JP6379562B2 - 細胞培養用電極及びその製造方法 - Google Patents

Description

本発明は、細胞培養用電極及びその製造方法、並びに細胞培養用電極を用いた細胞培養用基板に関する。

現在、様々な動物や植物の細胞培養が行われており、また、新たな細胞の培養法が開発されている。細胞培養の技術は、細胞の生化学的現象や性質の解明、有用な物質の生産等の目的で利用されている。さらに、培養細胞を用いて、人工的に合成された薬剤の生理活性や毒性を調べる試みがなされている。

一部の細胞（特に多くの動物細胞）は、何かに接着して生育する接着依存性を有しており、生体外の浮遊状態では長期間生存することができない。このような接着依存性を有した細胞の培養には、細胞が接着するための担体が必要であり、一般的には、コラーゲンやフィブロネクチン等の細胞接着性タンパク質を均一に塗布したプラスチック製の培養皿が用いられている。これらの細胞接着性タンパク質は、培養細胞に作用し、細胞の接着を容易にし、細胞の形態に影響を与えることが知られている。

一方、細胞の遊走は免疫応答や受精後の胚形態形成、組織修復及び再生等の様々な段階に関与している。また、癌やアテローム動脈硬化症、関節炎等の疾患の進行においても極めて重要な役割を持つ。具体的には、血管内皮を通しての細胞の遊走は、炎症、アテローム性動脈硬化症、癌の転移といった状態の病態生理における重要な現象である。そのため、インビトロでの細胞遊走を測定する方法は、長年に渡って開発されてきた。

細胞遊走アッセイに関してすでに市販されている装置としては、古典的なボイデンチャンバ、細胞培養インサート、ＦｌｕｏｒｏＢｌｏｃｋ（登録商標）（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、Ｃｅｌｌ Ｍｏｔｉｌｉｔｙ ＨｉｔＫｉｔ（登録商標）（Ｃｅｌｌｏｍｉｃｓ）がある。しかし、こうした装置では、接着した細胞の遊走方向を制御して、定量的に細胞遊走をアッセイすることは困難である。

これに対し、（特許文献１）には、導電性領域と絶縁性領域とを有する基材、並びに該導電性領域に形成された細胞接着性領域と細胞接着阻害性領域、及び該絶縁性領域に形成された細胞接着阻害性領域を備える細胞培養用基板であって、導電性領域において細胞接着性領域と細胞接着阻害性領域とが隣り合っており、導電性領域の細胞接着阻害性領域が、導電性領域への電圧印加によって細胞接着性に改変可能である細胞培養用基板が開示されている。この細胞培養用基板により、担体に接着して移動する細胞の細胞遊走を簡便にアッセイすることができる。

上記（特許文献１）には、導電性領域と絶縁性領域とを有する基材を製造する方法として、絶縁性材料からなる基材、例えばガラス基材に、導電性材料、例えば金属膜又は金属酸化物膜を成膜し、これをフォトリソグラフィー技術等を用いてパターニングすることにより、導電性領域と絶縁性領域を形成する旨が記載されている。

しかし、フォトリソグラフィー技術による従来のパターニングは、エッチング工程等を有するウェットプロセスであり、また有機溶剤やレジスト材料を使用するため、それらの材料が培養する細胞に悪影響を及ぼす可能性が懸念される。また、ウェットプロセスに比べてより製造効率に優れたプロセスの開発が望まれる。

また、導電性領域及び絶縁性領域のパターンがより微細になると、導電性領域上を遊走する細胞が隣接する絶縁性領域を越えて別の導電性領域上にまで侵入し、遊走試験の精度が低下する恐れが懸念された。さらに、導電性領域の電気抵抗が大きくなると、特に細胞接着阻害性領域を広範囲に改変するため電位を高くする場合に導電性領域上の細胞に悪影響を及ぼすことが懸念された。そのため、導電性の抵抗をより低くすることが求められる。

特許第５２７８４００号公報

そこで本発明は、上記従来の状況に鑑み、絶縁性材料からなる基材上に複数の導電性領域が設けられた細胞培養用電極を、有機溶剤やレジスト材料を使用するウェットプロセスによらず、より効率良く得ることができる細胞培養用電極の製造方法を提供することを目的とする。

また、導電性領域上を遊走する細胞が別の導電性領域上にまで侵入する事態を回避できる細胞培養用電極を提供することを目的とする。さらに、導電性領域の電気抵抗が小さい細胞培養用電極を提供することを目的とする。

本発明者らは、鋭意検討の結果、絶縁性材料を含む基材上に複数の導電性領域を設け、その複数の導電性領域の間における基材の表面を凹ませることにより上記課題が解決されることを見出した。また、上記の細胞培養用電極を製造するに際し、絶縁性材料を含む基材上に形成した導電性領域をレーザーにて切削することによって上記課題が解決されることを見出し、発明を完成した。

すなわち、本発明は、以下の発明を包含する。
（１）絶縁性材料を含む基材上に複数の導電性領域が設けられた細胞培養用電極であって、
前記複数の導電性領域の間における前記基材の表面の少なくとも一部が、前記複数の導電性領域の間における前記基材の表面以外の表面に比べて凹んでいる前記細胞培養用電極。
（２）前記導電性領域の表面の端部に、前記端部以外の前記導電性領域の表面に比べて厚い畝部が設けられる上記（１）に記載の細胞培養用電極。
（３）前記導電性領域が、複数の櫛歯部と各櫛歯部を支持する基部とを含む櫛形の領域である上記（１）又は（２）に記載の細胞培養用電極。
（４）前記複数の導電性領域の間の距離が、０．００５ｍｍ〜３ｍｍである上記（１）〜（３）のいずれかに記載の細胞培養用電極。
（５）前記基材、及び前記複数の導電性領域が透明である上記（１）〜（４）のいずれかに記載の細胞培養用電極。
（６）前記導電性領域に、前記導電性領域を構成する導電性材料よりも電気抵抗が低い線状電極が埋め込まれている上記（１）〜（５）のいずれかに記載の細胞培養用電極。
（７）前記線状電極が、網目状に設けられる上記（６）に記載の細胞培養用電極。
（８）絶縁性材料を含む基材上に複数の導電性領域が設けられ、前記複数の導電性領域の間における前記基材の表面の少なくとも一部が、前記複数の導電性領域の間における前記基材の表面以外の表面に比べて凹んでいる細胞培養用電極の製造方法であって、
絶縁性材料を含む基材上に導電性領域を形成する工程と、
前記導電性領域の一部、及び前記一部に接する基材の表面をレーザーにより切削し、前記導電性領域を複数の導電性領域に分割する工程と、
を含む前記細胞培養用電極の製造方法。
（９）絶縁性材料を含む基材上に複数の導電性領域が設けられ、前記導電性領域に、前記導電性領域を構成する導電性材料よりも電気抵抗が低い線状電極が埋め込まれ、前記複数の導電性領域の間における前記基材の表面の少なくとも一部が、前記複数の導電性領域の間における前記基材の表面以外の表面に比べて凹んでいる細胞培養用電極の製造方法であって、
導電性領域を、前記導電性領域を構成する導電性材料よりも電気抵抗が低い線状電極を前記導電性領域に埋め込んだ状態で、絶縁性材料を含む基材上に形成する工程と、
前記導電性領域の一部、及び前記一部に接する基材の表面をレーザーにより切削し、前記導電性領域を複数の導電性領域に分割する工程と、
を含む前記細胞培養用電極の製造方法。
（１０）絶縁性材料を含む基材上に複数の導電性領域が設けられ、前記複数の導電性領域の間における前記基材の表面の少なくとも一部が、前記複数の導電性領域の間における前記基材の表面以外の表面に比べて凹んでいる細胞培養用電極の前記導電性領域上に、前記導電性領域への電圧印加によって細胞接着性に改変可能な細胞接着阻害性領域が設けられた細胞培養用基板。
（１１）前記細胞接着阻害性領域が、導電性領域上において細胞接着性領域と隣り合っている上記（１０）に記載の細胞培養用基板。

本発明によれば、複数の導電性領域の間における基材の表面を凹ませたため、導電性領域と別の導電性領域とが確実に分離され、短絡することがない。また、遊走する細胞が別の離れた導電性領域上に侵入することがない。

本発明に係る細胞培養用電極の一実施形態を示す平面図、及びその平面図におけるＡ−Ａ’断面図である。 本発明に係る細胞培養用電極の別の一実施形態を示す平面図、及びその平面図におけるＡ−Ａ’断面図である。 本発明に係る細胞培養用電極のさらに別の一実施形態を示す平面図、及びその平面図におけるＡ−Ａ’断面図である。 図２の細胞培養用電極を用いた細胞培養用基板における、図２のＳ部分に相当する部分の拡大図である。 図４の細胞培養用基板を用いて細胞の遊走試験を行う手順を説明する図である。 導電性領域をレーザーにより切削した断面を段差測定機にて測定した結果を示すグラフである。 導電性領域をレーザーにより切削した状態を示す写真である。 導電性領域をレーザーにより切削した断面を段差測定機にて測定した結果を示すグラフである。

以下、本発明を詳細に説明する。
図１に、本発明の細胞培養用電極の一実施形態を示す。この細胞培養用電極１は、絶縁性材料を含む基材１０上に複数の導電性領域２０ａ、２０ｂが設けられている。細胞培養を行う際には、導電性領域２０ａ、２０ｂの一方又は両方の上に、導電性領域への電圧印加によって細胞接着性に改変可能な細胞接着阻害性領域がさらに設けられた細胞培養用基板として用いられる。好ましくは、導電性領域上において細胞接着阻害性領域と細胞接着性領域とが隣り合っており、電圧印加によって細胞接着阻害性領域を細胞接着性に改変し、細胞を遊走させる試験において使用される。また、基材１０上の導電性領域２０ａ、２０ｂ以外の領域（図１においては導電性領域２０ａと導電性領域２０ｂとの間）にも細胞接着阻害性領域を設けることが好ましい。

本発明において細胞接着性とは、細胞が接着すること、又は細胞が接着し易いことを意味する。細胞接着阻害性とは、細胞が接着しにくいこと又は細胞が接着しないことを意味する。したがって、細胞接着性領域と細胞接着阻害性領域とがパターン化された基板上に細胞を播くと、細胞接着性領域には細胞が接着するが、細胞接着阻害性領域には細胞が接着しないため、基板表面には細胞がパターン状に配列することになる。

細胞接着性は、接着しようとする細胞によって異なる場合もあるため、細胞接着性とは、ある種の細胞に対して細胞接着性であることを意味する。したがって、細胞培養用基板上には、複数種の細胞に対する複数の細胞接着性領域が存在する場合、すなわち細胞接着性の程度が異なる細胞接着性領域が２水準以上存在する場合もある。

本発明の細胞培養用基板における、細胞接着性領域及び細胞接着阻害性領域の構造としては、例えば、以下の２つの形態が挙げられる。

第一の形態は、細胞接着性領域が、炭素酸素結合を有する有機化合物を含む細胞接着阻害性の親水性膜に酸化処理及び／又は分解処理を施して細胞接着性とした領域である形態である。この形態では、導電性領域を含む細胞培養用電極１の表面全体に炭素酸素結合を有する有機化合物を含む細胞接着阻害性の親水性膜を形成し、次いで、細胞の接着が望まれる領域に対して酸化処理及び／又は分解処理を施すことにより当該領域に細胞接着性を付与して細胞接着性領域に改変する。前記処理を施さない部分は細胞接着阻害性領域である。

第二の形態は、細胞接着性領域が、炭素酸素結合を有する有機化合物を低密度で含む親水性膜で形成されている形態である。この形態は、炭素酸素結合を有する有機化合物を高密度で含む親水性膜が細胞接着阻害性を有するのに対して、前記化合物を低密度で含む親水性膜は細胞接着性を有することを利用したものである。細胞培養用電極１の表面に前記化合物が結合し易い第一領域と結合しにくい第二領域とを設け、細胞培養用電極１の表面に前記化合物の膜を形成すると、第一領域は細胞接着阻害性領域となり、第二領域は細胞接着性領域となる。

さらに、本発明の細胞培養用基板においては、導電性領域上の細胞接着阻害性領域が、導電性領域への電圧印加、好ましくは正電圧の印加によって細胞接着性に改変可能である。具体的には、図１において、導電性領域２０ａを陽極とし、導電性領域２０ｂを陰極とし、導電性領域２０ａを正電圧として２つの電極間に電圧を印加することにより、導電性領域２０ａ上の細胞接着阻害性領域のみが細胞接着性に改変可能であることが好ましい。電圧の印加によって細胞接着性に改変された領域は、上記のように炭素酸素結合を有する有機化合物を含む細胞接着阻害性の親水性膜に酸化処理及び／又は分解処理を施して得られる細胞接着性領域とは、詳細な表面性状が異なる場合がある。

（基材）
細胞培養用電極１に用いられる基材１０としては、導電性領域２０ａ、２０ｂを形成可能な絶縁性材料を含むものであれば特に制限されない。具体的には、ガラス、石英ガラス、ホウケイ酸ガラス、アルミナ、サファイア、セラミクス、フォルステライト、感光性ガラス、セラミック、シリコン、エラストマー、プラスチック（例えば、ポリエステル樹脂、ポリエチレン樹脂、ポリプロピレン樹脂、ＡＢＳ樹脂、ポリアミド樹脂、アクリル樹脂、フッ素樹脂、ポリカーボネート樹脂、ポリウレタン樹脂、メチルペンテン樹脂、フェノール樹脂、メラミン樹脂、エポキシ樹脂、塩化ビニル樹脂）で代表される有機材料を挙げることができ、透明な材料であることが好ましい。なお、ここで「透明」とは、可視光に対して透過性を有することを意味し、いわゆる「半透明」な状態も含む概念である。また、基材１０の形状も限定されず、例えば、平板、平膜、フィルム、多孔質膜等の平坦な形状、シリンダ、スタンプ、マルチウェルプレート、マイクロ流路等の立体的な形状、並びに表面に凹凸が形成された形状が挙げられる。フィルムを使用する場合、その厚さは特に制限されないが、通常０．１μｍ〜１０００μｍ、好ましくは１μｍ〜５００μｍ、より好ましくは１０μｍ〜２００μｍである。

特に、細胞の大きさよりも小さい１ｎｍ〜１０μｍ程度の微細な凹凸が表面に付加された基材を用い、導電性領域上の細胞接着性の領域も同様の形状となる場合には、接着した細胞の形状や挙動を制御して、試験を効果的に行うことが可能である。微細な凹凸とは例えば、ラインパターンの場合、深さ１ｎｍ〜１０μｍ、ライン凸部の幅１ｎｍ〜１０μｍ、ライン凹部の幅１ｎｍ〜１０μｍのことを指す。

（導電性領域）
本発明の細胞培養用電極１は、絶縁性材料を含む基材１０上に複数の導電性領域２０ａ、２０ｂが設けられており、複数の導電性領域２０ａ、２０ｂの間における基材１０の表面１０１が、その複数の導電性領域２０ａ、２０ｂの間における基材１０の表面１０１以外の表面１０２に比べて凹んでいることを特徴とする。複数の導電性領域２０ａ、２０ｂの間における基材１０の表面１０１が凹んでいることにより、導電性領域２０ａと導電性領域２０ｂとが確実に分離され、短絡することがない。また、導電性領域上に細胞を遊走させる場合、細胞が複数の導電性領域２０ａ、２０ｂの間における基材１０の表面１０１を越えて、例えば導電性領域２０ａから導電性領域２０ｂへと侵入することが防止される。したがって、細胞接着性領域あるいは導電性領域のパターンに沿った精密な細胞遊走試験を行うことができる。なお、本発明では、複数の導電性領域の間における基材の表面の全てが凹んでいる必要はなく、複数の導電性領域の間における基材の表面の少なくとも一部が凹んでいれば本発明の範囲に含まれる。ここで「少なくとも一部が凹んでいる」とは、「複数の導電性領域の間における基材の表面」に相当する表面領域が、一つの細胞培養用電極において複数存在する場合（図１の例は一つのみ存在する場合）に、その複数の表面領域のうち少なくとも一つの表面領域が凹んでいるという意味である。例えば、細胞培養用電極に、複数の導電性領域の間の距離が十分に離れている「複数の導電性領域の間における基材の表面」と、複数の導電性領域の間の距離が小さい「複数の導電性領域の間における基材の表面」の２種類が存在するとき、複数の導電性領域の間の距離が十分に離れている「複数の導電性領域の間における基材の表面」の方については、凹んでいなくても良い場合がある。

導電性領域２０ａと導電性領域２０ｂとの間の距離は、両者の間に適切な電圧を印加できれば良く、導電性領域の材料や厚さ、あるいは培養する細胞の大きさ等を考慮して適宜設定される。例えば、０．００５ｍｍ〜３ｍｍ、特に０．０５ｍｍ〜０．１５ｍｍとすることが好ましい。また、複数の導電性領域２０ａ、２０ｂの間における基材１０の表面１０１の凹みの程度は、導電性領域２０ａと導電性領域２０ｂとの間の距離によっても異なるが、例えば、複数の導電性領域２０ａ、２０ｂの間における基材１０の表面１０１以外の表面１０２よりも最大で１μｍ〜５０μｍ凹んでいることが好ましい。

また、導電性領域２０ａ、２０ｂの表面の端部には、その端部以外の導電性領域２０ａ、２０ｂの表面に比べて導電性領域が厚く盛り上がっている畝部２０２（微細であるため、図１には図示せず）を設けることが好ましい。畝部２０２が障害となって細胞が乗り越えることができないため、増殖あるいは遊走する細胞が別の離れた導電性領域上に侵入する事態が確実に防止される。畝部２０２の大きさは、培養する細胞の大きさ等を考慮して適宜設定される。例えば、直径が２０μｍの細胞を培養する場合、その細胞の大きさと同等以上、具体的には畝部２０２の幅及び高さを２０μｍ〜３０μｍ程度とすることが好ましい。

上記の細胞培養用電極１は、種々の方法により製造することができるが、好ましくは、絶縁性材料を含む基材１０上に導電性領域を形成する工程と、その導電性領域の一部、及びその一部に接する基材１０の表面（複数の導電性領域２０ａ、２０ｂの間における基材１０の表面１０１に相当する）をレーザーにより切削し、導電性領域を図１のように複数の導電性領域２０ａ、２０ｂに分割する工程を経て製造することが好ましい。

レーザーで切削することにより、絶縁性材料を含む基材１０上に複数の導電性領域２０ａ、２０ｂが設けられた細胞培養用電極１を、有機溶剤やレジスト材料を使用するウェットプロセスではなくドライプロセスによって高い製造効率で得ることができる。また、導電性領域の一部を切削により除去するとともに、複数の導電性領域の間における基材の表面１０１における凹みも同時に形成することができる。さらに、走査するレーザーの熱による効果で、切削により形成された導電性領域２０ａ、２０ｂのそれぞれの端部に、厚く盛り上がった畝部２０２を形成することができるため好ましい。

レーザーの種類や照射条件は、基材１０及び導電性領域の材料の種類、導電性領域の厚さ、培養する細胞の種類（導電性領域２０ａと導電性領域２０ｂとの距離をどの程度確保すべきか）等を考慮して適宜設定することができ、特に限定されるものではない。例えば、プラスチック製のフィルムからなる基材上に厚さ１００ｎｍ〜２００ｎｍの導電性領域（ＩＴＯ）を形成し、波長１０．６μｍのＣＯ_２レーザー（スポットサイズφ１００μｍ）によって切削を行う場合、出力を１０Ｗ〜３０Ｗ、レーザー走査スピードを５００ｍｍ／ｓ〜１５００ｍｍ／ｓとすることが好ましく、基材としてプラスチック製のフィルムに代えてガラスを用いた場合には出力を２５Ｗ〜３０Ｗ、レーザー走査スピードを２０ｍｍ／ｓ〜１２０ｍｍ／ｓとすることが好ましい。レーザーの種類は、上記ＣＯ_２レーザー等の気体レーザーの他、ＡｒＦレーザー等のエキシマレーザー、ＹＡＧレーザー等の固体レーザー、Ｙｂファイバーレーザー等のファイバーレーザー、半導体レーザー等を挙げることができる。また、発振形態はＣＷ及びパルスのいずれも適用可能である。

基材１０上へ導電性領域を形成する方法としては、公知の方法を用いることができる。例えば、マイクロ波プラズマＣＶＤ（Chemical vapor deposit）法、ＥＣＲＣＶＤ（Electric cyclotron resonance chemical vapor deposit）法、ＩＣＰ（Inductive coupled plasma）法、直流スパッタリング法、ＥＣＲ（Electric cyclotron resonance）、スパッタリング法、イオン化蒸着法、アーク式蒸着法、レーザー蒸着法、ＥＢ（Electron beam）蒸着法、抵抗加熱蒸着法等が挙げられる。また、塗布により導電性領域を形成しても良い。スピンコートや各種の印刷方式も使用できる。

導電性領域を構成する導電性材料の膜として、金属膜又は金属酸化物膜、金属微粒子や金属ナノファイバーが絶縁体に分散された膜、導電性の有機材料を含む膜等が挙げられる。金属酸化物としては、ＩＴＯ（酸化インジウム錫）、ＩＺＯ（酸化インジウム亜鉛）、ＡＺＯ（ＡｌドープＺｎＯ）等が挙げられ、金属微粒子としては、銀、金、銅等の微粒子、金属ナノファイバーとしてはカーボンナノチューブ、導電性の有機材料としては、ポリエチレンジオキシチオフェン（ＰＥＤＯＴ）等が挙げられる。

導電性材料の膜としては特に制限されないが、透明な膜であることが好ましく、例えば、ＩＴＯ膜、ＩＺＯ膜、導電性高分子のポリエチレンジオキシチオフェン膜等が挙げられる。また、電圧印加後も透明な膜であることが好ましい。なお、ここで「透明」とは、可視光に対して透過性を有することを意味し、いわゆる「半透明」な状態も含む概念である。本発明においては、ＩＴＯ膜をスパッタリング法により成膜して、その後レーザーにより切削してパターニングすることにより、導電性領域２０ａ、２０ｂを形成することが好ましい。透明な導電性領域は、細胞の観察において有利である。

導電性材料の膜の厚さは、通常、単分子膜〜１００μｍ程度であり、好ましくは２ｎｍ〜１μｍ、より好ましくは５ｎｍ〜５００ｎｍである。

図２に、本発明の細胞培養用電極の別の実施形態を示す。この細胞培養用電極１では、導電性領域２０ａ、２０ｂのそれぞれが、複数の櫛歯部２００と、各櫛歯部を支持する基部２０１とを含む櫛形の領域になっている。この場合、導電性領域として形成される櫛歯部２００の幅（基部２０１から櫛歯部２００が延びる方向（櫛歯部２００の長さ方向）と直交する側の幅）は、０．１μｍ〜５０ｍｍであり、好ましくは１５ｍｍ〜５０ｍｍであるがこれに限定されるものではない。櫛歯部２００の幅が狭過ぎると、櫛歯部２００の長さ方向の電気抵抗が高くなり、一定の電圧をかけた際に櫛歯部２００の長さ方向に電圧降下が生じやすく、電位の制御が困難になる。電圧降下の程度は、用いる導電性材料の導電率により変わるため、櫛歯部２００の幅の下限も導電性材料の導電率に応じて適宜決められるが、一般的には５μｍ以上が好ましい。基材１０上の導電性領域の幅を５μｍ未満のように狭くする場合には、基材１０上に幅の広い電極を設け、該電極の表面の一部を絶縁膜で被覆し、５μｍ未満の所望の幅の領域だけを露出させて、該領域を導電性領域とすることにより、抵抗値が高く電圧降下を起こす問題を解決することができる。また、櫛歯部２００の幅が測定対象の細胞の大きさよりも狭いと、櫛歯部２００上に細胞が接着しにくくなる。したがって、細胞遊走を観察する際の櫛歯部２００の幅は、測定対象の細胞の大きさによって適宜決められるが、一般的には１０μｍ以上が好ましい。また、櫛歯部２００の幅が適度に狭いと、測定対象の細胞の遊走方向が制限されるため、一定時間経過後の遊走距離が長くなり測定に有利になる効果もある。櫛歯部２００と、隣り合う別の櫛歯部２００との間隔は、好ましくは０．００５ｍｍ〜３ｍｍ、より好ましくは０．０５ｍｍ〜０．１５ｍｍである。通常は櫛歯部２００間の間隔が狭過ぎると、櫛歯部２００間を細胞が乗り越えて、隣り合った櫛歯部に細胞が侵入し易くなるため、細胞の遊走方向を制限しにくくなるが、本発明の場合は、複数の導電性領域２０ａ、２０ｂの間における基材１０の表面１０１が凹んでおり、さらに好ましくは櫛歯部２００（導電性領域）の端部に厚く盛り上がった畝部２０２が形成されるため、離れた導電性領域へ細胞が侵入することを確実に防止できる。櫛歯部２００間の間隔が広過ぎると、顕微鏡で観察する際に視野に入る櫛歯の本数が少なくなり、統計的な処理をする際に不利になる。一般的には、顕微鏡の視野は数ｍｍ以下であるため、櫛歯部の幅は３ｍｍ以下が好ましい。櫛歯部と櫛歯部が互いにかみあった２つの櫛形のパターンが特に好ましい。そのようなパターンは、細胞遊走試験において電圧を印加した場合に、電流が効果的に流れるため好ましい。

図２に示す細胞培養用電極１は、絶縁性材料を含む基材１０上に導電性領域を形成し、形成した導電性領域の一部、及びその一部に接する基材１０の表面（複数の導電性領域２０ａ、２０ｂの間における基材１０の表面１０１に相当する）を切削するように、導電性領域の表面をレーザーでジグザグ状に走査することにより、それぞれが櫛歯部２００及び基部２０１から構成された、陽極及び陰極として機能する複数の導電性領域２０ａ、２０ｂに分割して製造することができる。

図３に、本発明の細胞培養用電極のさらに別の実施形態を示す。この細胞培養用電極１では、図２の例と同様に、導電性領域２０ａ、２０ｂのそれぞれが、複数の櫛歯部２００と各櫛歯部２００を支持する基部２０１とを含む櫛形の領域になっている。そして、図３の細胞培養用電極１は、導電性領域２０ａ、２０ｂに、その導電性領域２０ａ、２０ｂを構成する導電性材料よりも電気抵抗が低い線状電極２０５が埋め込まれていることを特徴とする。

導電性領域２０ａ、２０ｂに線状電極２０５を埋め込むことにより導電性領域２０ａ、２０ｂ全体の電気抵抗が低下するため、細胞接着阻害性領域を細胞接着性に改変するために印加する電圧値を抑えることができ、細胞に悪影響を及ぼすことがない。

図３の例では、複数の線状（ワイヤ状）の電極を網目状に交差させた状態で埋め込んでいるがこれに限定されるものではない。例えば、線状電極をメッシュ状に織ったもの、線状電極を一方向のみに平行に配列したもの等を挙げることができる。また、線状電極２０５の材料は、導電性領域２０ａ、２０ｂを構成する導電性材料に比べて電気抵抗が小さければ良く、例えば金、銀、銅等の金属材料が挙げられる。さらに、線状電極２０５の太さは、導電性領域２０ａ、２０ｂの厚さ等を考慮して適宜設定される。通常は１０μｍ〜１００μｍ程度とすることが好ましい。また、基材１０上における線状電極２０５の密度は、線状電極２０５が透明でない場合、高くし過ぎると導電性領域２０ａ、２０ｂが透明であったとしても細胞の観察の障害となるため適切な値に調整される。好ましくは、導電性領域２０ａ、２０ｂを平面的に見たときに線状電極が存在する面積の割合が３０％以下になるよう設定する。

図３に示す細胞培養用電極１は、絶縁性材料を含む基材１０上に、線状電極２０５を埋め込んだ状態で導電性領域を形成し、形成した導電性領域の一部、及びその一部に接する基材１０の表面（複数の導電性領域２０ａ、２０ｂの間における基材１０の表面１０１に相当する）を切削するように、導電性領域の表面をレーザーでジグザグ状に走査することにより、それぞれが櫛歯部２００及び基部２０１から構成された、陽極及び陰極として機能する複数の導電性領域２０ａ、２０ｂに分割して製造することができる。複数の導電性領域２０ａ、２０ｂの間における基材１０の表面１０１上に存在する線状電極２０５は、レーザー照射により、導電性領域と一緒に切断することができる。特に、線状電極２０５が透明でない場合、レーザー光を吸収し易いため効率的に切断することができる。

（細胞接着阻害性領域）
細胞接着阻害性領域は、好ましくは、炭素酸素結合を有する有機化合物により形成される親水性膜により形成される。当該親水性膜は、水溶性や水膨潤性を有する、炭素酸素結合を有する有機化合物を主原料とする薄膜であり、酸化される前は細胞接着阻害性を有し、酸化及び／又は分解された後は細胞接着性を有しているものであれば特に限定されない。

本発明において炭素酸素結合とは、炭素と酸素との間に形成される結合を意味し、単結合に限らず二重結合であっても良い。炭素酸素結合としてはＣ−Ｏ結合、Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ結合、Ｃ＝Ｏ結合が挙げられる。

主原料としては、水溶性高分子、水溶性オリゴマー、水溶性有機化合物、界面活性物質、両親媒性物質等が挙げられ、これらが相互に物理的又は化学的に架橋し、導電性領域等の下層に対して物理的又は化学的に結合することにより親水性薄膜となる。

具体的な水溶性高分子材料としては、ポリアルキレングリコール及びその誘導体、ポリアクリル酸及びその誘導体、ポリメタクリル酸及びその誘導体、ポリアクリルアミド及びその誘導体、ポリビニルアルコール及びその誘導体、双性イオン型高分子、多糖類等を挙げることができる。分子形状は、直鎖状、分岐を有するもの、デンドリマー等を挙げることができる。より具体的には、ポリエチレングリコール、ポリエチレングリコールとポリプロピレングリコールとの共重合体、例えば、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ１０８、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ１２７、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）、ポリ（Ｎ−ビニル−２−ピロリドン）、ポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）、ポリ（メタクリロイルオキシエチルフォスフォリルコリン）、メタクリロイルオキシエチルフォスフォリルコリンとアクリルモノマーとの共重合体、デキストラン、及びヘパリン等が挙げられるがこれらには限定されない。

具体的な水溶性オリゴマー材料や水溶性低分子化合物としては、アルキレングリコールオリゴマー及びその誘導体、アクリル酸オリゴマー及びその誘導体、メタクリル酸オリゴマー及びその誘導体、アクリルアミドオリゴマー及びその誘導体、酢酸ビニルオリゴマーの鹸化物及びその誘導体、双性イオンモノマーからなるオリゴマー及びその誘導体、アクリル酸及びその誘導体、メタクリル酸及びその誘導体、アクリルアミド及びその誘導体、双性イオン化合物、水溶性シランカップリング剤、水溶性チオール化合物等を挙げることができる。より具体的には、エチレングリコールオリゴマー、（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）オリゴマー、メタクリロイルオキシエチルフォスフォリルコリンオリゴマー、低分子量デキストラン、低分子量ヘパリン、オリゴエチレングリコールチオール、エチレングリコール、ジエチレングリコール、トリエチレングリコール、テトラエチレングリコール、２−メトキシ（ポリエチレンオキシ）−プロピルトリメトキシシラン、及びトリエチレングリコール−ターミネーティッド−チオール等が挙げられるがこれらには限定されない。

親水性膜は、処理前は高い細胞接着阻害性を有し、酸化処理及び／又は分解処理後は細胞接着性を示すものであることが望ましい。

親水性膜の平均厚さは、０．８ｎｍ〜５００μｍが好ましく、０．８ｎｍ〜１００μｍがより好ましく、１ｎｍ〜１０μｍがより好ましく、１．５ｎｍ〜１μｍが最も好ましい。平均厚さが０．８ｎｍ以上であれば、タンパク質の吸着や細胞の接着において、親水性薄膜で覆われていない領域の影響を受けにくいため好ましい。また、平均厚さが５００μｍ以下であればコーティングが比較的容易である。

導電性領域２０ａ、２０ｂ、又は複数の導電性領域２０ａ、２０ｂの間における基材１０の表面１０１（以下、「導電性領域等」という）の表面への親水性膜の形成方法としては、導電性領域等へ親水性有機化合物を直接吸着させる方法、導電性領域等へ親水性有機化合物を直接コーティングする方法、導電性領域等へ親水性有機化合物をコーティングした後に架橋処理を施す方法、導電性領域等への密着性を高めるために多段階式に親水性薄膜を形成させる方法、導電性領域等との密着性を高めるために導電性領域等の上に下地層を形成し、次いで親水性有機化合物をコーティングする方法、導電性領域等の表面に重合開始点を形成し、次いで親水性ポリマーブラシを重合する方法等を挙げることができる。

上記成膜方法のうち特に好ましい方法としては、多段階式に親水性薄膜を形成させる方法、並びに、導電性領域等との密着性を高めるために導電性領域等の上に下地層を形成し、次いで親水性有機化合物をコーティングする方法を挙げることができる。これらの方法を用いると、親水性有機化合物の導電性領域等への密着性を高めることが容易だからである。本明細書では「結合層」という用語を用いる。結合層とは、多段階式に親水性有機化合物の薄膜を形成する場合には最表面の親水性薄膜層と導電性領域等との間に存在する層を意味し、導電性領域等の表面に下地層を設け当該下地層の上に親水性薄膜層を形成する場合には当該下地層を意味する。結合層は、結合部分（リンカー）を有する材料を含む層であることが好ましい。リンカーとリンカーに結合させる材料の末端の官能基の組み合わせとしては、エポキシ基と水酸基、フタル酸無水物と水酸基、カルボキシル基とＮ−ハイドロキシスクシイミド、カルボキシル基とカルボジイミド、アミノ基とグルタルアルデヒド等が挙げられる。それぞれの組み合わせにおいて、いずれがリンカーであっても良い。これらの方法においては、親水性材料によるコーティングを行う前に、導電性領域等の上にリンカーを有する材料により結合層を形成する。結合層における前記材料の密度は結合力を規定する重要な因子である。前記密度は、結合層の表面における水の接触角を指標として簡便に評価することができる。例えば、エポキシ基を末端に有するシランカップリング剤（エポキシシラン）を例にとると、エポキシシランを付加した導電性領域等の表面の水接触角が典型的には４５°以上、望ましくは４７°以上であれば、次に酸触媒存在下エチレングリコール系材料等を付加することによって十分な細胞接着阻害性を有する基板を作ることができる。なお、本発明において水接触角とは、２３℃において測定される水接触角を指す。

（親水性膜の酸化処理及び／又は分解処理による細胞接着性領域の形成）
本発明では、細胞接着性領域は、炭素酸素結合を有する有機化合物を含む細胞接着阻害性の親水性膜に酸化処理及び／又は分解処理を施して細胞接着性とした領域により形成される。

本発明において「酸化」とは狭義の意味であり、有機化合物が酸素と反応して酸素の含有量が反応以前よりも多くなる反応を意味する。

本発明において「分解」とは有機化合物の結合が切断されて１種の有機化合物から２種以上の有機化合物が生じる変化を指す。「分解処理」としては典型的には、酸化処理による分解、紫外線照射による分解等が挙げられるがこれらには限定されない。「分解処理」が酸化を伴う分解（つまり酸化分解）である場合、「分解処理」と「酸化処理」とは同一の処理を指す。

紫外線照射による分解とは、有機化合物が紫外線を吸収し、励起状態を経て分解することを指す。なお、有機化合物が、酸素を含む分子種（酸素、水等）とともに存在している系中に紫外線を照射すると、紫外線が化合物に吸収されて分解が起こる以外に、該分子種が活性化して有機化合物と反応する場合がある。後者の反応は「酸化」に分類できる。そして活性化された分子種による酸化により有機化合物が分解する反応は、「紫外線照射による分解」ではなく「酸化による分解」に分類できる。

以上のように「酸化処理」と「分解処理」は操作としては重複する場合があり、両者を明確に区別することはできない。そこで本明細書では「酸化処理及び／又は分解処理」という用語を使用する。

酸化処理及び／又は分解処理の方法としては、親水性膜を紫外線照射処理する方法、光触媒処理する方法、酸化剤で処理する方法等が挙げられる。本発明では、導電性領域２０ａ、２０ｂ上、及び好ましくは複数の導電性領域２０ａ、２０ｂの間における基材１０の表面１０１上に、細胞接着性領域と細胞接着阻害性領域とをそれぞれ形成することから、親水性膜をパターン状に部分的に酸化処理及び／又は分解処理する。部分的に酸化処理及び／又は分解処理する場合は、フォトマスクやステンシルマスク等のマスクを用いたり、スタンプを用いたりすると良い。また、紫外線レーザー等のレーザーを用いた方式等の直描方式で酸化処理及び／又は分解処理を施しても良い。

紫外線照射処理の場合は、波長１８５ｎｍや２５４ｎｍの紫外線を出す水銀ランプや波長１７２ｎｍの紫外線を出すエキシマランプ等のＶＵＶ領域からＵＶ−Ｃ領域の紫外線を出すランプを光源として用いることが好ましい。光触媒処理する場合は、波長３６５ｎｍ以下の紫外線を出す光源を用いることが好ましく、波長２５４ｎｍ以下の紫外線を出す光源を用いることがより好ましい。光触媒としては、酸化チタン光触媒、金属イオンや金属コロイドで活性化された酸化チタン光触媒を用いるのが好ましい。酸化剤としては、有機酸や無機酸を特に制限なく用いることができるが、高濃度の酸は取り扱いが難しいので、１０％以下の濃度に希釈して用いると良い。最適な紫外線処理時間、光触媒処理時間、酸化剤処理時間は、用いる光源の紫外線強度、光触媒の活性、酸化剤の酸化力や濃度等の諸条件に応じて適宜決定することができる。

細胞接着性領域は、炭素酸素結合を有する有機化合物を低密度で含む親水性膜により形成されていても良い。この態様では、細胞接着性領域と細胞接着阻害性領域とは、ともに炭素酸素結合を有する有機化合物を含む親水性膜で形成されている。２つの領域は前記有機化合物の密度が相違する。同密度が高いほど細胞は接着しにくくなる傾向がある。細胞接着性領域では、前記有機化合物の密度が、細胞が接着できる程度に低い。一方、細胞接着阻害性領域では、前記有機化合物の密度が、細胞が接着できない程度に高い。

親水性有機化合物の密度を制御する方法としては、親水性有機化合物の薄膜と導電性領域等の表面との間に結合層を設け、当該結合層の親水性有機化合物との結合力を調整する方法が挙げられる。ここで「結合層」とは上記で定義した通りであり、上記で説明した好ましい材料から構成され得る。結合層の結合力は、結合層におけるリンカーを有する材料の密度が高いほど強くなり、同密度が低いほど弱くなる。結合層におけるリンカーを有する材料の密度は、上述の通り、結合層の表面における水の接触角を指標として簡便に評価することができる。

この場合、細胞接着性領域の結合層における、リンカーを有する材料の密度は低い。細胞接着性領域における、親水性有機化合物の薄膜を形成する前の結合層の表面の水接触角は、リンカーを有する材料としてエポキシ基を末端に有するシランカップリング剤を使用する場合を例にとると、典型的には、１０°〜４３°、望ましくは１５°〜４０°である。このような結合層を形成する方法としては、リンカーを有する材料の被膜（結合層）を導電性領域等の表面に形成した後、当該結合層の表面を酸化処理及び／又は分解処理する方法が挙げられる。結合層の表面を酸化処理及び／又は分解処理する方法としては、結合層の表面を紫外線照射処理する方法、光触媒処理する方法、酸化剤で処理する方法等が挙げられる。結合層表面の全面を酸化処理及び／又は分解処理しても良いし、部分的に処理しても良い。部分的な処理は、フォトマスクやステンシルマスク等のマスクを用いたり、スタンプを用いることにより行うことができる。また、紫外線レーザー等のレーザーを用いた方式等の直描方式で酸化処理及び／又は分解処理を施しても良い。その他の諸条件等については、親水性膜の酸化処理及び／又は分解処理により細胞接着性領域を形成する方法の場合と同様の条件を適用できる。こうして形成された結合層上に親水性有機化合物の薄膜を形成することにより、細胞接着性領域が形成できる。

また、上記の場合には、細胞接着阻害性領域の結合層における、リンカーを有する材料の密度は高い。細胞接着阻害性領域における、親水性有機化合物の薄膜を形成する前の結合層の表面の水接触角は、リンカーを有する材料としてエポキシ基を末端に有するシランカップリング剤を使用する場合を例にとると、典型的には４５°以上、望ましくは４７°以上である。このような結合層は、リンカーを有する材料の被膜を導電性領域等の表面に形成することにより得られる。結合層の表面を部分的に酸化処理及び／又は分解処理した場合には、処理を受けない残余の部分が前記水接触角を有する結合層となる。こうして形成された結合層上に親水性有機化合物の薄膜を形成することにより、細胞接着阻害性領域が形成できる。

（細胞接着性領域と細胞接着阻害性領域との比較）
細胞接着性領域（結合層が存在する場合には結合層も含む）の炭素量は、細胞接着阻害性領域（結合層が存在する場合には結合層も含む）の炭素量と比較して低いことが好ましい。具体的には、細胞接着性領域の炭素量が、細胞接着阻害性領域の炭素量に対して２０〜９９％であることが好ましい。この範囲内に該当することは、親水性膜の厚さ（結合層が存在する場合には結合層の厚さと親水性膜の厚さの合計）が１０μｍ以下の場合に特に好適である。「炭素量（atomic concentration、％）」は下記に定義する通りである。

また、細胞接着性領域（結合層が存在する場合には結合層も含む）における炭素のうちで酸素と結合している炭素の割合（％）の値は、細胞接着阻害性領域（結合層が存在する場合には結合層も含む）における炭素のうちで酸素と結合している炭素の割合（％）の値に対して小さい値であることが好ましい。具体的には、細胞接着性領域における炭素のうちで酸素と結合している炭素の割合（％）の値が、細胞接着阻害性領域における炭素のうちで酸素と結合している炭素の割合（％）の値に対して３５〜９９％であることが好ましい。この範囲内に該当することは、親水性膜の厚さ（結合層が存在する場合には結合層の厚さと親水性膜の厚さの合計）が１０μｍ以下の場合に特に好適である。「酸素と結合している炭素の割合（atomic concentration、％）」は下記に定義する通りである。

（親水性薄膜の評価方法）
本発明における親水性薄膜（結合層が存在する場合には結合層も含む）の評価手法としては、接触角測定、エリプソメトリー、原子間力顕微鏡観察、電子顕微鏡観察、オージェ電子分光測定、Ｘ線光電子分光測定、各種質量分析法等を用いることができる。これらの手法の中で、最も定量性に優れているのはＸ線光電子分光測定（ＸＰＳ／ＥＳＣＡ）である。この測定方法で求められるのは相対的定量値であり、一般的に元素濃度（atomic concentration、％）で算出される。以下、本発明におけるＸ線光電子分光分析方法を詳細に説明する。

本発明において親水性薄膜の「炭素量」は、「Ｘ線光電子分光装置を用いて得られるＣ１ｓピークの解析値から求められる炭素量」と定義される。また、本発明において親水性薄膜の「酸素と結合している炭素の割合」は、「Ｘ線光電子分光装置を用いて得られるＣ１ｓピークの解析値から求められる酸素と結合している炭素の割合」と定義される。具体的な測定は、特開２００７−３１２７３６号公報に記載される通りに実施できる。

（パターンの形状）
本発明の細胞培養用基板では、細胞接着性領域と細胞接着阻害性領域とがパターン化されて配置されていることが好ましい。パターンの形状は、二次元のパターンであれば特に制限されず、細胞の種類、形成させる組織等によって選択することができる。例えば、ライン状、ツリー状（樹状）、網目状、格子状、円形、四角形のパターン、円形及び四角形等の図形の内部が全て細胞接着性領域又は細胞接着阻害性領域となっているパターン等を形成することができる。

細胞接着性領域と細胞接着阻害性領域のパターンは、導電性領域２０ａ、２０ｂ上において細胞接着性領域と細胞接着阻害性領域とが隣り合っており、さらに好ましくは複数の導電性領域２０ａ、２０ｂの間における基材１０の表面１０１上においても細胞接着性領域と細胞接着阻害性領域とが隣り合っているように形成される。導電性領域上において細胞接着性領域と細胞接着阻害性領域とが隣り合っていることにより、まず細胞接着性領域に細胞を接着させて培養した後、導電性領域への電圧の印加により細胞接着阻害性領域を細胞接着性に改変させると、改変された領域に細胞が遊走できるようになる。したがって、細胞接着性に改変される領域をパターンニングにより予め決定して、細胞遊走試験において細胞を遊走させる領域及び方向を制御することができる。

例えば、導電性領域２０ａ、２０ｂのそれぞれが、図２のように複数の櫛歯部２００と各櫛歯部２００を支持する基部２０１とを含む櫛形の領域である場合、細胞接着阻害性領域が櫛歯部２００に直交する細長形状、すなわち、導電性領域２０ａ、２０ｂと、複数の導電性領域２０ａ、２０ｂの間における基材１０の表面１０１にまたがる細長形状、好ましくはライン形の領域となるようパターニングを行うことにより、櫛歯部２００に沿った細胞遊走を試験することができる。

櫛歯部２００に直交する細長形状、好ましくはライン形の幅は、櫛歯部２００が基部２０１から延びる長さより短く、細胞培養できる幅であれば良い。ライン形の幅は、通常１μｍ〜２ｃｍ、好ましくは５０μｍ〜１０００μｍである。また、細長形状、好ましくはライン形の領域は、櫛歯部２００とは直交するが、櫛形の基部２０１とは離れた位置、好ましくはできるだけ離れた位置にくるようパターニングする。そうすることにより、細長形状、好ましくはライン形の領域外に接着した細胞が、電圧印加後に細胞接着性に改変される櫛歯部２００の領域を移動できるからである。

本発明の細胞培養用基板は、上記のように製造することができ、一実施形態においては、導電性領域２０ａ、２０ｂと、複数の導電性領域２０ａ、２０ｂの間における基材１０の表面１０１の全面に、炭素酸素結合を有する有機化合物を含む細胞接着阻害性の親水性膜を形成する工程、及び導電性領域２０ａ、２０ｂ上において細胞接着性領域と細胞接着阻害性領域とが隣り合うように、親水膜をパターン状に酸化処理及び／又は分解処理して細胞接着性に改変させる工程を含む方法により製造できる。

（細胞）
細胞培養用基板に播種する細胞としては、血球系細胞やリンパ系細胞等の浮遊細胞でも良いし接着性細胞でも良いが、本発明は、接着性を有する細胞に対して好適に使用される。また遊走する性質を有する細胞に対して好適に使用される。そのような細胞としては、例えば、肝がん細胞、グリオーマ細胞、結腸がん細胞、腎がん細胞、膵がん細胞、前立腺がん細胞、大腸がん細胞、乳がん細胞、肺がん細胞、卵巣がん細胞等のがん細胞、肝臓の実質細胞である肝細胞、クッパー細胞、血管内皮細胞や角膜内皮細胞等の内皮細胞、繊維芽細胞、骨芽細胞、砕骨細胞、歯根膜由来細胞、表皮角化細胞等の表皮細胞、気管上皮細胞、消化管上皮細胞、子宮頸部上皮細胞、角膜上皮細胞等の上皮細胞、乳腺細胞、ペリサイト、平滑筋細胞や心筋細胞等の筋細胞、腎細胞、膵ランゲルハンス島細胞、末梢神経細胞や視神経細胞等の神経細胞、軟骨細胞、骨細胞等が挙げられる。これらの細胞は、組織や器官から直接採取した初代細胞でも良く、あるいは、それらを何代か継代させたものでも良い。さらにこれら細胞は、未分化細胞である胚性幹細胞、多分化能を有する間葉系幹細胞等の多能性幹細胞、単分化能を有する血管内皮前駆細胞等の単能性幹細胞、分化が終了した細胞の何れであっても良い。また、細胞は単一種を培養しても良いし二種以上の細胞を共培養しても良い。

目的の細胞を含む培養試料は、予め、生体組織を細かくして液体中に分散させる分散処理や、生体組織中の目的の細胞以外の細胞その他細胞破片等の不純物質を除去する分離処理等を行っておくことが好ましい。

細胞培養用基板への細胞の播種に先だって、目的とする細胞を含む培養試料を、予め、各種の培養方法で予備培養して、目的とする細胞を増やすことが好ましい。予備培養には、単層培養、コートディシュ培養、ゲル上培養等の通常の培養方法が採用できる。予備培養において、細胞を支持体表面に接着させて培養する方法の一つに、いわゆる単層培養法として既に知られている手段がある。具体的には、例えば、培養容器に培養試料と培養液を収容して一定の環境条件に維持しておくことにより、特定の生細胞のみが、培養容器等の支持体表面に接着した状態で増殖する。使用する装置や処理条件等は、通常の単層培養法等に準じて行う。細胞が接着して増殖する支持体表面の材料として、ポリリシン、ポリエチレンイミン、コラーゲン及びゼラチン等の細胞の接着や増殖が良好に用いられる材料を選択したり、ガラスシャーレ、プラスチックシャーレ、スライドガラス、カバーガラス、プラスチックシート及びプラスチックフィルム等の支持体表面に、細胞の接着や増殖が良好に行われる化学物質、いわゆる細胞接着因子を塗布しておくことも行われる。

予備培養後に、培養容器中の培養液を除去することで、培養試料中の支持体表面に接着しない塊状や線維状の不純物等の不要成分が除去され、支持体表面に接着した生細胞のみを回収できる。支持体表面に接着した生細胞の回収には、ＥＤＴＡ−トリプシン処理等の手段が適用できる。

上記のように予備培養した細胞を、培養液中の細胞培養用基板上に播種する。細胞の播種方法や播種量については特に制限はなく、例えば、朝倉書店発行「日本組織培養学会編組織培養の技術（１９９９年）」２６６〜２７０頁等に記載されている方法が使用できる。細胞を細胞培養用基板上で増殖させる必要がない程度に十分な量で、細胞が単層で接着するように播種することが好ましい。通常、培養液１ｍｌ当たり１０^４〜１０^６個のオーダーで細胞が含まれるように播種するのが好ましく、また、基板１ｃｍ^２当たり１０^４〜１０^６個のオーダーで細胞が含まれるように播種するのが好ましい。具体的には、４００ｍｍ^２当たり２×１０^５個程度で播種する。

細胞を播種した細胞培養用基板を培養液中で培養することにより、細胞を細胞接着性領域に接着させることが好ましい。培養液としては、当技術分野で通常用いられる細胞培養用培地であれば特に制限なく用いることができる。例えば、用いる細胞の種類に応じて、ＭＥＭ培地、ＢＭＥ培地、ＤＭＥ培地、αＭＥＭ培地、ＩＭＤＭ培地、ＥＳ培地、ＤＭ−１６０培地、Ｆｉｓｈｅｒ培地、Ｆ１２培地、ＷＥ培地及びＲＰＭＩ１６４０培地等、朝倉書店発行「日本組織培養学会編組織培養の技術第三版」５８１頁に記載されているような基礎培地を用いることができる。さらに、基礎培地に血清（ウシ胎児血清等）、各種増殖因子、抗生物質、アミノ酸等を加えても良い。また、Ｇｉｂｃｏ無血清培地（インビトロジェン社）等の市販の無血清培地等を用いることができる。

細胞を培養する時間は、培養時の細胞操作の有無等に左右されるが、通常６〜９６時間、好ましくは１２〜７２時間である。培養する温度は、通常３７℃である。ＣＯ_２細胞培養装置等を利用して、５％程度のＣＯ_２濃度雰囲気下で培養するのが好ましい。培養した後、細胞培養用基板を洗浄することにより、接着していない細胞が洗い流され、細胞接着性領域にのみ細胞を接着させることができる。

（細胞遊走試験）
上記のように、本発明の細胞培養用基板上に細胞を播種して培養し、細胞接着性領域に細胞を接着させた後、導電性領域に電圧を印加して、導電性領域上の細胞接着阻害性領域を細胞接着性に改変させ、その後の細胞の移動を観察することにより、細胞遊走を試験することができる。

すなわち、細胞遊走試験法は、
（ｉ）本発明の細胞培養用基板に細胞を播種し、細胞接着性領域に細胞を接着させる工程、
（ｉｉ）導電性領域に電圧を印加することによって導電性領域上の細胞接着阻害性領域を細胞接着性に改変させる工程、
（ｉｉｉ）導電性領域上の細胞接着性領域に接着している細胞の、工程（ｉｉ）で細胞接着性に改変した領域への移動を観察する工程、
を含む。

（ｉ）の工程においては、細胞を播種した後、細胞培養を行い、細胞接着性領域に細胞を接着させることが好ましく、さらに細胞培養用基板を洗浄することにより、接着していない細胞を洗い流し、細胞接着性領域にのみ細胞を接着させることが好ましい。

（ｉｉ）の工程において、導電性領域に印加する電圧は、正電圧であることが好ましい。正電圧を印加することにより、細胞接着阻害性領域を効果的に細胞接着性に改変できるとともに、特に導電性領域がＩＴＯ膜からなる場合に黒変するのを防止することができ、細胞遊走の観察を良好に実施できる。

印加する電圧は、当業者であれば適宜決定することができるが、通常１Ｖ〜１０Ｖ、好ましくは２Ｖ〜５Ｖであり、印加する時間は、通常０．５分間〜６０分間、好ましくは１分間〜１０分間である。

印加する電圧は、導電性領域が接している溶媒の種類や、導電性領域の材質、導電性領域の形状によって、適切な値が変わるが、通常、細胞接着阻害性領域を細胞接着性に改変可能な電圧以上で、細胞に悪影響を与えない程度に低い電圧を加えるのが良い。

電圧は、細胞培養用基板の平面内の導電性領域２０ａと導電性領域２０ｂとの間（例えば、ＩＴＯとＩＴＯ間）に印加しても良いし、細胞培養用基板の平面内に、Ｐｔ等の対抗電極を設けて導電性領域と対向電極との間（例えば、ＩＴＯとＰｔ間）に印加しても良い。また、電圧を精密に制御するため、細胞培養用基板の平面内にＡｇ／ＡｇＣｌ等の参照電極を設けても良い。上記の対抗電極や参照電極は、細胞培養用基板の平面内でなくても良い（培養液に電極を浸漬する形態でも良い）。

導電性領域に電圧を印加するための装置として、導電性領域（例えば、陽極及び陰極として機能する導電性領域２０ａ及び導電性領域２０ｂのそれぞれ）に外部端子を接続し、その外部端子に所定の電圧を発生させる電源を接続することができる。

また、必要に応じて、電源を直流電源とし、これに極性切り替え装置を組み合わせることができる。この構成により、例えば、２つの導電性領域２０ａ、２０ｂのうち導電性領域２０ａの方に正電圧を印加して導電性領域２０ａ上の細胞接着阻害性領域を細胞接着性に改変した後、極性を反転させて、導電性領域２０ｂ上の細胞接着阻害性領域を細胞接着性に改変させることができるため、細胞培養用基板の面全体を細胞遊走試験等に有効利用することができる。あるいは、設置する電源は、プラス電位のパルスやマイナス電位のパルスを発生させることができるパルス発生源であっても良い。

細胞の移動の観察には、細胞が移動する速度の計測、並びに遊走方向、遊走時の細胞形態、及び周囲の細胞同士のコネクション等の観察が含まれる。細胞が移動する速度の計測は、パターン、例えば櫛歯部のような線状のパターンにおいて、細胞が浸潤していく面積や距離を測定することにより、実施できる。

以下、本発明の細胞培養用基板を用いた細胞遊走試験法の一例について、図を参照することにより説明する。

図４は、細胞培養用基板２の一部を示しており、図２の細胞培養用電極１のＳ部分に対応する。図４に示すように、この実施形態に係る細胞培養用基板２は、基板上に導電性領域が櫛形にパターニングされ、陽極として機能する導電性領域２０ａと、陰極として機能する導電性領域２０ｂとが形成されている。そして、導電性領域２０ａの、長さ方向位置が異なる２つ以上の位置に、導電性領域２０ａの各位置における部分を少なくとも一部（一部又は全部）に含むように細胞接着性領域３０が形成されている。図４及び図５において、太枠は細胞接着性領域３０の外縁部を示し、枠外の領域が細胞接着阻害性領域３１を示す。複数の細胞接着性領域が存在する場合は、相互に離れて配置されている。図４及び５に示すように、導電性領域２０ａの各位置における部分が前記細胞接着性領域３０の一部である場合には、該細胞接着性領域３０には、残部として、複数の導電性領域２０ａ、２０ｂの間における基材の表面１０１がさらに含まれる。ただし、細胞接着性領域３０の全部が、各位置における導電性領域２０ａとなるように形成されても良い。導電性領域２０ａ、２０ｂ、及び複数の導電性領域２０ａ、２０ｂの間における基材の表面１０１のうち、前記細胞接着性領域３０に含まれない部分（枠に囲まれていない部分）は、細胞接着阻害性領域３１である。各細胞接着性領域３０の、該細胞接着性領域に連結する導電性領域２０ａの長さ方向の寸法を細胞接着性領域３０の長さＬ、該長さ方向に直交する方向の寸法を細胞接着性領域３０の幅Ｗと定義したとき、各細胞接着性領域３０の長さＬ及び幅Ｗが、それぞれ独立に、１μｍ〜５００μｍである。導電性領域２０ａのうち、細胞接着性領域３０に含まれない部分の線幅ＬＷは０．１μｍ〜１０μｍであり、且つ、該線幅ＬＷは、該部分と接続される細胞接着性領域３０の幅Ｗよりも小さい。導電性領域２０ａ上の細胞接着阻害性領域３１は、好ましくは、電圧印加によって細胞接着性に改変可能である。すなわち、電圧印加時には、予め形成されている細胞接着性領域３０と、導電性領域２０ａの全体とが一体となって、細胞接着性領域が形成される。

本発明のこの実施形態では、細胞接着性領域３０は、培養しようとする細胞が１〜数個、例えば１〜３個、好ましくは１又は２個、特に好ましくは１個のみ接着することが可能な寸法、形状、面積を有することが好ましい。この目的を達成するために、細胞接着性領域３０の寸法、形状、面積を、培養しようとする細胞の種類に応じて適宜決定することができる。細胞接着性領域３０の上記の定義による長さＬ及び幅Ｗは、通常は１μｍ〜５００μｍであり、好ましくは１０μｍ〜２００μｍであり、より好ましくは２５μｍ〜５０μｍである。細胞接着性領域３０の長さＬと幅Ｗの比は特に限定されないが、通常は、細胞接着性領域３０の長さＬを１としたときに、細胞接着性領域３０の幅Ｗは０．５〜２であり、好ましくは０．７〜１．５であり、より好ましくは０．８〜１．３であり、特に好ましくは０．９５〜１．０５であり、最も好ましくは１である。細胞接着性領域３０の形状として図４では正方形を例示しているが、特に限定されず、正方形、長方形、菱形、平行四辺形等の四角形、三角形、五角形、六角形、又はそれ以上の角を有する多角形、真円、楕円、長円等の円形が挙げられる。細胞接着性領域３０の長さＬ及び幅Ｗがそれぞれ１μｍ〜５００μｍである場合は、細胞接着性領域が四角形であれば面積は１μｍ^２〜２５０，０００μｍ^２、円形であれば約０．８μｍ^２〜１９６，３５０μｍ^２となる。細胞接着性領域の面積は好ましくは５０μｍ^２〜４０，０００μｍ^２、より好ましくは６２５μｍ^２〜２，５００μｍ^２（円形の場合は４９０μｍ^２〜１９６３μｍ^２）である。

導電性領域２０ａの線幅ＬＷは、好ましくは０．１μｍ〜２０μｍであり、より好ましくは０．１μｍ〜１０μｍであり、特に好ましくは１μｍ〜５μｍである。具体的には、培養される細胞の種類に応じて適宜決定することができる。また、導電性領域２０ａの線幅ＬＷは、予め形成される細胞接着性領域３０の幅Ｗよりも小さく形成することができる。例えば、細胞接着性領域３０の幅Ｗを１としたとき、該細胞接着領域３０に接続される導電性領域２０ａの線幅ＬＷは、好ましくは０．２以下、より好ましくは０．０１〜０．２とすることができる。

導電性領域２０ａの長さ方向位置が異なる２つ以上の位置に細胞接着性領域３０が形成される実施形態では、導電性領域２０ａの、２つの細胞接着性領域３０の間を連絡する部分の長さは培養される細胞の種類に応じて適宜決定することができ、通常は１０μｍ〜１０ｍｍであり、好ましくは５０μｍ〜２００μｍである。神経細胞の培養に用いる場合には、軸索の伸張能力が高いことを考慮すれば、上記長さを１００ｍｍ〜３０ｃｍとしても良い。

この実施形態に係る本発明の細胞培養用基板２は、例えば、基材１０の表面上に導電性領域２０ａ、２０ｂを形成し、これらの導電性領域を備えた細胞培養用電極の表面の全面に、親水性膜等を形成して細胞接着阻害性領域を形成し、次いで、親水膜をパターン状に酸化処理及び／又は分解処理して、１個又は複数個の細胞接着性領域３０を形成することにより製造することができる。

この実施形態に係る本発明の細胞培養用基板２の使用方法について図５を参照して説明する。まず本発明の細胞培養用基板２に細胞Ｃを播種し、細胞接着性領域３０に細胞Ｃを接着させる（図５（ａ））。この場合、各細胞接着性領域３０には１〜数個、例えば１〜３個、好ましくは１又は２個、特に好ましくは１個の細胞Ｃのみが接着する。次いで、図５（ｂ）に示すように、導電性領域２０ａに電圧（好ましくは正電圧）を印加することによって導電性領域２０ａ上の細胞接着阻害性領域３１を細胞接着性に改変させる。時間経過とともに、図５（ｃ）に示すように、細胞接着性領域３０に接着した細胞Ｃの一部の形態が変化し、新たに細胞接着性となった導電性領域２０ａに沿って伸長あるいは移動する。細胞Ｃを観察することにより、細胞の機能等を試験することができる。細胞の観察は、種々の観点から行うことができ、例えば形態変化の速度、距離、形態変化後の細胞の形状等を観察することができる。また、導電性領域２０ａの長さ方向位置が異なる２つ以上の位置に細胞接着性領域３０が形成されている本発明の細胞培養用基板２を用いることにより、導電性領域を介して連絡された他の細胞との相互作用等を観察することもできる。この方法によれば、細胞−細胞間の相互作用を評価することが可能である。

上記方法はまた、回路状の細胞構築物を形成するために用いることもできる。図５（ｃ）に示すように、導電性領域２０ａの長さ方向位置が異なる２つ以上の位置に細胞接着性領域３０を形成する本発明の細胞培養用基板を用い、電圧を印加した状態で細胞Ｃを培養することにより、細胞接着性領域３０に接着した細胞Ｃの一部が形態変化を生じ、新たに細胞接着性となった導電性領域２０ａに沿って伸長し、導電性領域２０ａを介して連絡された他の細胞Ｃとの間に、連絡部Ｃ１を形成する。この方法が適用される細胞は特に限定されない。例えば、培養細胞として神経細胞を用い、新たに細胞接着性となった導電性領域２０ａに沿った軸索伸張を誘導することにより、所望の形状の神経回路網を形成することが可能である。

本発明のように、細胞の播種後に電圧印加によって細い線状の細胞接着性の領域を新たに形成する場合には、予め細い線状の細胞接着性領域が形成された基板に細胞を播種する場合と比べて、細胞播種時に余計な細胞が線状領域上へ付着してしまう可能性を減らすことが可能であると考えられる。

以下、本発明を実施例により説明するが、本発明は実施例の範囲に限定されない。

（実施例１）
基材として厚さ０．７５ｍｍのガラス板を用いた。この基材上に導電性領域として厚さ１５０ｎｍのＩＴＯ膜を成膜した。次に、ＩＴＯ膜の表面を、波長１０．６μｍのＣＯ_２レーザーにより、出力３０Ｗ、スポットサイズφ１００μｍ、走査スピード２０ｍｍ／ｓの条件で直線状に切削し、導電性領域を分割して細胞培養用電極を作製した。

次に、この細胞培養用電極の上に、結合層としてシランを介してポリエチレングリコールからなる親水性膜を成膜し、細胞培養用基板を作製した。

作製した細胞培養用基板について、レーザーにより切削した部分を段差測定機にて測定した。その結果を図６に示す。図６に示すように、レーザーにより基材の表面が凹んでいることが確認された（図６中のＭ）。また、導電性領域の表面の端部には、端部以外の比べて厚く盛り上がった畝部が形成されていることが確認された（図６中のＮ）。なお、切削部分の中央の突起は、ガラスによりレーザー光が屈折した影響か、又はガラス厚さによるレーザー焦点のずれが影響したものと考えられる。

次に、２つの導電性領域２０ａ、２０ｂ間に電圧２Ｖを６０秒間印加し、ポリエチレングリコールからなる親水性膜を細胞接着性に改変した。そして、その上にマウス細胞Ｃ２を６０，０００ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２の密度で播種し、顕微鏡により観察した。その結果を図７に示す。図７に示すように、レーザーにより切削した部分（基材の表面の一部１０１）上にはマウス細胞Ｃ２が存在せず、パターンに忠実に細胞が接着していることが明らかとなった。この効果は、基材の表面が凹むように切削したことと、導電性領域２０ａ、２０ｂの端部に畝部を形成したことによるものと考えられる。

（実施例２）
基材として厚さ２００μｍのＰＥＴフィルムを用いた。この基材上に導電性領域として厚さ１００ｎｍのＩＴＯ膜を成膜した。次に、ＩＴＯ膜の表面を、波長１０．６μｍのＣＯ_２レーザーにより、出力１５Ｗ、スポットサイズφ１００μｍ、走査スピード１０００ｍｍ／ｓの条件で直線状に切削し、導電性領域を分割して細胞培養用電極を作製した。

次に、この細胞培養用電極の上に、結合層としてシランを介してポリエチレングリコールからなる親水性膜を成膜し、細胞培養用基板を作製した。

作製した細胞培養用基板について、レーザーにより切削した部分を段差測定機にて測定した。その結果を図８に示す。図８に示すように、レーザーにより基材の表面が凹んでいることが確認された（図８中のＭ）。また、導電性領域の表面の端部には、端部以外の比べて厚く盛り上がった畝部が形成されていることが確認された（図６中のＮ）。

１ 細胞培養用電極
２ 細胞培養用基板
１０ 基材
２０ａ 導電性領域
２０ｂ 導電性領域
３０ 細胞接着性領域
３１ 細胞接着阻害性領域
１０１ 複数の導電性領域の間における基材の表面
１０２ 複数の導電性領域の間における基材の表面以外の表面
２００ 櫛歯部
２０１ 基部
２０２ 畝部
２０５ 線状電極
Ｃ 細胞
Ｃ１ 連絡部
Ｃ２ マウス細胞

Claims (10)

1. 絶縁性材料を含む基材上に複数の導電性領域が設けられた細胞培養用電極であって、
   前記複数の導電性領域の間における前記基材の表面の少なくとも一部が、前記複数の導電性領域の間における前記基材の表面以外の表面に比べて凹んでおり、
   前記導電性領域の表面の端部に、前記端部以外の前記導電性領域の表面に比べて厚い畝部が設けられている前記細胞培養用電極。
2. 前記導電性領域が、複数の櫛歯部と各櫛歯部を支持する基部とを含む櫛形の領域である請求項１に記載の細胞培養用電極。
3. 前記複数の導電性領域の間の距離が、０．００５ｍｍ〜３ｍｍである請求項１又は２に記載の細胞培養用電極。
4. 前記基材、及び前記複数の導電性領域が透明である請求項１〜３のいずれかに記載の細胞培養用電極。
5. 前記導電性領域に、前記導電性領域を構成する導電性材料よりも電気抵抗が低い線状電極が埋め込まれている請求項１〜４のいずれかに記載の細胞培養用電極。
6. 前記線状電極が、網目状に設けられる請求項５に記載の細胞培養用電極。
7. 絶縁性材料を含む基材上に複数の導電性領域が設けられ、前記複数の導電性領域の間における前記基材の表面の少なくとも一部が、前記複数の導電性領域の間における前記基材の表面以外の表面に比べて凹んでおり、前記導電性領域の表面の端部に、前記端部以外の前記導電性領域の表面に比べて厚い畝部が設けられている細胞培養用電極の製造方法であって、
   絶縁性材料を含む基材上に導電性領域を形成する工程と、
   前記導電性領域の一部、及び前記一部に接する基材の表面をレーザーにより切削し、前記導電性領域を複数の導電性領域に分割する工程と、
   を含む前記細胞培養用電極の製造方法。
8. 絶縁性材料を含む基材上に複数の導電性領域が設けられ、前記導電性領域に、前記導電性領域を構成する導電性材料よりも電気抵抗が低い線状電極が埋め込まれ、前記複数の導電性領域の間における前記基材の表面の少なくとも一部が、前記複数の導電性領域の間における前記基材の表面以外の表面に比べて凹んでおり、前記導電性領域の表面の端部に、前記端部以外の前記導電性領域の表面に比べて厚い畝部が設けられている細胞培養用電極の製造方法であって、
   導電性領域を、前記導電性領域を構成する導電性材料よりも電気抵抗が低い線状電極を前記導電性領域に埋め込んだ状態で、絶縁性材料を含む基材上に形成する工程と、
   前記導電性領域の一部、及び前記一部に接する基材の表面をレーザーにより切削し、前記導電性領域を複数の導電性領域に分割する工程と、
   を含む前記細胞培養用電極の製造方法。
9. 絶縁性材料を含む基材上に複数の導電性領域が設けられ、前記複数の導電性領域の間における前記基材の表面の少なくとも一部が、前記複数の導電性領域の間における前記基材の表面以外の表面に比べて凹んでおり、前記導電性領域の表面の端部に、前記端部以外の前記導電性領域の表面に比べて厚い畝部が設けられている細胞培養用電極の前記導電性領域上に、前記導電性領域への電圧印加によって細胞接着性に改変可能な細胞接着阻害性領域が設けられた細胞培養用基板。
10. 前記細胞接着阻害性領域が、導電性領域上において細胞接着性領域と隣り合っている請求項９に記載の細胞培養用基板。

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