BR112021005285A2

BR112021005285A2 - biomaterial compreendendo células-tronco derivadas de adipose e gelatina e método para produzir o mesmo

Info

Publication number: BR112021005285A2
Application number: BR112021005285-2A
Authority: BR
Inventors: Denis Dufrane
Original assignee: Novadip Biosciences
Priority date: 2018-09-20
Filing date: 2019-09-20
Publication date: 2021-06-22
Also published as: EP3853350A1; US20210322644A1; IL281179A; SG11202101902QA; CN112823205A; AR116481A1; AU2019342877A1; IL281179B1; JP2022501118A; KR20210063324A; WO2020058511A1; CA3112846A1; MX2021003219A

Abstract

BIOMATERIAL COMPREENDENDO CÉLULAS-TRONCO DERIVADAS DE ADIPOSE E GELATINA E MÉTODO PARA PRODUZIR O MESMO. A presente invenção se refere a um biomaterial compreendendo células-tronco derivadas do tecido adiposo (ASCs), uma matriz extracelular e gelatina. A presente invenção também se refere a métodos para produzir o biomaterial e usos do mesmo.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para: “BIOMATERIAL COMPREENDENDO CÉLULAS-TRONCO DERIVADAS DE ADIPOSE E GELATINA E MÉTODO PARA PRODUZIR O MESMO”

CAMPO DA INVENÇÃO

[001] A presente invenção se refere ao campo das células-tronco e seu uso para a produção de biomateriais multidimensionais. Em particular, a presente invenção se refere a biomateriais compreendendo células-tronco derivadas do tecido adiposo (ASCs), métodos para preparar e usar tais biomateriais para terapia.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

[002] A engenharia de tecidos envolve a restauração da estrutura ou função do tecido por meio do uso de células vivas. O processo geral consiste no isolamento e proliferação celular, seguido por um procedimento de reimplantação em que um material de suporte é usado. As células-tronco mesenquimais fornecem uma boa alternativa às células de tecido maduro e têm uma série de vantagens como fonte de células para regeneração de tecido ósseo e cartilaginoso, por exemplo.

[003] Por definição, uma célula-tronco é caracterizada por sua habilidade de se autorrenovar e por sua habilidade de sofrer diferenciação em várias linhagens e formar células diferenciadas terminalmente. Idealmente, uma célula-tronco para aplicações medicinais regenerativas deve atender ao seguinte conjunto de critérios: (i) deve ser encontrada em quantidades abundantes (milhões a bilhões de células); (ii) pode ser coletada e colhida por um procedimento minimamente invasivo; (iii) pode ser diferenciada ao longo de múltiplas vias de linhagem celular de uma maneira reproduzível; (iv) pode ser transplantada com segurança e eficácia para um hospedeiro autólogo ou alogênico.

[004] Estudos têm demonstrado que as células- tronco têm a capacidade de se diferenciar em células de origem mesodérmica, endodérmica e ectodérmica. A plasticidade das MSCs na maioria das vezes se refere à capacidade inerente retida nas células-tronco de cruzar as barreiras da linhagem e adotar as propriedades fenotípicas, bioquímicas e funcionais de células exclusivas de outros tecidos. As células-tronco mesenquimais adultas podem ser isoladas da medula óssea e do tecido adiposo, por exemplo.

[005] As células-tronco derivadas do tecido adiposo são multipotentes e possuem profundas capacidades regenerativas. Os seguintes termos têm sido usados para identificar a mesma população de células de tecido adiposo: células-tronco/estromais derivadas de adiposo (ASCs); células-tronco adiposas derivadas de adiposo (ADAS), células estromais adiposas derivadas de adiposo, células estromais derivadas de adipose (ADSC), células estromais adiposas (ASC), células-tronco mesenquimais adiposas (AdMSC), lipoblastos, pericitos, pré-adipócitos, células de lipoaspirato processadas (PLA). O uso desta nomenclatura diversa tem gerado confusão significativa na literatura.

Para resolver esse problema, a International Fat Applied Technology Society chegou a um consenso para adotar o termo “Células-tronco derivadas do tecido adiposo” (ASCs) para identificar a população de células multipotentes isoladas, aderentes ao plástico.

[006] A reconstrução de tecido abrange a reconstrução de osso e cartilagem, mas também a reconstrução de derme e músculo. Atualmente, cada defeito do tecido deve ser tratado com um tratamento específico, exigindo um desenvolvimento diferente para cada um.

[007] Existe, portanto, ainda uma necessidade na técnica de materiais de engenharia de tecidos para reconstrução e/ou regeneração de tecidos que sejam totalmente biocompatíveis e forneçam recursos mecânicos apropriados para as aplicações designadas, embora utilizáveis em uma ampla gama de tecidos. Portanto, a presente invenção se refere a um enxerto feito de ASCs diferenciadas em uma estrutura multidimensional com gelatina.

SUMÁRIO

[008] A presente invenção se refere a um biomaterial com uma estrutura multidimensional que compreende células-tronco derivadas do tecido adiposo (ASCs) diferenciadas, uma matriz extracelular e gelatina.

[009] Em uma modalidade, a gelatina é gelatina porcina. Em uma modalidade, a gelatina está na forma de partículas. Em uma modalidade, a gelatina tem um diâmetro médio variando de cerca de 50 m a cerca de 1000 m, de um modo preferido de cerca de 75 m a cerca de 750 m, de um modo mais preferido de cerca de 100 m a cerca de 500 m.

[0010] Em uma modalidade, o biomaterial é tridimensional.

[0011] Em certas modalidades, o biomaterial é moldável ou formável.

[0012] Em uma modalidade, as ASCs são diferenciadas em células selecionadas do grupo que compreende ou consiste em osteoblastos, condrócitos, queratinócitos, miofibroblastos, células endoteliais e adipócitos.

[0013] A presente invenção também se refere a um dispositivo médico ou uma composição farmacêutica compreendendo o biomaterial multidimensional, conforme descrito acima.

[0014] Outro aspecto da presente invenção é um método para produzir o biomaterial multidimensional, conforme descrito acima, compreendendo as etapas de:

- proliferar células-tronco derivadas do tecido adiposo (ASCs), - diferenciar ASCs na quarta passagem, e - induzir de forma multidimensional, de um modo preferido indução 3D.

[0015] A presente invenção se refere ainda a um biomaterial multidimensional obtenível pelo método descrito acima.

[0016] Ainda outro objeto da presente invenção é um biomaterial como descrito acima para uso no tratamento de um defeito de tecido. Em uma modalidade, o tecido é selecionado a partir do grupo que compreende ou consiste em osso, cartilagem, derme, músculo, endotélio e tecido adiposo.

DEFINIÇÕES

[0017] Na presente invenção, os seguintes termos têm os seguintes significados.

[0018] O termo “cerca de” precedendo um valor significa mais ou menos 10% do valor desse valor.

[0019] O termo “tecido adiposo” se refere a qualquer tecido adiposo. O tecido adiposo pode ser tecido adiposo marrom ou branco, derivado do local do tecido adiposo subcutâneo, omental/visceral, mamário, gonadal ou outro. De um modo preferido, o tecido adiposo é tecido adiposo branco subcutâneo. Essas células podem compreender uma cultura de células primárias ou uma linhagem de células imortalizadas. O tecido adiposo pode ser de qualquer organismo, vivo ou falecido, com tecido adiposo. De um modo preferido, o tecido adiposo é animal, de um modo mais preferido mamífero, de um modo mais preferido o tecido adiposo é humano. Uma fonte conveniente de tecido adiposo é a cirurgia de lipoaspiração, no entanto, a fonte de tecido adiposo ou o método de isolamento de tecido adiposo não é crítico para a invenção.

[0020] O termo “células-tronco derivadas de tecido adiposo”, tal como aqui utilizado, refere-se à fração “não adiposa” do tecido adiposo. As células podem ser frescas ou em cultura. "Células-tronco derivadas de adipose" (ASCs) se referem a células do estroma que se originam do tecido adiposo que podem servir como precursoras para uma variedade de tipos de células diferentes, tais como, mas não se limitando a, adipócitos, osteócitos, condrócitos.

[0021] O termo "regeneração" ou "regeneração de tecido" inclui, mas não está limitado ao, crescimento, geração ou reconstrução de novos tipos de células ou tecidos das ASCs da presente divulgação. Em uma modalidade, esses tipos de células ou tecidos incluem, mas não estão limitados a, células osteogênicas (por exemplo, osteoblastos), condrócitos, células endoteliais, cardiomiócitos, células hematopoiéticas, células hepáticas,

adipócitos, células neuronais e miotubos. Em uma modalidade particular, o termo "regeneração" ou "regeneração de tecido" se refere à geração ou reconstrução de células osteogênicas (por exemplo, osteoblastos) a partir das ASCs da presente divulgação.

[0022] O termo "fatores de crescimento", tal como aqui utilizado, são moléculas que promovem o crescimento do tecido, proliferação celular, vascularização e semelhantes.

Em uma modalidade particular, o termo "fatores de crescimento" inclui moléculas que promovem o tecido ósseo.

[0023] O termo "cultivado", tal como aqui utilizado, refere-se a uma ou mais células que estão passando por divisão celular ou não estão passando por divisão celular em um ambiente in vitro, in vivo ou ex vivo. Um ambiente in vitro pode ser qualquer meio conhecido na técnica que seja adequado para manter células in vitro, tal como meio líquido adequado ou ágar, por exemplo.

Exemplos específicos de ambientes in vitro adequados para culturas de células são descritos em Culture of Animal Cells: a manual of basic technologies (3ª edição), 1994, R.

I. Freshney (ed.), Wiley-Liss, Inc.; Cells: a Laboratory manual (vol. 1), 1998, D. L. Spector, R. D. Goldman, L. A.

Leinwand (eds.), Cold Spring Harbor Laboratory Press; e Animal Cells: culture and media, 1994, D. C. Darling, S. J.

Morgan John Wiley and Sons, Ltd.

[0024] O termo "confluência" se refere ao número de células aderentes em uma superfície de cultura de células (como um prato ou um frasco de cultura), ou seja, à proporção da superfície que é coberta por células. Uma confluência de 100% significa que a superfície está completamente coberta pelas células. Em uma modalidade, a expressão "células atingem confluência" ou "células são confluentes" significa que as células cobrem de 80 a 100% da superfície. Em uma modalidade, a expressão "células são subconfluentes" significa que as células cobrem de 60 a 80% da superfície. Em uma modalidade, a expressão "células são superconfluentes" significa que as células cobrem pelo menos 100% da superfície e/ou são 100% confluentes desde várias horas ou dias.

[0025] O termo "refrigerar" ou "refrigeração" se refere a um tratamento trazendo temperaturas inferiores à temperatura fisiológica normal do indivíduo. Por exemplo, em uma ou mais temperaturas selecionadas na faixa de cerca de -196 °C a cerca de +32 °C, por longos períodos de tempo, por exemplo, pelo menos cerca de uma hora, pelo menos cerca de um dia, pelo menos cerca de uma semana, pelo menos cerca de 4 semanas, pelo menos cerca de 6 meses, etc. Em uma modalidade, "refrigerar" ou "refrigeração" se refere a um tratamento trazendo temperaturas inferiores a 0 °C. A refrigeração pode ser realizada manualmente, ou de um modo preferido realizada usando um aparelho ad hoc capaz de executar um programa de refrigeração. Em uma modalidade, o termo "refrigeração" inclui os métodos conhecidos na técnica como "congelamento" e "criopreservação". A pessoa versada na técnica entenderá que o método de refrigeração pode incluir outras etapas, incluindo a adição de reagentes para esse propósito.

[0026] O termo "célula não embrionária", tal como aqui utilizado, refere-se a uma célula que não é isolada de um embrião. As células não embrionárias podem ser diferenciadas ou não diferenciadas. As células não embrionárias podem se referir a quase qualquer célula somática, como células isoladas de um animal ex-útero.

Esses exemplos não pretendem ser limitativos.

[0027] O termo "célula diferenciada", tal como aqui utilizado, refere-se a uma célula precursora que se desenvolveu a partir de um fenótipo não especializado para um fenótipo especializado. Por exemplo, as células-tronco derivadas do tecido adiposo podem se diferenciar em células osteogênicas.

[0028] O termo "meio de diferenciação", conforme usado neste documento, refere-se a um de uma coleção de compostos que são usados em sistemas de cultura desta invenção para produzir células diferenciadas. Nenhuma limitação é pretendida quanto ao modo de ação dos compostos. Por exemplo, o agente pode auxiliar o processo de diferenciação induzindo ou auxiliando uma mudança no fenótipo, promovendo o crescimento de células com um fenótipo particular ou retardando o crescimento de outros.

Ele também pode atuar como um inibidor para outros fatores que podem estar no meio ou sintetizados pela população de células que, de outra forma, direcionariam a diferenciação ao longo do caminho para um tipo de célula indesejado.

[0029] Os termos "tratamento", "tratando" ou "alívio" se referem a tratamentos terapêuticos em que o objetivo é prevenir ou retardar (diminuir) o defeito ósseo.

Aqueles que precisam de tratamento incluem aqueles que já têm o distúrbio, bem como aqueles propensos a ter o distúrbio ou aqueles nos quais o defeito ósseo deve ser prevenido. Um indivíduo é "tratado" com sucesso para um defeito ósseo se, depois de receber uma quantidade terapêutica de um biomaterial de acordo com os métodos da presente invenção, o paciente mostra redução observável e/ou mensurável ou ausência de um ou mais dos seguintes: redução e/ou alívio em alguma extensão do defeito ósseo, de um ou mais dos sintomas associados ao defeito ósseo; morbidade e mortalidade reduzidas e melhoria em questões de qualidade de vida. Os parâmetros acima para avaliar o sucesso do tratamento e a melhora da doença são facilmente mensuráveis por procedimentos de rotina familiares ao médico.

[0030] No contexto do uso terapêutico dos biomateriais divulgados, na terapia 'alogênica', o doador e o receptor são indivíduos diferentes da mesma espécie, enquanto na terapia 'autóloga', o doador e o receptor são o mesmo indivíduo, e em 'terapia xenogênica', o doador é derivado de um animal de uma espécie diferente do receptor.

[0031] O termo “quantidade eficaz” se refere a uma quantidade suficiente para efetuar resultados benéficos ou desejados, incluindo resultados clínicos. Uma quantidade eficaz pode ser administrada em uma ou mais administrações.

[0032] O termo "indivíduo" se refere a um mamífero, de um modo preferido um ser humano. Exemplos de indivíduos incluem humanos, primatas não humanos, cães, gatos, camundongos, ratos, cavalos, vacas e espécies transgênicas dos mesmos. Em uma modalidade, um indivíduo pode ser um "paciente", isto é, um animal de sangue quente, de um modo mais preferido um humano, que está aguardando o recebimento de, ou está recebendo cuidados médicos ou foi/é/será o objeto de um procedimento médico, ou é monitorado para o desenvolvimento de uma doença. Em uma modalidade, o indivíduo é um adulto (por exemplo, um indivíduo humano com mais de 18 anos). Em outra modalidade, o indivíduo é uma criança (por exemplo, um indivíduo humano com menos de 18 anos). Em uma modalidade, o indivíduo é um homem. Em outra modalidade, o indivíduo é uma mulher.

[0033] O termo “biocompatível” se refere a um material não tóxico que é compatível com um sistema biológico, como uma célula, cultura de células, tecido ou organismo.

DESCRIÇÃO DETALHADA

[0034] Esta invenção se refere a um biomaterial com uma estrutura multidimensional que compreende células- tronco derivadas do tecido adiposo (ASCs), uma matriz extracelular e gelatina.

[0035] Conforme usado neste documento, o termo "biomaterial com uma estrutura multidimensional" pode ser substituído ao longo da presente invenção pelo termo "biomaterial multidimensional".

[0036] Em uma modalidade, as células são isoladas do tecido adiposo e são doravante referidas como células- tronco derivadas do tecido adiposo (ASCs).

[0037] Em uma modalidade, o tecido de ASCs é de origem animal, de um modo preferido de origem mamífera, de um modo mais preferido de origem humana. Consequentemente, em uma modalidade, ASCs são ASCs animais, de um modo preferido ASCs de mamíferos, de um modo mais preferido ASCs humanas. Em uma modalidade preferida, ASCs são ASCs humanas.

[0038] Os métodos de isolamento de células-tronco de tecido adiposo são conhecidos na técnica e são divulgados, por exemplo, em Zuk et al. (Tissue Engineering.

2001, 7: 211 a 228). Em uma modalidade, ASCs são isoladas do tecido adiposo por lipoaspiração.

[0039] A título de ilustração, o tecido adiposo pode ser coletado por biópsia por agulha ou aspiração de lipoaspiração. As ASCs podem ser isoladas do tecido adiposo lavando primeiro a amostra de tecido extensivamente com solução salina tamponada com fosfato (PBS), opcionalmente contendo antibióticos, por exemplo, 1% de Penicilina/Estreptomicina (P/S). Em seguida, a amostra pode ser colocada em uma placa de cultura de tecidos estéril com colagenase para digestão de tecidos (por exemplo, Colagenase Tipo I preparada em PBS contendo 2% de P/S) e incubada por 30 minutos a 37 °C, 5% de CO2. A atividade da colagenase pode ser neutralizada pela adição de meio de cultura (por exemplo DMEM contendo 10% de soro). Após a desintegração, a amostra pode ser transferida para um tubo.

A fração vascular estromal (SVF), contendo as ASCs, é obtida por centrifugação da amostra (por exemplo, a

2.000 rpm por 5 minutos). Para completar a separação das células do estroma dos adipócitos primários, a amostra pode ser agitada vigorosamente para romper completamente o sedimento e misturar as células. A etapa de centrifugação pode ser repetida. Após girar e aspirar a solução de colagenase, o grânulo pode ser ressuspenso em tampão de lise, incubado em gelo (por exemplo, por 10 minutos), lavado (por exemplo com PBS/2% de P/S) e centrifugado (por exemplo a 2.000 rpm por 5 minutos). O sobrenadante pode então ser aspirado, o grânulo celular ressuspenso em meio (por exemplo, meio estromal, isto é, -MEM, suplementado com 20% de FBS, 1% de L-glutamina e 1% de P/S), e a suspensão celular filtrada (por exemplo, por meio de um filtro de células de 70 m). A amostra contendo as células pode ser finalmente semeada em placas de cultura e incubada a 37 °C, 5% de CO2.

[0040] Em uma modalidade, ASCs da invenção são isolados da fração vascular do estroma do tecido adiposo.

Em uma modalidade, o lipoaspirado pode ser mantido várias horas à temperatura ambiente, ou a +4 °C por 24 horas antes do uso, ou abaixo de 0 °C, por exemplo -18 °C, para conservação a longo prazo.

[0041] Em uma modalidade, as ASCs podem ser ASCs frescas ou ASCs refrigeradas. ASCs frescas são ASCs isoladas que não foram submetidas a um tratamento de refrigeração. ASCs refrigeradas são ASCs isoladas que foram submetidas a um tratamento de refrigeração. Em uma modalidade, um tratamento de refrigeração significa qualquer tratamento abaixo de 0 °C. Em uma modalidade, o tratamento de refrigeração pode ser realizado a -18 °C, a -80 °C ou a -180 °C. Em uma modalidade específica, o tratamento de refrigeração pode ser criopreservação.

[0042] Como ilustração do tratamento de refrigeração, as ASCs podem ser colhidas em cerca de 80 a 90% de confluência. Após as etapas de lavagem e destacamento do prato, as células podem ser peletizadas à temperatura ambiente com um meio de preservação refrigerado e colocadas em frascos. Em uma modalidade, o meio de preservação refrigerante compreende 80% de soro fetal bovino ou soro humano, 10% de dimetilsulfóxido (DMSO) e 10% de DMEM/Ham’s F-12. Em seguida, os frascos podem ser armazenados a -80 °C durante a noite. Por exemplo, os frascos podem ser colocados em um recipiente para congelamento de álcool que os resfria lentamente, a aproximadamente 1 °C a cada minuto, até atingirem -80 °C.

Finalmente, os frascos congelados podem ser transferidos para um recipiente de nitrogênio líquido para armazenamento de longo prazo.

[0043] Em uma modalidade, as ASCs são ASCs diferenciadas. Em uma modalidade, ASCs são diferenciadas em células selecionadas a partir do grupo que compreende ou consiste em osteoblastos, condrócitos, queratinócitos, células endoteliais, miofibroblastos e adipócitos. Em outra modalidade, as ASCs são diferenciadas em células selecionadas do grupo que compreende ou consiste em osteoblastos, condrócitos, queratinócitos, células endoteliais e miofibroblastos. Em outra modalidade, as ASCs são diferenciadas em células selecionadas do grupo que compreende ou consiste em osteoblastos, condrócitos, queratinócitos e miofibroblastos. Em outra modalidade, as ASCs são diferenciadas em células selecionadas do grupo que compreende ou consiste em osteoblastos, condrócitos, queratinócitos e células endoteliais. Em outra modalidade, as ASCs são diferenciadas em células selecionadas do grupo que compreende ou consiste em osteoblastos, condrócitos e queratinócitos. Em outra modalidade, as ASCs são diferenciadas em células selecionadas do grupo que compreende ou consiste em osteoblastos e condrócitos.

[0044] Em uma modalidade, as ASCs são ACS diferenciadas osteogênicas. Em outras palavras, em uma modalidade preferida, as ASCs são diferenciadas em células osteogênicas. Em ainda outras palavras, em uma modalidade preferida, as ASCs são diferenciadas em meio osteogênico.

Em uma modalidade particular, as ASCs são diferenciadas em osteoblastos.

[0045] Métodos para controlar e avaliar a diferenciação osteogênica são conhecidos na técnica. Por exemplo, a osteodiferenciação das células ou tecidos da invenção pode ser avaliada por coloração de osteocalcina e/ou fosfato (por exemplo, com von Kossa); por coloração com fosfato de cálcio (por exemplo, com vermelho de Alizarina); por imagem de ressonância magnética (IRM); por medição da formação da matriz mineralizada; ou por medição da atividade da fosfatase alcalina.

[0046] Em uma modalidade, a diferenciação osteogênica de ASCs é realizada por cultura de ASCs em meio de diferenciação osteogênica (MD).

[0047] Em uma modalidade, o meio de diferenciação osteogênica compreende soro humano. Em uma modalidade particular, o meio de diferenciação osteogênica compreende lisado de plaquetas humano (hPL). Em uma modalidade, o meio de diferenciação osteogênica não compreende qualquer outro soro animal, de um modo preferido não compreende outro soro além do soro humano.

[0048] Em uma modalidade, o meio de diferenciação osteogênico compreende ou consiste em meio de proliferação suplementado com dexametasona, ácido ascórbico e fosfato de sódio. Em uma modalidade, o meio de diferenciação osteogênico compreende ainda antibióticos, tais como penicilina, estreptomicina, gentamicina e/ou anfotericina B. Em uma modalidade, todos os meios são isentos de proteínas animais.

[0049] Em uma modalidade, o meio de proliferação pode ser qualquer meio de cultura projetado para suportar o crescimento das células conhecido por uma pessoa versada na técnica. Conforme usado neste documento, o meio de proliferação também é chamado de "meio de crescimento".

Exemplos de meio de crescimento incluem, sem limitação, MEM, DMEM, IMDM, RPMI 1640, FGM ou FGM-2, meio 199/109, HamF10/HamF12 ou McCoy’s 5A. Em uma modalidade preferida, o meio de proliferação é DMEM.

[0050] Em uma modalidade, o meio de diferenciação osteogênica compreende ou consiste em DMEM suplementado com L-alanil-L-glutamina (Ala-Gln, também chamado de ‘Glutamax®’ ou ‘Ultraglutamine®’), hPL, dexametasona, ácido ascórbico e fosfato de sódio. Em uma modalidade, o meio de diferenciação osteogênica compreende ou consiste em DMEM suplementado com L-alanil-L-glutamina, hPL, dexametasona, ascórbico e fosfato de sódio, penicilina, estreptomicina e anfotericina B.

[0051] Em uma modalidade, o meio de diferenciação osteogênica compreende ou consiste em DMEM suplementado com L-alanil-L-glutamina, hPL (cerca de 5%, v/v), dexametasona (cerca de 1 M), ácido ascórbico (cerca de 0,25 mM) e fosfato de sódio (cerca de 2,93 mM). Em uma modalidade, o meio de diferenciação osteogênica compreende ou consiste em DMEM suplementado com L-alanil-L-glutamina, hPL (cerca de 5%, v/v), dexametasona (cerca de 1 M), ácido ascórbico

(cerca de 0,25 mM) e fosfato de sódio (cerca de 2,93 mM), penicilina (cerca de 100 U/mL) e estreptomicina (cerca de 100 g/mL). Em uma modalidade, o meio de diferenciação osteogênica compreende ainda anfotericina B (cerca de 0,1%).

[0052] Em outra modalidade, as ASCs são ASCs diferenciadas condrogênicas. Em outras palavras, em uma modalidade preferida, as ASCs são diferenciadas em células condrogênicas. Em ainda outras palavras, em uma modalidade preferida, as ASCs são diferenciadas em meio condrogênico.

Em uma modalidade particular, as ASCs são diferenciadas em condrócitos.

[0053] Métodos para controlar e avaliar a diferenciação condrogênica são conhecidos na técnica. Por exemplo, a diferenciação condrogênica das células ou tecidos da invenção pode ser avaliada por coloração de Alcian Blue.

[0054] Em uma modalidade, a diferenciação condrogênica é realizada por cultura de ASCs em meio de diferenciação condrogênica.

[0055] Em uma modalidade, o meio de diferenciação condrogênica compreende ou consiste em DMEM, hPL, piruvato de sódio, ITS, prolina, TGF-1 e dexametasona. Em uma modalidade, o meio de diferenciação condrogênica compreende ainda antibióticos, como penicilina, estreptomicina, gentamicina e/ou anfotericina B.

[0056] Em uma modalidade, o meio de diferenciação condrogênica compreende ou consiste em DMEM, hPL (cerca de 5%, v/v), dexametasona (cerca de 1 M), piruvato de sódio (cerca de 100 g/mL), ITS (cerca de 1X), prolina (cerca de 40 g/mL) e TGF-1 (cerca de 10 ng/mL).

[0057] Em outra modalidade, as ASCs são ASCs diferenciadas queratinogênicas. Em outras palavras, em uma modalidade preferida, as ASCs são diferenciadas em células queratinogênicas. Em ainda outras palavras, em uma modalidade preferida, as ASCs são diferenciadas em meio queratinogênico. Em uma modalidade particular, as ASCs são diferenciadas em queratinócitos.

[0058] Os métodos para controlar e avaliar a diferenciação queratinogênica são conhecidos na técnica.

Por exemplo, a diferenciação queratinogênica das células ou tecidos da invenção pode ser avaliada por coloração de Pankeratin ou CD34.

[0059] Em uma modalidade, a diferenciação em queratinócitos é realizada por cultura de ASCs em meio de diferenciação queratinogênica.

[0060] Em uma modalidade, o meio de diferenciação queratinogênica compreende ou consiste em DMEM, hPL,

insulina, KGF, hEGF, hidrocortisona e CaCl2. Em uma modalidade, o meio de diferenciação queratinogênico compreende ainda antibióticos, tais como penicilina, estreptomicina, gentamicina e/ou anfotericina B.

[0061] Em uma modalidade, o meio de diferenciação queratinogênico compreende ou consiste em DMEM, hPL (cerca de 5%, v/v), insulina (cerca de 5 g/mL), KGF (cerca de 10 ng/mL), hEGF (cerca de 10 ng/mL), hidrocortisona (cerca de 0,5 g/mL) e CaCl2 (cerca de 1,5 mM).

[0062] Em outra modalidade, as ASCs são ASCs diferenciadas endoteliogênicas. Em ainda outras palavras, em uma modalidade preferida, as ASCs são diferenciadas em meio endoteliogênico. Em uma modalidade particular, as ASCs são diferenciadas em células endoteliais.

[0063] Métodos para controlar e avaliar a diferenciação endoteliogênica são conhecidos na técnica.

Por exemplo, a diferenciação endoteliogênica das células ou tecidos da invenção pode ser avaliada por coloração de CD34.

[0064] Em uma modalidade, a diferenciação em células endoteliais é realizada por cultura de ASCs em meio de diferenciação endoteliogênica.

[0065] Em uma modalidade, o meio de diferenciação endoteliogênica compreende ou consiste em meio EBMTM-2,

hPL, hEGF, VEGF, R3-IGF-1, ácido ascórbico, hidrocortisona e hFGFb. Em uma modalidade, o meio de diferenciação endoteliogênica compreende ainda antibióticos, como penicilina, estreptomicina, gentamicina e/ou anfotericina B.

[0066] Em uma modalidade, o meio de diferenciação endoteliogênica compreende ou consiste em meio EBMTM-2, hPL (cerca de 5%, v/v), hEGF (cerca de 0,5 mL), VEGF (cerca de 0,5 mL), R3-IGF-1 (cerca de 0,5 mL), ácido ascórbico (cerca de 0,5 mL), hidrocortisona (cerca de 0,2 mL) e hFGFb (cerca de 2 mL), reagentes do kit Clonetics™ EGM™ -2MV BulletKit™ CC-3202 (Lonza).

[0067] Em outra modalidade, as ASCs são ASCs diferenciadas miofibrogênicas. Em outras palavras, em uma modalidade preferida, as ASCs são diferenciadas em células miofibrogênicas. Em ainda outras palavras, em uma modalidade preferida, as ASCs são diferenciadas em meio miofibrogênico. Em uma modalidade particular, as ASCs são diferenciadas em miofibroblastos.

[0068] Métodos para controlar e avaliar a diferenciação miofibrogênica são conhecidos na técnica. Por exemplo, a diferenciação miofibrogênica das células ou tecidos da invenção pode ser avaliada por coloração de - SMA.

[0069] Em uma modalidade, a diferenciação em células miofibrogênicas é realizada por cultura de ASCs em meio de diferenciação miofibrogênica.

[0070] Em uma modalidade, o meio de diferenciação miofibrogênica compreende ou consiste em DMEM: F12, piruvato de sódio, ITS, vitamina RPMI 1640, TGF-1, Glutationa, MEM. Em uma modalidade, o meio de diferenciação miofibrogênica compreende ainda antibióticos, como penicilina, estreptomicina, gentamicina e/ou anfotericina B.

[0071] Em uma modalidade, o meio de diferenciação miofibrogênica compreende ou consiste em DMEM: F12, piruvato de sódio (cerca de 100 g/mL), ITS (cerca de 1X), vitamina RPMI 1640 (cerca de 1X), TGF-1 (cerca de 1 ng/mL), Glutationa (cerca de 1 g/mL), MEM (cerca de 0,1 mM).

[0072] Em outra modalidade, as ASCs são ASCs diferenciadas adipogênicas. Em outras palavras, em uma modalidade preferida, as ASCs são diferenciadas em células adipogênicas. Em ainda outras palavras, em uma modalidade preferida, as ASCs são diferenciadas em meio adipogênico.

Em uma modalidade particular, as ASCs são diferenciadas em adipócitos.

[0073] Métodos para controlar e avaliar a diferenciação adipogênica são conhecidos na técnica. Por exemplo, a diferenciação adipogênica das células ou tecidos da invenção pode ser avaliada por coloração com Oil-Red.

[0074] Em uma modalidade, a diferenciação em adipócitos é realizada por cultura de ASCs em meio de diferenciação adipogênica.

[0075] Em uma modalidade, o meio de diferenciação adipogênica compreende ou consiste em DMEM, hPL, Dexametazona, insulina, Indometacina e IBMX. Em uma modalidade, o meio de diferenciação adipogênica compreende ainda antibióticos, como penicilina, estreptomicina, gentamicina e/ou anfotericina B.

[0076] Em uma modalidade, o meio de diferenciação adipogênica compreende ou consiste em DMEM, hPL (cerca de 5%), Dexametazona (cerca de 1 M), insulina (cerca de 5 g/mL), Indometacina (cerca de 50 M) e IBMX (cerca de 0,5 mM).

[0077] Em uma modalidade, as ASCs são células- tronco derivadas de tecido adiposo de passagem tardia.

Conforme usado neste documento, o termo "passagem tardia" significa células-tronco derivadas do tecido adiposo diferenciadas pelo menos após a passagem 4. Conforme usado neste documento, a passagem 4 se refere à quarta passagem, ou seja, o quarto ato de divisão das células, destacando-as da superfície do recipiente de cultura antes de serem ressuspensas em meio fresco. Em uma modalidade, as células- tronco derivadas do tecido adiposo de passagem tardia são diferenciadas após passagem 4, passagem 5, passagem 6 ou mais. Em uma modalidade preferencial, as ASCs são diferenciadas após a passagem 4.

[0078] A passagem inicial das células primárias foi referida como passagem 0 (P0). De acordo com a presente invenção, a passagem P0 se refere à semeadura de suspensão de células da Fração Vascular Estromal (SVF) peletizada em vasos de cultura. Portanto, a passagem P4 significa que as células foram separadas 4 vezes (em P1, P2, P3 e P4) da superfície do recipiente de cultura (por exemplo, por digestão com tripsina) e ressuspensas em meio fresco.

[0079] Em uma modalidade, as ASCs da invenção são cultivadas em meio de proliferação até a quarta passagem.

Em uma modalidade, as ASCs da invenção são cultura em meio de diferenciação após a quarta passagem. Por conseguinte, em uma modalidade, nas passagens P1, P2 e P3, as ASCs são destacadas da superfície do recipiente de cultura e, em seguida, diluídas para a densidade celular apropriada no meio de proliferação. Ainda de acordo com esta modalidade, na passagem P4, as ASCs são destacadas da superfície do recipiente de cultura e, em seguida, diluídas para a densidade celular apropriada no meio de diferenciação.

Portanto, de acordo com esta modalidade, em P4 as ASCs da invenção não são ressuspensas e cultivadas em meio de proliferação até que atinjam a confluência antes de serem diferenciadas (isto é, antes de serem cultivadas em meio de diferenciação), mas são diretamente ressuspensas e cultivadas em meio de diferenciação.

[0080] Em uma modalidade, as células são mantidas em meio de diferenciação pelo menos até que atinjam a confluência, de um modo preferido entre 70% e 100% de confluência, de um modo mais preferido entre 80% e 95% de confluência. Em uma modalidade, as células são mantidas em meio de diferenciação por pelo menos 5 dias, de um modo preferido pelo menos 10 dias, de um modo mais preferido pelo menos 15 dias. Em uma modalidade, as células são mantidas em meio de diferenciação de 5 a 30 dias, de um modo preferido de 10 a 25 dias, de um modo mais preferido de 15 a 20 dias. Em uma modalidade, o meio de diferenciação é substituído a cada 2 dias. No entanto, como é conhecido na técnica, a taxa de crescimento celular de um doador para outro pode ser ligeiramente diferente. Assim, a duração da diferenciação e o número de mudanças de meio podem variar de um doador para outro.

[0081] Em uma modalidade, as células são mantidas em meio de diferenciação pelo menos até a formação de tecido distinto, dependendo do meio de diferenciação usado.

[0082] Por exemplo, as células podem ser mantidas em meio de diferenciação osteogênica pelo menos até a formação do osteóide, isto é, a porção orgânica não mineralizada da matriz óssea que se forma antes da maturação do tecido ósseo.

[0083] Parâmetros de cultura, tais como, por exemplo, temperatura, pH, teor de O2, teor de CO2 e salinidade podem ser ajustados de acordo com os protocolos padrão disponíveis no estado da técnica.

[0084] Em uma modalidade, a gelatina da invenção é gelatina porcina. Conforme usado neste documento, o termo "gelatina porcina" pode ser substituído por "gelatina de suíno" ou "gelatina de porco". Em uma modalidade, a gelatina é gelatina de pele porcina.

[0085] Em uma modalidade, a gelatina da invenção está na forma de partículas, grânulos, esferas, microesferas e semelhantes.

[0086] Em uma modalidade, a gelatina da invenção não é estruturada para formar uma forma ou estrutura 3D predefinida, como, por exemplo, um cubo. Em uma modalidade, a gelatina da invenção não tem uma forma ou estrutura predefinida. Em uma modalidade, a gelatina da invenção não tem a forma de um cubo. Em uma modalidade, a gelatina, de um modo preferido a gelatina porcina, não é uma estrutura 3D. Em uma modalidade, o biomaterial da invenção é livre de estrutura.

[0087] Em uma modalidade, a gelatina da invenção é um microtransportador macroporoso.

[0088] Exemplos de partículas de gelatina porcina incluem, mas não estão limitados a, Cultispher® G, Cultispher® S, Spongostan e Cutanplast. Em uma modalidade, a gelatina da invenção é Cultispher® G ou Cultispher® S.

[0089] Em uma modalidade, a gelatina, de um modo preferido a gelatina porcina, da invenção tem um diâmetro médio de pelo menos cerca de 50 m, de um modo preferido de pelo menos cerca de 75 m, de um modo mais preferido de pelo menos cerca de 100 m, de um modo mais preferido de pelo menos cerca de 130 m. Em uma modalidade, a gelatina da invenção, de um modo preferido a gelatina porcina, tem um diâmetro médio de no máximo cerca de 1000 m, de um modo preferido de no máximo cerca de 750 m, de um modo mais preferido de no máximo cerca de 500 m. Em outra modalidade, a gelatina da invenção, de um modo preferido a gelatina porcina, tem um diâmetro médio de no máximo cerca de 450 m, de um modo preferido de no máximo cerca de 400 m, de um modo mais preferido de pelo menos cerca de 380 m.

[0090] Em uma modalidade, a gelatina da invenção, de um modo preferido a gelatina porcina, tem um diâmetro médio variando de cerca de 50 m a cerca de 1000 m, de um modo preferido de cerca de 75 m a cerca de 750 m, de um modo mais preferido de cerca de 100 m a cerca de 500 m.

Em outra modalidade, a gelatina da invenção, de um modo preferido a gelatina porcina, tem um diâmetro médio que varia de cerca de 50 m a cerca de 500 m, de um modo preferido de cerca de 75 m a cerca de 450 m, de um modo mais preferido de cerca de 100 m a cerca de 400 m. Em outra modalidade, a gelatina da invenção, de um modo preferido a gelatina porcina, tem um diâmetro médio que varia de cerca de 130 m a cerca de 380 m.

[0091] Os métodos para avaliar o diâmetro médio das partículas de gelatina de acordo com a invenção são conhecidos na técnica. Exemplos de tais métodos incluem, mas não estão limitados a, granulometria, em particular usando peneiras adequadas; sedimentometria; técnicas de centrifugação; difração de laser; e análise de imagens, em especial por meio de uma câmera de alto desempenho com lentes telecêntricas; e similares. Em uma modalidade, a gelatina é adicionada a uma concentração que varia de cerca de 0,1 cm3 a cerca de 5 cm3 para um vaso de 150 cm2, de um modo preferido de cerca de 0,5 cm3 a cerca de 4 cm3, de um modo mais preferido de cerca de 0,75 cm3 a cerca de 3 cm3.

Em uma modalidade, a gelatina é adicionada em uma concentração que varia de cerca de 1 cm3 a cerca de 2 cm3 para um vaso de 150 cm2. Em uma modalidade, a gelatina é adicionada a uma concentração de cerca de 1 cm3, 1,5 cm3 ou 2 cm3 para um vaso de 150 cm2.

[0092] Em uma modalidade, a gelatina é adicionada a uma concentração que varia de cerca de 0,1 g a cerca de 5 g para um recipiente de 150 cm2, de um modo preferido de cerca de 0,5 g a cerca de 4 g, de um modo mais preferido de cerca de 0,75 g a cerca de 3 g. Em uma modalidade, a gelatina é adicionada em uma concentração que varia de cerca de 1 g a cerca de 2 g para um recipiente de 150 cm2.

Em uma modalidade, a gelatina é adicionada a uma concentração de cerca de 1 g, 1,5 g ou 2 g para um recipiente de 150 cm2.

[0093] Em uma modalidade, a gelatina da invenção é adicionada ao meio de cultura após a diferenciação das células. Em uma modalidade, a gelatina da invenção é adicionada ao meio de cultura quando as células são subconfluentes. Em uma modalidade, a gelatina da invenção é adicionada ao meio de cultura quando as células são superconfluentes. Em uma modalidade, a gelatina da invenção é adicionada ao meio de cultura quando as células atingem a confluência após a diferenciação. Em outras palavras, em uma modalidade, a gelatina da invenção é adicionada ao meio de cultura quando as células atingem a confluência no meio de diferenciação. Em uma modalidade, a gelatina da invenção é adicionada ao meio de cultura pelo menos 5 dias após P4, de um modo preferido 10 dias, de um modo mais preferido 15 dias. Em uma modalidade, a gelatina da invenção é adicionada ao meio de cultura de 5 a 30 dias após P4, de um modo preferido de 10 a 25 dias, de um modo mais preferido de 15 a 20 dias.

[0094] Em uma modalidade, o biomaterial de acordo com a invenção é bidimensional. Nesta modalidade, o biomaterial da invenção pode formar uma película fina de menos de 1 mm.

[0095] Dentro do escopo da invenção, a expressão "menos de 1 mm" abrange 0,99 mm, 0,95 mm, 0,9 mm, 0,8 mm, 0,75 mm, 0,7 mm, 0,6 mm, 0,5 mm, 0,4 mm, 0,3 mm, 0,2 mm, 0,1 mm e menos. Em algumas modalidades, a expressão "menor que" pode ser substituída pela expressão "inferior a".

[0096] Em outra modalidade, o biomaterial de acordo com a invenção é tridimensional. Nesta modalidade, o biomaterial da invenção pode formar uma película espessa com uma espessura de pelo menos 1 mm. O tamanho do biomaterial pode ser adaptado ao uso.

[0097] Dentro do escopo da invenção, a expressão "pelo menos 1 mm" abrange 1 mm, 1,2 mm, 1,3 mm, 1,5 mm, 1,6 mm, 1,75 mm, 1,8 mm, 1,9 mm, 2 mm, 2,25 mm, 2,5 mm, 2,75 mm, 3 mm, 3,5 mm, 4 mm, 4,5 mm, 5 mm e mais. Em algumas modalidades, a expressão "pelo menos 1 mm" pode ser substituída pela expressão "igual ou superior a 1 mm".

[0098] Em uma modalidade, o biomaterial da invenção não compreende uma estrutura. Tal como aqui utilizado, o termo "estrutura" significa uma estrutura que imita a porosidade, tamanho de poro e/ou função de tecidos de mamíferos nativos, incluindo tecidos humanos e animais, tais como ossos de mamíferos nativos ou estrutura que imita a estrutura da matriz extracelular natural. Exemplos de tais estruturas incluem, mas não estão limitados a, osso artificial, esponjas de colágeno, hidrogéis, tais como hidrogéis de proteína, hidrogéis de peptídeo, hidrogéis de polímero e hidrogéis de nanocelulose à base de madeira e semelhantes. Em uma modalidade, o biomaterial da invenção não compreende um osso artificial. Em uma modalidade, o material biocompatível da invenção não é um osso artificial. Em uma modalidade, o biomaterial da invenção não compreende uma derme artificial. Em uma modalidade, o material biocompatível da invenção não é uma derme artificial.

[0099] Em uma modalidade, a multidimensionalidade do biomaterial da invenção não é devido a uma estrutura que imita a estrutura da matriz extracelular natural. Em uma modalidade, o biomaterial da invenção não compreende uma estrutura que imita a estrutura da matriz extracelular natural.

[00100] Em uma modalidade, a multidimensionalidade do biomaterial da invenção é devido à síntese da matriz extracelular por células-tronco derivadas do tecido adiposo da invenção.

[00101] Em uma modalidade, o biomaterial da invenção compreende uma matriz extracelular. Em uma modalidade, a matriz extracelular do biomaterial da invenção é derivada das ASCs.

[00102] Conforme usado neste documento, o termo "matriz extracelular" significa uma rede macromolecular tridimensional não celular. Os componentes da matriz de ECM se ligam uns aos outros, bem como aos receptores de adesão celular, formando assim uma rede complexa na qual as células residem em tecidos ou em biomateriais da invenção.

[00103] Em uma modalidade, a matriz extracelular da invenção compreende colágeno, proteoglicanos/ glicosaminoglicanos, elastina, fibronectina, laminina e/ou outras glicoproteínas. Em uma modalidade particular, a matriz extracelular da invenção compreende colágeno. Em outra modalidade particular, a matriz extracelular da invenção compreende proteoglicanos. Em outra modalidade particular, a matriz extracelular da invenção compreende colágeno e proteoglicanos. Em uma modalidade, a matriz extracelular da invenção compreende fatores de crescimento,

proteoglicanos, fatores de secreção, reguladores de matriz extracelular e glicoproteínas.

[00104] Em uma modalidade, as ASCs dentro do biomaterial da invenção formam um tecido, aqui referido como tecido de ASCs.

[00105] Em uma modalidade, o tecido de ASCs é um tecido interconectivo celularizado. Em uma modalidade, o material biocompatível, de um modo preferido as partículas biocompatíveis, é integrado no tecido interconectivo celularizado. Em uma modalidade, o material biocompatível, de um modo preferido as partículas biocompatíveis, é disperso no tecido de ASCs.

[00106] Em uma modalidade, o biomaterial da invenção é caracterizado por um tecido interconectivo formado através da gelatina. Em uma modalidade, o biomaterial da invenção é caracterizado pela mineralização em torno da gelatina.

[00107] Em uma modalidade, quando o meio de diferenciação osteogênica é usado, o biomaterial da invenção tem as mesmas propriedades que um osso real com expressão de osteocalcina e propriedades de mineralização.

De acordo com esta modalidade, o biomaterial da invenção compreende células ósseas. Ainda de acordo com esta modalidade, o biomaterial da invenção compreende células ósseas e uma matriz extracelular. Ainda de acordo com esta modalidade, o biomaterial da invenção compreende células ósseas e colágeno. Ainda de acordo com esta modalidade, o biomaterial da invenção compreende uma matriz óssea.

[00108] Em uma modalidade, o biomaterial da invenção é tal que a diferenciação das células do biomaterial atingiu um ponto final e o fenótipo do biomaterial permanecerá inalterado quando implantado.

[00109] Em uma modalidade, o biomaterial da invenção compreende fatores de crescimento. Em uma modalidade, o biomaterial da invenção compreende VEGF e/ou SDF-1.

[00110] Em uma modalidade, o biomaterial de acordo com a invenção é mineralizado. Conforme usado neste documento, o termo "mineralização" ou "densidade mineral do tecido ósseo" se refere à quantidade de matéria mineral por centímetro quadrado de ossos ou tecidos "semelhantes aos ossos" formados por biomaterial, também expressa em porcentagem. Por conseguinte, conforme usado neste documento, o termo "mineralização" ou "densidade mineral do tecido ósseo" se refere à quantidade de matéria mineral por centímetro quadrado de biomaterial, também expressa em porcentagem.

[00111] Métodos para avaliar o grau de mineralização de um biomaterial são conhecidos na técnica. Exemplos de tais métodos incluem, mas não estão limitados a, análise de micro tomografia computadorizada (micro-TC), espectrometria de massa de imagem, coloração com azul de calceína, análise de distribuição de densidade mineral óssea (BMDD) e semelhantes.

[00112] Em uma modalidade, a mineralização do biomaterial da invenção aumenta com a maturação do biomaterial. Conforme usado neste documento, o termo "maturação do biomaterial" significa a duração da cultura com gelatina. Em outras palavras, a maturação do biomaterial corresponde ao tempo de indução multidimensional.

[00113] Em uma modalidade, o grau de mineralização do biomaterial da invenção é inferior a 1%. Em uma modalidade, o grau de mineralização inferior a 1% é obtido com uma maturação inferior a 12 semanas em meio de diferenciação osteogênica. Em uma modalidade, o grau de mineralização inferior a 1% é obtido com uma maturação inferior ou igual a 8 semanas em meio de diferenciação osteogênica.

[00114] Em uma modalidade, o grau de mineralização do biomaterial da invenção varia de cerca de 1% a cerca de 20%, de um modo preferido de cerca de 1% a cerca de 15%, de um modo mais preferido de cerca de 1% a cerca de 10%, de um modo ainda mais preferido de cerca de 1 % a cerca de 5%. Em uma modalidade, o grau de mineralização do biomaterial da invenção varia de cerca de 1% a cerca de 4% ou 3%. Dentro do escopo da invenção, a expressão "cerca de 1% a cerca de 20%" abrange cerca de 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19% e cerca de 20%.

[00115] Em outra modalidade, o grau de mineralização do biomaterial da invenção é de pelo menos 1% ou 1,24%. Em uma modalidade, o grau de mineralização de pelo menos 1% ou 1,24% é obtido com uma maturação superior ou igual a 12 semanas em meio de diferenciação osteogênica.

[00116] Em outra modalidade, o grau de mineralização do biomaterial da invenção é de pelo menos 2%, 2,5% ou 2,77%. Em uma modalidade, o grau de mineralização de pelo menos 2%, 2,5% ou 2,77% é obtido com uma maturação superior ou igual a 25 semanas em meio de diferenciação osteogênica.

[00117] Em uma modalidade particular, o grau de mineralização do biomaterial da invenção é de cerca de 0,07%. Em outra modalidade particular, o grau de mineralização do biomaterial da invenção é de cerca de 0,28%. Em outra modalidade particular, o grau de mineralização do biomaterial da invenção é de cerca de 0,33%. Em outra modalidade particular, o grau de mineralização do biomaterial da invenção é de cerca de 1,24%. Em outra modalidade particular, o grau de mineralização do biomaterial da invenção é de cerca de 2,77%.

[00118] A presente invenção também se refere a um método para a produção de uma estrutura multidimensional compreendendo células-tronco derivadas do tecido adiposo diferenciadas (ASCs), uma matriz extracelular e gelatina.

[00119] Em uma modalidade, o método para produzir o biomaterial de acordo com a invenção compreende as etapas de: - proliferação celular, - diferenciação celular, e - indução multidimensional.

[00120] Em uma modalidade, o método para produzir o biomaterial de acordo com a invenção compreende as etapas de: - proliferação de ASCs, - diferenciação de ASCs, e - indução tridimensional.

[00121] Em uma modalidade, o método para produzir o biomaterial de acordo com a invenção compreende as etapas de: - isolar células, de um modo preferido ASCs, de um indivíduo; - proliferar células, de um modo preferido ASCs, - diferenciar as células proliferadas, de um modo preferido ASCs, e - cultivar células diferenciadas, de um modo preferido

ASCs, na presença de uma gelatina.

[00122] Em uma modalidade, o método para produzir o biomaterial da invenção compreende ainda uma etapa de isolamento de células, de um modo preferido ASCs, realizada antes da etapa de proliferação celular. Em uma modalidade, o método para produzir o biomaterial da invenção compreende ainda uma etapa de isolamento de células, de um modo preferido ASCs, realizada antes da etapa de proliferação celular.

[00123] Em uma modalidade, a etapa de proliferação é realizada em meio de proliferação. Em uma modalidade particular, o meio de proliferação é DMEM. Em uma modalidade, o meio de proliferação é suplementado com Ala- Gln e/ou lisado de plaquetas humanas (hPL). Em uma modalidade, o meio de proliferação compreende ainda antibióticos, como penicilina e/ou estreptomicina.

[00124] Em uma modalidade, o meio de proliferação compreende ou consiste em DMEM suplementado com Ala-Gln e hPL (5%). Em uma modalidade, o meio de proliferação compreende ou consiste em DMEM suplementado com Ala-Gln, hPL (5%, v/v), penicilina (100 U/mL) e estreptomicina (100 g/mL).

[00125] Em uma modalidade, a etapa de proliferação é realizada conforme descrito acima. Em uma modalidade, a etapa de proliferação é realizada até P8. Em uma modalidade, a etapa de proliferação dura até P4, P5, P6, P7 ou P8. Consequentemente, em uma modalidade, a etapa de proliferação celular inclui pelo menos 3 passagens. Em uma modalidade, a etapa de proliferação celular inclui no máximo 7 passagens. Em uma modalidade, a etapa de proliferação celular inclui de 3 a 7 passagens. Em uma modalidade particular, a etapa de proliferação é realizada até P4. Consequentemente, em uma modalidade, a etapa de proliferação celular inclui separar as células da superfície do recipiente de cultura e, em seguida, diluí- las em meio de proliferação nas passagens P1, P2 e P3. Em uma modalidade de uma proliferação até P6, a etapa de proliferação celular inclui separar as células da superfície do recipiente de cultura e, em seguida, diluí- las em meio de proliferação nas passagens P1, P2, P3, P4 e P5.

[00126] Em uma modalidade, a etapa de proliferação dura o tempo necessário para que as células sejam passadas 3, 4, 5, 6 ou 7 vezes. Em uma modalidade particular, a etapa de proliferação dura o tempo necessário para que as células sejam passadas 3 vezes. Em uma modalidade, a etapa de proliferação dura até que as células atinjam a confluência após a última passagem, de um modo preferido entre 70% e 100% de confluência, de um modo mais preferido entre 80% e 95% de confluência. Em uma modalidade, a etapa de proliferação dura até as células atingirem a confluência após a terceira, quarta, quinta, sexta ou sétima passagem.

[00127] Em uma modalidade vantajosa, a cultura de células, de um modo preferido ASCs, em meio de diferenciação antes da adição de gelatina é uma etapa chave do método da invenção. Essa etapa é necessária para permitir a diferenciação das ASCs em células osteogênicas.

Além disso, esta etapa é necessária para a obtenção de uma estrutura multidimensional.

[00128] Em uma modalidade, a etapa de diferenciação é realizada após P4, P5, P6, P7 ou P8. Em uma modalidade, a etapa de diferenciação é realizada quando as células não estão em confluência. Em uma modalidade particular, a etapa de diferenciação é realizada após P4, P5, P6, P7 ou P8 sem cultura de células até a confluência.

[00129] Em uma modalidade, a etapa de diferenciação é realizada em P4, P5, P6, P7 ou P8. Em uma modalidade, a etapa de diferenciação é realizada quando as células não estão em confluência. Em uma modalidade particular, a etapa de diferenciação é realizada em P4, P5, P6, P7 ou P8 sem cultura de células até a confluência.

[00130] Em uma modalidade, a etapa de diferenciação é realizada incubando células em um meio de diferenciação.

Em uma modalidade, a etapa de diferenciação é realizada incubando células em um meio de diferenciação osteogênica,

condrogênica, miofibrogênica ou queratinogênica, de um modo preferido em um meio de diferenciação osteogênica, condrogênica ou miofibrogênica, de um modo mais preferido em um meio de diferenciação osteogênica ou condrogênica, de um modo mais preferido um meio osteogênico. Em uma modalidade, a etapa de diferenciação é realizada pela ressuspensão das células destacadas da superfície do recipiente de cultura em meio de diferenciação.

[00131] Em uma modalidade, a incubação de ASCs em meio de diferenciação é realizada por pelo menos 3 dias, de um modo preferido pelo menos 5 dias, de um modo mais preferido pelo menos 10 dias, de um modo mais preferido pelo menos 15 dias. Em uma modalidade, a incubação de ASCs em meio de diferenciação é realizada de 5 a 30 dias, de um modo preferido de 10 a 25 dias, de um modo mais preferido de 15 a 20 dias. Em uma modalidade, o meio de diferenciação é substituído a cada 2 dias. Dentro do escopo da invenção, a expressão "pelo menos 3 dias" abrange 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 dias e mais.

[00132] Em uma modalidade, a etapa de indução multidimensional, de um modo preferido indução 3D, é realizada adicionando gelatina, conforme definido acima, no meio de diferenciação. Em uma modalidade, as células são mantidas em meio de diferenciação durante a etapa de indução multidimensional, de um modo preferido indução 3D.

[00133] Em uma modalidade, a etapa de indução multidimensional, de um modo preferido indução 3D, é realizada quando as células atingem confluência no meio de diferenciação, de um modo preferido entre 70% e 100% de confluência, de um modo mais preferido entre 80% e 95% de confluência.

[00134] Em outra modalidade, a etapa de indução multidimensional, de um modo preferido indução 3D, é realizada quando uma mudança morfológica aparece. Em uma modalidade, a etapa de indução multidimensional, de um modo preferido indução 3D, é realizada quando pelo menos um tecido distinto ocorre, dependendo do meio de diferenciação usado. Por exemplo, quando o meio de diferenciação osteogênica é usado, a etapa de indução multidimensional, de um modo preferido indução 3D, é realizada quando pelo menos um nódulo osteóide é formado. Conforme usado neste documento, o termo "osteóide" significa uma porção orgânica não mineralizada da matriz óssea que se forma antes da maturação do tecido ósseo.

[00135] Em outra modalidade, a etapa de indução multidimensional, de um modo preferido indução 3D, é realizada quando as células atingem a confluência.

[00136] Em uma modalidade, as células e a gelatina da invenção são incubadas por pelo menos 5 dias, de um modo preferido pelo menos 10 dias, de um modo mais preferido pelo menos 15 dias. Em uma modalidade, as células e a gelatina da invenção são incubadas de 10 dias a 30 dias. No escopo da invenção, a expressão "pelo menos 5 dias" abrange 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 dias e mais.

[00137] Em outra modalidade, as células e a gelatina da invenção são incubadas por pelo menos 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas, 8 semanas, 12 semanas, 25 semanas ou 34 semanas.

[00138] Em uma modalidade, o meio é substituído a cada 2 dias durante a etapa de indução multidimensional, de um modo preferido indução 3D.

[00139] A invenção também se refere a um biomaterial multidimensional que pode ser obtido pelo método de acordo com a invenção. Em uma modalidade, o biomaterial multidimensional é obtido pelo método de acordo com a invenção. Em uma modalidade, o biomaterial multidimensional é produzido pelo método de acordo com a invenção. Em uma modalidade, o biomaterial obtenível ou obtido pelo método da invenção se destina a ser implantado em um corpo humano ou animal. Em uma modalidade, o biomaterial implantado pode ser de origem autóloga ou alogênica. Em uma modalidade, o biomaterial da invenção pode ser implantado em uma área de osso, cartilagem, derme, músculo, tecido endotelial ou adiposo. Em uma modalidade, este biomaterial pode ser implantado em áreas irregulares do corpo humano ou animal.

[00140] Em uma modalidade, o biomaterial da invenção é homogêneo, o que significa que a estrutura e/ou constituição do biomaterial são semelhantes em todo o tecido. Em uma modalidade, o biomaterial tem características desejáveis de manuseio e mecânicas necessárias para implantação na área da doença nativa. Em uma modalidade, o biomaterial obtenível ou obtido pelo método da invenção pode ser mantido com um instrumento cirúrgico sem ser rasgado.

[00141] Outro objeto da presente invenção é um dispositivo médico que compreende um biomaterial de acordo com a invenção.

[00142] Ainda outro objeto é uma composição farmacêutica compreendendo um biomaterial de acordo com a invenção e pelo menos um veículo farmaceuticamente aceitável.

[00143] A presente invenção também se refere a um biomaterial ou uma composição farmacêutica de acordo com a invenção para uso como um medicamento.

[00144] A invenção se refere a qualquer uso do biomaterial da invenção, como um dispositivo médico ou incluído em um dispositivo médico, ou em uma composição farmacêutica. Em certas modalidades, o biomaterial, dispositivo médico ou composição farmacêutica da invenção é um material tipo massa que pode ser manipulado e moldado antes do uso.

[00145] A presente invenção se refere ainda a um biomaterial com uma estrutura multidimensional que compreende células-tronco derivadas de adiposo diferenciadas (ASCs), uma matriz extracelular e gelatina, um dispositivo médico ou uma composição farmacêutica compreendendo o mesmo, para uso para ou para uso em, tratar um defeito de tecido em um indivíduo com necessidade.

[00146] Outro aspecto da invenção também se refere ao uso de um biomaterial tendo uma estrutura multidimensional compreendendo células-tronco derivadas do tecido adiposo (ASCs) diferenciadas, uma matriz extracelular e gelatina, um dispositivo médico ou uma composição farmacêutica compreendendo o mesmo, para o tratamento de um defeito do tecido. Um outro aspecto da invenção também se refere ao uso de um biomaterial tendo uma estrutura multidimensional compreendendo células-tronco derivadas de adiposo (ASCs) diferenciadas, uma matriz extracelular e gelatina, um dispositivo médico ou uma composição farmacêutica compreendendo o mesmo, para a preparação ou a fabricação de um medicamento para tratar um defeito de tecido.

[00147] A presente invenção se refere ainda a um método de tratamento de defeito de tecido em um indivíduo com necessidade, compreendendo administrar ao indivíduo uma quantidade terapeuticamente eficaz de um biomaterial, dispositivo médico ou composição farmacêutica de acordo com a invenção.

[00148] Um aspecto da invenção é um método de reconstrução de tecido em um indivíduo com necessidade, compreendendo administrar ao indivíduo uma quantidade terapeuticamente eficaz de um biomaterial, dispositivo médico ou composição farmacêutica de acordo com a invenção.

Conforme usado neste documento, o termo "reconstrução de tecido" pode ser substituído por "reparo de tecido" ou "regeneração de tecido".

[00149] Em uma modalidade, o termo "tecido" compreende ou consiste em osso, cartilagem, derme, músculo, endotélio e tecido adiposo. Consequentemente, em uma modalidade, o defeito do tecido compreende ou consiste em defeito de osso, cartilagem, derme, músculo, endotélio e tecido adiposo.

[00150] Em uma modalidade, a reconstrução de tecido é selecionada a partir do grupo que compreende ou consiste em reconstrução óssea, reconstrução da cartilagem, reconstrução da derme, reconstrução muscular ou miogênica, reconstrução endotelial e reconstrução adipogênica.

[00151] Exemplos de reconstrução de osso e derme incluem, mas não estão limitados a, reconstrução dérmica, cicatrização de feridas, tratamento de úlcera diabética, como úlcera de pé diabético, reconstrução de lesões pós- queimadura, reconstrução de lesões pós-radiação, reconstrução após câncer de mama ou deformidades mamárias.

[00152] Exemplos de reconstrução da derme incluem, mas não estão limitados a, reconstrução dérmica, cicatrização de feridas, tratamento de úlcera diabética, como úlcera de pé diabético, reconstrução de lesões pós- queimadura, reconstrução de lesões pós-radiação, reconstrução após câncer de mama ou deformidades mamárias.

[00153] Exemplos de reconstrução de cartilagem incluem, mas não estão limitados a, condroplastia de joelho, reconstrução de nariz ou orelha, reconstrução costal ou esternal.

[00154] Exemplos de reconstrução miogênica incluem, mas não estão limitados a, reconstrução do músculo esquelético, reconstrução após ruptura da parede abdominal, reconstrução após lesão muscular isquêmica de membros inferiores, reconstrução associada à síndrome compartimental (CS).

[00155] Exemplos de reconstrução endotelial incluem, mas não estão limitados a, recelularização de remendos vasculares para anastomose vascular, como fístula de arteriosclerose venosa.

[00156] Exemplos de reconstrução adipogênica incluem, mas não estão limitados a, cirurgia estética, rejuvenescimento, reconstrução de lipofilling.

[00157] A Requerente demonstrou que o biomaterial da invenção possui propriedades osteogênicas com a presença de tecido mineralizado no local do implante.

[00158] Em um aspecto particular, a invenção se refere ao biomaterial, dispositivo médico ou composição farmacêutica da invenção para uso no tratamento de defeitos ósseos. Em um aspecto particular, a invenção se refere ao biomaterial, dispositivo médico ou composição farmacêutica da invenção para uso na reconstrução óssea. Em uma modalidade, o biomaterial da invenção é para uso para preencher uma cavidade óssea no corpo humano ou animal.

[00159] Em uma modalidade, o biomaterial, dispositivo médico ou composição farmacêutica da invenção é para uso no tratamento de defeitos da cartilagem. Em uma modalidade, o biomaterial, dispositivo médico ou composição farmacêutica da invenção é para uso para reconstrução de cartilagem. Em uma modalidade, o biomaterial, dispositivo médico ou composição farmacêutica da invenção é para uso para condroplastia de joelho, reconstrução de nariz ou orelha, reconstrução costal ou esternal.

[00160] A Requerente demonstrou que o biomaterial da invenção tem as vantagens de uma reconstrução epidérmica e dérmica mais rápida, elicitação de uma resposta imune e aumento do número de fibras de elastina. Além disso, a cicatriz formada após a implantação do biomaterial da invenção não é hipertrófica.

[00161] Em uma modalidade, o biomaterial, dispositivo médico ou composição farmacêutica da invenção é para uso no tratamento de defeitos da derme. Em uma modalidade, o biomaterial, dispositivo médico ou composição farmacêutica da invenção é para uso na reconstrução da derme. Em uma modalidade, o biomaterial, dispositivo médico ou composição farmacêutica da invenção é para reconstrução dérmica, cicatrização de feridas, tratamento de úlcera diabética, tal como úlcera de pé diabético, reconstrução de lesões pós-queimadura, reconstrução de lesões pós-radiação, reconstrução após câncer de mama ou deformidades na mama.

Em uma modalidade particular, o biomaterial, dispositivo médico ou composição farmacêutica da invenção é para uso para ou para uso em tratamento de feridas na derme, de um modo preferido feridas na derme diabética. Em uma modalidade, o biomaterial, dispositivo médico ou composição farmacêutica da invenção é para promover o fechamento de feridas. Em uma modalidade, o biomaterial, dispositivo médico ou composição farmacêutica da invenção é para reduzir a espessura da ferida, em particular durante a cicatrização de feridas.

[00162] Em uma modalidade particular, o biomaterial, dispositivo médico ou composição farmacêutica da invenção é para uso para ou para uso em tratamento de epidermólise bulbosa, nevos congênitos gigantes e/ou aplasia cutis congênita.

[00163] Em ainda outro aspecto, a invenção se refere ao biomaterial, dispositivo médico ou composição farmacêutica da invenção para uso em cirurgia reconstrutiva ou estética.

[00164] Em uma modalidade, o biomaterial da invenção pode ser usado como um implante alogênico ou como um implante autólogo. Em uma modalidade, o biomaterial da invenção pode ser usado no enxerto de tecido.

[00165] Em uma modalidade, o indivíduo já foi tratado para defeito do tecido. Em outra modalidade, o indivíduo ainda não foi tratado para um defeito do tecido.

[00166] Em uma modalidade, o indivíduo não respondia a pelo menos um outro tratamento para um defeito de tecido.

[00167] Em uma modalidade, o indivíduo é diabético.

Em uma modalidade, o indivíduo sofre de uma ferida diabética.

[00168] Em uma modalidade, o indivíduo é um adulto, ou seja, tem 18 anos ou mais. Em outra modalidade, o indivíduo é uma criança, ou seja, tem menos de 18 anos.

[00169] Em uma modalidade, o biomaterial, dispositivo médico ou composição farmacêutica da invenção é administrado ao indivíduo com necessidade durante um procedimento de reconstrução de tecido.

[00170] Em algumas modalidades, o biomaterial, dispositivo médico ou composição farmacêutica da invenção é administrado ao indivíduo com necessidade por implantação cirúrgica, por exemplo, por meio de clipes ou um trocarte; ou por via laparoscópica.

[00171] A invenção também se refere a um kit, compreendendo um biomaterial, uma composição farmacêutica ou um dispositivo médico de acordo com a invenção e meios de fixação adequados. Exemplos de meios de fixação adequados incluem, mas não estão limitados a, cola cirúrgica, cola de tecido ou qualquer composição adesiva para uso cirúrgico que seja biocompatível, não tóxico e, opcionalmente, bioabsorvível.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[00172] As Figuras 1A a 1B são fotografias que mostram vistas macroscópicas de um biomaterial. Fig. 1A: biomaterial formado com gelatina porcina (Cultispher G) e ASCs em 2,5 semanas de cultura em meio de osteodiferenciação. Fig. B: biomaterial formado com gelatina porcina (Cultispher G) e ASCs em 7,5 semanas de cultura em meio de osteodiferenciação.

[00173] As Figuras 2A a 2B são fotografias que mostram manchas de hematoxilina-eosina de um biomaterial formado com gelatina porcina (Cultispher G) e ASCs em 7,5 semanas de cultura em meio de osteodiferenciação. Fig. 2A: ampliação original x5. Fig. 2B: ampliação x10.

[00174] As Figuras 3A a 3B são fotografias que mostram colorações de Von Kossa de um biomaterial formado com gelatina porcina (Cultispher G) e ASCs em 7,5 semanas de cultura em meio de osteodiferenciação. Fig. 3A: ampliação original. Fig. 3B: ampliação x10.

[00175] As Figuras 4A a 4B são fotografias que mostram a expressão de osteocalcina de um biomaterial formado com gelatina porcina (Cultispher G) e ASCs em 7,5 semanas de cultura em meio de osteodiferenciação. Fig. 4A: ampliação original. Fig. 4B: ampliação x10.

[00176] As Figuras 5A a 5L são gráficos que mostram a expressão de genes no biomaterial da invenção formado com ASCs e Cultipher G (biomaterial) em meio de osteodiferenciação em comparação com ASCs em MP (MP). Fig.

5A: ANG; Fig. 5B: ANGPT1; Fig. 5C: EPHB4; Fig. 5D: EDN1; Fig. 5E: THBS1; Fig. 5F: PTGS1; Fig. 5G: LEP; Fig. 5H: VEGFA; Fig. 5I: VEGFB; Fig. 5J: VEGFC; Fig. 5K: ID1; e Fig. 5L: TIMP1. *: p < 0,05.

[00177] As Figuras 6A a 06D são fotografias que mostram o biomaterial da invenção formado com ASCs e

Cultipher G em diferentes níveis de maturação em meio de osteodiferenciação. Fig. 6A: 4 semanas; Fig. 6B: 8 semanas; Fig. 6C: 12 semanas; e Fig. 6D: 25 semanas. A mineralização é exibida em amarelo na matriz 3D mostrada em transparente.

[00178] A Figura 7 é uma fotografia de radiografias dos "locais de implante" de biomaterial formado com gelatina porcina (Cultispher G ou S) e ASCs em 7,5 semanas de cultura em meio de osteodiferenciação em ratos Nude no dia 29 pós-implantação.

[00179] A Figura 8 é uma fotografia de radiografias dos "locais de implante" de biomaterial formado com gelatina suína (Cultispher G ou S) e ASCs em 7,5 semanas de cultura em meio de osteodiferenciação em ratos Wistar no dia 29 pós-implantação.

[00180] A Figura 9 é uma fotografia que mostra a coloração de Von Kossa de um biomaterial formado com gelatina porcina (Cultispher G ou S) e ASCs em 7,5 semanas de cultura em meio de osteodiferenciação.

[00181] A Figura 10 é uma fotografia que mostra a coloração com hematoxilina-eosina de um biomaterial formado com gelatina porcina (Cultispher S) e ASCs em 7,5 semanas de cultura em meio de osteodiferenciação.

[00182] A Figura 11 é uma fotografia que mostra a coloração de Von Kossa 29 dias após implantação em um rato

Nude de um biomaterial formado com gelatina porcina (Cultispher S) e ASCs em 7,5 semanas de cultura em meio de osteodiferenciação.

[00183] As Figuras 12A a 12B são fotografias que mostram radiografias dos "locais de implante" em ratos Nude. Fig. 12A: no dia 29 pós-implantação de um biomaterial formado com gelatina porcina (Cultispher G ou S) e ASCs em 7,5 semanas de cultura em meio de osteodiferenciação. Fig.

12B: no dia 29 pós-implantação de um biomaterial formado apenas com gelatina porcina (Cultispher G ou S).

[00184] As Figuras 13A a 13C são fotografias que mostram a cicatrização de feridas de pernas de ratos no dia 0 (D0), 15 (D15), 23 (D23) e 34 (D34). Fig. 13A: sem implantação; Fig. 13B: após implantação de partículas Cultispher S sozinhas; e Fig. 13C: após implantação de um biomaterial formado com gelatina porcina (Cultispher S) e ASCs em 8 semanas de cultura em meio de osteodiferenciação (C). Membros esquerdos: pernas isquêmicas; membros direitos: pernas não isquêmicas.

[00185] A Figura 14 é um histograma que mostra a área sob a curva (AUC) para o tamanho da ferida em pernas não isquêmicas (barras pretas) e pernas isquêmicas (barras brancas) não tratadas (placebo) ou tratadas apenas com partículas Cultispher S (Cultispher) ou um biomaterial formado com gelatina porcina (Cultispher S) e ASCs com 8 semanas de cultivo em meio de osteodiferenciação (biomaterial), avaliado em comparação com o placebo, fixado em 100%.

[00186] As Figuras 15A a 15B são gráficos que mostram a área da ferida em porcentagem do dia 0 ao dia 34 após o tratamento com partículas Cultispher S sozinha (quadrados) ou um biomaterial formado com gelatina porcina (Cultispher S) e ASCs em 8 semanas de cultura em meio de osteodiferenciação (círculos), ou não tratado (placebo, triângulos). Fig. 15A: em pernas não isquêmicas; Fig. 15B: nas pernas isquêmicas.

[00187] As Figuras 16A a 16B são gráficos que mostram dias de fechamento completo da ferida após nenhum tratamento (simulação, esquerda), tratamento com partículas Cultispher S sozinhas (meio) ou um biomaterial da invenção (direita). Fig. 16A: pernas não isquêmicas; Fig. 16B: pernas isquêmicas.

[00188] As Figuras 17A a 17C são gráficos que mostram o número de linfócitos CD3 (linhas pretas) e macrófagos CD68 (linhas cinza) do dia 0 ao dia 34 após o tratamento de uma perna isquêmica. Fig. 17A: sem tratamento (controle simulado). Fig. 17B: com partículas Cultispher S sozinhas. Fig. 17C: com um biomaterial formado com gelatina porcina (Cultispher S) e ASCs em 8 semanas de cultura em meio de osteodiferenciação.

[00189] As Figuras 18A a 18B são gráficos que mostram a espessura da ferida no dia 15 e no dia 34 após nenhum tratamento (controle simulado), após implantação de partículas Cultispher S sozinhas (Cultisphers) e após implantação de um biomaterial formado com gelatina porcina (Cultispher S) e ASCs em 8 semanas de cultura em meio de osteodiferenciação. Fig. 18A: em um modelo isquêmico. Fig.

18B: em um modelo não isquêmico.

[00190] As Figuras 19A a 19D são histogramas que mostram pontuações epidérmicas e dérmicas em pernas não isquêmicas no dia 1, 5, 15 e 34 após o tratamento com partículas Cultispher S sozinhas (histogramas pontilhados) ou um biomaterial formado com gelatina porcina (Cultispher S) e ASCs em 8 semanas de cultura em meio de osteodiferenciação (histogramas pretos), ou não tratado (placebo, histogramas listrados). Fig. 19A: pontuação epidérmica do núcleo da perna não isquêmica. Fig. 19B: pontuação epidérmica da periferia da perna não isquêmica.

Fig. 19C: pontuação dérmica do núcleo da perna não isquêmica. Fig. 19D: pontuação dérmica do contorno da perna não isquêmica.

[00191] As Figuras 20A a 20D são fotografias que mostram estruturas obtidas com ASCs e partículas em diferentes meios. Fig. 20A: meio osteogênico; Fig. 20B: meio condrogênico; Fig. 20C: meio miofibrogênico; e Fig.

20D: meio queratinogênico. Forma da estrutura (1.), capacidade de agarrar (2.), coloração com hematoxilina- eosina (3.) e colorações específicas do tecido (4.), particularmente osteocalcina (OC) para meio osteogênico, azul de alcian (AB) para meio condrogênico, -SMA para meio miofibrogênico e CD34 para meio queratinogênico.

EXEMPLOS

[00192] A presente invenção é ainda ilustrada pelos seguintes exemplos.

Exemplo 1: Produção de biomateriais da invenção

1.1. Isolamento de hASCs

[00193] O tecido adiposo subcutâneo humano foi colhido por lipoaspiração seguindo a técnica de Coleman na região abdominal e após consentimento informado e triagem sorológica.

[00194] Células-tronco derivadas de adiposo humano (hASCs) foram prontamente isoladas do tecido adiposo de entrada. O lipoaspirado pode ser armazenado a +4 °C por 24 horas ou por mais tempo a 80 °C.

[00195] Primeiro, uma fração do lipoaspirado foi isolada para fins de controle de qualidade e o volume restante do lipoaspirado foi medido. Em seguida, o lipoaspirado foi digerido por uma solução de colagenase (NB 1, Serva Electrophoresis GmbH, Heidelberg, Alemanha) preparada em HBSS (com uma concentração final de ~8 U/mL).

O volume da solução enzimática utilizada para a digestão era o dobro do volume do tecido adiposo. A digestão foi realizada durante 50 a 70 minutos a 37 °C ± 1 °C. Uma primeira agitação intermitente foi realizada após 15 a 25 minutos e uma segunda após 35 a 45 minutos. A digestão foi interrompida pela adição de meio MP (meio de proliferação ou meio de crescimento). O meio MP compreendia meio DMEM (4,5 g/L de glicose e 4 mM de Ala-Gln; Sartorius Stedim Biotech, Göttingen, Alemanha) suplementado com 5% de lisado de plaquetas humanas (hPL) (v/v). DMEM é um meio de cultura padrão contendo sais, aminoácidos, vitaminas, piruvato e glicose, tamponado com tampão carbonato e possui pH fisiológico (7,2 a 7,4). O DMEM usado continha Ala-Gln. O lisado de plaquetas humanas (hPL) é uma fonte rica de fator de crescimento usado para estimular o crescimento in vitro de células-tronco mesenquimais (como hASCs).

[00196] O tecido adiposo digerido foi centrifugado (500 g, 10 minutos, temperatura ambiente) e o sobrenadante foi removido. A Fração Vascular Estromal (SVF) peletizada foi ressuspensa em meio MP e passada através de um filtro de malha de 200 a 500 m. A suspensão de células filtradas foi centrifugada uma segunda vez (500 g, 10 minutos, 20 °C). O sedimento contendo as hASCs foi ressuspenso em meio MP. Uma pequena fração da suspensão de células pode ser mantida para contagem de células e toda a suspensão de células restante foi usada para semear um frasco T de 75 cm2 (referido como passagem P0). A contagem de células foi realizada (apenas para informação) a fim de estimar o número de células semeadas.

[00197] No dia seguinte à etapa de isolamento (dia 1), o meio de crescimento foi removido do frasco T de 75 cm2. As células foram enxaguadas três vezes com tampão fosfato e meio MP preparado de forma fresca foi então adicionado ao frasco.

1.2. Crescimento e expansão de células-tronco derivadas de tecido adiposo humano

[00198] Durante a fase de proliferação, hASCs foram passadas 4 vezes (P1, P2, P3 e P4) a fim de se obter uma quantidade suficiente de células para as etapas subsequentes do processo.

[00199] Entre P0 e a quarta passagem (P4), as células foram cultivadas em frascos T e alimentadas com meio MP fresco. As células foram passadas ao atingir uma confluência ≥ 70% e ≤ 100% (confluência alvo: 80 a 90%).

Todos os recipientes de cultura de células de 1 lote foram passados ao mesmo tempo. Em cada passagem, as células foram destacadas de seu recipiente de cultura com TrypLE (Select 1X; 9 mL para frascos de 75 cm2 ou 12 mL para frascos de 150 cm2), uma enzima de dissociação celular livre de animal recombinante. A digestão de TrypLe foi realizada por 5 a 15 minutos a 37 °C ± 2 °C e interrompida pela adição de meio MP.

[00200] As células foram então centrifugadas (500 g, 5 minutos, temperatura ambiente) e ressuspensas em meio MP.

As células colhidas foram agrupadas de modo a garantir uma suspensão homogênea de células. Após a ressuspensão, as células foram contadas.

[00201] Nas passagens P1, P2 e P3, a suspensão de células remanescente foi então diluída para a densidade celular apropriada em meio MP e semeada em superfícies de cultura de tecidos maiores. Nessas etapas, frascos de 75 cm2 foram semeados com volume de suspensão de células de 15 mL, enquanto frascos de 150 cm2 foram semeados com volume de suspensão de células de 30 mL. Em cada passagem, as células foram semeadas entre 0,5 x 104 e 0,8 x 104 células/cm2. Entre as diferentes passagens, o meio de cultura foi trocado a cada 3 a 4 dias. O comportamento celular e a taxa de crescimento de um doador para outro podem ser ligeiramente diferentes. Portanto, a duração entre duas passagens e o número de trocas de meio entre as passagens podem variar de um doador para outro.

1.3. Diferenciação Osteogênica

[00202] Na passagem P4 (ou seja, a quarta passagem), as células foram centrifugadas uma segunda vez e ressuspensas em meio MD (meio de diferenciação). Após a ressuspensão, as células foram contadas uma segunda vez antes de serem diluídas para a densidade celular apropriada em meio MD, e um volume de suspensão celular de 70 mL foi semeado em frascos de 150 cm2 e alimentado com meio MD osteogênico. De acordo com este método, as células foram cultivadas diretamente em meio MD osteogênico após a quarta passagem. Portanto, meio DM osteogênico foi adicionado enquanto as células não atingiram a confluência.

[00203] O meio MD osteogênico era composto por meio de proliferação (DMEM, Ala-Gln, hPL 5%) suplementado com dexametasona (1 M), ácido ascórbico (0,25 mM) e fosfato de sódio (2,93 mM).

[00204] O comportamento celular e a taxa de crescimento de um doador para outro podem ser ligeiramente diferentes. Portanto, a duração da etapa de diferenciação osteogênica e o número de trocas de meio entre as passagens podem variar de um doador para outro.

1.4. Indução multidimensional de células

[00205] A indução 3D foi iniciada quando as células atingiram a confluência e se apareceu uma alteração morfológica e se pelo menos um nódulo osteóide (porção orgânica não mineralizada da matriz óssea que se forma antes da maturação do tecido ósseo) foi observado nos frascos.

[00206] Após serem expostos ao meio MD osteogênico,

os vasos de cultura contendo a monocamada confluente de células osteogênicas aderentes foram lenta e homogeneamente borrifados com partículas de gelatina (Cultispher-G e Cultispher-S, Percell Biolytica, Astorp, Suécia) a uma concentração de 1, 1,5 e 2 cm3 para um vaso de 150 cm2.

[00207] As células foram mantidas em meio MD. As trocas médias regulares foram realizadas a cada 3 a 4 dias durante a indução multidimensional. Essas trocas de meio foram realizadas evitando cuidadosamente a remoção de partículas de gelatina e desenvolvimento de estrutura(s).

Exemplo 2: Caracterização dos biomateriais

2.1. Materiais e métodos

2.1.1. Estrutura/Histologia

[00208] Foi testada a formação de uma estrutura 3D obtida a partir de ASCs e partículas de Cultispher G e S.

Partículas de Cultispher foram adicionadas em ASCs confluentes na passagem 4 de 6 doadores diferentes. Volumes diferentes foram testados: partículas de 1, 1,5, 2 cm3 por vaso de 150 cm2. As células foram mantidas em meio de diferenciação (DMEM 4,5g/L de glicose com Ultraglutamina + 1% de penicilina/estreptomicina + 0,5% de Anfotericina AB + dexametasona (1 M), ácido ascórbico (0,25 mM) e fosfato de sódio (2,93 mM)) com mudança de meio a cada 3 a 4 dias.

[00209] Para a comparação da cultura em MP e MD, biópsias de estruturas 3D em MD foram realizadas 5 dias, 14 dias e 8 semanas após a adição das partículas.

[00210] Para a avaliação da celularidade, biópsias de estruturas 3D foram feitas em 4 semanas, 8 semanas e 12 semanas após a adição de partículas de Cultispher.

[00211] Eles foram fixados em formol e preparados para colorações de hematoxilina-eosina, Tricromo de Masson, Osteocalcina e Von Kossa.

[00212] A osteodiferenciação e a mineralização dos tecidos foram avaliadas em lâminas coradas com osteocalcina e Von Kossa, respetivamente. A estrutura do tecido, celularidade e a presença de matriz extracelular foram avaliadas após coloração com hematoxilina-eosina e tricromo de Masson.

2.1.2. Atividade biológica

[00213] O estudo in vitro da bioatividade foi avaliado por (i) extração e quantificação dos fatores de crescimento VEGF, IGF1, SDF-1 no produto final e (ii) capacidade de secreção/conteúdo de fatores de crescimento do biomaterial da invenção em hipóxia e hiperglicemia (condições de cicatrização de feridas diabéticas, por exemplo). Além disso, (iii) as propriedades bioativas do biomaterial da invenção foram caracterizadas in vitro em nível molecular por qRT-PCR.

Conteúdo de fatores de crescimento

[00214] Para avaliar a bioatividade do tecido formado, biópsias foram realizadas 4 e 8 semanas após a adição de gelatina (1,5 cm3) para extração e quantificação das proteínas. Os conteúdos de proteína total e fatores de crescimento foram quantificados por colorimetria (BCA Protein Assay Kit, ThermoFisher Scientific) e ELISA para VEGF, SDF1, IGF1 (kits Human Quantikine ELISA, RD Systems), de acordo com as instruções dos fornecedores.

Cultura em hipóxia e hiperglicemia

[00215] Para avaliar a bioatividade do biomaterial da invenção e o impacto da oxemia e glicemia na bioatividade desta estrutura 3D, as biópsias do tecido formado com Cultispher G (1,5 cm3) e ASCs de 3 doadores em 8 semanas foram enxaguadas duas vezes com PBS e colocadas em duplicata em placas de 6 poços em 10 mL de MD a 4,5 g/L (condição hiperglicêmica) ou 1 g/L (condição normoglicêmica) de glicose sem HPL. As placas foram colocadas em hipóxia (1% de O2) ou normóxia (21% de O2), 5% de CO2, 37 °C, por 72 horas. Os sobrenadantes foram então colhidos para quantificação de proteína total e fatores de crescimento por colorimetria (BCA Protein Assay Kit, ThermoFisher Scientific) e ELISA (BMP2, BMP7, VEGF, SDF- 1, IGF1, FGFb (kits Human Quantikine ELISA, RD Systems), respectivamente. Os tecidos foram tratados para extração de proteínas, purificação e quantificação dos teores de proteínas totais e fatores de crescimento.

qRT-PCR

[00216] O potencial pró-angiogênico do biomaterial da invenção foi investigado pela análise da expressão de genes envolvidos na vasculogênese e angiogênese. A expressão de genes por células-tronco adiposas em diferentes estados foi analisada: células-tronco adiposas em meio de proliferação (sem orientação de fenótipo, MP), células-tronco adiposas em meio osteogênico clássico sem partículas (MD) e finalmente o biomaterial da invenção (células-tronco adiposas com 1,5 cm3 de partículas com o objetivo de induzir a formação da estrutura livre de estrutura tridimensional pela matriz extracelular).

[00217] O RNA total foi extraído de ≥ 2.000 ASCs cultivadas em meio de proliferação (MP) (n = 4 fontes independente de tecido adiposo humano) e de biópsias de ~1 cm2 do biomaterial da invenção (n = 5) usando o reagente de lise Qiazol (Qiagen, Hilden, Alemanha) e um homogeneizador Precellys (Bertin Instruments, Montigny-le- Bretonneux, França). Os RNAs foram purificados usando o mini kit Rneasy (Qiagen, Hilden, Alemanha) com uma digestão de DNase adicional na coluna de acordo com as instruções do fabricante. A qualidade e a quantidade de RNA foram determinadas em espectrofotômetro (Spectramax 190, Molecular Devices, Califórnia, EUA). O cDNA foi sintetizado a partir de 0,5 g de RNA total usando o kit de primeira fita RT2 RNA (Qiagen, Hilden, Alemanha) para perfis de expressão de genes osteogênicos e angiogênicos através de matrizes de PCR disponíveis comercialmente (Human RT2 Profiler Assay - Angiogênese). O sistema ABI Quantstudio 5 (Applied Biosystems) e SYBR Green ROX Mastermix (Qiagen, Hilden, Alemanha) foram usados para a detecção do produto de amplificação. A quantificação foi obtida pelo método CT. O resultado final de cada amostra foi normalizado para as médias do nível de expressão de três genes Housekeeping (ACTB, B2M e GAPDH).

2.1.3. Impacto da maturação do biomaterial em suas propriedades

[00218] O impacto da maturação do biomaterial (também referido como “tecido”) em suas propriedades foi avaliado pela avaliação do nível de mineralização, avaliação histológica (determinação da celularidade) e avaliação da bioatividade (extração e quantificação dos fatores de crescimento VEGF, IGF1, SDF-1) Maturação do biomaterial significa aqui a duração da cultura de ASCs com partículas de Cultispher em meio de diferenciação.

[00219] As biópsias das estruturas 3D foram feitas em 4 semanas (um doador), 8 semanas (6 doadores), 12 semanas (3 doadores) e 25 semanas (1 doador) após a adição de partículas de Cultispher e fixadas em formol para análise de micro-TC. A mineralização de estruturas 3D foi avaliada usando uma máquina de TC quantitativa periférica (Skyscan 1172G, Bruker micro-CT NV, Kontich, Bélgica).

[00220] Além disso, as biópsias de tecidos (4 semanas (n = 3), 8 semanas (n = 8), 12 semanas (n = 3) e 25 semanas (n = 1)) foram fixadas em formol e preparadas para hematoxilina-eosina, Tricromo de Masson e colorações de Von Kossa.

2.2. Resultados

2.2.1. Estrutura/Histologia

[00221] Nenhuma estrutura 3D foi obtida quando as partículas de Cultispher foram cultivadas com hASCs em meio de proliferação. Como nenhuma estrutura 3D macroscópica foi encontrada, nenhuma estrutura microscópica foi formada.

[00222] Em contraste com o meio de proliferação, Cultispher cultivada com ASCs em meio de diferenciação osteogênica mostrou a formação de uma estrutura 3D em forma de folha (Figura 1A). Além disso, essa estrutura era preênsil com uma pinça (Figura 1B).

[00223] O exame histológico de Cultispher cultivada com ASCs em meio de diferenciação osteogênica revelou a presença de um tecido celularizado interconectado entre as partículas. Além disso, a matriz extracelular e as células foram encontradas nos poros das partículas (Figura 2A e B).

A coloração de Von Kossa mostrou a presença de partículas mineralizadas isoladas. Em contraste, a matriz extracelular não foi corada por Von Kossa (Figura 3A e B). Finalmente, a expressão da osteocalcina foi encontrada no tecido interconectivo (Figura 4A e B).

2.2.2. Atividade biológica Conteúdo e secreção de fatores de crescimento

[00224] Nenhum conteúdo de proteína foi encontrado em Cultispher G e S sozinho. Apenas traços de IGF-1 foram detectados, mas abaixo do limite inferior de quantificação do método ELISA.

[00225] Os níveis de IGF-1 e BMP7 detectados nos sobrenadantes de biópsias de Cultispher cultivadas com ASCs em meio de diferenciação osteogênica ficaram abaixo do limite inferior de quantificação dos métodos ELISA enquanto os traços de BMP2 e FGFb foram medidos. Em contraste, uma secreção significativa de VEGF e SDF-1 foi encontrada.

[00226] Não foi encontrado impacto significativo das condições de cultivo na secreção dos fatores de crescimento (Tabela 1).

Secreção (ng/g) Oxemia Glicemia VEGF SDF-1 1 g/L 74 ± 24 19 ± 20 21% de O2 4,5 g/L 50 ± 28 27 ± 27 1 g/L 130 ± 51 14 ± 10 1% de O2 4,5 g/L 106 ± 60 26 ± 10 Tabela 1: Impacto das condições de cultura na secreção de VEGF e SDF-1 pelo biomaterial da invenção

[00227] Os níveis de BMP2, BMP7 e FGFb detectados nos extratos protéicos das biópsias de Cultispher cultivadas com ASCs em meio de diferenciação osteogênica ficaram abaixo do limite inferior de quantificação dos métodos ELISA. Em contraste, um conteúdo significativo em IGF-1, VEGF e SDF-1 foi encontrado.

[00228] Nenhum impacto significativo das condições de cultura no conteúdo de VEGF foi encontrado. No entanto, um menor conteúdo de IGF-1 em normóxia (21% de O2) a 4,5 g/L de glicose foi encontrado em comparação com outros grupos (p < 0,05). Um maior conteúdo de SDF-1 foi encontrado em normóxia e normoglicemia versus hipóxia (1 e 4,5 g/L de glicose) (p < 0,05) (Tabela 2).

Secreção (ng/g) Oxemia Glicemia VEGF IGF1 SDF-1 1 g/L 123 ± 47 117 ± 79** 53 ± 37 21% de O2 4,5 g/L 104 ± 61 139 ± 208 25 ± 22* 1 g/L 152 ± 80 36 ± 29 109 ± 85 1% de O2 4,5 g/L 155 ± 101 36 ± 44 94 ± 78 *: p < 0,05 em comparação a outros grupos **: p < 0,05 em comparação com 1% de O2 (1 e 4,5 g/L) Tabela 2: Impacto das condições de cultura no conteúdo de VEGF, SDF-1 e IGF1 do biomaterial da invenção Análise qRT-PCR

[00229] Ao longo dos 84 genes pró-angiogênicos analisados pela análise de qRT-PCR, 13 mRNA foram modulados entre as diferentes condições de cultura. Dez genes foram regulados positivamente no biomaterial da invenção em comparação com ASCs no meio de proliferação (ANG, ANGPT1, EPHB4, EDN1, LEP, THBS1, PTGS1, VEGFA, VEGFB e VEGFC) e dois genes foram encontrados para serem regulados negativamente no biomaterial da invenção em comparação com ASCs em MP (ID1, TIMP1) (Figura 5).

[00230] Uma expressão significativamente mais alta de mRNA de angiopoietina (ANG e ANGPT1) foi encontrada no biomaterial da invenção em comparação com ASCs em MP (Figuras 5A e B). A sinalização da angiopoietina promove a angiogênese, o processo pelo qual novas artérias e veias se formam a partir de vasos sanguíneos preexistentes (Fagiani E et al, Cancer Lett, 2013).

[00231] EPHB4 (receptor de efrina B4), uma proteína transmembrana, desempenhando papéis essenciais na vasculogênese, endotelina (EDN1), um potente vasoconstritor (Wu MH, Nature, 2013), trombospondina 1 (THBS1), um vasodilatador e ciclo-oxigenase 1 (PTGS1/COX-1), as células endoteliais de regulação foram significativamente superexpressadas no biomaterial da invenção em comparação com ASCs em MP (Figuras 5C, D, E e F, respectivamente).

[00232] A expressão do mRNA da Leptina (LEP) (um importante intensificador da angiogênese e indutor da expressão de VEGF; Bouloumie A et al, Circ. Res. 1998; Sierra-Honigmann M R et al, Science (New York, NY) 1998) também foi superexpressado no biomaterial da invenção em comparação com ASCs em MP (Figura 5G).

[00233] Finalmente, a expressão do fator de crescimento endotelial vascular A, B e C mRNA (VEGFA/B/C) também foi significativamente melhorada para ASCs no biomaterial da invenção em comparação com ASCs em MP (Figuras 5H, I e J, respectivamente). O VEGF é um dos fatores de crescimento mais importantes para a regulação do desenvolvimento vascular e angiogênese. Visto que o osso é um órgão altamente vascularizado (com a angiogênese como um regulador importante na osteogênese), o VEGF também impacta positivamente o desenvolvimento esquelético e o reparo ósseo pós-natal (Hu K et al, Bone 2016).

[00234] Em contraste, o inibidor da proteína de ligação ao DNA (ID1) e o inibidor da metalopeptidase 1 (TIMP1), associados à redução da angiogênese in vivo (Reed M J et al, Microvasc Res 2003) foram regulados negativamente no biomaterial da invenção em comparação com ASCs em MP (Figuras 5K e L, respectivamente).

[00235] No geral, essas análises moleculares mostram que o potencial pró-angiogênico de ASCs é regulado positivamente quando as células são incorporadas em sua matriz 3D no biomaterial da invenção.

2.2.3. Impacto da maturação do biomaterial em suas propriedades Avaliação do nível de mineralização

[00236] Fotomacrografias dos enxertos 3D em 4, 8, 12 e 25 semanas revelaram a mesma estrutura macroscópica (Figura 6A e B) e foram analisadas em micro-TC. A porcentagem do volume de mineralização foi determinada: 0,07% em 4 semanas, 0,28% +/-0,33% em 8 semanas, 1,24% +/- 0,35% em 12 semanas e 2,77% em 25 semanas (Figura 6C e D).

[00237] Portanto, quanto maior o nível de maturação, maior a mineralização.

Avaliação histológica

[00238] Não foi encontrado impacto da maturação do tecido sobre o conteúdo celular, visto que a similaridade celular foi quantificada nos diferentes tecidos analisados (dados não mostrados).

[00239] Em contraste, a proporção de ECM no tecido aumentou com o nível de maturação, com uma proporção significativamente inferior de ECM em 4 semanas e uma proporção maior de ECM em 25 semanas (28 ± 7 versus 33 ± 11/34 ± 11 versus 56 ± 8% de ECM em 4, 8/12 e 25 semanas, respectivamente (p < 0,05)) (Tabela 3).

Células/mm² ECM (%) 4 semanas 160 ± 104 28 ± 7* 8 semanas 175 ± 86 33 ± 11 12 semanas 177 ± 70 34 ± 11 25 semanas 191 ± 77 56 ± 8* *: p < 0,05 versus outros grupos Tabela 3: Análise histomorfológica do biomaterial da invenção em diferentes tempos de maturação.

[00240] Um maior grau de mineralização foi encontrado em 12 e 25 semanas de maturação, conforme mostrado por uma coloração de Von Kossa mais marcada (dados não mostrados).

Avaliação de bioatividade

[00241] A bioatividade do biomaterial em 4, 8, 12 e 25 semanas de maturação foi estudada após extração de proteínas, purificação e quantificação de fatores de crescimento (VEGF, IGF1, SDF-1) por ELISA (Tabela 4).

VEGF (ng/ml) IGF (ng/ml) SDF-1 (ng/ml) 4 semanas 117 ± 7 108 ± 17 105 ± 42 8 semanas 102 ± 91 50 ± 83 189 ± 180 12 semanas 181 ± 12 436 ± 18 663 ± 27 25 semanas 128 94 424 Tabela 4: Conteúdo de proteínas e fatores de crescimento nos tecidos às 4, 8, 12 e 25 semanas de maturação Exemplo 3: Estudo in vivo das propriedades angiogênicas e osteogênicas

3.1. Materiais e métodos

3.1.1. Experiência in vivo usando ratos Nude

[00242] Dez réplicas do biomaterial da invenção (ASCs cultivadas como descrito no Exemplo 1, com 1,5 cm3 de Cultispher G ou S durante uma maturação de 7,5 semanas) foram suturadas no músculo lombar cauterizado de ratos Nude no dia 0. Vinte e nove dias após implantação, os biomateriais foram colhidos para serem analisados por imagem e histologia.

3.1.2. Experimento in vivo usando ratos Wistar

[00243] Dez réplicas do biomaterial da invenção (ASCs cultivadas como descrito no Exemplo 1, com 1,5 cm3 de Cultispher G ou S durante uma maturação de 7,5 semanas) foram suturadas no músculo lombar cauterizado de ratos Wistar no dia 0. Vinte e nove dias após implantação, os biomateriais foram colhidos para serem analisados por imagem e histologia.

[00244] O estado clínico geral dos animais foi verificado diariamente ao longo do período experimental.

[00245] A análise da mineralização das 30 amostras foi realizada usando o sistema de micro-TC de raios X de alta resolução para imagens de pequenos animais SkyScan1076. Reconstruções tridimensionais de varreduras e análise de tecido mineralizado foram realizadas usando os softwares CTvol e CTan (Skyscan).

[00246] As análises histológicas foram realizadas em amostras de músculo a fim de avaliar as propriedades angiogênicas e osteoindutivas in vivo dos produtos (hematoxilina-eosina, Tricromo de Masson, Von Kossa (para precisar a localização da mineralização no tecido), marcador de tecido humano Ku80 (para confirmar a origem humana das células em tecido animal) e colorações de CD3 (para descrever a repartição de células imunes CD3+ no tecido).

3.2. Resultados

3.2.1. Experiência in vivo usando ratos Nude

[00247] Durante as experiências in vivo, nenhum sinal de angústia ou lesão significativa foi notado indicando que o produto não induziu efeito adverso em animais.

[00248] Em ratos Nude, foi observada a presença de estruturas radiopacas sugestivas de mineralização, nas radiografias realizadas no dia 29 (Figura 7).

[00249] A presença de células humanas foi destacada em amostras de ratos Nudes. Quando presentes, as células humanas representaram em média metade das células dos locais de implante, excluindo o contorno, nos dois grupos.

As células de origem humana e de rato foram distribuídas homogeneamente nos locais de implante, exceto no contorno, onde apenas células de rato estão presentes.

3.2.2. Experimento in vivo usando ratos Wistar

[00250] Em ratos Wistar, foi observada a presença de estruturas radiopacas sugestivas de mineralização, nas radiografias realizadas no dia 29 (Figura 8).

[00251] A análise da mineralização sugere a presença de tecido mineralizado em cada local de implante.

[00252] A coloração de Von Kossa indica que a mineralização está localizada nas partículas (Figura 9).

Exemplo 4: Estudo de bioatividade in vivo

4.1. Materiais e métodos

4.1.1. Preparação de Amostras

[00253] Dez amostras de ~0,5 g de biomaterial (ASCs cultivadas como descrito no Exemplo 1, com 1,5 cm3 de Cultispher S durante uma maturação de 8 semanas) foram preparadas para implantação na musculatura paravertebral de 10 ratos Nude. Além disso, 2 amostras de ~0,5 g de partículas de Cultispher S foram usadas como controle.

[00254] Para avaliar o conteúdo de fatores de crescimento das amostras, foi preparada uma amostra de biomaterial para extração e quantificação de proteínas (VEGF, IGF1, SDF-1).

[00255] Para avaliação da qualidade do biomaterial, uma amostra foi fixada em formol para coloração por hematoxilina-eosina (HE) e Von Kossa (VK). A avaliação da eficácia do tratamento de descelularização foi avaliada pela contagem do número de células nos tecidos após a coloração HE.

4.1.2. Alojamento em biotérios

[00256] Os animais foram alojados no biotério “Centre Préclinique Atlanthera” aprovado pelos serviços veterinários e utilizado em todo o procedimento experimental de acordo com a legislação em vigor (Decreto No. 2013-118, de 1 de fevereiro de 2013, sobre animais utilizados em finalidades de experimentação). Os animais foram aclimatados por um mínimo de 7 dias antes do início do estudo durante o qual o estado geral dos animais foi seguido diariamente. Os animais foram alojados em um biotério com ar-condicionado em caixas de plástico de dimensões padronizadas. O ciclo de luz artificial dia/noite foi definido para 12 horas de luz e 12 horas de escuridão.

Todos os animais tiveram livre acesso à água e foram alimentados ad libitum com ração comercial. Cada animal foi identificado por um brinco (anel).

4.1.3. Protocolo experimental

[00257] No dia 0, replicados de biomateriais foram suturados no músculo lombar cauterizado de 10 ratos Nude enquanto as partículas sozinhas foram implantadas em baias musculares cauterizadas realizadas no músculo lombar de 1 rato Nude. Vinte e nove dias após a implantação, músculos contendo biomateriais foram colhidos para serem analisados por imagens e histologia.

Implantação nos músculos lombares

[00258] Os animais foram totalmente anestesiados para a realização da cirurgia nas melhores condições. Foi realizado procedimento de analgesia com injeção de Buprenorfina quase 30 minutos antes da cirurgia, seguida de nova injeção no dia seguinte.

[00259] Cirurgia: para cada animal, foi feita uma incisão cutânea longitudinal ao longo da raque ao nível lombar. Para 1 rato, as paradas musculares foram obtidas em ambos os lados da incisão na pele (ou seja, as paradas foram realizadas nos músculos lombares). As baias foram cauterizadas. Apenas partículas foram implantadas nessas baias. Para 10 ratos, os biomateriais foram suturados no músculo lombar cauterizado. Após o procedimento cirúrgico, as feridas cutâneas foram suturadas com grampos cirúrgicos.

Acompanhamento clínico

[00260] O estado clínico geral dos animais foi verificado diariamente ao longo do período experimental.

Duas vezes por semana, foi realizado um acompanhamento clínico detalhado com foco em: Sinais respiratórios, oculares, cardiovasculares, gastrointestinais; Atividade motora e comportamento; Sinais de apreensão; Avaliação da pele; Inflamação no local de implantação.

[00261] Além disso, o peso corporal foi medido duas vezes por semana, no mesmo período de acompanhamento clínico detalhado.

Procedimentos terminais e análise post-mortem

[00262] No dia 29, os animais foram sacrificados por exsanguinação e avaliação macroscópica foi realizada.

Durante a autópsia, o aspecto externo do cadáver foi observado e qualquer perda patológica de fluido, sinalizando possíveis anomalias da lesão interna, foi registrada.

[00263] As cavidades torácica e abdominal foram amplamente abertas para avaliar qualquer modificação lesional dos órgãos internos, com foco no coração, rins, baço, fígado e pulmão.

Avaliação macroscópica no local do implante

[00264] O local do implante muscular foi exposto e uma avaliação macroscópica detalhada foi obtida com foco na reação local do tecido e na presença e localização dos implantes (análise radiográfica).

[00265] Os locais de implante muscular foram removidos ao longo. Os explantes foram fixados em solução de formalina tamponada neutra por 48 horas em temperatura ambiente.

Análise histomorfométrica 3D

[00266] A análise da mineralização das amostras foi realizada usando o sistema de micro-TC de raios X de alta resolução para imagens de pequenos animais SkyScan1076.

[00267] Amostras de músculos foram escaneadas em temperatura ambiente usando os seguintes parâmetros: Tensão da fonte: 50 kV; Etapa de rotação: 0,5°; Tamanho do pixel: 18 m; 1 quadro por posição.

[00268] Reconstruções tridimensionais de varreduras e análise de tecido mineralizado foram realizadas usando os softwares CTvol e CTan (Skyscan).

[00269] Em cada amostra, foi determinada a quantidade de sinal semelhante ao do tecido ósseo mineralizado (limiar 40/255) (identificado como volume ósseo: VB). Os valores de "Volume do tecido" usados são os volumes dos implantes formulados.

Análises histopatológicas e histomorfométricas 2D

[00270] Análises histológicas foram realizadas em amostras de músculo para avaliar as propriedades angiogênicas e osteoindutivas in vivo dos produtos.

[00271] Os explantes fixados em formalina foram descalcificados 13 dias em EDTA 15%. Em seguida, as amostras foram desidratadas e incluídas em parafina. Seções de 4 a 5 m foram cortadas em micrótomo e esticadas em lâminas. Os cortes foram realizados em dois níveis diferentes distantes de 150 m.

[00272] Nessas áreas de duas seções, hematoxilina- eosina (HE), tricromo de Masson (MT) e imunohistoquímica de CD146 foram realizadas (usando seções das amostras embebidas em parafina ou congeladas).

[00273] As imagens das seções coradas completas foram adquiridas usando um scanner de lâmina digital (Nanozoomer, Hamamatsu). A quantificação da área ocupada por vasos sanguíneos (Tricromo de Masson, CD146) foi realizada usando o software NDPview2: Uma região de interesse foi delineada manualmente com base nas características do tecido para definir a área do “local do implante” na seção. Cada vaso sanguíneo foi delineado manualmente para quantificar a área ocupada pelos vasos sanguíneos na região de interesse. A superfície correspondente aos vasos e o número de vasos sanguíneos foram reportados à área total do “local do implante”.

4.2. Resultados

4.2.1. Análises histológicas

[00274] O número de células nos tecidos foi determinado após coloração com HE (Figura 10): 146,5 ± 50,4 células/mm2.

[00275] A coloração de Von Kossa do tecido mostrou uma mineralização fraca localizada nas partículas (Figura 11).

4.2.2. Estudo in vivo da bioatividade do biomaterial

[00276] Nenhum sinal de angústia ou lesão significativa foi notado indicando que o produto não induziu efeito adverso no animal. O peso corporal dos animais, registrado ao longo do experimento, indicou que todos os animais não apresentaram ganho de peso no dia 2 e, a seguir, apresentaram ganho de peso regular entre o dia 2 e o dia 28. Falta de ganho de peso logo após a cirurgia é frequentemente observada e não é considerada um sinal de toxicidade do produto testado. O ganho de peso regular observado entre o dia 2 e o dia 28 confirma que as partículas não afetaram o metabolismo animal. Ao final do experimento in vivo, a autópsia não evidenciou nenhuma lesão macroscópica de órgão.

Conteúdo mineral no local do implante

[00277] Foi observada presença de estruturas radiopacas sugestivas de mineralização, nas radiografias realizadas no dia 29, em todos os locais implantados com o biomaterial (Figura 12).

[00278] A fim de quantificar a porcentagem de formação de tecido mineralizado no músculo, a análise de mineralização dos “locais de implante” foi realizada usando o sistema de micro-TC de raios-X de alta resolução para imagens de pequenos animais SkyScan1076. Os resultados são apresentados na Tabela 5.

Amostras BV 40/255 TV (mm3) BV/TV (%) 3 (mm ) NG-987 76,7677 514,6821 0,1492 NG-988 22,7560 518,1965 0,0439 NG-989 121,3495 470,9364 0,2577 NG-990 137,0365 724,1618 0,1892 NG-991 44,8830 519,4913 0,0864 NG-992 23,1673 560,8324 0,0413 NG-993 48,1291 496,7399 0,0969 NG-994 21,2821 791,3064 0,0269 NG-995 123,9947 638,3353 0,1942 NG-996 52,9368 561,4798 0,0943 Tabela 5: Resultados do sistema de micro-TC de raios-X de alta resolução para imagens de pequenos animais SkyScan1076

[00279] A análise sugere a presença de um conteúdo perceptível de tecido mineralizado em cada local implantado com o biomaterial, com média de VB/VC de 0,118.

Neovascularização do implante

[00280] A presença de capilares no tecido conjuntivo fibroso foi examinada para documentar a neovascularização.

[00281] O número de vasos/área e a densidade vascular nos implantes e na junção entre o músculo e o local do implante após a coloração com Tricromo de Masson foram quantificados.

[00282] Os implantes com o biomaterial foram encontrados vascularizados pela coloração de Tricromo de Masson, com um número de 40,8 ± 18,5 vasos/mm2.

Exemplo 5: Estudo de eficácia in vivo em um modelo de rato xenogênico hiperglicêmico/isquêmico

5.1. Materiais e métodos

5.1.1 Animais

[00283] 56 ratas Wistar de 250 a 300 g receberam estreptozotocina (50 mg/kg) por via intraperitoneal. Sete a dez dias após a administração de estreptozotocina, os níveis de glicose no sangue foram medidos a partir do sangue venoso da cauda por tiras de teste de glicose no sangue. Ratos com níveis de glicose > 11,1 mM foram considerados hiperglicêmicos e incluídos no estudo (n-42 ratos).

[00284] A isquemia foi induzida no membro esquerdo de cada rato, conforme descrito em Levigné et al (Biomed Res Int 2013). Através de uma incisão longitudinal na região inguinal raspada, as artérias ilíaca externa e femoral foram dissecadas desde a ilíaca comum até as safenas. Para provocar o quadro isquêmico, as artérias dissecadas foram ressecadas da ilíaca comum no membro esquerdo, enquanto no membro direito as artérias foram conservadas e os membros considerados não isquêmicos. Todos os procedimentos cirúrgicos foram realizados em microscópio cirúrgico (Carl Zeiss, Jena, Alemanha), e os animais foram anestesiados por inalação de isoflurano 5% para indução e 3% para manutenção da anestesia.

[00285] Os animais foram divididos aleatoriamente em 3 grupos: - Grupo de placebo (n = 10 ratas Wistar fêmeas); - Grupo Cultispher (n = 10 ratos Wistar fêmeas), isto é, partículas isoladas; - Grupo de biomateriais (n = 14 ratas Wistar), ou seja, ASCs com partículas de gelatina formando um tecido.

5.1.2 Itens de teste

[00286] Foram preparadas 14 amostras de ~0,5 g de partículas Cultispher, com radiação gama.

[00287] 14 Amostras de ~2 cm2 de biomaterial (ASCs cultivadas como descrito no Exemplo 1, com 1,5 cm3 de Cultispher S durante uma maturação de 8 semanas) foram preparadas para implantação.

[00288] Para avaliar o conteúdo de fatores de crescimento das amostras, foi preparada uma amostra de biomaterial para extração e quantificação de proteínas (VEGF, IGF1, SDF-1).

[00289] Para avaliação da qualidade do biomaterial, uma amostra foi fixada em formol para coloração de hematoxilina-eosina (HE). A avaliação da eficácia do tratamento de descelularização foi avaliada pela contagem do número de células nos tecidos após a coloração HE.

5.1.3 Avaliação macroscópica da cicatrização de feridas

[00290] Fotos das pernas foram tiradas nos dias 0, 15, 24 e 34 após a implantação.

[00291] Para quantificar o fechamento da ferida, a área da ferida foi medida por análise de imagem usando o software Image J por dois operadores independentes. A área sob a curva foi calculada na área da ferida medida em cada ponto de tempo entre D0 e D34 e foi expressa em comparação com o grupo de placebo, fixada em 100%.

5.1.4 Avaliação microscópica da cicatrização de feridas

[00292] As pernas foram dissecadas para retirada do tecido da ferida e este último foi orientado transversalmente para a obtenção de lâminas histológicas de toda a espessura do tecido. Lâminas histológicas de 5 m foram preparadas e coradas com HE para epiderme (op ‘t Veld RC et al, Biomaterials 2018) e pontuações dérmicas (Yates C et al, Biomaterials 2007):

[00293] Pontuação da cicatrização epidérmica em três seções representativas da ferida (centro e periferia): - 0: sem migração de células epiteliais, - 1: migração parcial, - 2: migração completa sem/queratinização parcial, - 3: migração completa com queratinização completa, - 4: Hipertrofia avançada.

[00294] Pontuação da cicatrização dérmica em três seções representativas da ferida (centro e periferia): - 0: sem cura, - 1: infiltrado inflamatório, - 2: tecido de granulação presente - fibroplasias e angiogênese, - 3: deposição de colágeno substituindo o tecido de granulação > 50%, - 4: resposta fibrótica hipertrófica.

[00295] Além disso, a coloração do Tricromo de Masson foi realizada para avaliação da área vascular por histomorfometria e imunomarcação de CD3, CD68 para avaliação das respostas imune e inflamatória. Além disso, a coloração KU80 foi realizada para identificar a presença de células humanas após a implantação.

5.2 Resultados

[00296] Dos 56 ratos que receberam injeção de estreptozotocina, 42 desenvolveram hiperglicemia e foram selecionados para o estudo, enquanto 14 apresentavam glicemia baixa e desenvolveram complicações cirúrgicas e, portanto, foram excluídos do estudo.

5.2.1. Avaliação macroscópica da cicatrização de feridas

[00297] Imagens macroscópicas de feridas são apresentadas na Figura 13. Uma melhor cicatrização de feridas pode ser observada a partir do dia 15 após a cirurgia (D15) no grupo de biomaterial (Figura 13C) em comparação com outros grupos (controle de placebo (Figura 13A) e partículas sozinhas, Figura 13B). Essa diferença é visível tanto para as feridas isquêmicas (membros esquerdos) quanto para as não isquêmicas (membros direitos).

[00298] Os resultados das áreas sob a curva para a ferida não isquêmica são apresentados na Figura 14. A implantação de Cultispher sozinho mostrou uma diminuição da cicatrização da ferida em comparação com os animais não tratados em 23%, respectivamente. Em contraste, uma melhor cicatrização de feridas (25%) foi encontrada no grupo tratado com o biomaterial da invenção.

[00299] A evolução da área da ferida para uma ferida não isquêmica e uma ferida isquêmica entre D0 e D34 é apresentada na Figura 15 (A e B, respectivamente). Observe que as feridas tratadas com o biomaterial da invenção apresentam tecidos inferiores não cicatrizados de D21 a D34 em comparação com outros grupos. O fechamento completo da ferida é significativamente mais rápido quando tratado com o biomaterial da invenção, em condições não isquêmicas e isquêmicas (Figuras 16A e B, respectivamente).

[00300] Os resultados da histomorfometria para avaliar a reação inflamatória são apresentados na Figura

17. Estes resultados mostram linfócitos CD3 mais elevados (linha preta) no contorno, no núcleo e nas feridas isquêmicas totais tratadas com o biomaterial da invenção (Figura 17C) em comparação com o controle de placebo (Figura 17A) e Cultispher S sozinho (Figura 17B). O CD3 normalmente funciona para destruir infecções e células com mau funcionamento.

[00301] Além disso, os macrófagos CD68 (linha cinza) atingiram um pico em torno de D10 (Figura 17C), como o controle de placebo (Figura 17A) e Cultispher S sozinho (Figura 17B). CD68 é característico de macrófagos que infestam locais de tecidos e removem restos celulares e infecções.

[00302] Estas duas observações confirmam que a implantação do biomaterial da invenção leva a um aumento da cinética de fechamento da ferida por elicitação imune.

[00303] A espessura da ferida também foi avaliada (Figura 18). Em um modelo isquêmico (Figura 18A), a espessura da ferida diminuiu de D15 para D34 após o implante, mostrando uma retração. Em um modelo não isquêmico (Figura 18B), a espessura da ferida diminuiu ligeiramente de D15 para D34 após a implantação, mas mais importante não aumentou como no caso de controle de palcebo e Cultisphers sozinho. Este resultado evidencia a ausência de hipertrofia quando o biomaterial da invenção é implantado.

5.2.2. Avaliação microscópica da cicatrização de feridas

[00304] As pontuações epidérmicas e dérmicas, avaliadas em feridas não isquêmicas em cada ponto de tempo, são apresentadas na Figura 19A, B, C e D. Dérmica e epidérmica mais rápidas foram encontradas para biomateriais da invenção em comparação com outros grupos.

Exemplo 6: Teste de diferentes meios de diferenciação

6.1. Materiais e métodos

[00305] O impacto do meio de diferenciação na estrutura 3D formada foi estudado. ASCs foram cultivadas com 1,5 cm3 de Cultispher S em diferentes meios de diferenciação por 4 semanas: osteogênico (o mesmo que no Exemplo 1), condrogênico (DMEM, 5% HPL, 100 g/mL de piruvato de sódio, ITS 1X, 40 g/mL de Prolina, 10 ng/mL de TGF-1, Dexametasona 1 M), queratinogênica (DMEM, HPL 5%, 5 g/mL de insulina, 10 ng/mL de KGF, 10 ng/mL de hEGF, 0,5

g/mL de hidrocortisona, CaCl2 1,5 mM), e miofibrogênico (DMEM: F12, 100 g/mL de piruvato de sódio, 1X ITS, 1X RPMI 1640 vitamina, 1 ng/mL de TGF-1, 1 g/mL de Glutationa, MEM 0,1 mM). As culturas foram mantidas durante 4 semanas com mudança do meio de diferenciação a cada 3 a 4 dias.

[00306] Biópsias de tecidos em 4 semanas foram fixadas em formol para hematoxilina-eosina, tricromo de Masson e coloração de Von Kossa. Além disso, foram realizadas colorações específicas do tecido (osteocalcina, Alcian Blue, Pankeratin, CD34, -SMA).

[00307] Para avaliar a bioatividade do tecido formado, foram feitas biópsias 4 semanas após a adição de Cultispher para extração e quantificação de proteínas. O conteúdo total de proteínas e fatores de crescimento (VEGF e SDF-1) foram quantificados por colorimetria (BCA Protein Assay Kit, ThermoFisher Scientific).

6.2 Resultados

[00308] ASCs e Cultispher S em meio osteogênico servem como controle positivo para diferenciação osteogênica. Foi observada a formação de uma grande estrutura 3D aderente. A análise histológica revelou integração de partículas no tecido interconectivo celularizado e uma coloração positiva para osteocalcina da matriz (Figura 20A).

[00309] A cultura em meio condrogênico rapidamente (somente após alguns dias) apresentou a formação de uma estrutura tridimensional robusta e espessa, facilmente aderente e resistente às forças mecânicas. A análise histológica revelou integração de partículas no tecido interconectivo celularizado e uma matriz positiva para coloração azul alcian (Figura 20B).

[00310] O meio de diferenciação miofibrogênica permitiu a formação de estruturas 3D. A estrutura formada era aderente, mas frágil. Mais uma vez, a análise histológica revelou integração de partículas no tecido interconectivo celularizado e coloração positiva de -SMA da matriz (Figura 20C).

[00311] ASCs e partículas em meio queratinogênico formaram uma estrutura 3D grande, plana e fina. Este último era muito frágil e difícil de manusear (Figura 20D).

Meio de Estrutura Aderente Solidez Tecido diferenciação 3D interconectivo Osteogênico + + +/- + Condrogênico + + + + Miofibrogênico + +/- +/- + Ceratinogênico + +/- - + Tabela 6: Características das estruturas formadas nos meios de diferenciação testados

[00312] Portanto, uma estrutura 3D foi observada em todas as amostras de biomateriais formadas com ASCs e gelatina, com todos os meios de diferenciação testados.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Biomaterial com uma estrutura multidimensional caracterizado pelo fato de compreender células-tronco derivadas do tecido adiposo (ASCs) diferenciadas, uma matriz extracelular e gelatina.

2. Biomaterial, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a referida gelatina é gelatina porcina.

3. Biomaterial, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que a referida gelatina está na forma de partículas.

4. Biomaterial, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que as referidas partículas têm um diâmetro médio variando de cerca de 50 m a cerca de 1000 m, de um modo preferido de cerca de 75 m a cerca de 750 m, de um modo mais preferido de cerca de 100 m a cerca de 500 m.

5. Biomaterial, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que o referido biomaterial é tridimensional.

6. Biomaterial, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que as referidas ASCs são diferenciadas em células selecionadas do grupo que compreende ou consiste em osteoblastos,

condrócitos, queratinócitos, miofibroblastos, células endoteliais e adipócitos.

7. Dispositivo médico caracterizado pelo fato de compreender o biomaterial multidimensional conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 6.

8. Método para produzir o biomaterial multidimensional conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 6 caracterizado pelo fato de compreender as etapas de: - proliferar células-tronco derivadas do tecido adiposo (ASCs), - diferenciar ASCs na quarta passagem, e - induzir de forma multidimensional, de um modo preferido indução 3D.

9. Biomaterial multidimensional caracterizado pelo fato de poder ser obtido pelo método conforme definido na reivindicação 8.

10. Biomaterial, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de ser para uso no tratamento de defeito de tecido.

11. Biomaterial para uso, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que o referido tecido é selecionado do grupo que compreende ou consiste em osso, cartilagem, derme, músculo, endotélio e tecido adiposo.

12. Biomaterial para uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 ou 11, caracterizado pelo fato de que o referido defeito do tecido é um defeito da derme.

13. Biomaterial para uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 a 12, caracterizado pelo fato de que o referido biomaterial é para uso na reconstrução da derme.

14. Biomaterial para uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 a 13, caracterizado pelo fato de que o referido biomaterial é para uso no tratamento de feridas na derme, de um modo preferido feridas na derme diabética.

15. Biomaterial para uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 a 14, caracterizado pelo fato de que o referido biomaterial é para uso no tratamento de epidermólise bulbosa, nevos congênitos gigantes e/ou aplasia cutis congenita.