CN114432500B

CN114432500B - 一种CeO2修饰TiO2可变纳米管阵列的仿生多孔钛支架及其制备方法

Info

Publication number: CN114432500B
Application number: CN202210067978.4A
Authority: CN
Inventors: 马俊青; 赵娜; 詹卓嵘; 杨燕; 郭舒瑜; 袁礼婵; 马煜欢
Original assignee: Affiliated Stomatological Hospital of Nanjing Medical University
Current assignee: Affiliated Stomatological Hospital of Nanjing Medical University
Priority date: 2022-01-20
Filing date: 2022-01-20
Publication date: 2022-09-16
Anticipated expiration: 2042-01-20
Also published as: CN114432500A

Abstract

本发明公开了一种CeO₂修饰TiO₂可变纳米管阵列的仿生多孔钛支架的制备方法，先采用3D打印技术制得多孔钛支架，接着对其进行两步法阳极氧化，在支架上形成哑铃形TiO₂NT阵列，制得TiO₂NT修饰多孔钛支架，再将其浸入Ce(NO₃)₃溶液中，取出干燥后进行热处理，得到负载CeO₂NP的TiO₂NT修饰多孔钛支架，然后浸泡于rhBMP‑2溶液，冻干过夜后干燥，最后利用冻干法和真空干燥法将VEGF/壳聚糖混合溶液涂覆在支架上，并使用京尼平做交联剂，制得仿生多孔钛支架。该支架具有抗菌、抗炎、促血管新生和促成骨细胞分化等优点，能够有效改善骨缺损修复重建的预后情况，并且具有优异的药物缓释性能。

Description

一种CeO2修饰TiO2可变纳米管阵列的仿生多孔钛支架及其制备方法

技术领域

本发明属于生物医学材料技术领域，具体涉及一种CeO₂修饰TiO₂可变纳米管阵列的仿生多孔钛支架及其制备方法。

背景技术

血管化自体骨移植可为快速血管新生和骨形成提供必要的生物信号和环境，因其具有良好的骨传导性和骨诱导性，被誉为骨缺损修补的“金标准”。但由于供区损伤大和供体骨较难获取等原因，在应用中存在一定困难。人工合成的工程骨则成为解决骨资源问题的有效替代方法，具有良好的应用前景。

钛合金植入物拥有良好的力学性能、化学稳定性和生物相容性，是一种常见的骨组织工程材料。但其多为实心结构，弹性模量显著超出骨组织，易出现应力屏蔽现象导致植入物周围出现骨吸收。为改进这一弊端，使用3D打印技术制备多孔钛支架的解决方法应运而生，一方面使植入物与骨弹性模量相匹配，另一方面能根据患者的骨缺损情况进行个性化定制。

二氧化钛纳米管(TiO₂nano-tube，TiO₂NT)是备受关注的钛表面结构修饰方法，其具有纳米级管状结构、尺寸可控等特点，不仅可以增加钛植体的吸附能力和比表面积，还有利于负载药物。传统纳米管的结构为上下均一直径，作为载药平台存在药物初期的突释现象，无法满足长期组织改建中的药物缓释需求。为了解决传统纳米管在药物缓释方面的局限性，学者们在不同材料表面研制出可变的不均一直径的纳米管系统，改善内容物流体动力学，以实现对所加载药物不同程度的缓释。Xu等人(Bone-shaped nanomaterials fornanocomposite applications， 2003)在多孔阳极氧化铝上成功构建了哑铃形(骨形)碳纳米管通道，为可变纳米结构应用于材料表面以实现对负载药物的缓释，提供了理论支持。研发可变直径的钛纳米管材料不仅有利于获得更大的比表面积和更佳的载药性能，还有利于对其内载药物的长期控释，以获得更优异的骨愈合能力。目前尚未见钛表面可变直径的哑铃形纳米管用于调整药物缓释速率的相关研究报道。

纳米酶是一种既有纳米材料物化特性且能高效模拟天然酶催化活性的人造酶，其相比传统蛋白酶提供了更优的催化稳定性和制备经济性。CeO₂纳米颗粒(CeO₂Nanoparticle，CeO₂NP)系统具有强大的过氧化氢酶(Catalase，CAT) 和超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase,SOD)等多酶活性，可有效清除组织中活性氧(reactive oxygenspecies，ROS)，显示出更好的抗菌和抗炎作用，减少人工骨的植入失败。壳聚糖具有良好的组织相容性和生物降解性，并与生物交联剂京尼平交联形成三维水凝胶体系以调控降解速率，满足负载药物的缓释需求。此外，将骨形态发生蛋白-2(Bone morphogenetic protein-2，BMP-2)、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)加载于有机涂层涂覆在钛植体表面，能够促进植体周围成骨细胞分化和血管新生，加速骨形成。因此，研发TiO₂NT-CeO₂/壳聚糖/水凝胶的复合药物缓释系统既可以实现促成骨药物的长期缓释，还能够满足多种因子的按需依次释放。

中国专利CN109701085A公开了一种载锶多孔钛合金支架的制备方法，该方法在钛合金表面获得掺杂0.9wt％锶离子的羟基磷灰石生物活性涂层，显著提高了该支架的成骨性能和新骨长入速度。然而，该支架需要高温热处理及长时间烘干、震荡，制备条件严格，且无法满足骨组织改建中持续释放生长因子的需求，无法做到药物缓释，对于长期成骨性能的改善仍无确切的结果。

中国专利CN111658816A公开了一种载药金属纳米颗粒/壳聚糖控释水凝胶及其制备方法与应用，该方法将万古霉素吸附于纳米氧化锌颗粒表面，再与壳聚糖溶液形成水凝胶。该水凝胶通过超声处理和磁力搅拌制备，获得良好的力学性能和缓释性能，其负载万古霉素的释放周期达15天，但仍存在29％的初期突释现象。

目前，骨组织缺损修复的需求十分广泛，用于解决治疗中愈合欠佳、感染、成骨能力较差等疑难问题的相关技术亟待发展，也成为备受关注的研究方向之一。基于此，本发明构建了一种具有促血管新生、促新骨形成以及抗炎抗菌等协同作用的CeO₂修饰TiO₂可变纳米管阵列的仿生多孔钛支架，具有客观的现实意义和良好的应用前景。

发明内容

本发明的目的在于针对现有的技术不足，提供一种CeO₂修饰TiO₂可变纳米管阵列的仿生多孔钛支架及其制备方法。

技术方案

本发明创新性地在3D打印多孔钛支架表面研制出哑铃形的可变TiO₂NT阵列，不仅可以增加钛植体的吸附能力和比表面积，还有利于负载并实现药物的缓释，同时，本发明在TiO₂NT中负载CeO₂NP/BMP-2/VEGF，赋予钛植体良好的抗炎、促细胞增殖和促成骨的性能，显著提高钛植体的生物相容性。具体方案如下：

一种CeO₂修饰TiO₂可变纳米管阵列的仿生多孔钛支架的制备方法，包括如下步骤：

(1)3D打印制备多孔钛支架

通过计算机建模软件建立多孔钛支架的三维模型并输入到3D打印机，然后采用直径为15～50μm的Ti-6Al-4V合金粉末进行3D打印，得到多孔钛支架，取出后进行热处理和喷砂处理，备用；

所述多孔钛支架由圆柱体单元堆积而成，圆柱体单元高5mm，外径3.2mm，孔隙率为70.27±4.2％；

(2)制备TiO₂NT修饰多孔钛支架

将步骤(1)的多孔钛支架进行抛光处理后，浸泡于电解液中作为阳极，以石墨片作为阴极，两电极平行放置，间距为3cm，在两电极间施加60-100V的电压，进行第一步阳极氧化，结束后取出清洗干净，再次放入相同电解液中进行第二步阳极氧化，结束后取出干燥，再进行热处理，得到TiO₂NT修饰多孔钛支架；

所述电解液为乙二醇体系，里面含有0.3～0.5wt％NH₄F、1～3v％水和1～2 mol/L乳酸；

(3)制备负载CeO₂NP的TiO₂NT修饰多孔钛支架

将步骤(2)制得的TiO₂NT修饰多孔钛支架浸入0.2～1mol/L的Ce(NO₃) ₃溶液中，15～30s后取出，干燥后进行热处理，得到负载CeO₂NP的TiO₂NT 修饰多孔钛支架；

(4)制备负载CeO₂/BMP-2的TiO₂NT修饰多孔钛支架

将步骤(3)制得的负载CeO₂NP的TiO₂NT修饰多孔钛支架浸泡于rhBMP-2 溶液中，取出后置于冷冻干燥机中-40℃下冻干过夜，再取出在室温下干燥，制得负载CeO₂/BMP-2的TiO₂NT修饰多孔钛支架；

(5)制备CeO₂修饰TiO₂可变纳米管阵列的仿生多孔钛支架

将步骤(4)制备的负载CeO₂/BMP-2的TiO₂NT修饰多孔钛支架浸泡于VEGF/壳聚糖混合溶液中，取出后置于冷冻干燥机中-40℃下冻干过夜，再取出真空干燥，最后浸泡于京尼平溶液中，室温放置24～30h后，干燥，得到CeO₂修饰TiO₂可变纳米管阵列的仿生多孔钛支架。

进一步，步骤(1)中，所述3D打印参数为：铺粉厚度为30μm,激光功率为120W，曝光时间70μs，激光扫描点间距60μm，线间距60μm。

进一步，步骤(1)中，所述热处理的温度为800-900℃，升温速率为5℃/min，保温时间为0.5-2h。热处理可以消除加工过程中产生的残余应力。

进一步，步骤(1)中，所述喷砂处理在喷砂机中进行，目的是去除表面多余的金属粉末，采用的喷砂磨料为石英砂，石英砂粒径为80目，喷砂时间60s。

进一步，步骤(2)中，所述抛光处理是指：先在丙酮中机械抛光10min，再置于体积比为1:4:5的氢氟酸、硝酸和去离子水组成的混合溶液中化学抛光60 s。

进一步，步骤(2)中，所述第一步阳极氧化的条件为：电压为90V，时间为15min；所述第二步阳极氧化的条件为：先在90V电压下氧化5min，再在 60V电压下氧化5min，最后在90V电压下氧化5min。通过控制两步法阳极氧化中的细节参数，可制备出顶部和底部管内直径大，中间段缩窄直径小，底部封闭内部中空的哑铃形TiO₂NT阵列，应用于构成仿生多孔钛支架上的药物缓释系统，提供优异的生物相容性和药物缓释性能。

进一步，步骤(2)中，所述热处理温度为450℃，时间为2h。

进一步，步骤(3)中，所述热处理温度为450℃，时间为3h。

进一步，步骤(5)中，所述VEGF/壳聚糖混合溶液中，壳聚糖浓度为0.01～0.05 g/mL，VEGF浓度为30～80ng/mL。

上述方法制得的CeO₂修饰TiO₂可变纳米管阵列的仿生多孔钛支架用于人造骨植入物的应用。

与现有技术相比，本发明的优势为：

1)本发明对3D打印多孔钛支架进行哑铃形TiO₂NT表面改性并负载CeO₂ NP涂层和BMP-2/VEGF/壳聚糖/京尼平水凝胶，制得的仿生多孔钛支架具有抗菌、抗炎、促血管新生和促成骨细胞分化等优点，能够有效改善骨缺损修复重建的预后情况，通过与间充质干细胞共培养发现，本发明的多孔钛支架中细胞的增殖活性有显著增加；

2)本发明的仿生多孔钛支架具有哑铃形可变直径TiO₂NT阵列，与常规柱状纳米管相比，能够实现对钛植体内载药物不同程度的缓释，具有良好的载药和控释性能；

3)本发明采用操作简易及成本较低的热分解结晶法代替传统电沉积法、湿化学沉积沉淀法等方式，成功将CeO₂涂层负载到哑铃形TiO₂NT阵列的内部和顶端，赋予仿生多孔钛支架CeO₂NP纳米酶的抗炎和促成骨性能；

4)本发明将壳聚糖与天然交联剂京尼平交联，制得具有良好生物相容性和降解性能的水凝胶，再与哑铃形TiO₂NT阵列构成复合药物缓释系统，赋予支架缓释并顺序可控释放内载药物的性能，能够满足骨缺损重建中药物长期释放，以促进骨缺损血管新生和骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化的需求。

附图说明

图1为实施例1制得的仿生多孔钛支架的扫描电镜图；

图2为实施例1制得的多孔钛支架的CeO₂NP释放曲线；

图3为实施例1和对比例1-4制得的多孔钛支架的CCK-8检测结果柱状图；

图4为实施例1和对比例1-4制得的多孔钛支架的ALP活性柱状图。

具体实施方式

为更详尽地说明本方案的目的、技术方案和优点，下面结合附图和具体实施例对本发明的技术方案作进一步阐述。应理解，下列实施例仅为本发明地部分实施例而并非全部，且仅用于说明本发明的技术效果而非用于限制本发明的保护范围。

实施例1

(1)3D打印制备多孔钛支架

S1.通过计算机建模软件建立多孔钛支架的三维模型并输入到选择性激光熔化(SLM)3D打印机，所述多孔钛支架由圆柱体单元堆积而成，圆柱体单元高 5mm，外径3.2mm，中值孔径为292.4μm，孔隙率为70.27±4.2％；

S2.以直径为15～50μm的Ti-6Al-4V合金粉末为基材，进行3D打印；3D打印机配备了聚焦光束直径为30-50μm的光纤激光器，在Ar/N2气氛(Ar纯度≥99.99％，氧气含量小于1000ppm)下，该打印过程中的参数为：铺粉厚度为 30μm,激光功率为120W，曝光时间70μs，激光扫描点间距60μm，线间距60μm；

S3.将3D打印得到的多孔钛支架取出后进行热处理，以消除加工过程中产生的残余应力，热处理温度为850℃，升温速率为5℃/min，保温1h，随炉冷却，去除钛支架支撑后打磨，并置于喷砂机中喷砂处理，去除表面多余的金属粉末，喷砂磨料为石英砂，石英砂粒径为80目，喷砂时间60s；

(2)制备TiO₂NT修饰多孔钛支架

S1、预处理：将步骤(1)的多孔钛支架先在丙酮中机械抛光10min，再置于体积比为1:4:5的氢氟酸、硝酸和去离子水组成的混合溶液中化学抛光60s；

S2、配制电解液：电解液为乙二醇体系，里面含有0.5wt％NH₄F、3v％水和 1.5mol/L乳酸；

S3、两步法阳极氧化：将预处理后的多孔钛支架浸泡于电解液中作为阳极，以石墨片作为阴极，两电极平行放置，间距为3cm，直流稳压电源为体系提供正向偏压，在20℃的电解液中施加90V的恒定电压氧化15min，取出后在去离子水中超声震荡30min，然后再次放入相同电解液中进行第二步阳极氧化，所述第二步阳极氧化的条件为：先在90V电压下氧化5min，再在60V电压下氧化 5min，最后在90V电压下氧化5min；

S4、后处理：将两步法阳极氧化后的支架取出，在80℃下干燥，然后在450℃下热处理2h，室温下冷却，得到TiO₂NT修饰多孔钛支架，该多孔钛支架表面呈随机分布的钛微米级微球颗粒的粗糙结构；

(3)制备负载CeO₂NP的TiO₂NT修饰多孔钛支架

将步骤(2)制得的TiO₂NT修饰多孔钛支架浸入1mol/L的Ce(NO₃)₃溶液中，20s后取出，70℃下干燥后，在450℃下热处理3h，得到负载CeO₂NP 的TiO₂NT修饰多孔钛支架；

(4)制备负载CeO₂/BMP-2的TiO₂NT修饰多孔钛支架

将步骤(3)制得的负载CeO₂NP的TiO₂NT修饰多孔钛支架浸泡于100 ng/mL的rhBMP-2溶液中，取出后置于冷冻干燥机中-40℃下冻干过夜，再取出在室温下干燥，制得负载CeO₂/BMP-2的TiO₂NT修饰多孔钛支架；

(5)制备CeO₂修饰TiO₂可变纳米管阵列的仿生多孔钛支架

制备VEGF/壳聚糖混合溶液，混合溶液中，壳聚糖溶液浓度为0.03g/mL， VEGF浓度为50ng/mL；

将步骤(4)制备的负载CeO₂/BMP-2的TiO₂NT修饰多孔钛支架浸泡于 VEGF/壳聚糖混合溶液中，取出后置于冷冻干燥机中-40℃下冻干过夜，再取出真空干燥，然后浸泡于京尼平溶液(称取1g京尼平于烧杯中，加入100mL去离子水，室温下搅拌成澄清透明溶液，得到京尼平溶液)中，室温下放置24h 后，扩散交联成水凝胶，颜色由透明黄色溶液变为蓝色胶体，室温干燥后即得仿生多孔钛支架。

制得的CeO₂修饰TiO₂可变纳米管阵列的仿生多孔钛支架记为TNT-BV。

对比例1 3D打印多孔钛支架

以直径为15～50μm的Ti-6Al-4V合金粉末作为基材，使用选择性激光熔化 (SLM)3D打印机制作多孔钛支架，该支架不具有TiO₂NT阵列修饰，所得样品记为Ti6Al4V。该多孔钛支架的制备步骤如下：

S3.将3D打印得到的多孔钛支架取出后进行热处理，以消除加工过程中产生的残余应力，热处理温度为850℃，升温速率为5℃/min，保温1h，随炉冷却，去除钛支架支撑后打磨，并置于喷砂机中喷砂处理，去除表面多余的金属粉末，喷砂磨料为石英砂，石英砂粒径为80目，喷砂时间60s。所得样品记为Ti6Al4V。

对比例2传统柱形TiO₂NT阵列修饰多孔钛支架

步骤(1)与实施例1的步骤(1)相同，在3D打印制得多孔钛支架的基础上，利用两步法阳极氧化制备传统柱形TiO₂NT阵列，方法如下：

S1、多孔钛支架预处理：将3D打印制得多孔钛支架置于丙酮中机械抛光10 min，再置于体积比为1:4:5的氢氟酸、硝酸和去离子水组成的混合溶液中化学抛光60s；

S3、两步法阳极氧化：将预处理后的多孔钛支架浸泡于电解液中作为阳极，以石墨片作为阴极，两电极平行放置，间距为3cm，直流稳压电源为体系提供正向偏压，在20℃的电解液中施加90V的恒定电压氧化15min，取出后在去离子水中超声震荡30min，然后再次放入相同电解液中进行第二步阳极氧化，所述第二步阳极氧化的条件为：在90V电压下氧化15min，得到高度有序的传统柱形TiO₂NT阵列；

S4、后处理：将两步法阳极氧化后的支架取出，在80℃下干燥，然后在450℃下热处理2h，室温下冷却，得到传统柱形TiO₂NT阵列修饰多孔钛支架；

将制得的多孔钛支架记为TNT-B。该支架上的TiO₂NT阵列为上下管径均一的中空结构，其顶部开放、底部密闭，管内直径均一为150nm，管壁厚度为10nm，管长为3.5μm。

对比例3TiO₂NT修饰多孔钛支架

制备方法与实施例1的步骤(1)和(2)相同，不含有实施例1的步骤(3)、 (4)和(5)。制得的多孔钛支架记为TNT-D，该支架上含有哑铃形TiO₂NT 阵列，TiO₂NT阵列为纵截面上下直径不等的管状中空结构，其顶部开放、底部密闭，两部分末端管内直径均为150nm，中段茎部管内直径为100nm，管壁厚度为10nm，管长为3.5μm。

对比例4负载CeO₂NP的TiO₂NT修饰多孔钛支架

制备方法与实施例1的步骤(1)、(2)和(3)相同，不含有实施例1的步骤(4)和(5)。制得的多孔钛支架记为TNT-Ce，CeO₂NP涂层均匀分散在纳米管中，并在纳米管阵列表面形成纳米薄膜，平均厚度为1200±100nm。

性能测试：

一、多孔钛支架表面TiO₂NT阵列表面微观结构、力学性能分析和润湿性分析

试验材料：制备的多孔钛支架Ti6Al4V、TNT-B、TNT-D和TNT-BV。

试验方法：

(1)扫描电子显微镜(SEM)分析：将多孔钛支架放在丙酮里进行超声清洗2min后吹干。测试时先将试样镀金，置于扫描电子显微镜中，分别观察该组支架宏观、俯视观、底面观和纵截面的微观结构。

(2)力学性能测试：使用游标卡尺测量Ti6Al4V多孔钛支架的直径和高度，以1mm/min的恒定形变速率施加10KN的最大载荷，采用电子万能试验机测试样品的压缩弹性模量。

(3)润湿性测试：在室温20℃下，应用接触角测量仪测量Ti6Al4V、TNT-B、 TNT-D和TNT-BV组水接触角：8μL去离子水悬滴在样品表面，照相机在同一时间取像，利用分析软件分析液滴所成的图像得出接触角数值。每组样品选取3 个分别测量，取平均值作为结果。

3、试验结果：

(1)图1为实施例1制得的仿生多孔钛支架的扫描电镜图，可以看出，本发明制得的仿生多孔钛支架上，哑铃形TiO₂NT阵列纵向管径出现明显变化，顶部和底部较中间部分管径宽，形成类似于哑铃的形状。

(2)力学性能测试结果如表1所示：

表1

备注：皮质骨和松质骨的数据来源于文献：樊博.钛酸钡涂层修饰的多孔Ti6Al4V支架在超声介导下修复大段骨缺损的体内外生物学评价[D].第四军医大学，2017.

由表1可以看出，本发明的TNT-BV多孔钛支架的弹性模量和抗压强度均类似人的天然骨组织，具有优良的力学性能。

(3)润湿性测试结果如表2所示：

表2

	Ti6Al4V	TNT-B	TNT-D	TNT-BV
					接触角	82.16°	23.98°	11.79°	16.32°

由表2可以看出，在钛片上分别制备哑铃形和传统柱形纳米管阵列后，均显著降低了样品表面的水接触角，增加了亲水性，按TNT-BV组参数对哑铃型纳米管负载CeO₂/BMP-2和仿生凝胶后，亲水性约为16.32°，更接近生理水平。

二、体外CeO₂NP缓释测试

试验材料：实施例1制得的多孔钛支架TNT-BV。

试验方法：

将多孔钛支架TNT-BV浸泡于37℃的10mL超纯水中，分别在第1、2、3、 5、7、10、15、20、25、30天提取3mL释放介质，采用电感耦合等离子体/光发射光谱法测定CeO₂NP在特定时间点的释放量，换算成释放比例，以明确随时间推移TNT-BV组的CeO₂NP缓释性能。

试验结果：如图2所示，TNT-BV组多孔钛支架的CeO₂NP释放比例，在初始的2天内CeO₂NP释放量未超过25％，且30天末仍有15％未释放，且随时间推移上升速率逐渐减缓表明该多孔钛支架的CeO₂/BMP-2/VEGF涂层在人体正常的pH范围内具有良好的缓释作用，且随时间延长释放持续且缓慢。

三、体外细胞增殖测试

试验材料：制得的多孔钛支架Ti6Al4V、TNT-B、TNT-D、TNT-Ce和TNT-BV。

试验方法：

(1)提取并培养鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)，常规换液和传代，原代细胞经过三代培养后用于细胞增殖和成骨活性测试。

(2)将消毒后的多孔钛支架Ti6Al4V、TNT-B、TNT-D、TNT-Ce和TNT-BV 放入24孔板内，再将MSCs以3x10⁴个细胞的浓度接种到24孔板中，24孔板置于37℃、5％的CO₂培养箱中培养。

(3)通过CCK-8试剂盒检测细胞增殖情况，分别在细胞培养4d和7d后取样，加入CCK-8试剂，于37℃孵育1h后置入酶标仪中读取OD_450nm。

试验结果：如图3所示，实施例1及对比例1-4制得的多孔钛支架的细胞增殖能力均随着培养时间的延长而增加，7d时五组内细胞增殖能力均高于4d时所测试的结果，在4d和7d时，TNT-D、TNT-Ce、TNT-BV组的细胞增殖能力均显著高于Ti6Al4V组和TNT-B组，且TNT-BV组表现出最佳的促增殖活性。

四、体外细胞成骨活性测试

试验方法：

将体外细胞增殖测试试验中各组中的MSCs在培养第4d和7d时，弃去培养基，PBS清洗3次，加入细胞裂解液，置于-20℃结冰后溶解，使用碱性磷酸酶(ALP)检测试剂盒检测，重复3次，读取OD_405nm，所得结果依照总蛋白换算。

试验结果：如图4所示，4d时各组间ALP活性无显著差异，而培养7d后实施例TNT-D、TNT-Ce和TNT-BV多孔钛支架上的MSCs的ALP活性显著高于Ti6Al4V组和TNT-B组，且TNT-BV组ALP活性最高，证明实施例1制得的多孔钛支架TNT-BV具有优异的成骨活性。

最后，以上实施例仅用于示例性说明本发明的技术方案和功效而非对本发明的保护范围起限制作用。应理解，任何本领域内熟悉本发明技术的人士，在未脱离本发明原理和精神实质下，对本发明技术方案做出的修饰、改进、替换、简化、组合等改变，均属于等效的置换方式，仍应包含在本发明的保护范围之中。

Claims

1.一种CeO₂修饰TiO₂可变纳米管阵列的仿生多孔钛支架的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）3D打印制备多孔钛支架

通过计算机建模软件建立多孔钛支架的三维模型并输入到3D打印机，然后采用直径为15~50 μm 的Ti-6Al-4V合金粉末进行3D打印，得到多孔钛支架，取出后进行热处理和喷砂处理，备用；

所述多孔钛支架由圆柱体单元堆积而成，圆柱体单元高5 mm，外径3.2 mm，孔隙率为70.27±4.2 %；

（2）制备TiO₂ NT修饰多孔钛支架

将步骤（1）的多孔钛支架进行抛光处理后，浸泡于电解液中作为阳极，以石墨片作为阴极，两电极平行放置，间距为3 cm，在两电极间施加电压，进行第一步阳极氧化，结束后取出清洗干净，再次放入相同电解液中进行第二步阳极氧化，结束后取出干燥，再进行热处理，得到TiO₂ NT修饰多孔钛支架；

所述电解液为乙二醇体系，里面含有0.3~0.5wt% NH₄F、1~3v%水和1~2 mol/L乳酸；

步骤（2）中，所述第一步阳极氧化的条件为：电压为90 V，时间为15 min；所述第二步阳极氧化的条件为：先在90 V电压下氧化5 min，再在60 V电压下氧化5 min，最后在90 V电压下氧化5 min；

（3）制备负载 CeO₂ NP的TiO₂ NT修饰多孔钛支架

将步骤（2）制得的TiO₂ NT修饰多孔钛支架浸入0.2~1 mol/L Ce（NO₃）₃溶液中，15~30 s后取出，干燥后进行热处理，得到负载 CeO₂ NP的TiO₂ NT修饰多孔钛支架；

（4）制备负载CeO₂/BMP-2的TiO₂ NT修饰多孔钛支架

将步骤（3）制得的负载 CeO₂ NP的TiO₂ NT修饰多孔钛支架浸泡于rhBMP-2溶液中，取出后置于冷冻干燥机中-40℃下冻干过夜，再取出在室温下干燥，制得负载CeO₂/BMP-2的TiO₂NT修饰多孔钛支架；

（5）制备CeO₂修饰TiO₂可变纳米管阵列的仿生多孔钛支架

将步骤（4）制备的负载CeO₂/BMP-2的TiO₂ NT修饰多孔钛支架浸泡于VEGF/壳聚糖混合溶液中，取出后置于冷冻干燥机中-40℃下冻干过夜，再取出真空干燥，最后浸泡于京尼平溶液中，室温放置24~30 h后，干燥，得到CeO₂修饰TiO₂可变纳米管阵列的仿生多孔钛支架。

2.如权利要求1所述CeO₂修饰TiO₂可变纳米管阵列的仿生多孔钛支架的制备方法，其特征在于，步骤（1）中，所述3D打印参数为：铺粉厚度为30 μm,激光功率为120 W，曝光时间70μs，激光扫描点间距60 μm，线间距60 μm。

3.如权利要求1所述CeO₂修饰TiO₂可变纳米管阵列的仿生多孔钛支架的制备方法，其特征在于，步骤（1）中，所述热处理的温度为800-900℃，升温速率为5℃/min，保温时间为0.5-2 h。

4.如权利要求1所述CeO₂修饰TiO₂可变纳米管阵列的仿生多孔钛支架的制备方法，其特征在于，步骤（2）中，所述抛光处理是指：先在丙酮中机械抛光10 min，再置于体积比为1:4:5的氢氟酸、硝酸和去离子水组成的混合溶液中化学抛光60 s。

5.如权利要求1所述CeO₂修饰TiO₂可变纳米管阵列的仿生多孔钛支架的制备方法，其特征在于，步骤（2）中，所述热处理温度为450℃，时间为2 h。

6.如权利要求1所述CeO₂修饰TiO₂可变纳米管阵列的仿生多孔钛支架的制备方法，其特征在于，步骤（3）中，所述热处理温度为450℃，时间为3 h。

7.如权利要求1至6任一项所述CeO₂修饰TiO₂可变纳米管阵列的仿生多孔钛支架的制备方法，其特征在于，步骤（5）中，所述VEGF/壳聚糖混合溶液中，壳聚糖浓度为0.01~0.05 g/mL，VEGF浓度为30~80 ng/mL。

8.一种如权利要求1至7任一项所述方法制备的CeO₂修饰TiO₂可变纳米管阵列的仿生多孔钛支架。