薬製剤などの前述した物質に含まれる細胞の免疫原性の低減によって、これらが投与される対象による、かかる治療に関連する生成物又は組成物の拒絶の危険性を低減することができる。
GDF‐8による免疫原性及び免疫拒絶調節能についての観察から、本発明の更なる態様は、対象に投与されるか、埋め込まれるか又は移植される物質に対する対象による拒絶の危険性の低減に使用されるGDF‐8を提供する。また、投与されるか、埋め込まれる又は移植される物質に対する対象による拒絶の危険性を低減するための医薬品の製造におけるGDF‐8の使用とともに、対象にGDF‐8を投与することを含む、投与されるか、埋め込まれるか又は移植される物質に対する対象による拒絶の危険性を低減する方法も本態様に包含される。本態様及び前述の態様及び実施形態に関連し、対象に投与された(投与される)物質に対する言及は、対象に投与する場合、有益であり得る、例えば、対象において治療上又は予防上有益であり得る(例えば、対象において、筋骨格系疾患(骨疾患若しくは骨関節疾患がより好ましい。)を治療するのに有用であり得る)がこれらに限定されない、いかなる物質も広く包含するものとする。特定の実施形態は、物質が骨及び/又は関節組織(例えば、骨髄若しくは骨組織)を含む、明示した使用のためのGDF‐
8(又は対応する方法若しくは使用)を提供する。
8(又は対応する方法若しくは使用)を提供する。
特定の実施形態において、物質は、MSC、MSCの分化によって得られる細胞、骨細胞系統の細胞、軟骨細胞系統の細胞、脂肪細胞系統の細胞、筋細胞系統の細胞、腱細胞系統の細胞、線維芽細胞系統の細胞及び間質発生細胞系統からなる群より選択される細胞を含み得る。好ましくは、細胞は、インビトロにおいて、GDF‐8の使用(上記)に関連して同様により詳細に扱われ得る。好ましくは、物質が筋骨格系疾患(骨疾患若しくは骨関節疾患が好ましい。)の治療に意図される場合、物質は細胞を含有し、細胞は、MSC、骨細胞系統の細胞、軟骨細胞系統の細胞、筋細胞系統の細胞及び腱細胞系統の細胞からなる群より選択されるか、より好ましくは、MSC、前骨芽細胞、骨芽細胞、骨細胞、軟骨芽細胞、軟骨細胞、筋芽細胞若しくは筋細胞からなる群より選択されるか、更により好ましくは、MSC、前骨芽細胞、骨芽細胞、軟骨芽細胞若しくは軟骨細胞からなる群より選択されるか、更により好ましくは、MSCからなる群より選択されるか、又は、前骨芽細胞若しくは骨芽細胞からなる群より選択され得る。
物質が拒絶の顕著な危険性を保有する場合、例えば、物質に1以上の成分、例えば、対象に対して同種若しくは更に異種であり、より一般には同種である、組織、細胞、生体分子又は他の物質を含有する場合、物質に対する対象の拒絶の危険性の減少に対するGDF‐8の効果は、特定の実施形態で特に顕著である。
GDF‐8及び物質は、インビボで同時に投与してもよいし、又は、いずれかの順序でインビボにおいて連続して投与してもよく、例えば、物質はインビボで投与でき、その後、GDF‐8はインビボで投与できるか、又は、GDF‐8はインビボで投与でき、その後、物質はインビボで投与できることが理解される。一例において、物質に対する拒絶の徴候が対象に検出される場合、先に細胞を受け入れた対象にGDF‐8の投与を指示してもよい。更なる例において、対象において、物質に対する拒絶(例えば、不十分なHLA一致)を示す可能性が増加した場合、物質を先に受け入れたか、受け入れているか又は将来受け入れる対象にGDF‐8の投与を指示してもよい。更なる例において、物質に対する拒絶の可能性が増加することを実際に観察したか又は予想していたかにかかわらず、物質を先に受け入れたか、受け入れているか又は将来受け入れる対象にGDF‐8の投与を指示してもよい。
特定の実施形態において、GDF‐8は、物質が局所的に又は全身に投与されているか否かにかかわらず、全身に投与することができる。他の実施形態において、GDF‐8は、局所的に投与することができる。例えば、物質が局所的に(例えば、物質が骨若しくは関節組織修復を意図するような場合、骨内若しくは骨周囲、又は関節内若しくは関節周囲に)投与される場合、GDF‐8も、好ましくは局所的に投与することができ、具体的には、物質に近接して投与することができる(例えば、場合によって、骨内若しくは骨周囲、又は関節内若しくは関節周囲も考えられる。)。適切には、GDF‐8は、物質に対するその効果を延長させるために、その投与部位における徐放製剤に製剤され得る。
したがって、本発明の更なる態様は、対象に投与されるか、埋め込まれるか又は移植される物質とGDF‐8とを含み、必要に応じて、1以上の医薬として許容し得る賦形剤を更に含む医薬組成物を提供する。MSC、MSCの分化によって得られる細胞、骨細胞系統の細胞、軟骨細胞系統の細胞、脂肪細胞系統の細胞、筋細胞系統の細胞、腱細胞系統の細胞、線維芽細胞系統の細胞及び間質発生細胞系統の細胞からなる群より選択される細胞とGDF‐8とを含み、必要に応じて、1以上の医薬として許容し得る賦形剤を更に含む医薬組成物が提供されることが好ましい(換言すると、対象に投与されるか、埋め込まれるか又は移植される物質は、記載された細胞を含むということができる。)。好ましくは、細胞は、インビトロにおいて、GDF‐8の使用(上記)に関連して同様により詳細に
扱われ得る。また、骨及び/又は関節組織(例えば、骨髄若しくは骨組織)とGDF‐8とを含み、必要に応じて、1以上の医薬として許容し得る賦形剤を更に含む医薬組成物も提供されることが好ましい(換言すると、対象に投与されるか、埋め込まれるか又は移植される物質は、記載された骨及び/又は関節組織を含むということができる。)。
扱われ得る。また、骨及び/又は関節組織(例えば、骨髄若しくは骨組織)とGDF‐8とを含み、必要に応じて、1以上の医薬として許容し得る賦形剤を更に含む医薬組成物も提供されることが好ましい(換言すると、対象に投与されるか、埋め込まれるか又は移植される物質は、記載された骨及び/又は関節組織を含むということができる。)。
本明細書全体をとおして、本発明の原理を具体化する生成物、方法及び使用は、好ましくは動物細胞、より好ましくは温血動物細胞、更により好ましくは、ヒト細胞又は非ヒト哺乳動物細胞などの哺乳動物細胞、更により好ましくはヒト細胞を用いることができる。
さらに、本明細書全体をとおして、本発明の原理を具体化する生成物、方法及び使用は、動物対象、より好ましくは温血動物対象、更により好ましくは、ヒト対象又は非ヒト哺乳動物対象などの哺乳動物対象、更により好ましくはヒト対象に適用することができる。
また、特定の種(例えば、所定の哺乳動物種若しくはヒト)由来の細胞、組織又は他の物質が、通常、同じ種、すなわち、自家又は同種の投与から対象に投与されることも認識される。
本発明者らは、従来技術の上述の課題の1以上に対処する間葉系幹細胞(MSC)を分化させる方法を更に見出した。
したがって、本発明の付加的な態様は、インビトロ若しくはエクスビボにおいて、成体MSCを、前骨芽細胞若しくは骨芽細胞、又は前骨芽細胞及び/又は骨芽細胞を含む細胞集団に分化させるための方法に関し、この方法は、血漿又は血清、増殖分化因子8(GDF‐8)及び線維芽細胞増殖因子2(FGF‐2)を含む培地で前述のMSCを培養することを含む。本発明の原理を適用する方法によって、免疫原性が減少した、前骨芽細胞若しくは骨芽細胞、又は前骨芽細胞及び/又は骨芽細胞を含む細胞集団を得ることができる。
例えば、本発明の方法は、MHCクラスII細胞表面受容体の発現、例えばHLA‐DRの発現が減少した、前骨芽細胞若しくは骨芽細胞、又は前骨芽細胞及び/又は骨芽細胞を含む細胞集団を提供する。かかる免疫原性の減少によって、有利に、例えば同種対象への細胞移植が可能になる。
さらに、本発明者らは、本発明の方法が細胞増殖を促進することを見出した。かかる方法は、細胞移植に良好な又は細胞移植を改善する量の移植に適した細胞を発生させるという利点を有する。これによって、出発MSCを得るために対象から採取する必要のある組織の量を低減することもできる。
したがって、本発明の方法は、移植可能性が改善された、前骨芽細胞若しくは骨芽細胞、又は前骨芽細胞及び/又は骨芽細胞を含む細胞集団を有利に提供する。
本発明者らは、本発明の方法が、得られる前骨芽細胞若しくは骨芽細胞、又は前骨芽細胞及び/又は骨芽細胞を含む細胞集団の所望の骨芽細胞表現型を維持することを確認した。MSCの骨形成分化の増加は、GDF‐8欠損マウスで過去に文書化されている(Hamrick et al., Bone, 2007, vol. 40(6), 1544-53)ので、このことはとりわけ予想外である
。
。
一実施形態において、本発明の方法は、(a)対象の生体試料から回収したMSCを含む細胞を基材表面に付着させることと、(b)血漿又は血清、GDF‐8及びFGF‐2を含む培地で付着細胞を培養し、例えば、インビトロ若しくはエクスビボにおいて、MS
Cを、前骨芽細胞若しくは骨芽細胞、又は前骨芽細胞及び/又は骨芽細胞を含む細胞集団に分化させることと、を含み得る。
Cを、前骨芽細胞若しくは骨芽細胞、又は前骨芽細胞及び/又は骨芽細胞を含む細胞集団に分化させることと、を含み得る。
本発明の原理を具体化する特定の方法において、細胞は、約10〜約18日間、段階(b)に定義する培地で培養することができる。かかる期間によって、細胞移植に特に良好な、前骨芽細胞若しくは骨芽細胞、又は前骨芽細胞及び/又は骨芽細胞を含む細胞集団を生産することが可能になる。
本発明に係る一部の方法には、(c)段階(b)の前骨芽細胞若しくは骨芽細胞、又は前骨芽細胞及び/又は骨芽細胞を含む細胞集団を継代し(例えば、1回以上継代し)、さらに、段階(b)に定義する培地で、段階(b)の前骨芽細胞若しくは骨芽細胞、又は前骨芽細胞及び/又は骨芽細胞を含む細胞集団を培養することが更に含まれ得る。例えば、限定されないが、細胞を段階(c)において約3〜約18日間培養し、細胞療法に特に良好な、前骨芽細胞若しくは骨芽細胞、又は前骨芽細胞及び/又は骨芽細胞を含む細胞集団を生産することができる。
更なる実施形態では、本発明の方法は、(a)対象の生体試料から回収したMSCを含む細胞を基材表面に付着させることと、(b’)血漿又は血清及びFGF‐2を含む培地で付着細胞を培養することと、(b’’)血漿又は血清、GDF‐8及びFGF‐2を含む培地で付着細胞を更に培養し、例えば、インビトロ若しくはエクスビボにおいて、MSCを、前骨芽細胞若しくは骨芽細胞、又は前骨芽細胞及び/又は骨芽細胞を含む細胞集団に分化させることと、を含み得る。一部の実施形態において、本発明の方法には、段階(b')と(b’’)との間に、細胞を継代し、基材表面に細胞を付着させる段階(c’)
が更に含まれ得る。
が更に含まれ得る。
本発明の原理を具体化する方法が、細胞を1回以上継代すること、すなわち、1回、2回、3回、4回以上の継代を更に含み得ることが認識される。好適な実施形態において、方法は、1回、2回又は3回の継代、より好ましくは1回又は2回の継代、更により好ましくは1回の継代を更に含み得る。
この点で、本明細書に使用される、「一次培養」、「二次培養」及び「三次培養」という用語はそれぞれ、本方法においていかなる継代もしていないか、1回継代されたか又は2回継代された、MSCを含む対象の生体試料から回収された細胞を指す。本方法において、血漿又は血清、GDF‐8及びFGF‐2を含む培地でMSCを培養することは、通常、一次培養、例えば一次培養の開始(若しくは始め)、若しくは一次培養の途中から、二次培養、例えば二次培養の開始(若しくは始め)、若しくは二次培養の途中から、又は、三次培養、例えば三次培養の開始(若しくは始め)、若しくは三次培養の途中から行うことができるが、これらに限定されない。好ましくは、血漿又は血清、GDF‐8及びFGF‐2を含む培地でMSCを培養することは、一次培養、例えば一次培養の開始、又は一次培養の途中から、好ましくは一次培養の開始から行うことができる。
例に示すように、一次培養の開始から、血漿又は血清、GDF‐8及びFGF‐2を含む培地でMSCを培養することによって、特に免疫原性が低減した、具体的には、MHCクラスII細胞表面受容体の発現が低減した、前骨芽細胞若しくは骨芽細胞、又は前骨芽細胞及び/又は骨芽細胞を含む細胞集団を得ることができる。また、例に更に示すように、一次培養の開始から、血漿又は血清、GDF−8及びFGF‐2を含む培地でMSCを培養することによって、特に細胞増殖も促進する。したがって、より大きな細胞増殖を達成し、例えば同種対象に対して拒絶の少ない細胞といった、移植に特に適し、免疫原性が低減した、前骨芽細胞若しくは骨芽細胞、又は前骨芽細胞及び/又は骨芽細胞を含む細胞集団を生産することができるので、本発明を例示するかかる方法は特に有利である。
更なる実施形態において、本明細書に教示する方法は、得られた前骨芽細胞若しくは骨芽細胞、又は前骨芽細胞及び/又は骨芽細胞を含む細胞集団を、骨形成、骨誘導及び/又は骨伝導(osteo-conductive)特性を有する成分に接触させる(例えば、一緒にするか若しくは混合する)ことを含み得る。かかる工程によって、例えば同種対象に移植に適した医薬組成物の調製が特に可能になる。
本明細書に意図される方法及び使用は、特に好ましくは動物細胞、好ましくは温血動物細胞、より好ましくはヒト細胞又は非ヒト哺乳動物細胞などの哺乳動物細胞、最も好ましくはヒト細胞に適用される。本発明の別の態様は、本方法のうちのいずれかによって得ることができる、前骨芽細胞若しくは骨芽細胞、又は前骨芽細胞及び/又は骨芽細胞を含む細胞集団を提供する。血漿又は血清、GDF‐8及びFGF‐2を含む培地でMSCを培養することを含む、インビトロ又はエクスビボにおいて、成体MSCを分化させるための上に定義した方法によって得ることができる、前骨芽細胞若しくは骨芽細胞、又は前骨芽細胞及び/又は骨芽細胞を含む細胞集団が特に開示されている。本発明の方法が、一般に、十分な部分、例えば、前骨芽細胞又は骨芽細胞の大部分を含む細胞集団を生産できることが認識される。かかる細胞集団には、他の細胞型が更に含まれ得る。
また、本発明の態様では、本明細書に教示する、前骨芽細胞若しくは骨芽細胞、又は前骨芽細胞及び/又は骨芽細胞を含む細胞集団を含み、適切には更に賦形剤を含む医薬組成物であって、前述の賦形剤のうちの少なくとも1つが、骨形成、骨誘導及び/又は骨伝導特性を有する成分であることが好ましい医薬組成物も提供される。
本発明の更なる態様は、本明細書に教示する、前骨芽細胞若しくは骨芽細胞、若しくは前骨芽細胞及び/又は骨芽細胞を含む細胞集団、又は医薬品として使用し、好ましくは、筋骨格系疾患の治療(本明細書全体をとおして、治療及び/又は予防措置を含む。)に使用される、上に定義した医薬組成物を提供する。好ましくは、前述の筋骨格系疾患は、骨疾患又は骨関節疾患であり得る。したがって、骨疾患及び/又は骨関節疾患などであるが、これらに限定されない、筋骨格系疾患の治療に使用され、本発明の方法によって得ることができる前骨芽細胞若しくは骨芽細胞、若しくは前骨芽細胞及び/又は骨芽細胞を含む細胞集団が意図されることが好ましい。
例えば、前骨芽細胞若しくは骨芽細胞、又は前骨芽細胞及び/又は骨芽細胞を含む細胞集団の免疫原性の低減により、同種対象への移植が可能になるので、筋骨格系疾患の治療における前述の前骨芽細胞若しくは骨芽細胞、又は前骨芽細胞及び/又は骨芽細胞を含む細胞集団の使用は有利である。
また、本発明によれば、特に骨疾患及び骨関節疾患を含む筋骨格系疾患を治療するための医薬品の製造における、本明細書に教示する、前骨芽細胞若しくは骨芽細胞、又は前骨芽細胞及び/又は骨芽細胞を含む細胞集団の使用も提供される。したがって、骨疾患及び/又は骨関節疾患などであるが、これらに限定されない、筋骨格系疾患を治療するための医薬品の製造における、本発明の方法によって得ることができる前骨芽細胞若しくは骨芽細胞、又は前骨芽細胞及び/又は骨芽細胞を含む細胞集団の使用が特に意図される。
さらに、本発明によれば、特に骨疾患及び骨関節疾患を含んだ筋骨格系疾患の治療を必要とする対象において、本明細書に教示する、前骨芽細胞若しくは骨芽細胞、若しくは前骨芽細胞及び/又は骨芽細胞を含む細胞集団、又は上に定義した医薬組成物を投与することを含む、特に骨疾患及び骨関節疾患を含む筋骨格系疾患を治療するための方法が提供される。特に、筋骨格系疾患の治療を必要とする対象において、本発明の方法によって得ることができる、前骨芽細胞若しくは骨芽細胞、又は前骨芽細胞及び/又は骨芽細胞を含む
細胞集団の治療有効量又は予防有効量を投与することを含む、筋骨格系疾患を治療するための方法が意図される。
細胞集団の治療有効量又は予防有効量を投与することを含む、筋骨格系疾患を治療するための方法が意図される。
したがって、本発明の本態様によって、以下に詳述するような(i’)〜(viii’)のうちのいずれかが提供されるが、これらに限定されない。
(i’)インビトロ又はエクスビボにおいて、成体間葉系幹細胞(MSC)を、前骨芽細胞若しくは骨芽細胞、又は前骨芽細胞及び/又は骨芽細胞を含む細胞集団に分化させるための方法であって、前述の方法が、血漿又は血清、増殖分化因子8(GDF‐8)及び線維芽細胞増殖因子2(FGF‐2)を含んだ培地で前述のMSCを培養することを含む方法。
(ii’)上述の(i’)に記載の方法であって、この方法が、
(a)対象の生体試料から回収したMSCを含む細胞を基材表面に付着させることと、
(b)血漿又は血清、GDF‐8及びFGF‐2を含む培地で付着細胞を培養し、例えば、インビトロ若しくはエクスビボにおいて、MSCを、前骨芽細胞若しくは骨芽細胞、又は前骨芽細胞及び/又は骨芽細胞を含む細胞集団に分化させることと、を含む方法。
(a)対象の生体試料から回収したMSCを含む細胞を基材表面に付着させることと、
(b)血漿又は血清、GDF‐8及びFGF‐2を含む培地で付着細胞を培養し、例えば、インビトロ若しくはエクスビボにおいて、MSCを、前骨芽細胞若しくは骨芽細胞、又は前骨芽細胞及び/又は骨芽細胞を含む細胞集団に分化させることと、を含む方法。
(iii’)上述の(ii’)に記載の方法であって、この方法に、段階(b)に定義する培地で、段階(b)の前骨芽細胞若しくは骨芽細胞、又は前骨芽細胞及び/又は骨芽細胞を含む細胞集団を継代し更に培養する段階(c)が更に含まれる方法。
(iv’)上述の(i’)に記載の方法であって、この方法が、
(a)対象の生体試料から回収したMSCを含む細胞を基材表面に付着させることと、
(b’)血漿又は血清及びFGF‐2を含む培地で付着細胞を培養することと、
(b’’')血漿又は血清、GDF‐8及びFGF‐2を含む培地で付着細胞を更に培
養し、例えば、インビトロ若しくはエクスビボにおいて、MSCを、前骨芽細胞若しくは骨芽細胞、又は前骨芽細胞及び/又は骨芽細胞を含む細胞集団に分化させることと、を含む方法。
(a)対象の生体試料から回収したMSCを含む細胞を基材表面に付着させることと、
(b’)血漿又は血清及びFGF‐2を含む培地で付着細胞を培養することと、
(b’’')血漿又は血清、GDF‐8及びFGF‐2を含む培地で付着細胞を更に培
養し、例えば、インビトロ若しくはエクスビボにおいて、MSCを、前骨芽細胞若しくは骨芽細胞、又は前骨芽細胞及び/又は骨芽細胞を含む細胞集団に分化させることと、を含む方法。
(v’)上述の(iv’)に記載の方法であって、この方法に、段階(b')と(b’
’)との間に、細胞を継代し、基材表面に細胞を付着させる段階(c’)が更に含まれる方法。
’)との間に、細胞を継代し、基材表面に細胞を付着させる段階(c’)が更に含まれる方法。
(vi’)上述の(i’)〜(v’)のうちのいずれか1つに記載の方法であって、この方法が、前述の前骨芽細胞若しくは骨芽細胞、又は前骨芽細胞及び/又は骨芽細胞を含む細胞集団を、骨形成、骨誘導及び/又は骨伝導特性を有する成分に接触させることを更に含む方法。
(vii’)上述の(i’)〜(vi’)のうちのいずれかに記載の方法によって得ることができる前骨芽細胞若しくは骨芽細胞、若しくは前骨芽細胞及び/又は骨芽細胞を含む細胞集団、又は上述の(i’)〜(vi’)のうちのいずれかに記載の方法によって得ることができる前骨芽細胞若しくは骨芽細胞、若しくは前骨芽細胞及び/又は骨芽細胞を含む細胞集団を含んだ医薬組成物。
(viii’)医薬品として、好ましくは筋骨格系疾患(骨疾患若しくは骨関節疾患がより好ましい。)の治療に使用される、上述の(vii’)に定義した前骨芽細胞若しくは骨芽細胞、若しくは前骨芽細胞及び/又は骨芽細胞を含む細胞集団、又は上述の(vii)に定義した医薬組成物。
本発明の上述の態様及び更なる態様並びに好適な実施形態を、次の節及び添付の特許請求の範囲に記載する。具体的には、添付の特許請求の範囲の主題は、本明細書中に援用される。
本明細書に使用される、単数形「a」、「an」及び「the」には、文脈に明確な指示がない限り、単数と複数の対象の両方が含まれる。
本明細書に使用される、「含む(comprising)」、「含む(comprises)」及び「からなる(comprised of)」という用語は、「含む(including)」、「含む(includes)」又は「含有する(containing)」、「含有する(contains)」と同義であり、包括的で制限がなく、また、
付加的で記載されていない手段、要素又は方法の段階を排除しない。また、これらの用語は、「からなる(consisting of)」及び「から本質的になる(consisting essentially of)」も包含する。
付加的で記載されていない手段、要素又は方法の段階を排除しない。また、これらの用語は、「からなる(consisting of)」及び「から本質的になる(consisting essentially of)」も包含する。
終点による数値範囲の記載には、それぞれの範囲内に入るすべての数及び分数とともに、記載された終点も含まれる。
かかるパラメータ、量、一時的な期間などの測定可能な値について言及する場合、本明細書に使用される「約(about)」という用語は、特定値の変化値及び特定値からの変化値
を包含し、かかる変化値が、開示する本発明を実施するのに適切である限りにおいて、特に+/−10%以下、好ましくは+/−5%以下、より好ましくは+/−1%以下、更により好ましくは+/−0.1%以下の特定値の変化値及び特定値からの変化値を包含することを意味する。「約」という修飾語が言及する値自体も、具体的に及び好ましくは開示されていることが理解される。
を包含し、かかる変化値が、開示する本発明を実施するのに適切である限りにおいて、特に+/−10%以下、好ましくは+/−5%以下、より好ましくは+/−1%以下、更により好ましくは+/−0.1%以下の特定値の変化値及び特定値からの変化値を包含することを意味する。「約」という修飾語が言及する値自体も、具体的に及び好ましくは開示されていることが理解される。
一群の手段の1以上の手段といった「1以上」という用語自体は、更なる例示によって明らかであるが、この用語は、とりわけ、前述の手段のうちのいずれか1つ、又は、前述の手段の3以上、4以上、5以上、6以上若しくは7以上といった前述の手段のうちのいずれか2以上、及び最大すべての前述の手段に対する言及を包含する。
本明細書で引用したすべての文献は、その全体が参照により本明細書に援用される。
特に断りのない限り、技術用語及び科学用語を含む本発明を開示するのに使用される用語はすべて、一般に、本発明が属する技術分野の当業者によって理解されるような意味を有する。更なる案内によって、本発明の教示が十分に理解されるように、用語の定義が含まれ得る。
細胞培養及び培地の使用における一般的な技術については、とりわけ、大規模哺乳動物細胞培養(Hu et al. 1997. Curr Opin Biotechnol 8: 148)、無血清培地(K. Kitano. 1991. Biotechnology 17: 73)、又は大規模哺乳動物細胞培養(Curr Opin Biotechnol 2: 375, 1991)で概説されている。
上述したように、本発明者らは、本発明の態様による、インビトロ又はエクスビボにおいて、成体間葉系幹細胞(MSC)を、前骨芽細胞若しくは骨芽細胞、又は前骨芽細胞及び/又は骨芽細胞を含む細胞集団に分化させるための方法であって、この方法が、血漿又は血清、増殖分化因子8(GDF‐8)及び線維芽細胞増殖因子2(FGF‐2)を含んだ培地で前述のMSCを培養することを含む方法を見出した。
上述の知見を発展させ、本発明者らは、GDF‐8が細胞の免疫原性を低減する能力を更に認識し、本発明の特定の態様において、インビトロ又はエクスビボにおいて、GDF‐8を使用して細胞の免疫原性を低減する使用、方法及び生成物を提供する。本発明の関連する態様において、本発明者らは、GDF‐8を使用し、対象に投与されるか、埋め込まれるか又は移植される物質に対する対象による拒絶の危険性を低減する、使用、方法及び生成物を考慮している。
本明細書に使用される「免疫原性」という用語は、ヒト又は動物の体内で免疫反応を誘発する細胞などの特定の物質の能力を指す。この能力は、細胞上に提示される抗原又はエピトープなどの免疫原によって異なる。かかる免疫原は、例えば、ヒト白血球抗原(HLA)、好ましくはHLA‐DRなどのいずれかの主要組織適合遺伝子複合体(MHC)クラスII細胞表面受容体複合体であってもよいが、これに限定されない。本明細書に使用
される「HLA‐DR」という用語自体は周知であり、この用語は、特に、染色体6の6p21.31領域のヒト白血球抗原複合体によってコードされたMHCクラスII細胞表面受容体複合体を指す。免疫原性は、さらに、免疫反応において共刺激シグナルを提供する共刺激因子によって異なる。かかる共刺激因子は、例えば、分化80のクラスタ(CD80若しくはB7‐1)又は分化86のクラスタ(CD86若しくはB7‐2)のクラスタのうちの1以上であってもよいが、これらに限定されない。
される「HLA‐DR」という用語自体は周知であり、この用語は、特に、染色体6の6p21.31領域のヒト白血球抗原複合体によってコードされたMHCクラスII細胞表面受容体複合体を指す。免疫原性は、さらに、免疫反応において共刺激シグナルを提供する共刺激因子によって異なる。かかる共刺激因子は、例えば、分化80のクラスタ(CD80若しくはB7‐1)又は分化86のクラスタ(CD86若しくはB7‐2)のクラスタのうちの1以上であってもよいが、これらに限定されない。
したがって、更なる態様において、本発明は、インビトロでの細胞の免疫原性の低減におけるGDF‐8の使用を提供する。免疫原性の低減は、GDF‐8のない状態で培養した細胞におけるMHCクラスII細胞表面受容体複合体を表すそれぞれの基準値と比較した、MHCクラスII細胞表面受容体複合体の低減を含み得る。例えば、ヒト細胞における免疫原性の低減は、GDF‐8のない状態で培養した細胞におけるHLA MHCクラ
スII細胞表面受容体複合体を表すそれぞれの基準値と比較した、HLA MHCクラス
II細胞表面受容体複合体の低減を含み得る。免疫原性の低減は、GDF‐8のない状態で培養した細胞におけるHLA‐DRを表すそれぞれの基準値と比較した、HLA‐DRの低減を含むことが好ましい。「低減する(reducing)」、「減少する(decreasing)」、「減らす(diminishing)」又は「下げる(lowering)」という用語は、本明細書において区別
なく使用することができる。
スII細胞表面受容体複合体を表すそれぞれの基準値と比較した、HLA MHCクラス
II細胞表面受容体複合体の低減を含み得る。免疫原性の低減は、GDF‐8のない状態で培養した細胞におけるHLA‐DRを表すそれぞれの基準値と比較した、HLA‐DRの低減を含むことが好ましい。「低減する(reducing)」、「減少する(decreasing)」、「減らす(diminishing)」又は「下げる(lowering)」という用語は、本明細書において区別
なく使用することができる。
「MHCクラスII細胞表面受容体複合体の低減」、「HLA MHCクラスII細胞
表面受容体複合体の低減」又は「HLA‐DRの低減」という記載はそれぞれ、MHCクラスII細胞表面受容体複合体、HLA MHCクラスII細胞表面受容体複合体又はH
LA‐DRの細胞における量及び/又は有効性(例えば、生物活性を機能させる有効性)
の低減を指す。
表面受容体複合体の低減」又は「HLA‐DRの低減」という記載はそれぞれ、MHCクラスII細胞表面受容体複合体、HLA MHCクラスII細胞表面受容体複合体又はH
LA‐DRの細胞における量及び/又は有効性(例えば、生物活性を機能させる有効性)
の低減を指す。
本明細書に使用される「細胞におけるHLA‐DRを低減する」という記載は、細胞におけるHLA‐DRの量及び/又は有効性(例えば、生物活性を機能させる有効性)を低減することを指す。この量及び/又は有効性の低減は、細胞におけるHLA‐DRの量の減少、及び/又は細胞集団におけるHLA‐DRを発現する細胞画分の減少を包含する。
例えば、限定されないが、量及び/又は有効性の低減が、GDF‐8のない状態で培養した細胞におけるHLA‐DRを表すそれぞれの基準値と比較した、細胞集団におけるHLA‐DRを発現する細胞画分の減少を包含する場合、25%未満の細胞、好ましくは20%未満の細胞、更により好ましくは15%未満の細胞は、HLA‐DRを発現することができる。
本発明の更なる態様は、インビボで投与され、細胞の免疫原性を低減するのに使用されるGDF‐8に関する。GDF‐8は、例えば注入によって、局所的に、例えば筋骨格病変の部位に投与することができる。GDF‐8は、単独で、又は、幹細胞、好ましくはMSC、好ましくは成人MSCなどの細胞、及び/又は前骨芽細胞若しくは骨芽細胞などの細胞、若しくは前骨芽細胞及び/又は骨芽細胞を含む細胞集団(好ましくは、かかる細胞はヒト由来であり得る。)と組み合わせて投与することができる。GDF‐8は、好ましくは、MSCと組み合わせて投与することができ、より好ましくは、成人MSCと組み合わせて投与することができる。このため、インビボにおいて、MSC、好ましくは成人MSCとともに投与され、細胞の免疫原性の低減に使用されるGDF‐8が更に提供される。GDF‐8は、必要に応じて、上述のように細胞と組み合わせて、更にFGF‐2と同時投与することができる。好ましくは、前述の投与が行われる対象はヒトであり得る。好ましくは、投与される細胞又は細胞集団は、前述の対象に対し自家又は同種であり得る。GDF‐8とそれぞれの細胞若しくは細胞集団、例えばMSCは、インビボで同時に投与してもよいし、又は、いずれかの順序でインビボにおいて連続して投与してもよく、例え
ば、それぞれの細胞若しくは細胞集団、例えばMSCは、インビボで投与することができ、その後、GDF‐8は、インビボで投与することができるか、又は、GDF‐8は、インビボで投与することができ、その後、それぞれの細胞若しくは細胞集団、例えばMSCは、インビボで投与することができる。したがって、インビボで投与される、細胞の免疫原性を低減するための医薬品の製造におけるGDF‐8の使用も開示し、さらに、細胞の免疫原性の低減を必要とする対象にGDF‐8を投与することを含む、前述の対象における細胞の免疫原性を低減するための方法も開示する。
ば、それぞれの細胞若しくは細胞集団、例えばMSCは、インビボで投与することができ、その後、GDF‐8は、インビボで投与することができるか、又は、GDF‐8は、インビボで投与することができ、その後、それぞれの細胞若しくは細胞集団、例えばMSCは、インビボで投与することができる。したがって、インビボで投与される、細胞の免疫原性を低減するための医薬品の製造におけるGDF‐8の使用も開示し、さらに、細胞の免疫原性の低減を必要とする対象にGDF‐8を投与することを含む、前述の対象における細胞の免疫原性を低減するための方法も開示する。
本発明の別の態様は、医薬品として使用され、好ましくは、骨疾患及び骨関節疾患を含む筋骨格系疾患の治療に使用されるGDF‐8を提供する。したがって、骨疾患及び骨関節疾患を含む筋骨格系疾患の治療のための医薬品の製造におけるGDF‐8の使用も提供される。さらに、骨疾患及び骨関節疾患を含んだ筋骨格系疾患の治療を必要とする対象において、GDF‐8を投与することを含む、骨疾患及び骨関節疾患を含んだ筋骨格系疾患を治療するための方法が提供される。筋骨格系疾患の治療を必要とする対象において、治療有効量又は予防有効量のGDF‐8を投与することを含む、筋骨格系疾患を治療するための方法が特に意図される。医薬品として使用される場合、GDF‐8は、単独で、又は、幹細胞、好ましくはMSC、好ましくは成人MSCなどの細胞、及び/又は前骨芽細胞若しくは骨芽細胞などの細胞、若しくは前骨芽細胞及び/又は骨芽細胞を含む細胞集団(好ましくは、かかる細胞はヒト由来であり得る。)と組み合わせて投与することができる。GDF‐8は、好ましくは、MSCと組み合わせて投与することができ、より好ましくは、成人MSCと組み合わせて投与することができる。このため、インビボでMSCとともに、好ましくは成人MSCとともに投与され、医薬品として使用され、好ましくは、骨疾患及び骨関節疾患を含む筋骨格系疾患の治療に使用されるGDF‐8が特に開示されている。GDF‐8は、必要に応じて、上述のように細胞と組み合わせて、更にFGF‐2と同時投与することができる。さらに、骨疾患及び骨関節疾患を含んだ筋骨格系疾患の治療を必要とする対象において、GDF‐8とMSC、好ましくは成人MSCとを投与することを含む、骨疾患及び骨関節疾患を含んだ筋骨格系疾患を治療するための方法が提供される。好ましくは、前述の投与が行われる対象はヒトであり得る。好ましくは、投与される細胞又は細胞集団は、前述の対象に対し自家又は同種であり得る。
上述したように、本発明は、インビトロ又はエクスビボにおいて、間葉系幹細胞(MSC)を、前骨芽細胞若しくは骨芽細胞、又は前骨芽細胞及び/又は骨芽細胞を含む細胞集団に分化させるための方法についての態様に関する。本発明は、インビトロ又はインビボにおいて、細胞の免疫原性の低減におけるGDF‐8の適用であって、特に、細胞が、MSC、MSCの分化によって得られる細胞、骨細胞系統の細胞、軟骨細胞系統の細胞、脂肪細胞系統の細胞、筋細胞系統の細胞、腱細胞系統の細胞、線維芽細胞系統の細胞及び間質発生細胞系統の細胞からなる群より選択される適用に関する。
本明細書に使用される「前骨芽細胞及び/又は骨芽細胞を含む細胞集団」という記載は、記載された細胞型のうちのいずれか又は両方を含み、場合により、他の記載されていない細胞型を含有する細胞集団を指す。
本明細書に使用される「前骨芽細胞」は、特に、初期及び後期前骨芽細胞を含み得る。「骨芽細胞」は、特に、前骨芽細胞、骨芽細胞及び骨細胞を包含し得る。本明細書に使用される、これらの用語はすべてそれ自体周知であり、通常、骨形成表現型を有し、骨物質若しくは骨基質の形成に寄与し得る細胞又は骨物質若しくは骨基質の形成に寄与し得る細胞に成長可能な細胞を指すことがある。特に、本方法によって、移植、又は筋骨格系疾患の治療、例えば、治療設定において骨形成を回復させるのに有利に有用である、細胞及び細胞集団が生じる。したがって、「前骨芽細胞」(初期及び後期前骨芽細胞を含む。)並びに「骨芽細胞」(前骨芽細胞、骨芽細胞及び骨細胞を含む。)という用語は、本発明の
原理を適用する方法から得られる骨形成系統のかかる有用な細胞を包含することを望むものとして解釈される。このため、骨形成系統の有用な細胞は、成熟骨細胞への骨形成分化のいずれかの段階における細胞を包含し得る。
原理を適用する方法から得られる骨形成系統のかかる有用な細胞を包含することを望むものとして解釈される。このため、骨形成系統の有用な細胞は、成熟骨細胞への骨形成分化のいずれかの段階における細胞を包含し得る。
更なる案内によって、前骨芽細胞及び骨芽細胞とともに、前骨芽細胞及び/又は骨芽細胞を含む細胞集団は、次の特性を示すことができるが、これらに限定されない。
a)細胞は、Runx2、骨芽細胞分化を調節する多機能性転写因子の発現、及び骨芽細胞分化時の多くの細胞外マトリックスタンパク質遺伝子の発現を構成する。
b)細胞は、アルカリホスファターゼ(ALP)、具体的には、骨‐肝臓‐腎臓型AL
Pのうちの少なくとも1つの発現を構成し、オステオカルシン(OCN)、プロコラーゲン1型アミノ末端プロペプチド(P1NP)、オステオネクチン(ON)、オステオポンチン(OP)及び/又は骨シアロタンパク質(BSP)などの1以上の付加的な骨マーカー、及び/又はデコリン及び/又はオステオプロテゲリン(OPG)などの1以上の付加的な骨基質の発現も構成することがより好ましい。
Pのうちの少なくとも1つの発現を構成し、オステオカルシン(OCN)、プロコラーゲン1型アミノ末端プロペプチド(P1NP)、オステオネクチン(ON)、オステオポンチン(OP)及び/又は骨シアロタンパク質(BSP)などの1以上の付加的な骨マーカー、及び/又はデコリン及び/又はオステオプロテゲリン(OPG)などの1以上の付加的な骨基質の発現も構成することがより好ましい。
c)細胞は、実質的に、CD45を発現しない(例えば、約10%未満、好ましくは約5%未満、より好ましくは約2%未満の細胞しかCD45を発現することができない。)。
d)細胞は、外部環境の石灰化能又はカルシウム含有細胞外マトリックスの合成能の証拠を示す(例えば、骨形成培地に暴露された場合:Jaiswal et al. J Cell Biochem, 1997, vol. 64, 295-312を参照)。細胞内部のカルシウムの蓄積及びマトリックスタンパク
質への堆積は、例えば、45Ca2+で培養し、洗浄し、再培養し、その後、細胞内部に存在するか若しくは細胞外マトリックス(米国特許第5,972,703号)に堆積した放射能を測定するか、又はアリザリンレッドベースの石灰化アッセイ(例えば、Gregory et al. Analytical Biochemistry, 2004, vol. 329, 77-84を参照)を用いることことによっ
て、通常、測定することができる。
質への堆積は、例えば、45Ca2+で培養し、洗浄し、再培養し、その後、細胞内部に存在するか若しくは細胞外マトリックス(米国特許第5,972,703号)に堆積した放射能を測定するか、又はアリザリンレッドベースの石灰化アッセイ(例えば、Gregory et al. Analytical Biochemistry, 2004, vol. 329, 77-84を参照)を用いることことによっ
て、通常、測定することができる。
e)細胞は、実質的に、脂肪細胞系統の細胞(例えば、脂肪細胞)又は軟骨細胞系統の細胞(例えば、軟骨細胞)のいずれにも分化しない。かかる細胞系統への分化の欠如は、当該技術分野において確立された標準的な分化誘導条件(例えば、Pittenger et al. Science, 1999, vol. 284, 143-7を参照)、及びアッセイ法(例えば、誘導された場合、脂
肪細胞、通常、脂質蓄積を示すオイルレッドOで染色;軟骨細胞、通常、アルシアンブルー又はサフラニンOで染色)を用いて試験することができる。脂肪生成及び/又は軟骨形成分化に対する傾向を実質的に欠くことは、通常、20%未満、又は10%未満、又は5%未満、又は1%未満の試験細胞が、それぞれの試験に適用した場合、脂肪生成分化又は軟骨形成分化の徴候を示すことを意味し得る。
肪細胞、通常、脂質蓄積を示すオイルレッドOで染色;軟骨細胞、通常、アルシアンブルー又はサフラニンOで染色)を用いて試験することができる。脂肪生成及び/又は軟骨形成分化に対する傾向を実質的に欠くことは、通常、20%未満、又は10%未満、又は5%未満、又は1%未満の試験細胞が、それぞれの試験に適用した場合、脂肪生成分化又は軟骨形成分化の徴候を示すことを意味し得る。
細胞は、VEGFなどの1以上の細胞動員因子の発現を更に構成し得る。細胞は、IL6の発現を更に構成し得る。
骨細胞(骨)系統、軟骨細胞(軟骨)系統、脂肪細胞(脂肪)系統、筋細胞(筋肉)系統、腱細胞(腱)系統、線維芽細胞(結合組織)系統若しくは間質発生細胞(間質)系統を構成するか又はこれらに属するものとして分類される細胞は、当業者に周知である。これらは、それぞれの表現型を有し、それぞれの組織型の形成に寄与し得る細胞又はそれぞれの組織型の形成に寄与し得る細胞に成長可能な細胞を包含する。更なる案内及び例による骨細胞系統の細胞には、初期及び後期前骨芽細胞、前骨芽細胞、骨芽細胞及び骨細胞などの前骨芽細胞が含まれ、軟骨細胞系統の細胞には、軟骨芽細胞及び軟骨細胞が含まれ、
さらに軟骨細胞は、肥大軟骨細胞も包含し、脂肪細胞系統の細胞には、脂肪芽細胞(又は前脂肪細胞)及び脂肪細胞が含まれ、筋細胞系統の細胞には、衛星細胞、筋芽細胞並びに筋細胞(筋組織のいずれかの型の細胞、すなわち、心臓、骨格及び平滑筋組織が想定され、骨格筋組織の細胞がより好ましい。)が含まれ、腱細胞系統の細胞には、腱芽細胞及び腱細胞が含まれ、線維芽細胞系統の細胞には、線維細胞及び線維芽細胞が含まれ、間質発生細胞系統の細胞には、特に骨髄間質細胞などの間質細胞が含まれる。
さらに軟骨細胞は、肥大軟骨細胞も包含し、脂肪細胞系統の細胞には、脂肪芽細胞(又は前脂肪細胞)及び脂肪細胞が含まれ、筋細胞系統の細胞には、衛星細胞、筋芽細胞並びに筋細胞(筋組織のいずれかの型の細胞、すなわち、心臓、骨格及び平滑筋組織が想定され、骨格筋組織の細胞がより好ましい。)が含まれ、腱細胞系統の細胞には、腱芽細胞及び腱細胞が含まれ、線維芽細胞系統の細胞には、線維細胞及び線維芽細胞が含まれ、間質発生細胞系統の細胞には、特に骨髄間質細胞などの間質細胞が含まれる。
細胞は、特定のマーカーに対して陽性である(又は特定のマーカーを発現するか若しくは発現を構成する)と考えられており、このことは、当業者が、別々のシグナルの存在又は証拠、例えば、適切な対照と比較して適切な測定を行う場合のそのマーカーを、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応によって検出可能な抗体又は当該マーカーの逆転写ポリメラーゼ連鎖反応による検出を結論付けるということを意味する。方法がマーカーの定量的評価を可能にする場合、陽性細胞は、平均して、対照と有意に異なるシグナルを発生させることができ、例えば、対照細胞によって発生するかかるシグナルの少なくとも1.5倍、例えば、少なくとも2倍、少なくとも4倍、少なくとも10倍、少なくとも20倍、少なくとも30倍、少なくとも40倍、少なくとも50倍、又は更にこれよりも高いが、これらに限定されない、シグナルを発生させることができる。
上述した細胞特異的マーカーの発現は、免疫細胞化学若しくは親和性吸着法、ウエスタンブロット分析、FACS、ELISAなどの当該技術分野において公知のいずれかの適切な免疫学的手法を用いて、又は、適切な酵素活性の生化学アッセイ(例えば、ALP)によって、又は、mRNAの量を測定するいずれかの適切な方法、例えば、ノーザンブロット、半定量的又は定量的RT‐PCRなどによって検出することができる。本開示に挙げたマーカーの配列データは公知であり、GenBank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)などの公共データベースから取得することができる。
言及したように、本発明は、前骨芽細胞又は骨芽細胞を含む細胞集団も考慮する。例示的な細胞集団は、少なくとも10%、好ましくは少なくとも30%、より好ましくは少なくとも50%、例えば少なくとも60%、更により好ましくは少なくとも70%、例えば少なくとも80%、及び更により好ましくは少なくとも90%、例えば少なくとも95%の、本明細書に教示する前骨芽細胞及び/又は骨芽細胞を含み得る。例えば、細胞集団は、50%未満、好ましくは40%未満、更に好ましくは30%未満、更により好ましくは30%未満、更により好ましくは20%未満、及び更により好ましくは10%未満、例えば7%未満、5%未満又は2%未満の、本明細書に定義する前骨芽細胞及び骨芽細胞以外の細胞型を含み得る。
「幹細胞」という用語は、一般に、特殊化されていないか又は比較的特殊化されていない増殖能力のある細胞を指し、この細胞は、自己再生することができ、すなわち、分化することなく増殖することができるか、又は、その子孫は、少なくとも1つの比較的特殊化された細胞型を発生させることができる。この用語は、実質的に無制限の自己再生が可能な幹細胞を包含し、すなわち、幹細胞の子孫又は少なくともその一部が、実質的に、特殊化されていないか又は比較的特殊化されていない表現型、分化潜在能及び母幹細胞の増殖能とともに、制限された自己再生を示す幹細胞を保持し、すなわち、子孫又は少なくともその一部の更なる増殖能及び/又は分化能が、母細胞と比較して、明らかに低減される幹細胞を包含する。例として、幹細胞は、1以上の系統に沿って分化させ、比較的特殊化された細胞を漸増的に発生させることができる子孫を発生させることができ、かかる子孫及び/又は漸増的に比較的特殊化された細胞自体は、本明細書に定義する幹細胞、又は最終分化細胞(すなわち、有系分裂後であり得る、完全に特殊化された細胞)を更に生産する幹細胞であってもよいが、これらに限定されない。
本明細書に使用される「成体幹細胞」という用語は、胎児の段階若しくは出生後、例えば成体期に達した後などに、生物体に存在するか又は当該生物体から得られる(例えば、単離される)幹細胞を指す。
本発明に係る好ましい幹細胞は、例えば、骨形成原細胞及び/又は前骨芽細胞及び/又は前骨芽細胞及び/又は骨芽細胞及び/又は骨細胞などのような、骨形成(骨)系統の細胞を少なくとも発生させる潜在能を有する。
さらに、好ましくは、本発明に係る少なくとも一部の幹細胞は、本方法から得られる細胞集団に含まれる更なる細胞、例えば、内皮系統の細胞など(例えば、内皮前駆細胞及び/又は内皮細胞)を発生させる潜在能も有し得る。
本明細書に使用される、「間葉系幹細胞」又は「MSC」という用語は、間葉系統の細胞、一般に、2以上の間葉系統の細胞、例えば、骨細胞(骨)、軟骨細胞(軟骨)、筋細胞(筋肉)、腱細胞(腱)、線維芽細胞(結合組織)、脂肪細胞(脂肪)及び間質発生細胞(骨髄間質)系統を発生させることが可能な成体の中胚葉由来の幹細胞を指す。MSCは、例えば、骨髄、骨梁、血液、臍帯、胎盤、胎児卵黄嚢、皮膚(真皮)、具体的には、胎児及び若年期の皮膚、骨膜及び脂肪組織から単離することができる。ヒトMSC、これらの単離、インビトロ増殖及び分化は、例えば、米国特許第5,486,359号、同5,811,094号、同5,736,396号、同5,837,539号又は同5,827,740号に記載されている。当該技術分野に示され、当該技術分野に示されたいずれかの方法によって単離された、いずれかのMSCは、本発明の方法において適切であり得、かかるMSCは、少なくとも骨細胞(骨)系統の細胞を発生させることができるように提供される。
また、MSCという用語は、MSCの子孫、例えば、動物又はヒト対象の生体試料から得られたMSCをインビトロ又はエクスビボにおいて増殖させることによって得られる子孫も包含する。
また、少なくとも一部のMSCは、潜在的に、本方法から得られる細胞集団に含まれる更なる細胞を発生させることもできるが、これに限定されない。
例に示すように、本発明の特定の態様の方法は、指定された培養条件下で基材表面に付着する、骨髄幹細胞(BMSC)の選択を必要とし得る。基材表面、例えばプラスチック表面に付着することができる(単核)細胞を選択することによって、骨髄(又は他の供給源)からMSCを単離できることが当該技術分野において公知である。このため、好ましくは、本明細書に使用されるMSCは、骨髄から単離することができる。骨髄(BMSC)の試料は、例えば、対象の腸骨稜、大腿骨、脛骨、脊椎、肋骨又は他の髄空間から得ることができる。
特定の成分に関連する「単離する」という用語は、組成物の少なくとも1つの他の成分からその成分を分離し、そこからその成分を単離することを意味する。また、いずれの細胞型又は細胞集団に関連して本明細書に使用される「単離された」という用語は、細胞集団が動物体又は人体の一部を形成しないことも意味する。
MSCは、生体試料、例えばBMSCを含む試料に含まれ得るか、又は当該技術分野において公知であるように、生体試料から少なくとも部分的に単離することができる。さらに、MSCは、骨髄、又は骨髄以外のMSCを含む適切な供給源、例えば、血液、臍帯、胎盤、胎児卵黄嚢、皮膚(真皮)、具体的には、胎児及び若年期の皮膚、骨膜及び脂肪組織から、少なくとも部分的に単離することができる。
「インビトロ」という用語は、一般に、動物体又は人体の外側又は外部を意味する。「エクスビボ」という用語は、通常、動物体若しくは人体から取り出され、維持されるか、又は体外で、例えば培養容器中で増殖させた組織又は細胞を指す。本明細書に使用される「インビトロ」という用語は、「エクスビボ」を含むと理解される。「インビボ」という用語は、一般に、動物体又は人体の内側又は内部を意味する。
実施形態において、MSC又は本明細書に想定される他の細胞型は、対象の生体試料から得ることができる。
「対象」又は「患者」という用語は、区別なく使用され、治療、観察又は試験の対象の目的である、動物、好ましくは温血動物、より好ましくは脊椎動物、及び更により好ましくは哺乳動物、具体的には、ヒト及び非ヒト哺乳動物を含む哺乳動物を指す。「哺乳動物」という用語には、ヒト、家畜と農場動物、動物園の動物、競技用動物、愛玩動物、伴侶動物及び実験動物、例えば、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ウシ、雌牛、ヒツジ、ウマ、ブタ及び霊長類(例えば、サル及び類人猿)などを含むが、これらに限定されないものとして分類される、いずれかの動物が含まれる。両方の性別及びすべての年齢層を含むヒト対象が特に好ましい。
ここで、ヒト血漿又は血清、GDF‐8及びFGF‐2を含む培地で成人MSCを培養することを含む、インビトロ又はエクスビボにおいて、前述のMSCを、前骨芽細胞若しくは骨芽細胞、又は前骨芽細胞及び/又は骨芽細胞を含む細胞集団に分化させるための方法も提供される。
非ヒト動物対象には、例えば、胚又は胎児などの動物の出生前の形態も含まれていてもよい。また、ヒト対象には、胎児も含まれていてもよいが、選択によって、胚は含まれない。
本明細書に使用される「生体試料」又は「試料」という用語は、一般に、生物供給源(例えば、生物体、器官、組織若しくは細胞培養物など)から得られた試料を指す。動物又はヒト対象の生体試料とは、動物又はヒト対象から取り出され、これらの細胞を含んだ試料をいう。動物又はヒト対象の生体試料は、1以上の組織型及び1以上の組織型の細胞を含んでいてもよい。動物又はヒト対象の生体試料を得る方法は、当該技術分野において周知であり、例えば、組織生検又は採血である。
対象の有用な生体試料は、そのMSC、又は本明細書に想定される対象の他の細胞型を含む。MSCを含む試料は、通常、骨髄、例えば、腸骨稜、大腿骨、脛骨、背骨、肋骨又は対象の他の髄空間から得ることができる。MSCを含む別の有用な生体試料は、例えば、血液、臍帯、胎盤、胎児卵黄嚢、皮膚(真皮)、具体的には、胎児及び若年期の皮膚、骨膜、骨梁又は対象の脂肪組織から得ることができる。本明細書に論じる他の細胞型は、利用可能なプロトコールを用いて、対応する組織から単離することができ、この対応する組織は、例えば、骨組織由来の骨細胞系統、軟骨組織由来の軟骨細胞系統、脂肪組織由来の脂肪細胞系統、平滑、心筋若しくは骨格筋細胞(好ましくは骨格筋細胞)由来の筋細胞系統の細胞、腱組織由来の腱細胞系統の細胞、結合組織由来の線維芽細胞系統の細胞、又は骨髄間質などの間質組織由来の間質発生細胞系統の細胞に存在する。または、かかる細胞型は、それ自体公知のプロトコールを用いて、MSCを分化させることができる。
実施形態において、MSCは、健全な対象から得られ、この対象は、前述のMSCを分化させる、前骨芽細胞若しくは骨芽細胞、又は前骨芽細胞及び/又は骨芽細胞を含む細胞集団、又は本明細書に想定される他の細胞型の機能性を保証するのに有用であり得る。更
なる実施形態において、MSC、又は本明細書に想定される他の細胞型は、健全な対象から得られ、この対象は、かかる細胞の機能性を保証するのに有用であり得る。
なる実施形態において、MSC、又は本明細書に想定される他の細胞型は、健全な対象から得られ、この対象は、かかる細胞の機能性を保証するのに有用であり得る。
別の実施形態において、MSCは、例えば骨疾患などの筋骨格系疾患の危険性があるか又は筋骨格系疾患に罹患している対象、このため、本発明の方法により前述のMSCを分化させる、前骨芽細胞若しくは骨芽細胞、又は前骨芽細胞及び/又は骨芽細胞を含む細胞集団の投与により特に利益を得ることができる対象から得ることができる。
更なる実施形態において、MSC、又は本明細書に想定される他の細胞型は、組織に有害な影響を及ぼす疾患の危険性があるか又はこの疾患に罹患している対象であって、MSC、又は本明細書に想定される1以上の他の細胞型の投与により利益を得ることができる対象から得ることができる。
本明細書に使用される「筋骨格系疾患」という用語は、いずれかの型の骨疾患、筋肉疾患、骨関節疾患又は軟骨形成異常を指し、これらの治療は、かかる疾患に罹患した対象に、骨形成系統の細胞、例えば、前骨芽細胞若しくは骨芽細胞、又は前骨芽細胞及び/又は骨芽細胞を含む細胞集団を投与することよって、利益を得ることができる。特に、かかる疾患は、例えば、骨形成又は過剰な骨吸収の減少、骨中に存在する骨芽細胞数又は骨細胞数、生存能又は機能の減少、対象の骨量の減少、骨の薄型化、骨強度又は弾性の低下などといった特徴があり得る。
本明細書に教示する、前骨芽細胞若しくは骨芽細胞、又は前骨芽細胞及び/又は骨芽細胞を含む細胞集団の投与により利益を得ることができる筋骨格系疾患の非限定的な例としては、いずれかの型の骨粗鬆症若しくは骨減少症、例えば、初期、閉経後、老人性、コルチコイド誘発性、ビスホスホネート誘発性及び放射線療法誘発性などの局所的又は全身障害;二次、単一部位若しくは多部位骨壊死;いずれかの型の骨折、例えば、偽関節、変形治癒、癒合遅延性骨折若しくは圧迫、骨癒合に必要な条件(例えば、脊椎固定術及び再建)、顎顔面骨折、先天性骨欠損、例えば外傷若しくは癌手術後の骨再建、及び頭蓋顔面骨再建;外傷性関節炎、局所性(focal)軟骨及び/又は関節欠損、局所性変形性関節炎;骨
関節炎、変形性関節炎、変形性膝関節症及び変形性股関節症;骨形成不全症;溶骨性骨癌;パジェット病、内分泌疾患、低リン酸血症、低カルシウム血症、腎性骨異栄養症、骨軟化症、無形成骨症、副甲状腺機能亢進症、原発性副甲状腺機能亢進症、二次性副甲状腺機能亢進症;歯周病;ゴーハム‐スタウト病及びマッキューン‐オルブライト症候群;慢性関節リウマチ;強直性脊椎炎、乾癬性関節炎、腸炎性関節炎、及び未分化脊椎関節炎と反応性関節炎を含む脊椎関節症;全身性紅斑性狼瘡及びこれに関連する症候群;強皮症及びこれに関連する疾患;シェーグレン症候群;巨細胞性動脈炎(ホートン病)、高安動脈炎、リウマチ性多発筋痛、ANCA関連血管炎(ウェゲナー肉芽腫症、顕微鏡的多発血管炎及びチャーグ‐ストラウス症候群など)、ベーチェット症候群及び他の多発動脈炎を含む全身性血管炎とこれに関連する疾患(結節性多発動脈炎、コーガン症候群及びバージャー病など);アミロイドーシス及びサルコイドーシスを含む、他の全身性炎症性疾患を伴う関節炎;痛風、ピロリン酸カルシウム二水和物疾患、リン酸カルシウム若しくはシュウ酸カルシウム結晶の関節沈着に関連する障害若しくは症候群を含む、結晶性関節症;軟骨石灰化症及び神経障害性関節症;フェルティ症候群及びライター症候群;ライム病及びリウマチ熱を挙げることができる。
関節炎、変形性関節炎、変形性膝関節症及び変形性股関節症;骨形成不全症;溶骨性骨癌;パジェット病、内分泌疾患、低リン酸血症、低カルシウム血症、腎性骨異栄養症、骨軟化症、無形成骨症、副甲状腺機能亢進症、原発性副甲状腺機能亢進症、二次性副甲状腺機能亢進症;歯周病;ゴーハム‐スタウト病及びマッキューン‐オルブライト症候群;慢性関節リウマチ;強直性脊椎炎、乾癬性関節炎、腸炎性関節炎、及び未分化脊椎関節炎と反応性関節炎を含む脊椎関節症;全身性紅斑性狼瘡及びこれに関連する症候群;強皮症及びこれに関連する疾患;シェーグレン症候群;巨細胞性動脈炎(ホートン病)、高安動脈炎、リウマチ性多発筋痛、ANCA関連血管炎(ウェゲナー肉芽腫症、顕微鏡的多発血管炎及びチャーグ‐ストラウス症候群など)、ベーチェット症候群及び他の多発動脈炎を含む全身性血管炎とこれに関連する疾患(結節性多発動脈炎、コーガン症候群及びバージャー病など);アミロイドーシス及びサルコイドーシスを含む、他の全身性炎症性疾患を伴う関節炎;痛風、ピロリン酸カルシウム二水和物疾患、リン酸カルシウム若しくはシュウ酸カルシウム結晶の関節沈着に関連する障害若しくは症候群を含む、結晶性関節症;軟骨石灰化症及び神経障害性関節症;フェルティ症候群及びライター症候群;ライム病及びリウマチ熱を挙げることができる。
本発明の原理を適用する方法及び使用は、例えば、液体又は半固体(例えば、ゲル状)などのそれ自体公知の細胞又は組織培養培地、好ましくは液体細胞又は組織培養培地の存在下における細胞又は細胞集団の培養(例えば、維持、増殖及び/又は分化)に関係し得る。かかる培養培地は、細胞又は細胞集団の維持(例えば、生存、遺伝子型、表現型及び/又は機能的安定性)並びに増殖を維持できることが望ましい。
特に、本発明の原理を具体化する方法は、血漿又は血清並びにGDF‐8及びFGF‐2を含む培地でMSCを培養することを含み得る。このため、細胞は、一般的に、培地中への増殖因子及び血漿又は血清などの1以上の薬剤の包含によって、これらを含む培地で培養することができる。
当業者であれば、血漿及び血清が、1以上の増殖因子、サイトカイン又はホルモンを含み得る複合的な生物学的組成物であることを認識する。このため、記載された増殖因子、特にGDF‐8及びFGF‐2が、血漿又は血清に加えて、すなわち、血漿又は血清に対し外因的に又は補助的に提供されることが意図される。
また、インビトロ又はエクスビボにおいて、成体間葉系幹細胞(MSC)を、前骨芽細胞若しくは骨芽細胞、又は前骨芽細胞及び/又は骨芽細胞を含む細胞集団に分化させる方法であって、基礎培地、血漿若しくは血清、GDF‐8及びFGF‐2から本質的になるか又はこれらからなる培地で前述のMSCを培養することを含む方法も提供される。
このため、実施形態において、GDF‐8及びFGF‐2は、培地に加えられる単独の増殖因子であり得る。
更なる実施形態において、MSCは、GDF‐8及びFGF‐2に加え、GDF‐8及びFGF‐2以外の1以上の増殖因子を更に外因的に添加して培養することができる。
好適な実施形態において、本方法に使用される増殖因子のうちのいずれか1つ又はすべて(本明細書に使用される増殖因子への一般的な言及は、特に、GDF‐8及びFGF‐2増殖因子、並びに、場合により、1以上の更なる増殖因子を包含する。)は、ヒト増殖因子である。本明細書に使用される「ヒト増殖因子」という用語は、天然のヒト増殖因子と実質的に同じ増殖因子を指す。例えば、増殖因子がタンパク質性の実体である場合、構成するペプチド又はそのポリペプチドは、天然のヒト増殖因子と同一の一次アミノ酸配列を有し得る。かかる増殖因子がヒト細胞の機能に対して望ましい効果を誘発することが予想されるので、ヒト増殖因子の使用が好ましい。
「天然の」という用語は、人によって人工的に生産されるものとは異なり、自然界に見出すことができる物体又は実体を説明するのに使用される。例えば、生物体に存在するポリペプチド配列は、自然界における供給源から単離することができ、実験室で人によって意図的に改変されておらず、自然に存在している。特定の実体(例えば、ポリペプチド又はタンパク質)に言及する場合、この用語は、自然界において、例えば、種と個体との間の正常な変異によって発生する形態とその変異体をすべて包含する。例えば、タンパク質性増殖因子に言及する場合、「天然の」という用語は、種と個体間の正常な対立遺伝子変異との間の遺伝的分化によって、これらの構成ペプチド又はポリペプチドの一次配列の相違を有する増殖因子を包含する。
FGF‐2又は線維芽細胞増殖因子2は、塩基性線維芽細胞増殖因子、FGFb、bFGF、プロスタトロピン(prostatropin)又はヘパリン結合性増殖因子2前駆体(HBGF‐2)としても一般に知られている。例示的なヒトFGF‐2としては、Uniprot/Swissprot登録番号P09038(http://www.uniprot.org/uniprot/)で注釈
された一次アミノ酸配列を有するFGF‐2が挙げられるが、これに限定されない。当業者であれば、前述の配列が前駆体FGF‐2のものであり、成熟FGF‐2以外の処理される部分を含み得ることが認識できる。例示的なヒトFGF‐2タンパク質配列は、NCBI Genbank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)登録番号NP_001997.5
で注釈されたものであり得る。また、例示的なヒトFGF‐2は、とりわけ、Abrahamら
の文献(1986) (EMBO J 5: 2523-8)及びKurokawaらの文献(1987) (FEBS Lett 213: 189-94)にも記載されている。
された一次アミノ酸配列を有するFGF‐2が挙げられるが、これに限定されない。当業者であれば、前述の配列が前駆体FGF‐2のものであり、成熟FGF‐2以外の処理される部分を含み得ることが認識できる。例示的なヒトFGF‐2タンパク質配列は、NCBI Genbank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)登録番号NP_001997.5
で注釈されたものであり得る。また、例示的なヒトFGF‐2は、とりわけ、Abrahamら
の文献(1986) (EMBO J 5: 2523-8)及びKurokawaらの文献(1987) (FEBS Lett 213: 189-94)にも記載されている。
GDF‐8又は増殖因子及び分化因子8は、ミオスタチン(MSTN)としても一般に知られている。例示的なヒトGDF‐8としては、Uniprot/Swissprot登録番号O14793で注釈された一次アミノ酸配列を有するGDF‐8が挙げられるが、これに限定されない。例示的なヒトGDF‐8タンパク質前駆体の配列は、NCBI
Genbank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)登録番号NP_005250.1で注釈されたものであり得る。また、例示的なマウスGDF‐8も、とりわけ、McPherronらの
文献(1997) (Nature 387 (6628): 83-90)に記載されている。
Genbank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)登録番号NP_005250.1で注釈されたものであり得る。また、例示的なマウスGDF‐8も、とりわけ、McPherronらの
文献(1997) (Nature 387 (6628): 83-90)に記載されている。
GDF‐8及びFGF‐2は、前骨芽細胞若しくは骨芽細胞、又は前骨芽細胞及び/又は骨芽細胞を含む細胞集団へのMSCの分化を誘導するのに十分な濃度で、本明細書に定義される培地中に含まれる。通常、FGF‐2は、0.1〜100 ng/ml、好まし
くは0.5〜20 ng/ml、例えば、約19、18、17、16、15、14、13
、12、11、10、9、8、7若しくは6 ng/ml、又は約5 ng/ml以下、例えば、約4、3、2、1若しくは0.5 ng/mlの濃度で培地中に含めることができ
る。通常、GDF‐8は、0.1〜1000 ng/ml、例えば1〜500 ng/ml、例えば、約450、400、350、300、250若しくは200 ng/ml、又
は約150 ng/ml以下、例えば、約100、75、50、25若しくは10 ng/ml、又は好ましくは約5 ng/ml以下、例えば、約4、3、2、1、0.75、0
.5若しくは0.25 ng/mlの濃度で培地中に含めることができる。前述の値は、
培地に外因的に添加されるそれぞれの増殖因子の濃度を指すものとする。
くは0.5〜20 ng/ml、例えば、約19、18、17、16、15、14、13
、12、11、10、9、8、7若しくは6 ng/ml、又は約5 ng/ml以下、例えば、約4、3、2、1若しくは0.5 ng/mlの濃度で培地中に含めることができ
る。通常、GDF‐8は、0.1〜1000 ng/ml、例えば1〜500 ng/ml、例えば、約450、400、350、300、250若しくは200 ng/ml、又
は約150 ng/ml以下、例えば、約100、75、50、25若しくは10 ng/ml、又は好ましくは約5 ng/ml以下、例えば、約4、3、2、1、0.75、0
.5若しくは0.25 ng/mlの濃度で培地中に含めることができる。前述の値は、
培地に外因的に添加されるそれぞれの増殖因子の濃度を指すものとする。
GDF‐8及びFGF‐2を含むいずれかの増殖因子などのいずれかのタンパク質、ポリペプチド又はペプチドへの本明細書の言及は、その断片も包含し得る。タンパク質、ポリペプチド又はペプチドの「断片」という用語は、一般に、N末端及び/又はC末端欠失若しくは切断形態の前述のタンパク質、ポリペプチド又はペプチドを指す。核酸、タンパク質、ポリペプチド又はペプチドの断片は、少なくとも約5%、又は少なくとも約10%、例えば、20%以上、30%以上若しくは40%以上、例えば好ましくは50%以上、例えば、60%以上、70%以上若しくは80%以上、又はより好ましくは90%以上若しくは95%以上であるが、これらに限定されない、前述の核酸のヌクレオチド配列、又は前述のタンパク質、ポリペプチド若しくはペプチドのアミノ酸配列を表し得る。
GDF‐8及びFGF‐2を含むいずれかの増殖因子などのいずれかのタンパク質、ポリペプチド又はペプチドへの本明細書の言及は、その変異体も包含し得る。核酸、タンパク質、ポリペプチド又はペプチドの「変異体」という用語は、前述の核酸、タンパク質、ポリペプチド又はペプチドと実質的に同一である(大部分が同一であるが、すべてではない)、例えば、少なくとも約80%又は少なくとも約85%、例えば、好ましくは少なくとも約90%、例えば、少なくとも91%、92%、より好ましくは少なくとも約93%、例えば、少なくとも94%、更により好ましくは少なくとも約95%、例えば、少なくとも96%、更により好ましくは少なくとも約97%、例えば、少なくとも98%、及び最も好ましくは少なくとも99%同一である、核酸、タンパク質、ポリペプチド又はペプチド(すなわち、それぞれのヌクレオチド配列若しくはアミノ酸配列)を指す。好ましくは、記載された核酸、タンパク質、ポリペプチド又はペプチドの全配列が、配列アラインメント(すなわち、全体的な配列同一性)で照会された場合、変異体は、記載された核酸、タンパク質、ポリペプチド又はペプチドに対する同一性のかかる程度を示し得る。また、前述の核酸、タンパク質、ポリペプチド又はペプチドと、通常これらとは無関係の、別の核酸、タンパク質、ポリペプチド又はペプチドの融合産物も、前述の核酸、タンパク質、ポリペプチド又はペプチドの断片及び変異体の中に含まれる。
配列同一性は、それ自体が公知の、配列アラインメント及び配列同一性の決定を行うのに適したアルゴリズムを用いて決定することができる。例示的なアルゴリズムとしては、例えば、公開されたデフォルト設定又は他の適切な設定(例えば、BLASTNアルゴリズム:cost to open a gap=5,cost to extend a gap=2,penalty for a mismatch=‐2,reward for a match=1,gap x_dropoff=50,expectation value=10.0,word size=28;若しくはBLASTPアルゴリズム:matr
ix=Blosum62,cost to open a gap=11,cost to extend a gap=1,expectation value=10.0,word size=3など)を使用する、Tatusova及びMaddenの文献(1999) (FEMS Microbiol Lett 174: 247-250)に記載されている「Blast 2配列」アルゴリズムなどの、もとはAltschulらの文献(1990) (J Mol Biol 215: 403-10)に記載されている、ベーシックローカ
ルアライメント検索ツール(Basic Local Alignment Search Tool)(BLAST)に基づ
くものが挙げられるが、これに限定されない。
ix=Blosum62,cost to open a gap=11,cost to extend a gap=1,expectation value=10.0,word size=3など)を使用する、Tatusova及びMaddenの文献(1999) (FEMS Microbiol Lett 174: 247-250)に記載されている「Blast 2配列」アルゴリズムなどの、もとはAltschulらの文献(1990) (J Mol Biol 215: 403-10)に記載されている、ベーシックローカ
ルアライメント検索ツール(Basic Local Alignment Search Tool)(BLAST)に基づ
くものが挙げられるが、これに限定されない。
タンパク質、ポリペプチド又はペプチドの変異体は、前述のタンパク質、ポリペプチド又はペプチドの相同体(例えば、オルソログ若しくはパラログ)であってもよい。本明細書に使用される「相同性」という用語は、一般に、同じか又は異なる分類群から、2つの巨大分子間、特に2つのタンパク質若しくはポリペプチドの間の構造的類似性を意味し、前述の類似性は共通の祖先によるものである。
本明細書が、タンパク質、ポリペプチド若しくはペプチドの断片及び/又は変異体を包含する場合、これは、「機能的な」、すなわち、生物活性を少なくとも部分的に保持するか又はタンパク質、ポリペプチド若しくはペプチドのそれぞれの機能性を意図した、変異体及び/又は断片を意味することが好ましい。例によるGDF‐8若しくはFGF‐2の機能的断片及び/又は変異体は、GDF‐8又はFGF‐2のそれぞれの生物活性を少なくとも部分的に保持することを要するが、これに限定されない。例えば、1以上の細胞の経路などに関与する1以上の同族受容体に結合する能力などの、GDF‐8又はFGF‐2の生物活性の1以上の態様を保持することができる。機能的断片及び/又は変異体は、対応するタンパク質、ポリペプチド若しくはペプチドと比較して、少なくとも約20%、例えば少なくとも30%、若しくは少なくとも約40%、若しくは少なくとも約50%、例えば少なくとも60%、より好ましくは少なくとも約70%、例えば少なくとも80%、更により好ましくは少なくとも約85%、更により好ましくは少なくとも約90%、及び最も好ましくは少なくとも約95%、又は更に約100%以上の意図された、生物活性又は機能性を保持できることが好ましい。特に、機能的断片又は変異体は、少なくともある程度、本方法又は使用におけるMSC細胞の骨形成分化を促進する能力を保持する。
増殖因子などのタンパク質、ポリペプチド又はペプチドは、その同族受容体に結合することによりその効果を発揮する場合、タンパク質、ポリペプチド又はペプチドの機能的断片及び/又は変異体は、タンパク質、ポリペプチド若しくはペプチドのそれぞれの親和性及び/又は特異性の、少なくとも約20%、例えば少なくとも30%、若しくは少なくとも約40%、若しくは少なくとも約50%、例えば少なくとも60%、より好ましくは少なくとも約70%、例えば少なくとも80%、更により好ましくは少なくとも約85%、更により好ましくは少なくとも約90%、及び最も好ましくは少なくとも約95%、又は更に約100%以上を保持することができる。上述の結合のパラメータは、それ自体公知のインビトロ又は細胞アッセイを用いて、当業者によって容易に決定することができる。
確立されたアッセイ法、例えば、インビトロ又は細胞アッセイ(例えば、細胞培養における細胞分裂促進活性の測定など)で、所定の増殖因子などの所定のタンパク質、ポリペ
プチド又はペプチドの活性を容易に測定することができる場合、タンパク質、ポリペプチド又はペプチドの機能的断片及び/又は変異体は、かかるアッセイで活性を示し、これは、タンパク質、ポリペプチド若しくはペプチドのそれぞれの活性の、少なくとも約20%、例えば少なくとも30%、若しくは少なくとも約40%、若しくは少なくとも約50%、例えば少なくとも60%、より好ましくは少なくとも約70%、例えば少なくとも80%、更により好ましくは少なくとも約85%、更により好ましくは少なくとも約90%、及び最も好ましくは少なくとも約95%、又は更に約100%以上の活性である。
プチド又はペプチドの活性を容易に測定することができる場合、タンパク質、ポリペプチド又はペプチドの機能的断片及び/又は変異体は、かかるアッセイで活性を示し、これは、タンパク質、ポリペプチド若しくはペプチドのそれぞれの活性の、少なくとも約20%、例えば少なくとも30%、若しくは少なくとも約40%、若しくは少なくとも約50%、例えば少なくとも60%、より好ましくは少なくとも約70%、例えば少なくとも80%、更により好ましくは少なくとも約85%、更により好ましくは少なくとも約90%、及び最も好ましくは少なくとも約95%、又は更に約100%以上の活性である。
増殖因子などのタンパク質、ポリペプチド又はペプチドの「活性」への言及は、一般に、例えば細胞、組織、器官若しくは生物体内のその生化学活性、酵素活性、シグナル伝達活性、相互作用活性、リガンド活性及び/又は構造活性うちのいずれか1以上の態様などであって、これらに限定されない、タンパク質、ポリペプチド又はペプチドの生物活性のうちのいずれか1以上の態様を包含し得る。例によるGDF‐8又はFGF‐2の活性への言及は、リガンドとしてのこれらの活性、すなわち、1以上の同族受容体への結合能、及び/又はシグナル伝達分子としてのこれらの活性、すなわち、1以上の細胞シグナル伝達経路に関与するこれらの能力などを意味し得るが、これらに限定されない。
また、GDF‐8及びFGF‐2を含むいずれかの増殖因子などのいずれかのタンパク質、ポリペプチド又はペプチドへの本明細書における言及は、その誘導体も包含し得る。タンパク質、ポリペプチド又はペプチドの「誘導体」という用語は、一般に、1以上のアミノ酸残基の化学変化、及び/又は1以上のアミノ酸残基における1以上の部分の追加、例えば、グリコシル化、リン酸化、アシル化、アセチル化、硫酸化、脂質化、アルキル化などによって誘導された、タンパク質、ポリペプチド又はペプチドを指す。通常、50%未満、例えば40%未満、好ましくは30%未満、例えば20%未満、より好ましくは15%未満、例えば、10%未満若しくは5%未満、例えば4%未満、3%、2%若しくは1%の、タンパク質、ポリペプチド又はペプチド中のアミノ酸が誘導され得る。タンパク質の誘導体は、1以上のタンパク質、ポリペプチド又はペプチドで構成されてもよく、そのうちの少なくとも1つは、少なくとも1つのアミノ酸残基において誘導されてもよい。本明細書が、タンパク質、ポリペプチド若しくはペプチドの誘導体を言及するか又は包含する場合、これは、機能的な誘導体を意味することが好ましい。
好適な実施形態において、増殖因子は組換えであり、すなわち、組換え核酸分子の発現を介して宿主生物体によって生産され、これは、宿主生物体(例えば、エシェリキア・コリ(E.coli)、サルモネラ・ティフィムリウム(S.tymphimurium)、セラチア・マルセッセンス(Serratia marcescens)、枯草菌(Bacillus subtilis)などの細菌;例えば、サッカロミセス・セレビシエ(S.cerevisiae)及びピキア・パストリス(Pichia pastoris)などの酵母
;とりわけ、シロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)及びタバコ(Nicotiana tobaccum)細胞などの培養植物細胞;哺乳動物及び昆虫細胞などの動物細胞;若しくは、植物若しくは動物などの多細胞生物体などであるが、これらに限定されない。)、又はこれらの祖先に導入され、増殖因子をコードする配列を含む。組換えにより発現した増殖因子の使用によって、病原体感染の危険性が低下する。
;とりわけ、シロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)及びタバコ(Nicotiana tobaccum)細胞などの培養植物細胞;哺乳動物及び昆虫細胞などの動物細胞;若しくは、植物若しくは動物などの多細胞生物体などであるが、これらに限定されない。)、又はこれらの祖先に導入され、増殖因子をコードする配列を含む。組換えにより発現した増殖因子の使用によって、病原体感染の危険性が低下する。
「血漿」という用語は、従来のとおりに定義される。血漿は、通常、抗凝固剤(例えば、ヘパリン、クエン酸塩、シュウ酸塩若しくはEDTA)を供するか又はこれと接触させた全血試料から得られる。次いで、血液試料の細胞成分は、通常、遠心分離による適切な方法によって、液体成分(血漿)から分離される。したがって、「血漿」という用語は、人体又は動物体の一部を形成しない組成物を指す。
「血清」という用語は、従来のとおりに定義される。血清は、通常、最初に試料中で凝固させ、その後、通常遠心分離による適切な方法によって、液体成分(血清)から、形成
された血塊及び血液試料の細胞成分を分離させることにより、全血試料から得ることができる。凝固は、不活性触媒、例えば、ガラスビーズ又は粉末によって促進することができる。または、血清は、抗凝固剤及びフィブリンを除去することによって、血漿から得ることができる。したがって、「血清」という用語は、人体又は動物体の一部を形成しない組成物を指す。
された血塊及び血液試料の細胞成分を分離させることにより、全血試料から得ることができる。凝固は、不活性触媒、例えば、ガラスビーズ又は粉末によって促進することができる。または、血清は、抗凝固剤及びフィブリンを除去することによって、血漿から得ることができる。したがって、「血清」という用語は、人体又は動物体の一部を形成しない組成物を指す。
単離された血漿又は血清は、本方法に直接使用することができる。また、これらは、(例えば、短期間、例えば約1〜2週間以内では、血漿若しくは血清のそれぞれの凝固点よりも高い温度であるが、周囲温度よりも低い温度(この温度は、通常、約4℃〜5℃である。)で、又は、長期間では、凍結保存により、通常、約−70℃〜約−80℃で)後で使用するために適切に保存することもできる。
単離された血漿又は血清は、特に補体を除去するために、当該技術分野において公知の熱不活性化をすることができる。本方法は、血漿又は血清の存在下で培養された細胞に対して自家である血清又は血漿を使用する場合、血漿又は血清を熱不活性化する必要はないと考えられる。血漿又は血清が、培養細胞に対して少なくとも部分的に同種である場合、血漿又は血清を熱不活性化することが有利であり得る。
必要に応じて、血漿又は血清は、好ましくは0.2 μm以下の細孔径を有する、従来
の微生物フィルタを使用して、保存前又は使用前に滅菌してもよい。
の微生物フィルタを使用して、保存前又は使用前に滅菌してもよい。
本発明の方法は、MSC、又は血漿若しくは血清と接触する他の細胞型に対して自家である血漿又は血清を使用することができる。血漿又は血清に対して「自家」という用語は、血漿又は血清が、MSC、又は血漿若しくは血清と接触する他の細胞型と同じ対象から得られることを意味する。本発明の方法は、MSC、又は血漿若しくは血清と接触する他の細胞型、すなわち、MSC又は他の細胞型が得られる対象以外の1以上の(プールされた)対象から得られたものに対して「同族」又は「同種」である血漿又は血清を更に使用することができる。また、本発明の方法は、上に定義した自家又は同族(同種)である血漿又は血清の混合物を使用してもよい。
血漿又は血清及びGDF‐8を含む培地で成体MSCを培養することを含む、インビトロ又はエクスビボにおいて、前述のMSCを、前骨芽細胞若しくは骨芽細胞、又は前骨芽細胞及び/又は骨芽細胞を含む細胞集団に分化させるための方法も提供される。実施例の節に示すように、血漿又は血清及びGDF‐8を含む培地でMSCを培養することを含む方法は、血漿又は血清並びにGDF‐8及びFGF‐2を含む培地で前述のMSCを培養することを含む本方法によって得られるような有利な効果を少なくとも部分的に奏する。
一実施形態において、本発明の方法は、(a)対象の生体試料から回収したMSCを含む細胞を基材表面に付着させることと、(b)血漿又は血清、GDF‐8及びFGF‐2を含む培地で付着細胞を培養することと、を含む。
本発明の方法のうちのいずれか1つは、場合により、対象の生体試料から回収したMSCを含む細胞から単核細胞を単離することを、単離された単核細胞を基材表面に付着させる前に、含んでいてもよい。単核細胞の単離は、従来の方法、例えば密度勾配遠心分離を用いて行うことができる。
特に接着細胞などの細胞の培養は、培地、一般に液体細胞培養培地の存在下で行われる。通常、培地は、当該技術分野において公知の基礎培地配合物を含む。多くの基礎培地配合物(例えば、米国培養菌保存施設(ATCC)、若しくはインビトロジェン(Invitrogen)社(カールスバード、カリフォルニア州)から入手可能)を使用して、本明細書の細胞
を培養することができ、この基礎培地配合物としては、インビトロジェン社又はケンブレックス(Cambrex)社(ニュージャージー)から入手可能な、イーグル最小必須培地(ME
M)、ダルベッコ変法イーグル培地(DMEM)、α変法最小必須培地(α‐MEM)、基礎培地エッセンシャル(Basal Medium Essential)(BME)、BGJb、F‐12栄養混合物(Ham)、イスコブ変法ダルベッコ培地(IMDM)、並びにこれらの改変物及び/又は組合せが挙げられるが、これらに限定されない。上述の基礎培地の組成は、一般に、当該技術分野において公知であり、これは、培養細胞に必要な培地及び/又は培地添加物の濃度を変更又は調整する当業者の技術の範囲内である。
を培養することができ、この基礎培地配合物としては、インビトロジェン社又はケンブレックス(Cambrex)社(ニュージャージー)から入手可能な、イーグル最小必須培地(ME
M)、ダルベッコ変法イーグル培地(DMEM)、α変法最小必須培地(α‐MEM)、基礎培地エッセンシャル(Basal Medium Essential)(BME)、BGJb、F‐12栄養混合物(Ham)、イスコブ変法ダルベッコ培地(IMDM)、並びにこれらの改変物及び/又は組合せが挙げられるが、これらに限定されない。上述の基礎培地の組成は、一般に、当該技術分野において公知であり、これは、培養細胞に必要な培地及び/又は培地添加物の濃度を変更又は調整する当業者の技術の範囲内である。
細胞は、前述の培地の存在下で、本明細書に意図される基材表面に付着させることができる。
かかる基礎培地配合物は、それ自体公知の哺乳動物細胞の発生に必要な成分を含有する。例示によるこれらの原料としては、無機塩類(具体的には、Na、K、Mg、Ca、Cl、P、及び恐らくCu、Fe、Se及びZnを含有する塩類)、生理緩衝液(例えば、HEPES、重炭酸塩)、ヌクレオチド、ヌクレオシド及び/又は核酸塩基、リボース、デオキシリボース、アミノ酸、ビタミン、抗酸化剤(例えば、グルタチオン)、並びに炭素源(例えば、グルコース、ピルビン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム)などを挙げることができるが、これらに限定されない。
培養での使用において、基礎培地は、1以上の更なる成分を補充されることができる。例えば、付加的な添加剤を使用し、最適増殖及び成長に必要な微量元素及び物質を細胞に補充することができる。さらに、抗酸化添加剤、例えばβ‐メルカプトエタノールを加えてもよい。多くの基礎培地が既にアミノ酸を含有しているが、一部のアミノ酸、例えば、溶液中で安定していないことが知られている、L‐グルタミンを後で添加してもよい。培地に、通常、ペニシリンとストレプトマイシンの混合物、及び/又は、例示されるが、これらに限定されない他の化合物、アンホテリシン、アンピシリン、ゲンタマイシン、ブレオマイシン、ヒグロマイシン、カナマイシン、マイトマイシン、ミコフェノール酸、ナリジクス酸、ネオマイシン、ナイスタチン、パロモマイシン、ポリミクシン、プロマイシン、リファンピシン、スペクチノマイシン、テトラサイクリン、チロシン及びゼオシンなどの抗生物質及び/又は抗真菌化合物を更に補充してもよい。
また、脂質及び脂質担体も、細胞培養培地に添加するのに使用することができる。かかる脂質及び脂質担体としては、とりわけ、シクロデキストリン、コレステロール、アルブミンに共役したリノール酸、アルブミンに共役したリノール酸及びオレイン酸、非共役型リノール酸、アルブミンに共役したリノール‐オレイン‐アラキドン酸、アルブミンに共役されていない及び共役したオレイン酸が挙げることができるが、これらに限定されない。アルブミンは、同様に、脂肪酸を含まない配合物に使用することができる。
また、血漿又は血清は、約0.5%〜約30%、好ましくは約1%〜約15%の割合(血漿若しくは血清の体積/培地の体積)で、前述の培地に含まれていてもよい。本発明の方法は、比較的少量の、例えば、約5〜10体積%以下、例えば、約1、約2、約3若しくは約4体積%で十分に行うことができ、有利には、コストを低減し、又はMSCを培養するために得る必要がある血漿若しくは血清の量を減少させる。
本発明の一実施形態において、細胞(特に、(a)の細胞)は、5×102〜5×107細胞/cm2、好ましくは5×103〜5×105細胞/cm2で、付着のために平板培養することができる。
培養容器は、細胞付着をすることができるように、プラスチック表面を設けてもよい。
この表面は、ガラス表面であってもよいし、又は細胞の付着及び増殖を導くのに適切な材料、例えば、マトリゲル(登録商標)、ラミニン若しくはコラーゲンでコーティングすることができる。
この表面は、ガラス表面であってもよいし、又は細胞の付着及び増殖を導くのに適切な材料、例えば、マトリゲル(登録商標)、ラミニン若しくはコラーゲンでコーティングすることができる。
細胞は、約10〜約18日間、(b)に定義する培地で培養することができる。例えば、細胞は、約10〜約16日間、通常、約12〜14日間、段階(b)又は段階(a)及び(b)において培養することができる。この他に、細胞は、段階(b)又は段階(a)及び(b)において、細胞の集密状態が約60%以上又は約80%以上又は約90%以上又は更に最大100%に達するまで、培養することができる。
実施形態において、段階(b)の後、方法は、このように得られた細胞又は細胞集団を回収することを含み得る。
別の実施形態において、段階(b)の後、得られた細胞は、1回、2回、3回、4回以上など1回以上継代することができ、好ましくは、細胞は、1回、2回又は3回継代することができ、より好ましくは、1回又は2回継代することができ、更により好ましくは、細胞を1回継代することができる。継代数とは、細胞集団を培養容器から取り出し、二次培養、すなわち、継代を経験した回数をいう。例えば、継代には、通常、2価のイオンキレート剤(例えば、EDTA若しくはEGTA)及び/又はトリプシン若しくは適切なプロテアーゼを使用した細胞の分離、分離した細胞の再懸濁、並びに、所望の細胞密度で、同じか若しくは新しい培養容器中で細胞を再び平板培養することが含まれ得る。
好適な実施形態において、段階(b)に続いて、方法には、特に1回継代し、段階(b)に定義する培地で(b)の細胞又は細胞集団を更に培養するという段階(c)が更に含まれる。例えば、かかる段階(c)後、細胞又は細胞集団を回収することができる。
継代段階(c)において、細胞は、5×101〜5×106細胞/cm2、好ましくは5
×102〜5×104細胞/cm2、より一般には約5×103細胞/cm2で、更に平板培
養されることが好ましい。
×102〜5×104細胞/cm2、より一般には約5×103細胞/cm2で、更に平板培
養されることが好ましい。
通常、細胞は、約3〜約18日間の期間、段階(c)で更に培養される。この期間によって、細胞が十分に増殖することができる。
更なる実施形態において、本発明の方法は、(a)対象の生体試料から回収したMSCを含む細胞を基材表面に付着させることと、(b’)血漿又は血清及びFGF‐2を含む培地で付着細胞を培養することと、(b’’)血漿又は血清、GDF‐8及びFGF‐2を含む培地で付着細胞を更に培養することと、を含む。
細胞は、約10〜約24日間、段階(b’)又は段階(a)及び(b’)に定義する培地で培養することができる。例えば、細胞は、約10〜約22日間、通常、約14〜21日間、段階(b’)又は段階(a)及び(b’)において培養することができる。この他に、細胞は、段階(b’)又は段階(a)及び(b’)において、細胞の集密状態が約60%以上又は約80%以上又は約90%以上又は更に最大100%に達するまで、培養することができる。
細胞は、約1〜約10日間、(b’’)に定義する培地で培養することができる。例えば、細胞は、約2〜約8日間、通常、約4〜6日間、段階(b’’)において培養することができる。この他に、細胞は、段階(b’’)において、細胞の集密状態が約60%以上又は約80%以上又は約90%以上又は更に最大100%に達するまで、培養することができる。
別の実施形態において、本発明の方法には、段階(b’)と段階(b’’)の間に、細胞を継代し、細胞を基材表面に付着させるという段階(c’)が更に含まれる。段階(c’)において、細胞は、1回、2回又は3回などの1回以上継代することができ、好ましくは、細胞は、1回又は2回継代することができる。
継代段階(c’)において、細胞は、5×101〜5×106細胞/cm2、好ましくは
5×102〜5×104細胞/cm2、より一般には約5×103細胞/cm2で、更に平板
培養されることが好ましい。
5×102〜5×104細胞/cm2、より一般には約5×103細胞/cm2で、更に平板
培養されることが好ましい。
別の実施形態において、段階(b’’)の後、本発明に係る方法は、このように得られた細胞又は細胞集団を回収することを含み得る。
本発明の方法は、特に、高い増殖率及び少ないMHCクラスII細胞表面受容体複合体の発現といった優れた特性を有する、前骨芽細胞若しくは骨芽細胞、又は前骨芽細胞及び/又は骨芽細胞を含む細胞集団を生産し、これらの細胞及び細胞集団は、埋込みなどのための予防的処置又は治療的処置に適している。
したがって、更なる態様において、本発明は、上述の本発明の方法を用いて得ることができるか又は直接得られる、前骨芽細胞若しくは骨芽細胞、又は前骨芽細胞及び/又は骨芽細胞を含む細胞集団に関する。
さらに、上述の本発明の方法を用いて得ることができるか又は直接得られる、前骨芽細胞若しくは骨芽細胞、又は前骨芽細胞及び/又は骨芽細胞を含む細胞集団を含む、単離された細胞集団が提供される。
本発明の原理を具体化する、上で定義した前骨芽細胞若しくは骨芽細胞、又は前骨芽細胞及び/又は骨芽細胞を含む細胞集団は、特に、高い増殖率及び少ないMHCクラスII細胞表面受容体複合体の発現といった優れた特性を示し、これらの細胞及び細胞集団は、予防的移植又は治療的移植に適している。
したがって、本明細書に教示する、前骨芽細胞若しくは骨芽細胞、又は前骨芽細胞及び/又は骨芽細胞を含む細胞集団は、筋骨格系疾患(例えば、本明細書の他の箇所で定義されるもの)に罹患した対象に自家又は同種投与に使用することができる。好ましくは、前骨芽細胞若しくは骨芽細胞、又は前骨芽細胞及び/又は骨芽細胞を含む細胞集団は、筋骨格系疾患を治療するために、ヒト対象に投与することができる。
本明細書に使用される「治療を必要とする対象」などの語句には、所定の症状、特に筋骨格系疾患から利益を得る対象が含まれる。かかる対象には、前述の症状と診断された対象、前述の症状に罹患又は発症しやすい対象、及び/又は前述の症状が予防されるべきである対象が含まれ得るが、これらに限定されない。
「治療する」又は「治療」という用語は、既に発症した筋骨格系疾患の治療などの既に発症した疾患又は症状の治療的処置と、予防的措置又は予防措置の両方を包含し、その目的は、望ましくない疾患の発生の可能性を予防するか又は減少させること、例えば、筋骨格系疾患の発症、発生及び進行を防止することである。有益な又は所望の臨床結果としては、1以上の症状又は1以上の生物学的マーカー、疾患の減少の程度、疾患の安定した(すなわち、悪化しない)状態、疾患進行の遅延又は鈍化、病態の寛解又は緩和などが挙げることができるが、これらに限定されない。また、「治療」とは、治療を受けない場合に予想される生存期間と比較して、生存期間の延長も意味し得る。
「予防有効量」という用語は、研究者、獣医、医師又は他の臨床医によって要求される、対象における疾患の発症を阻害するか若しくは遅延させる活性化合物又は薬剤の量を指す。本明細書に使用される「治療有効量」という用語は、研究者、獣医師、医師又は他の臨床医によって要求される、対象における生物学的応答若しくは医学的応答を誘発する活性化合物又は薬剤の量を指し、この用語には、とりわけ、治療される病態又は症状の緩和が含まれ得る。本前骨芽細胞若しくは骨芽細胞、又は前骨芽細胞及び/又は骨芽細胞を含む細胞集団の治療的及び予防的有効量を決定する方法は、当該技術分野において公知である。
本発明の一実施形態において、前骨芽細胞若しくは骨芽細胞、又は前骨芽細胞及び/又は骨芽細胞を含む細胞集団、又は本明細書に想定される他の細胞型は、前骨芽細胞若しくは骨芽細胞、又は前骨芽細胞及び/又は骨芽細胞を含む細胞集団、又は本明細書に想定される他の細胞型が導入される対象のMSCから分化させることができる(すなわち、自己細胞)。とりわけ、本細胞の少ないMHCクラスII細胞表面受容体複合体の発現により、本明細書に利用可能な別の実施形態によれば、前骨芽細胞若しくは骨芽細胞、又は前骨芽細胞及び/又は骨芽細胞を含む細胞集団、又は本明細書に想定される他の細胞型は、前骨芽細胞若しくは骨芽細胞、又は前骨芽細胞及び/又は骨芽細胞を含む細胞集団、又は本明細書に想定される他の細胞型が導入される他の1以上の対象のMSCから分化させることができる(すなわち、同種異系細胞)。
本発明の更なる態様によれば、本明細書に定義する前骨芽細胞若しくは骨芽細胞、又は前骨芽細胞及び/又は骨芽細胞を含む細胞集団は、医薬組成物に製剤することができ、医薬組成物として投与することができる。
本発明の更なる態様によれば、GDF‐8は、医薬組成物に製剤することができ、医薬組成物として投与することができる。また、その免疫原性がGDF‐8のインビボ投与によって低減される細胞が、対象に投与される場合、かかる細胞は、医薬組成物に適切に製剤することができ、医薬組成物として投与することができる。特定の実施形態において、同じ医薬組成物は、GDF‐8と細胞をともに含み得るが、他の実施形態において、GDF‐8及び細胞は、別々の医薬組成物中に含まれ得る。さらに、その拒絶の危険性がGDF‐8のインビボ投与によって低減されるいずれかの物質を医薬組成物に適切に製剤し、医薬組成物として投与することができる。特定の実施形態において、同じ医薬組成物は、GDF‐8と物質をともに含み得るが、他の実施形態において、GDF‐8及び物質は、別々の医薬組成物中に含まれ得る。
医薬組成物は、通常、1以上の活性成分(例えば、GDF‐8、細胞及び/又は物質)と、1以上の医薬として許容し得る担体/賦形剤とを含む。例えば、医薬組成物は、通常、本明細書に活性成分として開示する、前骨芽細胞若しくは骨芽細胞、又は前骨芽細胞及び/又は骨芽細胞を含む細胞集団と、1以上の医薬として許容し得る担体/賦形剤とを含んでいてもよい。本明細書に使用される「担体」又は「賦形剤」としては、いずれか及びすべての溶媒、希釈剤、緩衝剤(例えば、中性緩衝食塩水若しくはリン酸緩衝生理食塩水など)、可溶化剤、コロイド、分散媒、ビヒクル、充填剤、キレート剤(例えば、EDTA若しくはグルタチオン)、アミノ酸(例えば、グリシンなど)、タンパク質、崩壊剤、結合剤、潤滑剤、湿潤剤、乳化剤、甘味剤、着色剤、香味剤、アロマタイザー(aromatiser)、増粘剤、デポー効果を奏する薬剤、コーティング剤、抗真菌剤、保存剤、安定剤、抗酸化剤、張度調整剤、吸収遅延剤などが挙げられる。医薬活性物質のかかる媒体及び薬剤の使用は、当該技術分野において周知である。かかる物質は非毒性であり、細胞の活性を妨げないことを必要とする。
担体又は他の物質の正確な性質は、投与経路によって異なる。例えば、組成物は、非経口的に許容し得る水溶液の形態であってもよく、この水溶液は、発熱物質を含まず、適切なpH、等張性及び安定性を有する。医薬製剤の一般的な原理については、読者は、Handbook of Pharmaceutical Excipients 6th Edition 2009, eds. Rowe et al;Remington's
Pharmaceutical Sciences, 18th ed., Mack Publishing Co., Easton, PA (1990);Cell
Therapy: Stem Cell Transplantation, Gene Therapy, and Cellular Immunotherapy, by G. Morstyn & W. Sheridan eds., Cambridge University Press, 1996;及びHematopoietic Stem Cell Therapy, E. D. Ball, J. Lister & P. Law, Churchill Livingstone, 2000を参照する。
Pharmaceutical Sciences, 18th ed., Mack Publishing Co., Easton, PA (1990);Cell
Therapy: Stem Cell Transplantation, Gene Therapy, and Cellular Immunotherapy, by G. Morstyn & W. Sheridan eds., Cambridge University Press, 1996;及びHematopoietic Stem Cell Therapy, E. D. Ball, J. Lister & P. Law, Churchill Livingstone, 2000を参照する。
かかる医薬組成物は、細胞の生存率を保証する成分を更に含有していてもよい。例えば、組成物は、所望のpH、より一般には中性付近のpHを達成する適切な緩衝系(例えば、リン酸又は炭酸緩衝系)を含んでいてもよいし、浸透圧ストレスを防ぐ細胞の等張条件を保証するのに十分な塩を含んでいてもよい。例えば、これらの目的に適した溶液は、当該技術分野において公知のリン酸緩衝生理食塩水(PBS)、塩化ナトリウム溶液、リンガー液又は乳酸加リンガー液であってもよい。さらに、組成物は、細胞の生存率を増加させ得る担体タンパク質、例えばアルブミンを含んでいてもよい。
本発明に係る医薬組成物は、骨形成(骨がそれ自体のみにより形成する。)、骨誘導及び/又は骨伝導特性を有する成分も更に含み得る。
「骨誘導」という用語は、幹細胞、MSCなどの未成熟細胞を動員し、これらの細胞を刺激して前骨芽細胞及び成熟骨芽細胞に分化させ、これによって骨組織を形成する、ペプチド増殖因子などの成分の能力を指す。医薬組成物は、骨誘導性タンパク質又はペプチドなどの、骨誘導特性を有する成分を更に含み、例えば、BMP‐2、BMP‐7若しくはBMP‐4などの骨形成因子;コラーゲン、ヒアルロン酸若しくはその誘導体、オステオネクチン、フィブリノーゲン若しくはオステオカルシンなどのヒドロゲル若しくはバイオポリマーを更に含み得る。好ましくは、医薬組成物は、ヒアルロン酸若しくはその誘導体、コラーゲン又はフィブリノーゲンを含み得る。
「骨伝導」という用語は、骨細胞が付着、移動、増殖及び新しい骨を生成することができる足場として機能する成分の能力を指す。医薬組成物は、骨伝導特性を有する成分を更に含み、例えば、リン酸三カルシウム、ハイドロキシアパタイト、ハイドロキシアパタイト/リン酸三カルシウム粒子の組合せ(HA/TCP)、ゼラチン、ポリ乳酸、ポリ乳酸グリコール酸、ヒアルロン酸、キトサン、ポリ‐L‐リジン若しくはコラーゲンなどであるが、これらに限定されない、骨伝導性足場又はマトリックス又は表面を更に含み得る。
上述した本発明に係る医薬組成物は、骨の創傷及び欠損の修復に有用な成分を含み得る。医薬組成物は、骨伝導特性を有する足場又はマトリックスを含み得る。前骨芽細胞若しくは骨芽細胞、又は前骨芽細胞及び/又は骨芽細胞を含む細胞集団は、脱灰骨基質(DBM)又は他の基質と組み合わせ、複合体を骨形成並びに骨伝導及び骨誘導させる。自己骨髄細胞と同種DBMを使用する同様の方法によって、良好な結果が得られている(Connolly et al. 1995. Clin Orthop 313: 8-18)。
本発明に係る医薬組成物は、BMP‐2、BMP‐7若しくはBMP‐4などの骨形成タンパク質、又はいずれかの他の増殖因子などの相補的な生物活性因子又は骨誘導性タンパク質を更に含むか又は当該相補的な生物活性因子又は骨誘導性タンパク質と同時投与することができる。他の潜在能を伴う成分としては、骨再生を支援するのに適したカルシウム又はリン酸塩といった無機源が挙げられる(国際公開公報第00/07639号)。所望に応じて、細胞調製物を担体マトリックス又は材料上で投与し、組織再生を改善するこ
とができる。例えば、担体材料は、ヒドロゲル、又はゼラチン、コラーゲン、ヒアルロン酸若しくはその誘導体、オステオネクチン、フィブリノーゲン若しくはオステオカルシンなどのバイオポリマーであってもよい。生体材料は、標準法(例えば、Mikos et al., Biomaterials 14:323, 1993;Mikos et al., Polymer 35:1068, 1994;Cook et al., J. Biomed. Mater. Res. 35:513, 1997)に従って合成することができる。
とができる。例えば、担体材料は、ヒドロゲル、又はゼラチン、コラーゲン、ヒアルロン酸若しくはその誘導体、オステオネクチン、フィブリノーゲン若しくはオステオカルシンなどのバイオポリマーであってもよい。生体材料は、標準法(例えば、Mikos et al., Biomaterials 14:323, 1993;Mikos et al., Polymer 35:1068, 1994;Cook et al., J. Biomed. Mater. Res. 35:513, 1997)に従って合成することができる。
疾患の種類及び重症度に応じて、GDF‐8の一般的な1日の用量は、約1 ng/k
g体重〜100 mg/kg体重以上の範囲であり得るが、これに限定されない。数日間
以上にわたる連続投与では、症状に応じて、病徴の所望の抑制が生じるまで、治療は持続される。GDF‐8の好ましい用量は、約10 ng/kg体重〜約10 mg/kg体重の範囲であり得る。したがって、約10 ng/kg、100 ng/kg、500 ng
/kg、1 mg/kg若しくは10 mg/kg(又はそのいずれかの組合せ)の1以上の用量を患者に投与することができる。かかる用量を、断続的に、例えば毎週又は2、3週間投与することができる。
g体重〜100 mg/kg体重以上の範囲であり得るが、これに限定されない。数日間
以上にわたる連続投与では、症状に応じて、病徴の所望の抑制が生じるまで、治療は持続される。GDF‐8の好ましい用量は、約10 ng/kg体重〜約10 mg/kg体重の範囲であり得る。したがって、約10 ng/kg、100 ng/kg、500 ng
/kg、1 mg/kg若しくは10 mg/kg(又はそのいずれかの組合せ)の1以上の用量を患者に投与することができる。かかる用量を、断続的に、例えば毎週又は2、3週間投与することができる。
例えば、投与される細胞組成物の一般的な用量は、注入当たり約0.05×106細胞
〜5×109細胞の範囲とすることができるが、これに限定されない。例えば、投与量は
、注入当たり約0.5×106細胞〜1×109細胞の範囲とすることができる。投与量は、注入当たり約4×106細胞〜250×106細胞の範囲であることが好ましい。
〜5×109細胞の範囲とすることができるが、これに限定されない。例えば、投与量は
、注入当たり約0.5×106細胞〜1×109細胞の範囲とすることができる。投与量は、注入当たり約4×106細胞〜250×106細胞の範囲であることが好ましい。
本明細書に使用される「インプラント」という用語は、失った生物構造体を代用し、損傷した生物構造体を支持し若しくは補完するか、又は既存の生物構造体を強化するように製造された医療機器を広く意味する。本明細書に意図されるインプラントは、細胞及び/又は組織などの生物成分を含み得る。例示的な医療用インプラントとしては、例えば、ピン、ロッド、ねじ、プレート、並びに骨の手術及び骨の治癒に使用される他の構造体が挙げられる。
「移植する」という用語は、例えば、器官、組織又は細胞を含む移植された生体組織を広く意味する。
代替的に又はさらに、MSC細胞、又は本件の前骨芽細胞若しくは骨芽細胞、又は前骨芽細胞及び/又は骨芽細胞を含む細胞集団、又は本明細書に想定される他の細胞型は、対象への投与前に、関心対象の核酸に、安定的に又は一時的に形質転換することができる。関心対象の核酸配列としては、骨芽細胞集団の増殖、分化及び/又は石灰化を更に高める遺伝子産物をコードするものが挙げられるが、これらに限定されない。例えば、BMP‐2の発現系は、非治癒骨折又は骨粗鬆症を治療する目的で安定的に又は一時的にMSCに導入することができる。MSC及び前骨芽細胞若しくは骨芽細胞、又は前骨芽細胞及び/又は骨芽細胞を含む細胞集団の形質転換方法は、当業者に公知である。
本発明の細胞又は医薬として活性のある他の成分と、上述した1以上の付加的な成分並びに上述した1以上の医薬賦形剤を混合することによる前述の医薬組成物の製造方法も提供される。
本明細書に教示する、前骨芽細胞若しくは骨芽細胞、又は前骨芽細胞及び/又は骨芽細胞を含む細胞集団、又は他の細胞型、又は、例えば対象の全身に又は局所的に、例えば対象の筋骨格病変の部位に、例えば注入によって投与する、本明細書に定義する医薬組成物を投与するための外科用器具又は機器を含み、さらに、本明細書に教示する、前骨芽細胞若しくは骨芽細胞、又は前骨芽細胞及び/又は骨芽細胞を含む細胞集団、又は他の細胞型、又は本明細書に定義する医薬組成物を含む、配置又はキットの部品も開示される。
例えば、かかる配置又は部品のキットは、本方法によって得ることが可能な前骨芽細胞若しくは骨芽細胞、又は前骨芽細胞及び/又は骨芽細胞を含む細胞集団、又は他の細胞型を備えたバイアル、又は本明細書に意図される、前骨芽細胞若しくは骨芽細胞、又は前骨芽細胞及び/又は骨芽細胞を含む細胞集団、又は他の細胞型を含むバイアル;前述の前骨芽細胞若しくは骨芽細胞、又は前骨芽細胞及び/又は骨芽細胞を含む細胞集団、又は他の細胞型を対象に送達する機器であって、この機器が、前述の前骨芽細胞若しくは骨芽細胞、又は前骨芽細胞及び/又は骨芽細胞を含む細胞集団、又は他の細胞型を格納するリザーバ手段と、前述の前骨芽細胞若しくは骨芽細胞、又は前骨芽細胞及び/又は骨芽細胞を含む細胞集団、又は他の細胞型を分注する、リザーバ手段の長手方向軸に沿って移動可能なピストン手段と、前述の前骨芽細胞若しくは骨芽細胞、又は前骨芽細胞及び/又は骨芽細胞を含む細胞集団、又は他の細胞型を対象に送達する、前述のリザーバ手段に取り付けられた中空針と、を有する機器を備え得るが、これらに限定されない。
前骨芽細胞若しくは骨芽細胞、又は前骨芽細胞及び/又は骨芽細胞を含む細胞集団、又は他の細胞型は、意図された組織部位に移植されるか又は移動し、機能的な欠損領域を再構成するか又は再生することができるように、投与することができる。組成物の投与は、修復される筋骨格部位によって異なる。例えば、骨形成は、組織を再構築するか若しくは分裂に挿入する外科的処置、又は人工股関節置換術などの補綴機器との一致を容易にすることができる。他の状況において、侵襲的な手術が必要でなく、組成物は、誘導可能な内視鏡を使用して(例えば、脊柱の修復のために)注入によって投与することができる。
実施形態において、上に定義した医薬細胞調製物は、液体又は粘性組成物の形態で投与することができる。実施形態において、かかるもの含む細胞又は医薬組成物は、全身、局所的に又は病変の部位において投与することができる。
別の実施形態において、細胞又は細胞集団は、適切な基材に移し、及び/又は適切な基材上で培養し、インプラントが提供される。細胞を適用し培養することが可能な基材は、チタン、コバルト/クロム合金又はステンレス鋼などの金属、リン酸カルシウムなどの生物活性表面、ポリエチレンなどのポリマー表面などとすることができる。あまり好ましくないが、ガラスセラミックスなどのシリカ質材料も基材として使用することができる。チタンなどの金属、及びリン酸カルシウムが最も好ましいが、リン酸カルシウムは、基材の必須成分ではない。基材は、多孔性又は非多孔性であってもよい。
例えば、増殖しているか、又は培養皿で分化された細胞は、必要に応じて、本発明の液体栄養培地で固体支持体をインキュベーションすることにより、分化過程を増加させ及び/又は継続させるために、三次元固体支持体上に移すことができる。細胞は、例えば、前述の細胞を含有する液体懸濁液に前述の支持体を含浸させることによって、三次元固体支持体上に移すことができる。このように得られた含浸支持体は、ヒト対象に埋め込むことができる。また、かかる含浸支持体も、最終的に埋め込まれる前に、液体培養培地中に浸漬することによって、再培養することができる。
三次元固体支持体は、ヒトに埋め込むことができるように、生体適合性である必要がある。三次元固体支持体は、円筒状、球状、平状又は任意の形状の一部といった、いずれかの適切な形状とすることができる。生体適合性の三次元固体支持体に適した材料は、特に、炭酸カルシウム、特にアラゴナイト、具体的には珊瑚骨格の形態、アルミナ、ジルコニア、リン酸三カルシウムをベースとする多孔質セラミックス、及び/又は、ハイドロキシアパタイト、炭酸カルシウムからハイドロキシアパタイトに変換可能な水熱交換によって得られる模造珊瑚骨格、若しくはアパタイト‐珪灰石ガラスセラミックス、バイオガラス(商標)ガラスなどの生体活性ガラスセラミックスから製造することができる。
本発明を、その特定の実施形態に関連して説明してきたが、多くの代替、改変及び変形が、前述の説明に照らし、当業者に明らかであることは明確である。したがって、次に示す添付の特許請求の範囲の趣旨及び広い範囲内にすべての代替、改変及び変形を包含するものとする。
上述の態様及び実施形態は、次に示す非限定的な実施例によって更に支持される。
実施例1:対象の細胞の培養
骨髄をヒトの健全なドナーの腸骨稜から採取した。ヘパリン処理骨髄を、密度勾配溶液(Ficoll(商標)プレートプレミアム、GEヘルスケア(GE Healthcare)社製)中で分留
に供した。密度勾配溶液によって、単核細胞(MNC)を精製した。その後、MNCを、5×103〜5×105細胞/cm2の密度で平板培養した。細胞を、血清及びFGF‐2
の存在下で、培養培地で培養した。一次培養物を培養して10〜18日間維持し、第1日目と5日目の間で完全に培地を交換し、その後、規則的に交換した。一次培養時に、非接着造血細胞を、培地交換を介して取り出し、間葉由来細胞は、線維芽細胞様の形態を得た。一次培養後、間葉由来細胞をトリプシン処理によって採取し、二次培養のために再び平板培養した。二次培養を3日間〜18日間行った。
骨髄をヒトの健全なドナーの腸骨稜から採取した。ヘパリン処理骨髄を、密度勾配溶液(Ficoll(商標)プレートプレミアム、GEヘルスケア(GE Healthcare)社製)中で分留
に供した。密度勾配溶液によって、単核細胞(MNC)を精製した。その後、MNCを、5×103〜5×105細胞/cm2の密度で平板培養した。細胞を、血清及びFGF‐2
の存在下で、培養培地で培養した。一次培養物を培養して10〜18日間維持し、第1日目と5日目の間で完全に培地を交換し、その後、規則的に交換した。一次培養時に、非接着造血細胞を、培地交換を介して取り出し、間葉由来細胞は、線維芽細胞様の形態を得た。一次培養後、間葉由来細胞をトリプシン処理によって採取し、二次培養のために再び平板培養した。二次培養を3日間〜18日間行った。
実施例2:血清、GDF‐8及びFGF‐2を含む培地における一次培養からの細胞の培養
Ficollの後、実施例1に説明したように、MNC細胞をGDF‐8(組換えヒトミオスタチン、ペプロテック(Peprotech)社製)の存在下又はGDF‐8のない状態(対
照)で一次培養中に培養した。集密状態になったら、一次培養の細胞を継代し、種々の密度で二次培養のために再び平板培養し、GDF‐8の存在下(GDF‐8)又はGDF‐8のない状態(対照)で培養した。用いたGDF‐8の濃度は、1〜100 ng/ml
であった。
Ficollの後、実施例1に説明したように、MNC細胞をGDF‐8(組換えヒトミオスタチン、ペプロテック(Peprotech)社製)の存在下又はGDF‐8のない状態(対
照)で一次培養中に培養した。集密状態になったら、一次培養の細胞を継代し、種々の密度で二次培養のために再び平板培養し、GDF‐8の存在下(GDF‐8)又はGDF‐8のない状態(対照)で培養した。用いたGDF‐8の濃度は、1〜100 ng/ml
であった。
培養終了時に、細胞の、増殖、表現型(FACS)、タンパク質分泌(IL6、VEGF、デコリン、オステオプロテゲリン)、石灰化能及びALP酵素活性について特性評価した。
培養物の収率に対する影響
血清、FGF‐2及びGDF‐8を含む培地における一次培養細胞の培養の細胞増殖に対する影響について評価するために、一次培養及び二次培養の培養物の全収率を、GDF‐8の存在下(GDF‐8)又はGDF‐8のない状態(対照)で培養した細胞について決定した。
血清、FGF‐2及びGDF‐8を含む培地における一次培養細胞の培養の細胞増殖に対する影響について評価するために、一次培養及び二次培養の培養物の全収率を、GDF‐8の存在下(GDF‐8)又はGDF‐8のない状態(対照)で培養した細胞について決定した。
培養物の収率を、平板培養した細胞の数で割った培養又は増殖因子処理終了時に回収した細胞の数として決定した。細胞生存率を、トリパンブルー色素排除試験法によって評価し、細胞数を、ビルケルチャンバー(Burker chamber)内で細胞懸濁液を計数することによって測定した。
一次培養物及び二次培養物の収率はそれぞれ、一次培養及び二次細胞培養時の細胞増殖を表す。
平均データを表1及び図1に示す。培養物の収率は、血清、FGF‐2及びGDF‐8を含む培地における細胞の培養が、GDF‐8を含まない培地における細胞の培養と比較して、細胞増殖を増加させることを示した(表1、図1)。
FACSによるHLA‐DR及びALPの発現
細胞を特性評価するために、細胞の表現型を、細胞の分離後に、FACS分析を用いて決定した。測定したマーカーは、CD45(造血マーカー)、CD105(間葉系マーカー)、ALP(骨形成マーカー)及びHLA‐DR(免疫原性マーカー)であった。
細胞を特性評価するために、細胞の表現型を、細胞の分離後に、FACS分析を用いて決定した。測定したマーカーは、CD45(造血マーカー)、CD105(間葉系マーカー)、ALP(骨形成マーカー)及びHLA‐DR(免疫原性マーカー)であった。
細胞表現型を、フルオレセインイソチオシアネート(FITC)、フィコエリスリン(PE)又はアロフィコシアニン(APC)と結合したCD45、CD105、ALP及びHLA‐DRに対する抗体を使用し、FACS分析によって決定した。なお、抗CD45、抗CD105、抗HLA‐DRは、BDバイオサイエンス(BD Biosciences)社から、抗ALPは、R&Dシステムズ(R&D Systems)社から入手した。細胞を、BD FACS C
anto IIフローサイトメーター(ベクトン・ディキンソン(Becton Dickinson)社製
)で分析した。マーカーの発現を、割合として、すなわち、マーカーを発現する細胞の数を、FACSによって記録された細胞の総数で割って求めた。
anto IIフローサイトメーター(ベクトン・ディキンソン(Becton Dickinson)社製
)で分析した。マーカーの発現を、割合として、すなわち、マーカーを発現する細胞の数を、FACSによって記録された細胞の総数で割って求めた。
平均データを表2、図2及び3に示す。データは、GDF‐8の存在下での細胞の培養が、対照と比較して、HLA‐DRの発現を減少させることを示した(表2及び図2)。さらに、結果は、GDF‐8の存在下での細胞の培養が、TGF‐β1の存在下での細胞の培養とは異なり、高いレベルのALP発現を維持することを示した(表2及び図3)。
結果はまた、GDF‐8の存在下で培養した細胞が、GDF‐8のない状態で培養した対照の細胞と比較して、造血マーカーCD45(表2)、間葉系マーカーCD105(表2)、及び他の免疫原性マーカーCD28/CD80/CD83/CD86(結果は示さない。)と同様の発現を維持することも実証した。
上清中のマーカーの分泌
骨芽細胞の関与及び骨修復に関与する細胞の動員能を評価するために、タンパク質分泌を試験した。タンパク質分泌をELISAによって試験した。具体的には、培養後、培養
上清を回収し、IL6及びVEGF(細胞動員)、並びにデコリン及びオステオプロテゲリン(骨基質タンパク質及び骨因子)の生産を評価した。
骨芽細胞の関与及び骨修復に関与する細胞の動員能を評価するために、タンパク質分泌を試験した。タンパク質分泌をELISAによって試験した。具体的には、培養後、培養
上清を回収し、IL6及びVEGF(細胞動員)、並びにデコリン及びオステオプロテゲリン(骨基質タンパク質及び骨因子)の生産を評価した。
IL6、VEGF、デコリン及びオステオプロテゲリンの分泌を、それぞれの培地交換で回収した培養上清で評価した。アッセイを、メーカーの説明書(R&Dシステムズ社製ヒトIL6 ELISAキット#DY206、R&Dシステムズ社製ヒトVEGF ELISAキット#DY293b、R&Dシステムズ社製ヒトデコリンELISAキット#DY143、R&Dシステムズ社製ヒトオステオプロテゲリンELISAキット#DY805)に従って行った。Multiskanプレートリーダーを使用して450 nmの吸光
度を測定した。
度を測定した。
平均データを表3及び図4に示す。GDF‐8培養物中のIL6、VEGF、デコリン及びオステオプロテゲリンレベル(OPG)は、対照又はTGF‐β1培養物のものと同様であった(表3及び図4)。
二次培養物及び三次培養物の石灰化
石灰化を用いて、石灰化されたマトリックスを形成する細胞の能力を評価した。この目的のために、細胞を、5×103〜5×104細胞/cm2の密度で、24穴プレート中で
、二次培養の終了時に平板培養し、血清、FGF‐2及びGDF‐8を含む培地(FGF‐2/GDF‐8)、又はGDF‐8を含まないかかる培地(FGF‐2)、又は血清、FGF‐2及びTGF‐β1を含む培地(FGF‐2/TGF‐β1)を含む培地で培養した。翌日、培地を骨形成培地に置換することによって、すなわち、15%FBS、1%ペニシリン/ストレプトマイシン、β‐グリセロリン酸(10 mM)、アスコルビン酸
(ビタミンC)(50 μg/ml)及びデキサメタゾン(10-8M)を添加したα‐M
EMによって石灰化を誘導した。対照培地は、15%FBS及び1%ペニシリン/ストレプトマイシンを添加したα‐MEMからなっていた。培養3週間後、細胞を4%パラホルムアルデヒド/PBSで固定し、無機カルシウム堆積物を染色するアリザリンレッドSによって染色した。そして、石灰化能を、いずれかの観察される石灰化の0から観察される最大石灰化の2.5までの半定量的スコアによって評価した。
石灰化を用いて、石灰化されたマトリックスを形成する細胞の能力を評価した。この目的のために、細胞を、5×103〜5×104細胞/cm2の密度で、24穴プレート中で
、二次培養の終了時に平板培養し、血清、FGF‐2及びGDF‐8を含む培地(FGF‐2/GDF‐8)、又はGDF‐8を含まないかかる培地(FGF‐2)、又は血清、FGF‐2及びTGF‐β1を含む培地(FGF‐2/TGF‐β1)を含む培地で培養した。翌日、培地を骨形成培地に置換することによって、すなわち、15%FBS、1%ペニシリン/ストレプトマイシン、β‐グリセロリン酸(10 mM)、アスコルビン酸
(ビタミンC)(50 μg/ml)及びデキサメタゾン(10-8M)を添加したα‐M
EMによって石灰化を誘導した。対照培地は、15%FBS及び1%ペニシリン/ストレプトマイシンを添加したα‐MEMからなっていた。培養3週間後、細胞を4%パラホルムアルデヒド/PBSで固定し、無機カルシウム堆積物を染色するアリザリンレッドSによって染色した。そして、石灰化能を、いずれかの観察される石灰化の0から観察される最大石灰化の2.5までの半定量的スコアによって評価した。
石灰化は、GDF‐8を含まない条件(FGF‐2)と比較して、血清、FGF‐2及びGDF‐8(FGF‐2/GDF‐8)、又はFGF‐2及びTGFβ‐1(FGF‐2/TGF‐β1)を含むすべての培養条件で観察された(表4及び図5)。したがって、GDF‐8は、本発明に示す方法を用いて、培養細胞の石灰化能を損なうとは考えられなかった。
アルカリホスファターゼ活性
骨基質形成における重要な酵素であるアルカリホスファターゼの活性を、合成基質p‐ニトロフェニルホスフェート(pNPP)のリン酸基の加水分解に基づく生化学アッセイ、及び415 nmにおける反応生成物の検出によって決定した。細胞のALP酵素活性
を、精製子牛腸アルカリホスファターゼ活性に基づく標準曲線との比較によって決定した。ALP活性を、タンパク質のALP/mgの単位で報告した。タンパク質含量を、Bradfordアッセイによって決定した。1単位のALPは、37℃で毎分1 μmol
のpNPPを加水分解する。
骨基質形成における重要な酵素であるアルカリホスファターゼの活性を、合成基質p‐ニトロフェニルホスフェート(pNPP)のリン酸基の加水分解に基づく生化学アッセイ、及び415 nmにおける反応生成物の検出によって決定した。細胞のALP酵素活性
を、精製子牛腸アルカリホスファターゼ活性に基づく標準曲線との比較によって決定した。ALP活性を、タンパク質のALP/mgの単位で報告した。タンパク質含量を、Bradfordアッセイによって決定した。1単位のALPは、37℃で毎分1 μmol
のpNPPを加水分解する。
GDF‐8の存在下で培養した細胞は、高いALP活性を有すると考えられた(表5)。これらの結果は、FACS分析を裏付けている(表2)。
次に示すような非限定的な観察をすることができる。
GDF‐8を含まない培地における細胞の培養と比較して、血清、FGF‐2及びGDF‐8を含む培地における一次培養からの細胞の培養は、細胞増殖を促進した。
血清、FGF‐2及びGDF‐8を含む培地における一次培養からの細胞の培養は、HLA‐DRの発現を減少させた。したがって、GDF‐8は、細胞の免疫原性を低減させた。
血清、FGF‐2及びGDF‐8を含む培地で培養した細胞は、GDF‐8を含まない培地で培養した対照細胞と同様の骨形成表現型を示した。血清、FGF‐2及びGDF‐8を含む培地における細胞の培養は、培養時のALP発現に影響を及ぼすとは考えられなかった。さらに、血清、FGF‐2及びGDF‐8を含む培地における細胞の培養は、デコリン及びオステオプロテゲリンなどの骨マトリックスタンパク質、並びにVEGFなど
の細胞動員に関与するタンパク質の分泌に影響を及ぼさなかった。加えて、血清、FGF‐2及びGDF‐8を含む培地で培養した細胞は、石灰化マトリックスを合成することができた。
の細胞動員に関与するタンパク質の分泌に影響を及ぼさなかった。加えて、血清、FGF‐2及びGDF‐8を含む培地で培養した細胞は、石灰化マトリックスを合成することができた。
実施例3:血清、GDF‐8及びFGF‐2を含む培地における三次培養からの細胞の培養
実施例1に示す、FGF‐2とともに一次培養及び二次培養時に培養した細胞に対する血清、GDF‐8及びFGF‐2を含む培地における細胞培養の影響について調査するために、細胞を、三次培養のために6穴プレートに平板培養し、24時間放置して基材表面へ付着させた。翌日、細胞を、血清及びFGF‐2を含む培地、GDF‐8の存在下(GDF‐8)又はGDF‐8のない状態(対照)で培養した。
実施例1に示す、FGF‐2とともに一次培養及び二次培養時に培養した細胞に対する血清、GDF‐8及びFGF‐2を含む培地における細胞培養の影響について調査するために、細胞を、三次培養のために6穴プレートに平板培養し、24時間放置して基材表面へ付着させた。翌日、細胞を、血清及びFGF‐2を含む培地、GDF‐8の存在下(GDF‐8)又はGDF‐8のない状態(対照)で培養した。
4日間の培養後の細胞表現型
血清、FGF‐2及びGDF‐8を含む培地で4日間三次培養から培養した細胞の表現型を、本明細書に記載したとおりに、FACSによって測定した。マーカーの発現を、陽性細胞の割合として、すなわち、マーカーを発現する細胞の数を、平板培養した細胞の総数で割って求めた。造血マーカーCD45の発現と間葉系マーカーCD105は、すべての条件で類似していた(表6及び図6)。表6及び図6に示すように、HLA‐DRの発現は、血清、FGF‐2及びTGF‐β1を含む培地で4日間三次培養からの細胞の培養と比較して、血清、FGF‐2及びGDF‐8を含む培地で4日間三次培養細胞の培養後、少なかった。結論として、本発明に示す方法を用いて、得られる細胞又は細胞集団の特性を有利に改善することができる。
血清、FGF‐2及びGDF‐8を含む培地で4日間三次培養から培養した細胞の表現型を、本明細書に記載したとおりに、FACSによって測定した。マーカーの発現を、陽性細胞の割合として、すなわち、マーカーを発現する細胞の数を、平板培養した細胞の総数で割って求めた。造血マーカーCD45の発現と間葉系マーカーCD105は、すべての条件で類似していた(表6及び図6)。表6及び図6に示すように、HLA‐DRの発現は、血清、FGF‐2及びTGF‐β1を含む培地で4日間三次培養からの細胞の培養と比較して、血清、FGF‐2及びGDF‐8を含む培地で4日間三次培養細胞の培養後、少なかった。結論として、本発明に示す方法を用いて、得られる細胞又は細胞集団の特性を有利に改善することができる。
種々の濃度のGDF‐8で6日間培養後の細胞表現型
また、細胞を、血清、FGF‐2及びGDF‐8を含み、GDF‐8の用量を、50 ng/ml、100 ng/ml又は200 ng/mlと増加させた培地で6日間三次培養から培養した。
また、細胞を、血清、FGF‐2及びGDF‐8を含み、GDF‐8の用量を、50 ng/ml、100 ng/ml又は200 ng/mlと増加させた培地で6日間三次培養から培養した。
血清、FGF‐2及びGDF‐8を含む培地で6日間三次培養から培養した細胞の表現型を、本明細書に記載したとおりに、FACSによって分析した。マーカーの発現を、陽性細胞の割合として、すなわち、マーカーを発現する細胞の数を、平板培養した細胞の総数で割って求めた。
血清、FGF‐2及びGDF‐8を含む培地における6日間の三次培養からのすべての細胞培養条件において、HLA‐DRの発現は、対照条件よりも少なかった。さらに、HLA‐DRの発現は、GDF‐8の濃度の増加に伴って減少すると考えられた(表7及び図7)。
次に示すような非限定的な観察をすることができる。
血清、FGF‐2及びGDF‐8を含む培地における三次培養からの細胞の培養は、細胞のHLA‐DR発現の減少を誘発した。HLA‐DR発現の減少は、高い濃度のGDF‐8で顕著であった。
実施例4:血清及びGDF‐8を含む培地における一次培養からの細胞の培養
骨髄細胞を、(1)血清、FGF‐2及びGDF‐8、又は(2)血清及びGDF‐8を含む培地で培養した。一次培養後、細胞を継代し、対応する培地で二次培養のために再び平板培養した。使用されるGDF‐8の濃度は100 ng/mlであった。培養終了
時に、細胞の増殖及び表現型(FACS)について特性評価した。
骨髄細胞を、(1)血清、FGF‐2及びGDF‐8、又は(2)血清及びGDF‐8を含む培地で培養した。一次培養後、細胞を継代し、対応する培地で二次培養のために再び平板培養した。使用されるGDF‐8の濃度は100 ng/mlであった。培養終了
時に、細胞の増殖及び表現型(FACS)について特性評価した。
培養物の収率に対する影響
培養物の収率を細胞数によって決定した。データを表8及び図8に示す。データは、培養物の収率が、GDF‐8を含むか又は含まないFGF‐2の存在下での培養と比較して、培地中にFGF‐2がない状態で減少することを示した。
培養物の収率を細胞数によって決定した。データを表8及び図8に示す。データは、培養物の収率が、GDF‐8を含むか又は含まないFGF‐2の存在下での培養と比較して、培地中にFGF‐2がない状態で減少することを示した。
同様の追加試験では、試料数を増やし、表9で把握されるような結果を生じた。
FACSによるHLA‐DR及びALPの発現
一次培養及び二次培養後の細胞表現型を、実施例2に記載したとおりに、FACS分析によって決定した。マーカーALP及びHLA‐DRを、陽性細胞の割合の算出に提供する。GDF‐8を含む一次培養におけるALPの発現レベルは、FGF‐2の存在下又はこれがない状態の培養物に類似していたが、二次培養では、FGF‐2のない状態の培養物と比較して、ALP発現の減少が、FGF‐2を含む培養物でみられた(表10及び図9)。GDF‐8を含む培地における培養物は、GDF‐8のない状態のFGF‐2を含む培地における培養物と比較して、FGF‐2の存在下又はこれがない状態で、HLA‐DR発現の減少を示した。このような減少は、GDF‐8及びFGF‐2の存在下でより顕著であった(表10及び図10)。
一次培養及び二次培養後の細胞表現型を、実施例2に記載したとおりに、FACS分析によって決定した。マーカーALP及びHLA‐DRを、陽性細胞の割合の算出に提供する。GDF‐8を含む一次培養におけるALPの発現レベルは、FGF‐2の存在下又はこれがない状態の培養物に類似していたが、二次培養では、FGF‐2のない状態の培養物と比較して、ALP発現の減少が、FGF‐2を含む培養物でみられた(表10及び図9)。GDF‐8を含む培地における培養物は、GDF‐8のない状態のFGF‐2を含む培地における培養物と比較して、FGF‐2の存在下又はこれがない状態で、HLA‐DR発現の減少を示した。このような減少は、GDF‐8及びFGF‐2の存在下でより顕著であった(表10及び図10)。
同様の追加試験では、試料数を増やし、表11で把握されるような結果を生じた。
次に示すような非限定的な観察をすることができる。
予想どおり、細胞の培養培地における増殖因子FGF‐2の欠如によって、一次培養物及び二次培養物の収率が減少したが、細胞のHLA‐DR発現の減少に影響を及ぼさなかった。細胞の培養培地におけるGDF‐8の存在によって、FGF‐2の存在とは関係なく、低い免疫原性プロファイルを有するMSCの骨芽細胞の分化を誘導することができた。
上述の実施例は、一括して、血清、FGF‐2及びGDF‐8を含む培地における細胞の培養が、GDF‐8を含まない培地における一次培養細胞の培養と比較して、細胞増殖を増加させ、HLA‐DRの発現を減少させ、また、骨形成分化を低減しなかったことを示す。特に、血清、FGF‐2及びGDF‐8を含む培地における一次培養細胞の培養は、ALPの発現、並びにデコリン及びオステオプロテゲリンなどの骨マトリックスタンパク質の発現又はVEGFなどの細胞動員に関与するタンパク質の発現を変化させなかった
。
。
さらに、上述の実施例は、GDF‐8を含まない培地における一次培養からの細胞の培養と比較して、血清、FGF‐2及びGDF‐8を含む培地における三次培養からの細胞の培養が、ALPの発現に影響を及ぼさなかったことを示す。有利に、血清、FGF‐2及びGDF‐8を含む培地における二次培養又は三次培養からの細胞の培養が、GDF‐8を含まない培地における一次培養からの細胞の培養と比較して、特に長い処理において、HLA‐DR発現を減少させることが観察された。
実施例5:GDF‐8を含む培地における細胞の培養
骨髄を、ヒトの健康なドナーの腸骨稜から採取する。骨髄は、密度勾配溶液(Ficoll(商標)プレートプレミアム、GEヘルスケア社製)中で分留に供する。密度勾配溶液によって、単核細胞(MNC)を精製する。その後、MNCを、5×103〜5×105細胞/cm2の密度で平板培養し、標準的なMSC培養プロトコールに従って増殖させる。次に
示すような試験を行う。
骨髄を、ヒトの健康なドナーの腸骨稜から採取する。骨髄は、密度勾配溶液(Ficoll(商標)プレートプレミアム、GEヘルスケア社製)中で分留に供する。密度勾配溶液によって、単核細胞(MNC)を精製する。その後、MNCを、5×103〜5×105細胞/cm2の密度で平板培養し、標準的なMSC培養プロトコールに従って増殖させる。次に
示すような試験を行う。
一次培養物若しくは二次培養物、可能な場合、三次培養物から培養培地に加えるGDF‐8の存在下又はこれがない状態のいずれかで、MSCを、標準軟骨細胞系統分化プロトコールに供する。GDF‐8が含まれるものをこれが含まれないものと比較すると、軟骨細胞系統の得られた細胞、特に軟骨芽細胞及び軟骨細胞は、HLA‐DR発現の減少を示す。
一次培養物若しくは二次培養物、可能な場合、三次培養物から培養培地に加えるGDF‐8の存在下又はこれがない状態のいずれかで、MSCを、標準脂肪細胞系統分化プロトコールに供する。GDF‐8が含まれるものをこれが含まれないものと比較すると、脂肪細胞系統の得られた細胞、特に脂肪芽細胞及び脂肪細胞は、HLA‐DR発現の減少を示す。
一次培養若しくは二次培養物、可能な場合三次培養物から培養培地に加えるGDF‐8の存在下又はこれがない状態のいずれかで、MSCを、標準筋細胞系統分化プロトコールに供する。GDF‐8が含まれるものをこれが含まれないものと比較すると、筋細胞系統の得られた細胞、特に筋芽細胞及び筋細胞は、HLA‐DR発現の減少を示す。
一次培養物若しくは二次培養物、可能な場合、三次培養物から培養培地に加えるGDF‐8の存在下又はこれがない状態のいずれかで、MSCを、標準腱細胞系統分化プロトコールに供する。GDF‐8が含まれるものをこれが含まれないものと比較すると、腱細胞系統の得られた細胞、特に腱芽細胞及び腱細胞は、HLA‐DR発現の減少を示す。
一次培養物若しくは二次培養物、可能な場合、三次培養物から培養培地に加えるGDF‐8の存在下又はこれがない状態のいずれかで、MSCを、標準間質発生細胞系統分化プロトコールに供する。GDF‐8が含まれるものをこれが含まれないものと比較すると、間質発生細胞系統の得られた細胞、特に間質細胞は、HLA‐DR発現の減少を示す。
Claims (22)
- インビトロでの細胞の免疫原性の低減における増殖分化因子8(GDF‐8)の使用であって、該細胞が、間葉系幹細胞(MSC)、MSCの分化によって得られる細胞、骨細胞系統の細胞、軟骨細胞系統の細胞、脂肪細胞系統の細胞、筋細胞系統の細胞、腱細胞系統の細胞、線維芽細胞系統の細胞及び間質発生細胞系統の細胞からなる群より選択される、前記使用。
- 前記骨細胞系統の細胞、軟骨細胞系統の細胞、脂肪細胞系統の細胞、筋細胞系統の細胞、腱細胞系統の細胞、線維芽細胞系統の細胞又は間質発生細胞系統の細胞が、MSCの分化によって得られる、請求項1に記載の使用。
- 前記細胞が、MSC、前骨芽細胞、骨芽細胞、骨細胞、軟骨芽細胞、軟骨細胞、脂肪芽細胞、脂肪細胞、筋芽細胞又は筋細胞であり、MSC、前骨芽細胞、骨芽細胞、軟骨芽細胞又は軟骨細胞であることが好ましい、請求項1又は2のうちのいずれか一項に記載の使用。
- 前記細胞がMSCである、請求項1に記載の使用。
- 前記細胞が前骨芽細胞又は骨芽細胞である、請求項1又は2のうちのいずれか一項に記載の使用。
- 前記細胞が、ヒト細胞又は非ヒト哺乳動物細胞などの哺乳動物細胞であり、好ましくはヒト細胞である、請求項1〜5のうちのいずれか一項に記載の使用。
- GDF‐8が、前記細胞におけるMHCクラスII細胞表面受容体複合体を低減し、場合により、前記細胞における1以上の共刺激因子を低減する、請求項1〜6のうちのいずれか一項に記載の使用。
- ヒト細胞において、前記MHCクラスII細胞表面受容体が、ヒト白血球抗原DR(HLA‐DR)である、請求項7に記載の使用。
- 前記細胞が、インプラント若しくは移植片に、好ましくは骨及び/又は関節組織インプラント若しくは移植片、又は医薬製剤に含まれる、請求項1〜8のうちのいずれか一項に記載の使用。
- 細胞の免疫原性を低減する方法に使用されるGDF‐8であって、GDF‐8がインビボにおいて投与され、該細胞が、MSC、MSCの分化によって得られる細胞、骨細胞系統の細胞、軟骨細胞系統の細胞、脂肪細胞系統の細胞、筋細胞系統の細胞、腱細胞系統の細胞、線維芽細胞系統の細胞及び間質発生細胞系統の細胞からなる群より選択される、GDF‐8。
- GDF‐8及び前記細胞がインビボにおいて投与される、請求項10に記載のGDF‐8。
- 前記細胞が、請求項2〜6のうちのいずれか一項に記載の細胞である、請求項10又は11のうちのいずれか一項に記載のGDF‐8。
- 前記細胞が、投与される対象に対し同種である、請求項10〜12のうちのいずれか一項に記載のGDF‐8。
- 医薬品として使用され、好ましくは筋骨格系疾患、より好ましくは骨疾患又は骨関節疾患の治療に使用される、GDF‐8と細胞の組合せであって、該細胞が、MSC、MSCの分化によって得られる細胞、骨細胞系統の細胞、軟骨細胞系統の細胞、脂肪細胞系統の細胞、筋細胞系統の細胞、腱細胞系統の細胞、線維芽細胞系統の細胞及び間質発生細胞系統の細胞からなる群より選択される、前記GDF‐8と細胞の組合せ。
- 前記細胞が、請求項2〜6のうちのいずれか一項に記載の細胞である、請求項14に記載のGDF‐8と細胞の組合せ。
- 前記組合せが、筋骨格系疾患、好ましくは骨疾患又は骨関節疾患の治療に使用され、前記細胞が、MSC、骨細胞系統の細胞、軟骨細胞系統の細胞、筋細胞系統の細胞及び腱細胞系統の細胞からなる群より選択され、MSC、前骨芽細胞、骨芽細胞、骨細胞、軟骨芽細胞、軟骨細胞、筋芽細胞又は筋細胞であることが好ましい、請求項14又は15のうちのいずれか一項に記載のGDF‐8と細胞の組合せ。
- 前記細胞が、投与される対象に対し同種である、請求項14〜16のうちのいずれか一項に記載のGDF‐8と細胞の組合せ。
- 対象に投与されるか、埋め込まれるか又は移植される物質に対する対象による拒絶の危険性を低減する方法に使用される、GDF‐8。
- 前記物質が骨及び/又は関節組織を含む、請求項18に記載のGDF‐8。
- 対象に投与されるか、埋め込まれるか又は移植される物質とGDF‐8とを含み、必要に応じて、1以上の医薬として許容し得る賦形剤を更に含む、医薬組成物。
- 前記物質が、MSC、MSCの分化によって得られる細胞、骨細胞系統の細胞、軟骨細胞系統の細胞、脂肪細胞系統の細胞、筋細胞系統の細胞、腱細胞系統の細胞、線維芽細胞系統の細胞及び間質発生細胞系統の細胞からなる群より選択される細胞を含む、請求項20に記載の医薬組成物。
- 前記物質が骨及び/又は関節組織を含む、請求項20に記載の医薬組成物。
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