CN115779151A - 生物墨水及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本申请提供一种生物墨水及其制备方法和应用，其中生物墨水的制备方法，包括以下步骤：将脱细胞软骨细胞外基质原料分散在pH＝2～5的酸性水溶液中，以得到软骨细胞外基质溶胶作为生物墨水。该生物墨水仅以dCECM为原料，不需要添加其他人工高分子材料，具有良好的生物相容性。另外，本申请还提供了由此生物墨水经过3D打印得到的用于负载软骨修复细胞的支架，具有良好的生物相容性，且具有更精细的分级多孔结构，更加有利于细胞的粘附以及营养物质交换，提高软骨再生效率。
Description
技术领域
本申请涉及组织工程技术领域，具体涉及一种生物墨水及其制备方法和应用。
背景技术
关节软骨由于自身的结构特点，一旦损伤不加以及时的治疗修复，最终会导致骨性关节炎的发生。组织工程支架为关节软骨受损的患者带来了希望，以脱细胞的细胞外基质(dECM)为主要成分的支架，由于其极高的生物相容性被广泛应用，特别是脱细胞软骨细胞外基质(dCECM)制得的支架，由于其软骨再生线索的保留，被广泛用于软骨组织工程领域。
现有技术中以dCECM为主要成分的支架有两种，一种是使用冻干的方法，将dCECM构建为立体结构，但是这种方法比较粗糙，支架结构不够精细，孔径分布不均匀，不利于软骨修复的后期效果；另一种是在dCECM中添加人工高分子材料，得到适用于3D打印的生物墨水，但是这种方法由于添加了人工高分子材料会使支架的生物相容性以及降解速率降低。
因此，需要提供一种仅以dCECM为原料制备适用于3D打印的生物墨水的方法。
发明内容
本申请提供了一种生物墨水及其制备方法和应用，该生物墨水仅以dCECM为原料，不需要添加其他人工高分子材料，由此生物墨水经过3D打印得到的用于修复软骨的支架具有良好的生物相容性，且具有更精细的分级多孔结构，更加有利于细胞的粘附以及营养物质交换，提高软骨再生效率。
第一方面，本申请提供了一种生物墨水的制备方法，包括以下步骤：
将脱细胞软骨细胞外基质原料分散在pH＝2～5的酸性水溶液中，以得到软骨细胞外基质溶胶作为生物墨水。
本申请的技术方案中，本申请通过将dCECM分散在pH＝2～5的酸性水溶液中，得到的软骨细胞外基质溶胶具有良好的触变性能，能够直接用作生物墨水，通过进行3D打印得到结构精细且结构稳定的支架。且该制备方法步骤简单，成本较低，且无需添加有毒有害试剂，绿色环保，适合于工业化生产。
在本申请的一些实施例中，所述脱细胞软骨细胞外基质原料来源于哺乳动物的关节软骨组织。
在本申请的一些实施例中，所述软骨细胞外基质溶胶中脱细胞软骨细胞外基质的质量百分数为3～10％；
优选的，所述软骨细胞外基质溶胶中脱细胞软骨细胞外基质的质量百分数为5～9％；
进一步优选的，所述软骨细胞外基质溶胶中脱细胞软骨细胞外基质的质量百分数为6～8％。
在本申请的一些实施例中，所述酸性水溶液的溶质的pKa≥2.5。
在本申请的一些实施例中，所述制备方法，还包括：
将促成软骨分化因子分散在软骨细胞外基质溶胶中，以得到促软骨分化活性溶胶作为所述生物墨水；
可选的，促成软骨分化因子包括血小板源性生长因子、胰岛素样生长因子、转化生长因子、生长分化因子-5中一种或几种。
第二方面，本申请提供了一种生物墨水，根据第一方面任一实施例所述的制备方法制得。
在本申请的技术方案中，根据根据第一方面任一实施例所述的制备方法制得生物墨水，由于其不含其他人工高分子材料，因此该生物墨水制得的支架具有良好的生物相容性以及提高软骨再生效率。
第三方面，本申请还提供了一种用于负载软骨修复细胞的支架，包括：
根据第一方面或第二方面中任一实施例所述的生物墨水通过3D打印制备得到的用于负载软骨修复细胞的支架。
在本申请的技术方案中，由于通过3D打印可以得到具有仿生软骨组织精密结构的支架，适于细胞的粘附以及营养物质交换，促进细胞的增殖，同时由于dCECM中，包含有软骨再生的线索，可提供促进软骨修复细胞增殖、分化为软骨细胞的微环境，从而提高软骨再生效率，另外，生物墨水中不含有其他人工高分子材料，具有良好的生物相容性。由此，该用于负载软骨修复细胞的支架具有很好的修复软骨损伤的临床应用前景。
在本申请的一些实施例中，所述用于负载软骨修复细胞的支架具有孔径为200～400μm的通孔。
在本申请的一些实施例中，所述用于负载软骨修复细胞的支架具有孔径为10～15μm的微孔。
第四方面，本申请提供了一种用于负载软骨修复细胞的支架的制备方法，包括以下步骤：
S10：将如第一方面或第二方面任一实施例所述的生物墨水装入包含低温接收板的3D打印机中，所述3D打印机按预先设计的支架模型将生物墨水通过打印头分层沉积在低温接收板上得到凝胶支架；
S20：将凝胶支架冷冻干燥得到所述用于负载软骨修复细胞的支架。
在本申请的技术方案中，生物墨水在常温下可以通过3D打印机的打印头挤出连续的纤维丝，并在低温接收板上快速固化形成稳定精细结构，整个打印过程在常温或低温下进行，对生物墨水中的活性成分影响较小，更有利于保存dCECM中软骨再生的线索。因此通过该制备方法得到的用于负载软骨修复细胞的支架能有效提高软骨修复效率。
在本申请的一些实施例中，所述低温接收板的温度为-25～-50℃。
附图说明
此处的附图被并入说明书中并构成本说明书的一部分，示出了符合本申请的实施例，并与说明书一起用于解释本申请的原理。
图1为本申请实施例1～3制备的用于负载软骨修复细胞的支架的外观图以及不同放大倍数下扫描电镜图。
图2为本申请实施例1～3制备的用于负载软骨修复细胞的支架的成软骨分化能力测试结果图。
图3为本申请实施例4制备的用于负载软骨修复细胞的支架中GDF-5累计缓释度曲线图。
图4为本申请实施例2、4制备的用于负载软骨修复细胞的支架与空白组的成软骨分化能力测试结果图。
其中，图2、3中，*代表两组数据显著性分析的p＜0.05；**代表两组数据显著性分析的p＜0.01；***代表两组数据显著性分析的p＜0.001；
图3中，ECM组使用的支架为实施例2制备的用于负载软骨修复细胞的支架(7％ECM)。
通过上述附图，已示出本申请明确的实施例，后文中将有更详细的描述。这些附图和文字描述并不是为了通过任何方式限制本申请构思的范围，而是通过参考特定实施例为本领域技术人员说明本申请的概念。
具体实施方式
本说明书中各实施例或实施方案采用递进的方案描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示意性实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合实施方式或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本申请的至少一个实施方式或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施方式或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施方式或示例中以合适的方案结合。
此外，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括至少一个该特征。在本申请的描述中，“多个”的含义是至少两个，例如两个，三个等，除非另有明确具体的限定。
申请人发现，虽然使用dCECM作为原料制备用于负载软骨修复细胞的支架具有很好的应用前景，但是在现有技术中存在的问题在于，将dCECM水溶胶直接冻干得到的支架，支架结构较为粗糙，紧密结构不可控，不利于软骨修复的后期效果。而3D打印技术就能很好的解决上述问题，但是新的问题在于，单纯的dCECM水溶胶的触变性较差，即使将其浓度提升至10wt％，其粘度仍然无法满足用于3D打印的生物墨水的要求，且继续增加其浓度会导致dCECM在水中无法正常分散，因此在现有技术中，会通过添加其他人工高分子材料来改善其触变性能以满足生物墨水的要求。
因此，现有技术中使用的dCECM制备得到的支架，常含有其他人工高分子材料，如海藻酸钠、透明质酸、动物胶原等，还会添加一定量的交联剂，这种支架的缺点在于会使支架的生物相容性和降解速率降低；同时，由于添加有其他材料的支架，与单纯dCECM支架的成分、结构和机械功能均不相同，会在一定程度影响dCECM促进软骨再生的效果。
对于此，需要提供一种不添加其他人工高分子材料，以dCECM为原料制备生物墨水的方法，并使用该生物墨水通过3D打印技术得到具有适合于软骨修复结构的支架。
第一方面，本申请提供了一种生物墨水的制备方法，包括以下步骤：
将脱细胞软骨细胞外基质原料分散在pH＝2～5的酸性水溶液中，以得到软骨细胞外基质溶胶作为生物墨水。
本申请的技术方案中，本申请通过将dCECM分散在pH＝2～5的酸性水溶液中，得到的软骨细胞外基质溶胶具有良好的触变性能，能够直接用作生物墨水，通过进行3D打印得到结构精细且结构稳定的支架。且该制备方法步骤简单，成本较低，且无需添加有毒有害试剂，绿色环保，适合于工业化生产。
申请人意外发现，通过将dCECM分散至pH＝2～5的酸性水溶液中，得到的dCECM水溶胶相比将dCECM直接分散在水中得到的水溶胶具有更高的粘性，申请人将该dCECM水溶胶作为生物墨水装入3D打印机中，发现其能挤出连续且稳定的纤维丝，不易发生断裂也不成滴或聚团，同时在低温下可以快速固化，得到具有预设结构的产品，因此其满足作为3D打印生物墨水的需求。通过分析其中可能的原因在于，dCECM中主要由胶原蛋白、非胶原蛋白、弹性蛋白、蛋白聚糖以及氨基聚糖组成，将dCECM分散于pH＝2～5的酸性水溶液中时，通过改变蛋白表面的水化层和双电层，使dCECM中各种蛋白的构型发生变化，进而使其得到的dCECM水溶胶具有更好的触变性能。且当溶液中pH过高时，得到的dCECM水溶胶的粘性较低，并不能通过3D打印机挤出得到连续稳定的纤维丝；当溶液pH过低时，由于酸性过强，可能会由于部分蛋白质变形导致溶解性降低，粘性过大导致3D打印机挤出时容易出现断裂、成滴或聚团，不能形成连续稳定的纤维丝。
更优选的，酸性水溶液的pH为2.5～3.5，申请人通过实验发现，将dCECM溶解在pH＝2.5～3.5的酸性水溶液中时，得到的生物墨水的可3D打印性最好，可以选择根据需要调整更大范围的dCECM浓度。
作为一个示例的，本申请的一些实施例中使用5wt％的醋酸水溶液，在室温下，pH经过检测为2.92。
在本申请的技术方案中，对分散的具体方式并未做出进一步限定，可以通过机械搅拌、水浴加热、超声分散等现有技术中常用的加速分散方法进行分散，可根据实际情况进行选择。
具体的，本申请的一些实施例中，分散方式具体为在冰浴条件下进行超声分散2～5min。
在本申请的一些实施例中，脱细胞软骨细胞外基质原料来源于哺乳动物的关节软骨组织。
在上述一些实施例中，dCECM的主要来源为哺乳动物的关节软骨组织，根据生物墨水的施用对象，可以是修复哺乳动物的软骨损伤，选择同种同体或同种异体的关节软骨组织，经过脱细胞处理，并保留软骨组织结构和活性成分。需要说明的是，在确定了生物相容性、免疫原性及生物活性作用时，本申请并不排除使用异种的关节软骨组织。
本申请中并不对dCECM的制备方法进行进一步限定，可以使用商业化购买的dCECM，可以根据现有技术中dCECM的制备方法进行制备，其中使用的干燥dCECM中dsDNA的含量低于50ng/mg，可以尽可能降低宿主免疫排异反应。
在本申请的一些实施例中，脱细胞软骨细胞外基质原料的制备方法，包括以下步骤：
冻融循环步骤：将来源于哺乳动物的关节软骨组织经过冻融循环得到预处理关节软骨组织；
脱蛋白步骤：将预处理关节软骨组织在胰酶溶液中消化得到脱蛋白的关节软骨组织；
脱核酸步骤：将除蛋白的关节软骨组织在核酸酶溶液中消化得到脱细胞软骨；
冷冻干燥步骤：将脱细胞软骨洗涤后冷冻干燥后研磨得到脱细胞软骨细胞外基质原料。
在上述一些实施例中，通过冻融循环将软骨组织的细胞进行破裂，使内容物外流，再经过脱蛋白脱核酸处理得到脱细胞软骨，在进行冻干研磨即得到脱细胞软骨细胞外基质原料。
在本申请的一些实施例中，软骨细胞外基质溶胶中脱细胞软骨细胞外基质的质量百分数为3～10％；
优选的，软骨细胞外基质溶胶中脱细胞软骨细胞外基质的质量百分数为5～9％；
进一步优选的，软骨细胞外基质溶胶中脱细胞软骨细胞外基质的质量百分数为6～8％。
在上述一些实施例中，由于dCECM水溶胶的触变性能与dCECM含量相关，当dCECM水溶胶的质量百分数为3～10％时，dCECM水溶胶可通过3D打印机挤出连续稳定的纤维丝，可以顺利进行3D打印。若dCECM含量过高，一方面dCECM难以分散在酸性水溶液中，导致生产效率降低，另一方面，此时dCECM水溶胶的粘性过高，不易挤出，同样会产生不利影响；若dCECM含量过低，则无法得到连续稳定的纤维丝，不能用作生物墨水。
进一步的，当dCECM水溶胶的质量百分数为5～9％时，此时dCECM水溶胶的粘度适中，可以得到结构精细的支架，适于作为生物墨水，且生产效率较高。
更进一步的，dCECM水溶胶中dCECM的质量浓度不仅影响其作为生物墨水的可打印性，还会影响dCECM水溶胶作为生物墨水通过3D打印后干燥后得到支架微观结构，如支架中微孔孔径的大小，从而影响细胞的黏附、迁移、增殖和分化活动，进行影响支架修复软骨的效果。
如图1所示，可以看出不同浓度dCECM水溶胶得到支架的微观结构存在较大区别，浓度越高，支架微孔的孔径越小，并结合图2中成软骨分化能力测试结果，其中，SOX9、ACAN、COL2是本领域常用的检测干细胞分化为软骨细胞程度的指标，其数值越高，说明的干细胞分化为软骨细胞程度越高，由此可知，不同微观结构的支架显著影响其修复软骨组织的效果。
当dCECM水溶胶的质量百分数为6～8％时，此时得到的支架的微孔孔径更适于细胞的黏附、迁移、增殖和分化活动，其原因可能是此时支架的微观结构与天然软骨组织的结构更加相近，诱导干细胞分化成软骨细胞的能力更强，同时也有利于细胞的黏附、迁移、增殖，进而使支架具有良好的软骨修复效果。若dCECM含量过小或过大时，最终得到的支架孔径过大或过小，可能会导致影响细胞黏附、迁移、增殖和分化活动，进而影响其软骨修复效果。
在本申请的一些实施例中，酸性水溶液的溶质的pKa≥2.5。
在上述一些实施例中，酸性水溶液中的溶质选择pKa≥2.5的弱酸，这是由于弱酸具有一定的缓冲性能，使溶液pH受其他溶质的影响较小，使生物墨水的性质更加稳定。同时由于该生物墨水最终用途为植入人或动物体内进行软骨修复，因此生物墨水应该具有良好的生物相容性，酸性水溶液中溶质应该为细胞毒性较低的有机酸，如醋酸、柠檬酸、酒石酸、富马酸等，可以根据实际情况选择上述溶质中的一种或几种。
在本申请的一些实施例中，所述制备方法，还包括：
将促成软骨分化因子分散在软骨细胞外基质溶胶中，以得到促软骨分化活性溶胶作为生物墨水；
可选的，促成软骨分化因子包括血小板源性生长因子、胰岛素样生长因子、转化生长因子、生长分化因子-5(GDF-5)中一种或几种。
在上述一些实施例中，为了进一步提高支架诱导干细胞分化成软骨的能力，可在生物墨水中添加促成软骨分化因子，与dCECM具有的软骨再生线索协同作用，使使用该生物墨水得到的支架具有更好的软骨修复效果。
进一步的，血小板源性生长因子、胰岛素样生长因子、转化生长因子、GDF-5是本领域常用的促成软骨分化因子，可以根据实际情况选择的一种或几种。
另外，如图4所示，含有GDF-5的支架具有很好的缓释能力，说明GDF-5与支架之间的结合力较强，能够长时间发挥其诱导干细胞分化为软骨细胞，从而提高支架的软骨修复能力。
第二方面，本申请提供了一种生物墨水，根据第一方面任一实施例的制备方法制得。
在本申请的技术方案中，根据根据第一方面任一实施例的制备方法制得生物墨水，由于其不含其他人工高分子材料，因此该生物墨水制得的支架具有良好的生物相容性以及提高软骨再生效率。
第三方面，本申请还提供了一种用于负载软骨修复细胞的支架，包括：
根据第一方面或第二方面中任一实施例的生物墨水通过3D打印制备得到的用于负载软骨修复细胞的支架。
在本申请的技术方案中，由于通过3D打印可以得到具有仿生软骨组织精密结构的支架，适于细胞的粘附以及营养物质交换，促进细胞的增殖，同时由于dCECM中，包含有软骨再生的线索，可提供促进软骨修复细胞增殖、分化为软骨细胞的微环境，从而提高软骨再生效率，另外，生物墨水中不含有其他人工高分子材料，具有良好的生物相容性。由此，该用于负载软骨修复细胞的支架具有很好的修复软骨损伤的临床应用前景。
其中软骨修复细胞在临床上主要包括全能干细胞、多能干细胞或软骨细胞。全能干细胞、多能干细胞均具有分化为软骨细胞的能力，因此可以和软骨细胞一样作为软骨修复细胞用于软骨的修复，可以根据实际情况选择其中一种或几种。
进一步的，由于全能干细胞和软骨细胞来源有限、伦理问题、获取困难、培养增殖效率较低，一般选用具有贴壁生长及传代能力，具有成软骨细胞分化潜能的多能干细胞，目前常用于软骨修复研究领域的多能干细胞包括骨髓间充质干细胞、脂肪间充质干细胞或滑膜间充质干细胞中的一种或几种，可根据实际情况选择其中一种或几种。
需要说明的是，上述软骨修复细胞来源于商业购买，或是经过伦理委员会批准取自于哺乳动物经过传代纯化培养并鉴定后使用。
在本申请的一些实施例中，用于负载软骨修复细胞的支架具有孔径为200～400μm的通孔。
在上述一些实施例中，如图1所示，由于天然软骨组织没有血管，其营养来源于组织液的交换，因此通过3D打印技术建模，打印冷冻干燥得到用于负载软骨修复细胞的支架，使其具有孔径为200～400μm的通孔，一方面有利于软骨修复细胞的黏附，另一方面可以使其能快速被组织液浸润，为黏附在支架上的软骨修复细胞提供影响，促进其增殖分化。
在本申请的一些实施例中，用于负载软骨修复细胞的支架具有孔径为10～15μm的微孔。
在上述一些实施例中，通过图1和图2的结果可知，当支架的微孔孔径为10～15μm时，最有利于软骨修复细胞黏附、迁移、增殖和分化活动，因此此时得到的支架修复软骨的效果最好。
第四方面，本申请提供了一种用于负载软骨修复细胞的支架的制备方法，包括以下步骤：
S10：将如第一方面或第二方面任一实施例的生物墨水装入包含低温接收板的3D打印机中，3D打印机按预先设计的支架模型将生物墨水通过打印头分层沉积在低温接收板上得到凝胶支架；
S20：将凝胶支架冷冻干燥得到用于负载软骨修复细胞的支架。
在本申请的技术方案中，生物墨水在常温下可以通过3D打印机的打印头挤出连续的纤维丝，并在低温接收板上快速固化形成稳定精细结构，整个打印过程在常温或低温下进行，对生物墨水中的活性成分影响较小，更有利于保存dCECM中软骨再生的线索。因此通过该制备方法得到的用于负载软骨修复细胞的支架能有效提高软骨修复效率。
在本申请的一些实施例中，步骤S20中，还包括：
冷冻干燥后经过杀菌处理得到用于负载软骨修复细胞的支架。
在上述一些实施例中，用于负载软骨修复细胞的支架应经过杀菌处理，防止支架被杂菌污染，影响软骨修复细胞的黏附和增殖，降低支架的安全隐患。
在本申请的一些实施例中，低温接收板的温度为-25～-50℃。
在上述一些实施例中，低温接收板的温度为-25～-50℃，在此温度下，挤出的溶胶纤维丝可以快速在低温接收板上固化，从而得到具有精细结构的支架。若温度过高，则导致纤维丝无法快速固化；若温度过低，则会增加生产成本。
以下，通过实施例更详细地说明本申请的生物墨水及其制备方法和应用，但本申请丝毫不限于这些实施例。
具体实施例
dCECM原料的制备：从购买的猪的膝关节中取出所需的关节软骨，并将其切成均匀大小的块得到软骨样品。将软骨样品在-80℃冷冻、室温解冻的条件下，反复冷冻-解冻10个循环。
将软骨样品在4℃下均质，用0.25％胰蛋白酶-EDTA(gibco美国)溶液在搅拌处理24小时。
弃去胰蛋白酶-EDTA溶液，将软骨样品在核酸酶工作液中，37℃下处理4h；其中核酸酶工作液为50U/mL DNAse(biosharp中国)，1U/mL RNAse A(biosharp中国)，溶剂为pH＝7.5的10mM Tris-HCl缓冲液。
弃去核酸酶工作液，用PBS缓冲液溶液洗涤软骨样品24h，每8h更换一次缓冲液，洗去核酸酶。
再用去离子水冲洗软骨样品7天，去除有毒物质。
将软骨样品冷冻干燥后进行研磨得到dCECM原料。
骨髓间充质干细胞的制备：
大鼠骨髓间充质干细胞的分离培养：取SD大鼠乳鼠，麻醉后脱颈处死，置于体积分数75％乙醇浸泡消毒30min。无菌条件下取乳鼠股骨和胫骨，置于含有双抗的PBS溶液(pH＝7.4)中，将其剪成1.0～2.0mm3碎块，加入含体积分数10％胎牛血清的DMEM培养基，随后移入25cm2培养瓶，每两三天更换培养液。显微镜下观察，待细胞生长至80％～90％融合时进行传代，于细胞培养箱培养至P3代备用。
成软骨分化能力检测：
在用于负载软骨修复细胞的支架滴加1mL 106cells/mL的骨髓间充质干细胞，再将其使用成软骨分化培养基培养14d，提取RNA，使用PCR技术检测成软骨分化的相关基因SOX9、ACAN、COL2。
Control组是将1mL 106cells/mL的骨髓间充质干细胞直接在软骨分化培养基培养14d，提取RNA，使用PCR技术检测成软骨分化的相关基因SOX9、ACAN、COL2。
实施例1
生物墨水的制备：将5g dCECM原料加入100mL 5％醋酸水溶液中，使用Q125超声仪(Qsonica,USA)在冰浴中以75％的振幅粉碎材料，共2min，获得生物墨水。
用于负载软骨修复细胞的支架(5％ECM)的制备：将上述生物墨水装入配有塑料墨水注射器和低温接收板的3D打印机中，该打印机遵循预先设计的支架模型打印路线，生物墨水通过打印头分层沉积在-30℃的低温接收板上得，挤出的纤维丝在印刷过程中就能快速固化到凝胶支架；
将凝胶支架转移至-80℃进一步固化，在冷冻干燥机中冻干48h，以去除残留溶剂，在用Cobalt 60进行消毒得到用于负载软骨修复细胞的支架(5％ECM)。
对上述支架的外观和不同放大倍数的扫描电镜图如图1所示。
对上述支架进行成软骨分化能力检测，结果如图2所示。
实施例2
生物墨水的制备：将7g dCECM原料加入100mL 5％醋酸水溶液中，使用Q125超声仪(Qsonica,USA)在冰浴中以75％的振幅粉碎材料，共2min，获得生物墨水。
用于负载软骨修复细胞的支架(7％ECM)的制备：将上述生物墨水装入配有塑料墨水注射器和低温接收板的3D打印机中，该打印机遵循预先设计的支架模型打印路线，生物墨水通过打印头分层沉积在-30℃的低温接收板上得，挤出的纤维丝在印刷过程中就能快速固化到凝胶支架；
将凝胶支架转移至-80℃进一步固化，在冷冻干燥机中冻干48h，以去除残留溶剂，在用Cobalt 60进行消毒得到用于负载软骨修复细胞的支架(7％ECM)。
对上述支架的外观和不同放大倍数的扫描电镜图如图1所示。
对上述支架进行成软骨分化能力检测，结果如图2所示。
实施例3
生物墨水的制备：将9g dCECM原料加入100mL 5％醋酸水溶液中，使用Q125超声仪(Qsonica,USA)在冰浴中以75％的振幅粉碎材料，共2min，获得生物墨水。
用于负载软骨修复细胞的支架(9％ECM)的制备：将上述生物墨水装入配有塑料墨水注射器和低温接收板的3D打印机中，该打印机遵循预先设计的支架模型打印路线，生物墨水通过打印头分层沉积在-30℃的低温接收板上得，挤出的纤维丝在印刷过程中就能快速固化到凝胶支架；
将凝胶支架转移至-80℃进一步固化，在冷冻干燥机中冻干48h，以去除残留溶剂，在用Cobalt 60进行消毒得到用于负载软骨修复细胞的支架(9％ECM)。
对上述支架的外观和不同放大倍数的扫描电镜图如图1所示。
对上述支架进行成软骨分化能力检测，结果如图2所示。
实施例4
生物墨水的制备：将7g dCECM原料加入100mL 5％醋酸水溶液中，使用Q125超声仪(Qsonica,USA)在冰浴中以75％的振幅粉碎材料，共2min，再加入500μg GDF-5，搅拌充分溶解，获得生物墨水。
用于负载软骨修复细胞的支架(ECM/GDF-5)的制备：将上述生物墨水装入配有塑料墨水注射器和低温接收板的3D打印机中，该打印机遵循预先设计的支架模型打印路线，生物墨水通过打印头分层沉积在-30℃的低温接收板上得，挤出的纤维丝在印刷过程中就能快速固化到凝胶支架；
将凝胶支架转移至-80℃进一步固化，在冷冻干燥机中冻干48h，以去除残留溶剂，在用Cobalt 60进行消毒得到用于负载软骨修复细胞的支架(ECM/GDF-5)。
将control组、ECM组(使用实施例2制备的7％-ECM)、ECM/GDF-5组进行成软骨分化能力检测，结果如图3所示。
其中，control组是将1mL 106cells/mL的骨髓间充质干细胞直接在软骨分化培养基培养14d，提取RNA，使用PCR技术检测成软骨分化的相关基因SOX9、ACAN、COL2。
GDF-5释放试验：使用上述支架(n＝3)在PBS(含0.5％牛血清白蛋白)中孵育，在支架孵育0、1、4、7、8、14、21、28、35和42天的不同时间点从每个孔中收集上清，并添加等量的新鲜PBS。根据生产商的说明，使用GDF-5ELISA试剂盒(R&D Systems)量化不同时间点释放的GDF-5浓度。最后绘制GDF-5释放百分比曲线。结果如图4所示。
从图1的结果可知，实施例1～3制备的不同浓度的生物墨水均具有良好的可打印性，能得到具有良好结构的支架，通过比较可知三种支架具有不同大小的孔隙。从图2的结果可知，实施例2制备的7％ECM成软骨分化能力最好，相比5％ECM和9％ECM均有显著的提高，此时得到的支架的软骨修复效果最好。从图3的结果可知，实施例4得到的ECM/GDF-5成软骨分化能力比实施例2更好，说明脱细胞软骨细胞外基质的成软骨分化线索与GDF-5具有一定的协同作用，可以提高支架的软骨修复效果。从图4的结果可知，ECM/GDF-5中的GDF-5具有良好的缓释效果，可以缓慢释放，从而达到长效促进软骨分化的效果。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本申请的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本申请进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本申请各实施例技术方案的范围。
Claims (11)
1.一种生物墨水的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
将脱细胞软骨细胞外基质原料分散在pH＝2～5的酸性水溶液中，以得到软骨细胞外基质溶胶作为生物墨水。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述脱细胞软骨细胞外基质原料来源于哺乳动物的关节软骨组织。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述软骨细胞外基质溶胶中脱细胞软骨细胞外基质的质量百分数为3～10％；
优选的，所述软骨细胞外基质溶胶中脱细胞软骨细胞外基质的质量百分数为5～9％；
进一步优选的，所述软骨细胞外基质溶胶中脱细胞软骨细胞外基质的质量百分数为6～8％。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述酸性水溶液的溶质的pKa≥2.5。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，还包括：
将促成软骨分化因子分散在软骨细胞外基质溶胶中，以得到促软骨分化活性溶胶作为所述生物墨水；
可选的，促成软骨分化因子包括血小板源性生长因子、胰岛素样生长因子、转化生长因子、生长分化因子-5中一种或几种。
6.一种生物墨水，其特征在于，根据权利要求1～5任一项所述的制备方法制得。
7.一种用于负载软骨修复细胞的支架，其特征在于，包括：
根据权利要求1～6任一项所述的生物墨水通过3D打印制备得到的用于负载软骨修复细胞的支架。
8.根据权利要求7所述的支架，其特征在于，所述用于负载软骨修复细胞的支架具有孔径为200～400μm的通孔。
9.根据权利要求7或8所述的支架，其特征在于，所述用于负载软骨修复细胞的支架具有孔径为10～15μm的微孔。
10.一种用于负载软骨修复细胞的支架的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S10：将根据权利要求1～6任一项所述的生物墨水装入包含低温接收板的3D打印机中，所述3D打印机按预先设计的支架模型将生物墨水通过打印头分层沉积在低温接收板上得到凝胶支架；
S20：将凝胶支架冷冻干燥得到所述用于负载软骨修复细胞的支架。
11.根据权利要求10所述的制备方法，其特征在于，所述低温接收板的温度为-25～-50℃。
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| CN115382023A (zh) * | 2022-08-10 | 2022-11-25 | 北京积水潭医院 | 一种可用于低温沉积3d打印的脱细胞基质及其制备方法和应用 |
-
2022
- 2022-11-29 CN CN202211509231.6A patent/CN115779151A/zh active Pending
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