JP7269594B2 - 細胞分離フィルター及び細胞分離方法 - Google Patents

Description

本発明は、細胞分離フィルター及び細胞分離方法に関する。

目的の細胞を選択的に捕捉・回収するフィルターに供する材料として、特許文献１には、細胞に対する親和性が外部からの刺激に応じて変化する高分子ゲルを表面に被覆した高分子多孔体または繊維集合体よりなる細胞分離用材料が開示されている。

特許文献１に記載の細胞分離用材料によれば、高分子多孔体または繊維集合体の基材表面に、温度感応性、光感応性、電気感応性などの性質を持った高分子ゲルを被覆し、血小板あるいは白血球との親和性をこれらのゲルの膨潤・収縮などによって変化させて、該血小板あるいは白血球を吸・脱着させることができるとされている。

例えば、温度感応性ゲルを用いたフィルターで血小板を分離・回収する場合、フィルターに血小板を含む液体を導入する際は、ゲルを収縮状態の温度に保っておく。一般にゲルは収縮した状態では膨潤した状態に比べて疎水性であるため、血小板が濾材表面の該ゲルに吸着する。処理すべき液体を全てフィルターで濾過した後、ゲルが膨潤するような温度に設定する。ゲルは膨潤することにより親水性となり、血小板との相互作用が弱まり血小板が溶離してくる。

特開平７－１３６５０８号公報

特許文献１には、電気感応性ゲルの例として、アクリルアミドゲルの一部を加水分解したものや、ポリメタクリル酸、２－アクリルアミド－２－メチルプロパンスルホン酸－２－ヒドロキシエチル共重合体のようにイオン解離基を持たせたものなどが記載されている。

しかしながら、これらの材料を使用した場合、細胞との接着及び剥離は１回しか実施することができず、繰り返し使用することができないため、コストが高くなるという問題がある。

本発明は、上記の問題を解決するためになされたものであり、分離対象物である細胞との接着性が可逆的に変化し、繰り返し使用することが可能な細胞分離フィルターを提供することを目的とする。

本発明の細胞分離フィルターは、フィルター基材と、上記フィルター基材の表面に被覆された細胞接着性可変部と、を備える細胞分離フィルターであって、上記細胞接着性可変部は、導電性高分子と多糖類とを含み、外部から印加される電圧により分離対象物である細胞との接着性が可逆的に変化する。

本発明によれば、分離対象物である細胞との接着性が可逆的に変化し、繰り返し使用することが可能な細胞分離フィルターを提供することができる。

図１Ａ、図１Ｂ、図１Ｃ及び図１Ｄは、本発明の細胞分離フィルターに－電圧を印加した場合の説明図である。 図２Ａ、図２Ｂ、図２Ｃ及び図２Ｄは、本発明の細胞分離フィルターに＋電圧を印加した場合の説明図である。 図３Ａ及び図３Ｂは、本発明の一実施形態に係る細胞分離フィルターの製造方法の説明図である。 図４Ａ、図４Ｂ及び図４Ｃは、本発明の一実施形態に係る細胞分離フィルターの使用方法の説明図である。 図５は、印加電圧の大きさに対する撥水性の変化を示すグラフである。 図６は、繰り返し電圧を印加した際の撥水性の変化を示すグラフである。 図７は、撥水性の経時変化を示すグラフである。

以下、本発明の細胞分離フィルターについて説明する。
しかしながら、本発明は、以下の構成に限定されるものではなく、本発明の要旨を変更しない範囲において適宜変更して適用することができる。
以下において記載する本発明の個々の望ましい構成を２つ以上組み合わせたものもまた本発明である。

本発明の細胞分離フィルターは、フィルター基材と、上記フィルター基材の表面に被覆された細胞接着性可変部と、を備えている。

フィルター基材は、多孔膜などの多孔体であることが好ましい。フィルター基材の形状は特に限定されず、例えば、シート状、粒子状、繊維状、ブロック状などが挙げられる。

フィルター基材を構成する材料としては、例えば、ポリオレフィン、ハロゲン化ポリオレフィン、ポリウレタン、ポリアミド、ポリエステル、ポリスチレン、ガラス、シリカ、アルミナ、ゼオライト、カーボン、金属などが挙げられる。

フィルター基材の平均孔径は、目的の細胞の種類に合わせて適宜選択すればよく、特に限定されないが、例えば、１μｍ以上、１００μｍ以下であることが好ましい。

細胞接着性可変部は、導電性高分子と多糖類とを含む。

導電性高分子としては、例えば、ポリピロール、ポリピロール誘導体、ポリアニリン、ポリアニリン誘導体、ポリチオフェン、ポリチオフェン誘導体などが挙げられる。導電性高分子は、１種のみであってもよいし、２種以上であってもよい。これらの中では、ポリチオフェン又はポリチオフェン誘導体が好ましく、例えば、ＰＥＤＯＴと呼ばれるポリ（３，４－エチレンジオキシチオフェン）が好ましい。

多糖類としては、例えば、ヒアルロン酸、ケラタン硫酸、ヘパラン硫酸、ヘパリン、コンドロイチン、コンドロイチン硫酸Ａ、コンドロイチン硫酸Ｃ、コンドロイチン硫酸Ｄ、コンドロイチン硫酸Ｅ、コンドロイチン硫酸Ｋ及びデルマタン硫酸などが挙げられる。多糖類は、１種のみであってもよいし、２種以上であってもよい。これらの中では、硫酸基を有するものが好ましく、例えば、コンドロイチン硫酸Ｃが好ましい。

導電性高分子と多糖類とを含む細胞接着性可変部をフィルター基材の表面に被覆する方法としては、例えば、ＥＤＯＴと呼ばれる３，４－エチレンジオキシチオフェン等のモノマーと多糖類とを含む処理液を用いて、フィルター基材の表面にＰＥＤＯＴ等の導電性高分子の重合膜を形成して細胞接着性可変部を被覆する方法や、ＰＥＤＯＴ等の導電性高分子と多糖類とを含む分散液をフィルター基材の表面に塗布して乾燥させる方法等により細胞接着性可変部を被覆する方法などが挙げられる。

本発明の細胞分離フィルターにおいて、細胞接着性可変部は、外部から印加される電圧により分離対象物である細胞との接着性が可逆的に変化する。そのため、細胞分離フィルターとして繰り返し使用することが可能となり、コスト削減に繋がる。

外部から印加される電圧により細胞との接着性が可逆的に変化する理由としては、細胞接着性可変部内で多糖類分子の分布がスイッチするためではないかと考えられる。

以下、多糖類としてコンドロイチン硫酸Ｃを用いた場合を例にして説明する。

図１Ａ、図１Ｂ、図１Ｃ及び図１Ｄは、本発明の細胞分離フィルターに－電圧を印加した場合の説明図である。
図１Ａに示すように、細胞分離フィルター１に－電圧を印加し、細胞含有溶液３０に設けた電圧印加部４０に＋電圧を印加する。
図１Ｂに示すように、細胞分離フィルター１では、フィルター基材１０の表面に、導電性高分子２１と多糖類２２とを含む細胞接着性可変部２０が被覆されている。多糖類２２として用いたコンドロイチン硫酸Ｃは－にチャージしているため、細胞分離フィルター１に－電圧を印加した場合、多糖類２２はフィルター基材１０と反発し、細胞接着性可変部２０の表面に移動する。このため、図１Ｃに示すように、細胞分離フィルター１の表面は、水Ｗに対する接触角が小さくなり、親水性となる。その結果、図１Ｄに示すように、細胞５０との接着性が弱くなる。

図２Ａ、図２Ｂ、図２Ｃ及び図２Ｄは、本発明の細胞分離フィルターに＋電圧を印加した場合の説明図である。
図２Ａに示すように、電圧印加部４０に－電圧を印加し、細胞分離フィルター１に＋電圧を印加した場合、多糖類２２として用いたコンドロイチン硫酸Ｃは－にチャージしているため、図２Ｂに示すように、多糖類２２はフィルター基材１０に引き寄せられ、細胞接着性可変部２０の裏面に移動する。そのため、図２Ｃに示すように、細胞分離フィルター１の表面は、水Ｗに対する接触角が大きくなり、疎水性となる。その結果、図２Ｄに示すように、細胞５０との接着性が強くなる。

本発明の細胞分離フィルターは、フィルター基材の形状に合ったカラムなどの容器に収容されて使用されてもよい。

本発明の細胞分離フィルターを用いることにより、例えば、血液又は血液製剤から、血小板あるいは白血球を分離することができる。また、分離対象物である細胞との接着性の違いを利用することにより、例えば、血小板及び白血球の両方との接着性が高い状態、いずれか一方との接着性が高い状態、両方との接着性が低い状態という３段階の状態変化により、１つのフィルターで２種類の細胞を分離、回収することも可能である。

以下、本発明の一実施形態に係る細胞分離フィルターの製造方法及び使用方法について説明する。なお、本発明は、これらの実施形態に限定されるものではない。

図３Ａ及び図３Ｂは、本発明の一実施形態に係る細胞分離フィルターの製造方法の説明図である。
まず、図３Ａに示すように、リン酸緩衝液（ｐＨ＝７．４、１Ｍ）中にＥＤＯＴ（０．０２Ｍ）、コンドロイチン硫酸Ｃ（５０ｍｇ／ｌ）を混合して電解溶液１００を作製する。作用電極１１０を多孔体である金属メッシュ、対極１２０をＰｔ電極、参照電極１３０を飽和カロメル電極として、ガルバノスタットＧＳにて０．２ｍＡ／ｃｍ^２の電流を１時間流す。その結果、図３Ｂに示すように、作用電極１１０である多孔体の表面に細胞接着性可変部２０が被覆される。以上により、細胞分離フィルターが得られる。

図４Ａ、図４Ｂ及び図４Ｃは、本発明の一実施形態に係る細胞分離フィルターの使用方法の説明図である。
図４Ａに示すように、細胞分離フィルター１をフィルターフォルダー２００にはさみ込み、上下にチューブ２１０を接続する。さらに、上側のチューブ２１０には、電圧印加部設置フォルダー２２１及び細胞含有溶液挿入部２２２を有する蓋２２０を設置する。

図４Ｂに示すように、ローラーポンプ（図示せず）でヒト保存血２３０を送り込み、細胞分離フィルター１により血小板細胞２４０を採取する。全てのヒト保存血２３０を回収後、図４Ｃに示すように、生理食塩水２５０を加え、ポテンショスタットＰＳにて－１．０Ｖの電圧を１０分間印加し、血小板細胞２４０を含有する生理食塩水２５０をローラーポンプにて回収する。図示していないが、生理食塩水を加え、ポテンショスタットＰＳにて＋１．０Ｖの電圧を１０分間印加し、細胞分離フィルター１の表面を元の状態に戻した後、再度、分離操作を実施することができる。

図５は、印加電圧の大きさに対する撥水性の変化を示すグラフである。図６は、繰り返し電圧を印加した際の撥水性の変化を示すグラフである。図７は、撥水性の経時変化を示すグラフである。
図５、図６及び図７では、作用電極として金属メッシュに代えて金属基板（Ａｕ基板）を用いたことを除いて、図３Ａ及び図３Ｂと同じ方法及び条件により、導電性高分子としてＰＥＤＯＴ、多糖類としてコンドロイチン硫酸Ｃを含む細胞接着性可変部を金属基板の表面に被覆した。

水の接触角は、以下の方法により、協和界面科学製微小接触角計（ＭＣＡ－３）を用いて測定される値である。まず、水平な基盤の上に試料を配置する。次に、試料の表面温度が２５℃、周囲の気温が２５℃となる環境下で、細胞接着性可変部の上に水滴を滴下して、細胞接着性可変部の上に形成された液滴を横方向からマイクロスコープで撮影し、撮影した画像から、接触角を求める。ここでの接触角は、滴下した直後に測定した、静的接触角をいう。

図５より、印加電圧が大きくなるほど水の接触角が大きくなっており、撥水性が変化することが分かる。

また、図６より、初期状態から＋０．９Ｖの電圧を印加した場合、水の接触角は約１５°から約６０°まで増大し、その後、－０．９Ｖの電圧を印加すると、水の接触角は約１５°まで減少したが、再び＋０．９Ｖの電圧を印加すると、水の接触角は約６０°まで増大した。すなわち、撥水性が可逆的に変化することが分かる。

図５及び図６の結果から、細胞分離フィルターに適用した場合、外部から印加される電圧により分離対象物である細胞との接着性が可逆的に変化すると考えられる。

撥水性の経時変化を評価するため、＋０．５Ｖの電圧を印加し、電圧を印加した初日から１０日後まで水の接触角を測定した。図７には、電圧を印加した初日、５日後、１０日後における水の接触角の変化率を示している。
図７より、電圧を印加した初日と比較して、１０日後も水の接触角は±１０％以内に収まることが確認できた。このように、電圧を印加しなくても水の接触角が維持されるメモリー性があるため、細胞分離フィルターとして長期に繰り返し使用することが可能であると考えられる。

１ 細胞分離フィルター
１０ フィルター基材
２０ 細胞接着性可変部
２１ 導電性高分子
２２ 多糖類
３０ 細胞含有溶液
４０ 電圧印加部
５０ 細胞
１００ 電解溶液
１１０ 作用電極
１２０ 対極
１３０ 参照電極
２００ フィルターフォルダー
２１０ チューブ
２２０ 蓋
２２１ 電圧印加部設置フォルダー
２２２ 細胞含有溶液挿入部
２３０ ヒト保存血
２４０ 血小板細胞
２５０ 生理食塩水
ＧＳ ガルバノスタット
ＰＳ ポテンショスタット
Ｗ 水

Claims (4)

1. フィルター基材と、
   前記フィルター基材の表面に被覆された細胞接着性可変部と、を備える細胞分離フィルターであって、
   前記フィルター基材は、金属メッシュであり、
   前記細胞接着性可変部は、ポリピロール、ポリピロール誘導体、ポリアニリン、ポリアニリン誘導体、ポリチオフェン及びポリチオフェン誘導体からなる群から選ばれる少なくとも一種の導電性高分子とコンドロイチン硫酸Ｃとが前記金属メッシュの表面に被覆され、かつ当該金属メッシュの孔は維持されており、外部から印加される電圧により分離対象物である細胞との接着性が可逆的に変化する、細胞分離フィルター。
2. 前記導電性高分子は、ポリチオフェン及びポリチオフェン誘導体からなる群から選ばれる少なくとも一種である、請求項１に記載の細胞分離フィルター。
3. フィルター基材と、
   前記フィルター基材の表面に被覆された細胞接着性可変部と、を備える細胞分離フィルターを用いた細胞分離方法であって、
   前記フィルター基材は、金属メッシュであり、
   前記細胞接着性可変部は、ポリピロール、ポリピロール誘導体、ポリアニリン、ポリアニリン誘導体、ポリチオフェン及びポリチオフェン誘導体からなる群から選ばれる少なくとも一種の導電性高分子とコンドロイチン硫酸Ｃとが前記金属メッシュの表面に被覆され、かつ当該金属メッシュの孔は維持されており、
   前記細胞接着性可変部に電圧を印加することにより分離対象物である細胞との接着性を可逆的に変化させる、細胞分離方法。
4. 前記細胞分離フィルターを用いて、血液又は血液製剤から、血小板あるいは白血球を分離する、請求項３に記載の細胞分離方法。

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