CN111269882A - 种植体的表面处理方法及仿生种植体 - Google Patents

种植体的表面处理方法及仿生种植体 Download PDF

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Abstract

本发明涉及种植体的表面处理方法及仿生种植体，该表面处理方法包括以下步骤：提供钛种植体，将所述钛种植体进行阳极氧化，于所述钛种植体的表面形成二氧化钛纳米管；清洗阳极氧化后的钛种植体，干燥，高温高压灭菌后，置于紫外灯下照射，获得活化后的钛种植体；提供骨髓间充质干细胞，将所述骨髓间充质干细胞，分别接种于所述活化后的钛种植体表面上；加入含10％FBS的α‑MEM培养基，置于培养箱中培养至少2天后，加入成骨诱导液进行培养，诱导至少14天后，获得初产品；对所述初产品进行脱细胞处理。在钛种植体的表面搭建了一个与人体成骨状态相类似的环境，增加了钛种植体的生物功能，达到仿生的效果。

Description

种植体的表面处理方法及仿生种植体
技术领域
本发明涉及口腔牙科医学技术领域，特别是涉及种植体的表面处理方法及仿生种植体。
背景技术
细胞外基质是由细胞分泌并在其周围积累形成的，具有多种结构及功能的分子微粒形成的网状复合物，作为组织和器官的非细胞成分，为细胞分化及细胞平衡提供了相应的生物微环境，并通过调控信号分子的活性，影响细胞形态、增殖、迁移分化等细胞行为。在骨组织工程学中，有大量研究利用细胞外基质的生物特性，合成具有一定生物功能的骨替代材料。细胞外基质中各类组分对周围细胞的成骨均有一定的调控或促进作用，部分学者在支架材料上加载胶原、羟基磷灰石或者其他活性物质等细胞外基质组分，对材料表面进行生物改性，增强其生物相容性、生物仿生性和生物学活性，达到模拟细胞外基质的目的。
由于细胞外基质中的组分种类众多，仅利用体外合成材料无法完全模拟细胞外基质的功能，而直接利用生物骨组织制作的细胞外基质支架存在着植入后发生自身免疫反应的可能。
钛与钛合金具有良好的生物相容性、良好的力学性能以及抗腐蚀性，被广泛用于口腔种植体等生物医学植入材料领域。但由于钛是一种惰性金属，缺乏生物活性，骨诱导作用以及与周围组织结合强度也较低。如何对钛与钛合金种植体的表面进行生物改性，以增强其生物学活性，促进种植体的骨结合，是目前亟需解决的问题。
发明内容
基于此，本发明提供一种种植体的表面处理方法，在钛种植体的表面搭建了一个与人体成骨状态相类似的环境，增加了钛种植体的生物功能，达到仿生的效果。
本发明还提供了一种采用本发明种植体的表面处理方法处理后的仿生种植体。
一种种植体的表面处理方法，包括以下步骤：
提供钛种植体，将钛种植体进行阳极氧化，于钛种植体的表面形成二氧化钛纳米管；
清洗阳极氧化后的钛种植体，干燥，高温高压灭菌后，置于紫外灯下照射，获得活化后的钛种植体；
提供骨髓间充质干细胞，将骨髓间充质干细胞，分别接种于活化后的钛种植体表面上；
加入含10％FBS的α-MEM培养基，置于培养箱中培养至少2天后，加入成骨诱导液进行培养，诱导至少14天后，获得初产品；
对初产品进行脱细胞处理。
于骨髓间充质干细胞加入成骨诱导液生长至少14天，获得初产品；
上述种植体的表面处理方法，通过在钛种植体的表面形成二氧化钛纳米管，然后在经过紫外光照射后的二氧化钛纳米管表面体外培养骨髓间充质干细胞，利用骨髓间充质干细胞分泌的细胞外基质，同时再通过脱细胞处理，去除其免疫原性，在钛种植体表面搭建了一个与体内成骨状态相类似的环境，增加了二氧化钛纳米管的生物功能，达到仿生的效果。
在其中一个实施例中，骨髓间充质干细胞的制备方法为：提供颌骨骨松质，采用磷酸盐缓冲液清洗，离心，弃上清液，采用10wt％胎牛血清的α-MEM培养液重悬细胞，连同剪碎的颌骨骨碎接种于培养瓶，置于培养箱中培养，待细胞生长汇合达培养瓶底80％时，用2.5g/L胰酶消化细胞并按1∶3比例传代，取用第三代骨髓间充质干细胞，
在其中一个实施例中，提供钛种植体，将钛种植体进行阳极氧化，于钛种植体的表面形成二氧化钛纳米管的步骤中，将钛种植体进行阳极氧化的方法为：以钛种植体为阳极进行电解氧化，电解氧化的电解液为氟化铵与硫酸铵的混合溶液。
在其中一个实施例中，电解液中氟化铵的浓度为0.14～0.18mol/L与硫酸铵浓度为0.45～0.6mol/L。
在其中一个实施例中，电解氧化的阴极为纯铜；电解氧化的电压为20～23V，时间28～35min。
在其中一个实施例中，紫外灯照射时间为至少30min。
在其中一个实施例中，提供骨髓间充质干细胞，将骨髓间充质干细胞，分别接种于活化后的钛种植体表面上的步骤中，第三代骨髓间充质干细胞的接种密度为至少2×105个/cm2。
在其中一个实施例中，对初产品进行脱细胞处理的步骤中，脱细胞处理的方法为：
去除初产品表面的含10％FBS的α-MEM培养基，并用PBS冲洗，然后加入脱细胞液进行脱细胞处理；吸掉初产品的脱细胞液并用PBS、去离子水冲洗，常温干燥后在消化酶液消化，用PBS液冲洗。
在其中一个实施例中，脱细胞液为体积分数为0.5％～0.8％的TritonX-100溶液。
在其中一个实施例中，脱细胞液的制备方法为：用PBS溶液将25wt％NH3溶液浓度调至20mmol/L，加入TritonX-100配制体积分数为0.5％～0.8％的TritonX-100溶液。
一种采用上述任一项所述的种植体的表面处理方法制成的仿生种植体，其增加了生物相容性，促进了钛种植体的骨结合，仿生效果佳。
附图说明
图1为本发明种植体的表面处理方法的流程示意图；
图2为Control组、ECM-Control组、TNT组及ECM-TNT组的扫描电镜下的材料表面形貌图；
图3为Control组、ECM-Control组、TNT组及ECM-TNT组的材料表面的光子能谱分析图；
图4为Control组、ECM-Control组、TNT组及ECM-TNT组的材料表面骨髓间充质干细胞的粘附情况；
图5为Control组、ECM-Control组、TNT组及ECM-TNT组的材料表面骨髓间充质干细胞的增殖情况；
图6为骨髓间充质干细胞在Control组、ECM-Control组、TNT组及ECM-TNT组的材料表面成骨诱导7d、14d的活性情况；
图7为骨髓间充质干细胞在Control组、ECM-Control组、TNT组及ECM-TNT组的材料表面成骨诱导21d后的茜素红染色结果。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。
本发明提供了一种种植体的表面处理方法，如图1所示，包括以下步骤：
S100：提供钛种植体，将钛种植体进行阳极氧化，于钛种植体的表面形成二氧化钛纳米管。
一个实施例中，将钛种植体进行阳极氧化的方法为：以钛种植体为阳极进行电解氧化，电解氧化的电解液为氟化铵与硫酸铵的混合溶液。以电解氧化的方式在钛种植体表面生成二氧化钛纳米管，二氧化钛纳米管的分布均匀，且成形效果良好，其分布密度与纳米管的粗细尺寸符合要求，为后续接种骨髓间充质干细胞提供良好的结构基础。
钛种植体可以为纯钛或钛合金种植体。
进一步地，电解液中氟化铵的浓度为0.14～0.18mol/L与硫酸铵浓度为0.45～0.6mol/L。
一个实施例中，电解氧化的阴极为纯铜，电解氧化的电压为20～23V，时间28～35min。
较优地，在阳极氧化反应过程中，始终进行磁力搅拌，使反应均匀。
S200：清洗阳极氧化后的钛种植体，干燥，高温高压灭菌后，置于紫外灯下照射，获得活化后的钛种植体。
可采用双蒸水进行超声波清洗阳极氧化后的钛种植体，有效去除钛种植体表面的杂物，且清洗效率高。
进一步地，紫外灯照射时间为至少30min，保证钛种植体表面活化，增加后续骨髓间充质干细胞分泌的细胞外基质于二氧化钛纳米管的粘附作用，使仿生种植体与成骨牢固结合。
S300：提供骨髓间充质干细胞，将骨髓间充质干细胞，分别接种于活化后的钛种植体表面上，获得接种骨髓间充质干细胞后的钛种植体。
一个实施例中，骨髓间充质干细胞的制备方法为：提供颌骨骨松质，采用磷酸盐缓冲液清洗，离心，弃上清液，采用10wt％胎牛血清的α-MEM培养液重悬细胞，连同剪碎的颌骨骨碎接种于培养瓶，置于培养箱中培养，待细胞生长汇合达培养瓶底80％时，用2.5g/L胰酶消化细胞并按1∶3比例传代，取用第三代骨髓间充质干细胞。
当仿生种植体应用于口腔填充牙齿等用途时，颌骨骨松质的骨髓间充质干细胞分泌的细胞外基质与牙齿的生物学性相近，仿生种植体的骨结合效果更佳。
上述骨髓间充质干细胞的制备方法的实施方案例如可以为：
在正颌手术中无菌获取废弃的颌骨骨松质，立即在超净工作台用无菌磷酸盐缓冲液反复清洗3～4次，800r/min离心5min，弃上清，采用10％质量分数胎牛血清的α-MEM培养液重悬细胞，连同剪碎的颌骨骨碎接种于25cm2培养瓶，置于37℃、5％体积分数CO2饱和湿度孵箱中培养。待细胞生长汇合达瓶底80％时，用2.5g/L胰酶消化细胞并按1∶3比例传代，记为P1(第一代)。以此类推，获得第三代人骨髓间充质干细胞。
在一个实施例中，骨髓间充质干细胞于活化后的钛种植体表面的接种密度为至少2×105个/cm2，以保证骨髓间充质干细胞的存活率，以及骨髓间充质干细胞分泌的细胞基质的密度能达到改善钛种植体表面生物学活性的效果。较优地，骨髓间充质干细胞于活化后的钛种植体表面的接种密度为3×105个/cm2～2×107个/cm2，这个接种密度范围易于达到，且钛种植体表面的生物学活性足够，工作效率较高。
S400：往接种骨髓间充质干细胞后的钛种植体加入含10％FBS的α-MEM培养基，置于培养箱中培养至少2天后，加入成骨诱导液进行培养，诱导至少14天后，构建钛种植体表面的细胞外基质，获得初产品。
采用成骨诱导液诱导培养骨髓间充质干细胞，构建钛种植体表面的细胞外基质，以保证仿生种植体的仿生物活性。
S500：对初产品进行脱细胞处理。
一个实施例中，脱细胞处理的方法为：去除初产品表面的含10％FBS的α-MEM培养基，并用PBS冲洗，然后加入脱细胞液进行脱细胞处理；吸掉初产品的脱细胞液并用PBS、去离子水冲洗，常温干燥后在消化酶液消化，用PBS液反复冲洗。
具体地，脱细胞液为体积分数为0.5％～0.8％的TritonX-100溶液。
进一步地，脱细胞液的制备方法为：用PBS溶液将25wt％NH3溶液浓度调至20mmol/L，加入TritonX-100配制体积分数为0.5％～0.8％的TritonX-100溶液。
脱细胞处理完成后，获得仿生种植体，仿生种植体可以低温保存，保存温度为-20℃。
本发明种植体的表面处理方法，通过在钛种植体的表面形成二氧化钛纳米管，然后在经过紫外光照射后的二氧化钛纳米管表面体外培养骨髓间充质干细胞，骨髓间充质干细胞分泌的细胞外基质能够附着在具有二氧化钛纳米管结构的钛种植体的表面形成仿生种植体，与未进行仿生处理的钛种植体及二氧化钛纳米管表面相比，本发明仿生种植体可以有效促进周围骨髓间充质干细胞的附着，还通过脱细胞处理，去除其免疫原性，在钛种植体表面搭建了一个与体内成骨状态相类似的环境，增加了二氧化钛纳米管的生物功能，提高细胞增殖于成骨分化，有利于周围骨组织的早期愈合。
采用上述种植体的表面处理方法制成的仿生种植体，其增加了生物相容性，促进了钛种植体的骨结合，仿生效果佳。
以下为具体实施例说明。
实施例1
本实施例待处理的钛种植体为纯钛种植体，该钛种植体的表面处理方法包括以下步骤：
S100：提供钛种植体，以钛种植体为阳极，纯铜为阴极，进行阳极氧化，电解液为0.15mol/L氟化铵与0.5mol/L硫酸铵的混合液，阳极氧化的电压为22V，时间30min；于钛种植体的表面形成二氧化钛纳米管。
S200：采用双蒸水超声清洗阳极氧化后的钛种植体，干燥，高温高压灭菌后，置于紫外灯下照射，照射30min，获得活化后的钛种植体。
S210：在正颌手术中无菌获取废弃的颌骨骨松质，立即在超净工作台用无菌磷酸盐缓冲液反复清洗4次，800r/min离心5min，弃上清，采用10％质量分数胎牛血清的α-MEM培养液重悬细胞，连同剪碎的颌骨骨碎接种于25cm2培养瓶，置于37℃、5％体积分数CO2饱和湿度孵箱中培养。待细胞生长汇合达瓶底80％时，用2.5g/L胰酶消化细胞并按1∶3比例传代，记为P1(第一代)，以此类推，取用第三代人骨髓间充质干细胞。
S300：将第三代骨髓间充质干细胞，分别接种于活化后的钛种植体表面上，接种密度为3×105个/cm2，获得接种骨髓间充质干细胞后的钛种植体。
S400：往接种骨髓间充质干细胞后的钛种植体加入含10％FBS的α-MEM培养基，置于培养箱中培养2天后，加入成骨诱导液进行培养，诱导14天后，构建钛种植体表面的细胞外基质，获得初产品。
S500：对初产品进行脱细胞处理：去除初产品表面的含10％FBS的α-MEM培养基，并用PBS冲洗，然后加入脱细胞液进行脱细胞处理；吸掉初产品的脱细胞液并用PBS、去离子水冲洗，常温干燥后在消化酶液消化，用PBS液反复冲洗，获得仿生种植体，将仿生种植体置于-20℃保存。
脱细胞液为体积分数为0.5％的TritonX-100溶液，其制备方法为：用PBS溶液将25wt％NH3溶液浓度调至20mmol/L，加入TritonX-100配制体积分数为0.5％的TritonX-100溶液。
实施例2
本实施例待处理的钛种植体为钛合金种植体，该钛种植体的表面处理方法包括以下步骤：
S100：提供钛种植体，以钛种植体为阳极，纯铜为阴极，进行阳极氧化，电解液为0.16mol/L氟化铵与0.55mol/L硫酸铵的混合液，阳极氧化的电压为20V，时间35min；于钛种植体的表面形成二氧化钛纳米管。
S200：采用双蒸水超声清洗阳极氧化后的钛种植体，干燥，高温高压灭菌后，置于紫外灯下照射，照射至少30min，获得活化后的钛种植体。
S260：在正颌手术中无菌获取废弃的颌骨骨松质，立即在超净工作台用无菌磷酸盐缓冲液反复清洗4次，800r/min离心5min，弃上清，采用10％质量分数胎牛血清的α-MEM培养液重悬细胞，连同剪碎的颌骨骨碎接种于25cm2培养瓶，置于37℃、5％体积分数CO2饱和湿度孵箱中培养。待细胞生长汇合达瓶底80％时，用2.5g/L胰酶消化细胞并按1∶3比例传代，记为P1(第一代)，以此类推，获得第三代人骨髓间充质干细胞。
S300：将第三代骨髓间充质干细胞，分别接种于活化后的钛种植体表面上，接种密度为2×105个/cm2，获得接种骨髓间充质干细胞后的钛种植体。
S400：往接种骨髓间充质干细胞后的钛种植体加入含10％FBS的α-MEM培养基，置于培养箱中培养3天后，加入成骨诱导液进行培养，诱导14天后，构建钛种植体表面的细胞外基质，获得初产品。
S500：对初产品进行脱细胞处理：去除初产品表面的含10％FBS的α-MEM培养基，并用PBS冲洗，然后加入脱细胞液进行脱细胞处理；吸掉初产品的脱细胞液并用PBS、去离子水冲洗，常温干燥后在消化酶液消化，用PBS液反复冲洗，获得仿生种植体，将仿生种植体置于-20℃保存。
脱细胞液为体积分数为0.6％的TritonX-100溶液，其制备方法为：用PBS溶液将25wt％NH3溶液浓度调至20mmol/L，加入TritonX-100配制体积分数为0.6％的TritonX-100溶液。
实施例3
本实施例待处理的钛种植体为纯钛种植体，该钛种植体的表面处理方法包括以下步骤：
S100：提供钛种植体，以钛种植体为阳极，纯铜为阴极，进行阳极氧化，电解液为0.18mol/L氟化铵与0.45mol/L硫酸铵的混合液，阳极氧化的电压为23V，时间28min；于钛种植体的表面形成二氧化钛纳米管。
S200：采用双蒸水超声清洗阳极氧化后的钛种植体，干燥，高温高压灭菌后，置于紫外灯下照射，照射至少30min，获得活化后的钛种植体。
S260：在正颌手术中无菌获取废弃的颌骨骨松质，立即在超净工作台用无菌磷酸盐缓冲液反复清洗3次，800r/min离心5min，弃上清，采用10％质量分数胎牛血清的α-MEM培养液重悬细胞，连同剪碎的颌骨骨碎接种于25cm2培养瓶，置于37℃、5％体积分数CO2饱和湿度孵箱中培养。待细胞生长汇合达瓶底80％时，用2.5g/L胰酶消化细胞并按1∶3比例传代，记为P1(第一代)，以此类推，获得第三代人骨髓间充质干细胞。
S300：将第三代骨髓间充质干细胞，分别接种于活化后的钛种植体表面上，接种密度为2×107个/cm2，获得接种骨髓间充质干细胞后的钛种植体。
S400：往接种骨髓间充质干细胞后的钛种植体加入含10％FBS的α-MEM培养基，置于培养箱中培养3天后，加入成骨诱导液进行培养，诱导15天后，构建钛种植体表面的细胞外基质，获得初产品。
S500：对初产品进行脱细胞处理：去除初产品表面的含10％FBS的α-MEM培养基，并用PBS冲洗，然后加入脱细胞液进行脱细胞处理；吸掉初产品的脱细胞液并用PBS、去离子水冲洗，常温干燥后在消化酶液消化，用PBS液反复冲洗，获得仿生种植体，将仿生种植体置于-20℃保存。
脱细胞液为体积分数为0.8％的TritonX-100溶液，其制备方法为：用PBS溶液将25wt％NH3溶液浓度调至20mmol/L，加入TritonX-100配制体积分数为0.8％的TritonX-100溶液。
对比例2
本对比例的待处理的钛种植体为纯钛种植体，该钛种植体的表面处理方法包括以下步骤：
S100：在正颌手术中无菌获取废弃的颌骨骨松质，立即在超净工作台用无菌磷酸盐缓冲液反复清洗4次，800r/min离心5min，弃上清，采用10％质量分数胎牛血清的α-MEM培养液重悬细胞，连同剪碎的颌骨骨碎接种于25cm2培养瓶，置于37℃、5％体积分数CO2饱和湿度孵箱中培养。待细胞生长汇合达瓶底80％时，用2.5g/L胰酶消化细胞并按1∶3比例传代，记为P1(第一代)，以此类推，取用第三代人骨髓间充质干细胞。
S200：将第三代骨髓间充质干细胞，分别接种于钛种植体表面上，接种密度为3×105个/cm2，获得接种骨髓间充质干细胞后的钛种植体。
S300：往接种骨髓间充质干细胞后的钛种植体加入含10％FBS的α-MEM培养基，置于培养箱中培养2天后，加入成骨诱导液进行培养，诱导14天后，构建钛种植体表面的细胞外基质，获得初产品。
S400：对初产品进行脱细胞处理：去除初产品表面的含10％FBS的α-MEM培养基，并用PBS冲洗，然后加入脱细胞液进行脱细胞处理；吸掉初产品的脱细胞液并用PBS、去离子水冲洗，常温干燥后在消化酶液消化，用PBS液反复冲洗，获得仿生种植体，将仿生种植体置于-20℃保存。
脱细胞液为体积分数为0.5％的TritonX-100溶液，其制备方法为：用PBS溶液将25wt％NH3溶液浓度调至20mmol/L，加入TritonX-100配制体积分数为0.5％的TritonX-100溶液。
对比例1
本对比例的待处理的钛种植体为纯钛种植体，该钛种植体的表面处理方法包括以下步骤：
S100：提供钛种植体，以钛种植体为阳极，纯铜为阴极，进行阳极氧化，电解液为0.15mol/L氟化铵与0.5mol/L硫酸铵的混合液，阳极氧化的电压为22V，时间30min；于钛种植体的表面形成二氧化钛纳米管。
S200：采用双蒸水超声清洗阳极氧化后的钛种植体，干燥，高温高压灭菌后，置于紫外灯下照射，照射30min，获得活化后的钛种植体为目标仿生种植体。
对比例1的仿生种植体与实施例1的仿生种植体差别在于：对比例1的钛种植体没有进行阳极氧化与紫外光照射处理，只进行骨髓间充质干细胞接种、构建细胞外基质(ECM)及脱细胞处理。
对比例2的仿生种植体与实施例1的仿生种植体差别在于：对比例2的钛种植体仅进行阳极氧化与紫外照射，在钛种植体表面形成二氧化钛纳米管(TNT)，没有进行后续的骨髓间充质干细胞接种、构建细胞外基质及脱细胞处理。
以空白纯钛种植体为空白对照，分别检测分析空白纯钛种植体及实施例1、对比例1与对比例2的仿生种植体的性质，其中，空白纯钛种植体对应Control组，实施例1的仿生种植体对应ECM-TNT组，对比例1的仿生种植体对应ECM-Control组，对比例2的仿生种植体对应TNT组。
采用扫描电镜扫描Control组、ECM-Control组、TNT组及ECM-TNT组的表面形貌，放大倍数为50000×，各种植体的表面形貌如图2所示，其中，ECM-Control组及ECM-TNT组图中的箭头所指的是细胞外基质。从图2可看出，Control组及TNT组仿生种植体的表面均未观察到细胞外基质，ECM-Control组仿生种植体表面的细胞外基质呈颗粒状，ECM-TNT组仿生种植体表面的细胞外基质呈片状，ECM-TNT组较ECM-Control组可观察到更多的细胞外基质。所以，阳极氧化及紫外照射处理后的钛种植体所能构建的细胞外基质密度更大，分布更加均匀。
采用光子能谱(XPS)分析Control组及ECM-TNT组、ECM-Control组与TNT组，分析各种植体表面的C、O、Ti、N、Ca、P元素的含量，分析结果如表1及图3所示。
表1
Figure BDA0002379152110000141
可看出ECM-TNT组相较其他组样品的N、Ca、P元素含量高。
检测Control组及ECM-TNT组、ECM-Control组与TNT组的骨髓间充质干细胞的粘附情况，如图4所示，在光滑钛表面及TNT表面构建细胞外基质后，ECM-Control与Control在骨髓间充质干细胞接种2h及8h后的粘附能力具有统计学差异(P＜0.05)，同时ECM-TNT与TNT相比也具有较好细胞粘附能力；另一方面，ECM-TNT与ECM-Control相比细胞粘附能力有统计学差异(P＜0.05)，且ECM-TNT在8h时的细胞粘附能力明显高于ECM-Control。
检测Control组及ECM-TNT组、ECM-Control组与TNT组的仿生种植体的骨髓间充质干细胞的增殖情况，如图5所示，在骨髓间充质干细胞接种3d、5d及7d后，ECM-Control、ECM-TNT分别与Control、TNT相比，骨髓间充质干细胞均有较好的增殖能力(P＜0.05)，且骨髓间充质干细胞在ECM-TNT表面较ECM-Control表面增殖能力明显提高(P＜0.05)。
骨髓间充质干细胞在Control组及ECM-TNT组、ECM-Control组与TNT组的仿生种植体的成骨能力，如图6所示，骨髓间充质干细胞在不同材料表面成骨诱导7d、14d后碱性磷酸酶(ALP)的活性。
图4至6中，#代表各组分别与未进行ECM构建的材料对比，细胞粘附能力有统计学差异(P＜0.05)；*代表两组材料之间的细胞粘附能力具有统计学差异(P＜0.05)。
骨髓间充质干细胞在各组种植体表面成骨诱导21d后的茜素红染色结果(放大倍数为50×)如图7所示，ECM-Control较Control明显具有更多的钙结节茜素红染色，ECM-TNT与TNT表面均可观察到明显的茜素红染色，但ECM-TNT组较TNT组的茜素红染色更多。
由上述检测分析可知，ECM-TNT组的生物学活性、生物相容性及生物仿生性更佳，即经过阳极氧化及紫外照射后，再进行骨髓间充质干细胞接种、构建细胞外基质，骨髓间充质干细胞的粘附性、增殖性更好，有利于骨结合形成。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的一种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (10)

1.一种种植体的表面处理方法，其特征在于，包括以下步骤：
提供钛种植体，将所述钛种植体进行阳极氧化，于所述钛种植体的表面形成二氧化钛纳米管；
清洗阳极氧化后的钛种植体，干燥，高温高压灭菌后，置于紫外灯下照射，获得活化后的钛种植体；
提供骨髓间充质干细胞，将所述骨髓间充质干细胞，分别接种于所述活化后的钛种植体表面上；
加入含10％FBS的α-MEM培养基，置于培养箱中培养至少2天后，加入成骨诱导液进行培养，诱导至少14天后，获得初产品；
对所述初产品进行脱细胞处理。
2.根据权利要求1所述的种植体的表面处理方法，其特征在于，所述骨髓间充质干细胞的制备方法为：提供颌骨骨松质，采用磷酸盐缓冲液清洗，离心，弃上清液，采用10wt％胎牛血清的α-MEM培养液重悬细胞，连同剪碎的颌骨骨碎接种于培养瓶，置于培养箱中培养，待细胞生长汇合达培养瓶底80％时，用2.5g/L胰酶消化细胞并按1∶3比例传代，取用第三代骨髓间充质干细胞。
3.根据权利要求1所述的种植体的表面处理方法，其特征在于，所述提供钛种植体，将所述钛种植体进行阳极氧化，于所述钛种植体的表面形成二氧化钛纳米管的步骤中，将所述钛种植体进行阳极氧化的方法为：以钛种植体为阳极进行电解氧化，所述电解氧化的电解液为氟化铵与硫酸铵的混合溶液。
4.根据权利要求3所述的种植体的表面处理方法，其特征在于，所述电解液中氟化铵的浓度为0.14～0.18mol/L与硫酸铵浓度为0.45～0.6mol/L。
5.根据权利要求3或4所述的种植体的表面处理方法，其特征在于，所述电解氧化的阴极为纯铜；所述电解氧化的电压为20～23V，时间28～35min。
6.根据权利要求1所述的种植体的表面处理方法，其特征在于，所述紫外灯照射时间为至少30min。
7.根据权利要求1所述的种植体的表面处理方法，其特征在于，所述提供骨髓间充质干细胞，将所述骨髓间充质干细胞，分别接种于所述活化后的钛种植体表面上的步骤中，所述骨髓间充质干细胞的接种密度为至少2×105个/cm2。
8.根据权利要求1所述的种植体的表面处理方法，其特征在于，所述对所述初产品进行脱细胞处理的步骤中，所述脱细胞处理的方法为：
去除所述初产品表面的所述含10％FBS的α-MEM培养基，并用PBS冲洗，然后加入脱细胞液进行脱细胞处理；吸掉所述初产品的脱细胞液并用PBS、去离子水冲洗，常温干燥后在消化酶液消化，用PBS液冲洗。
9.根据权利要求8所述的种植体的表面处理方法，其特征在于，所述脱细胞液为体积分数为0.5％～0.8％的TritonX-100溶液；所述脱细胞液的制备方法为：用PBS溶液将25wt％NH3溶液浓度调至20mmol/L，加入TritonX-100配制体积分数为0.5％～0.8％的TritonX-100溶液。
10.一种采用如权利要求1至9任一项所述的种植体的表面处理方法制成的仿生种植体。
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