JP6349840B2

JP6349840B2 - 細胞培養システム及び細胞培養方法

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Publication number: JP6349840B2
Application number: JP2014062682A
Authority: JP
Inventors: 拓也樋口; 樋口　　拓也; 和正八巻
Original assignee: Dai Nippon Printing Co Ltd
Current assignee: Dai Nippon Printing Co Ltd
Priority date: 2014-03-25
Filing date: 2014-03-25
Publication date: 2018-07-04
Anticipated expiration: 2034-03-25
Also published as: JP2015181438A

Description

本発明は、細胞培養システム及び細胞培養方法に関する。

現在、細胞の培養及び増殖には、フラスコやシャーレ、又は閉鎖空間を持つ樹脂フィルムバッグや多段トレイ形状の容器が用いられている。例えば、（特許文献１）には、細胞増殖表面を画定する底部と、前記細胞増殖表面から上方に延在する少なくとも１つの壁部とをそれぞれが有する、複数のトレイを備えており、前記底部及び前記少なくとも１つの壁部は、前記細胞増殖表面と前記細胞増殖表面の上方に位置するヘッドスペースとを含むように構成された容積を画成し、前記少なくとも１つの壁部は、その上に追加のトレイを受けるように構成され、前記複数のトレイの高さ寸法に対する前記複数のトレイの個数の比率が、１２ｍｍ当たり約１トレイ以上である細胞培養デバイスが開示されている。このような多段トレイ形状の容器は、大きい細胞培養表面積を有し、複数のトレイにおいて同時に細胞を培養することによって大規模な細胞培養が可能である。

細胞が所定量になるまで培養されたか否かを確認するための従来の方法は、例えば、上記フラスコ等における細胞を顕微鏡等により光学的に観察することによって行われている。これに対し、培養された細胞をより定量的に、且つ効率的に確認するための新たな方法の開発が望まれていた。

特に、上述のような多段トレイ形状の容器を用いる場合には、次のような問題を生じていた。すなわち、多段トレイ形状の容器を用い、複数のトレイにおいて同時に細胞を培養する際に、細胞が所定量になるまで培養されたか否かを確認するための従来の方法は、多段状に積層したトレイのうちの最下段のトレイ内における細胞を、その最下段のトレイの下部方向から顕微鏡にて観察し、最下段のトレイでは細胞が所定量を超えていると判断された場合には、それ以外のトレイにおいても同様に細胞が所定量を超えているものと推定し、細胞培養の工程を終えて各トレイから培養した細胞を回収していた。この場合には、必要細胞数に達しないトレイが発生してしまう恐れがあった。

特表２０１３−５４０４４４号公報

そこで本発明は、上記従来の状況に鑑み、培養された細胞をより定量的に、且つ効率的に測定することが可能な細胞培養システムを提供することを目的とする。

また、多段に積層された複数の細胞培養容器を用いて細胞培養を行う場合に、必要細胞数に達しない細胞培養容器が発生してしまう事態を回避し、全ての細胞培養容器において所定量の培養細胞を得ることができる細胞培養システム及び細胞培養方法を提供することを目的とする。

本発明者らは、鋭意検討の結果、細胞及び培地を収容可能な細胞培養容器の内面に電極を設け、細胞培養容器内の細胞量に応じた量を電気信号として測定するとともに、複数の細胞培養容器を多段状に積層させる場合には、それぞれの細胞培養容器について測定された細胞量に応じた量を相互に比較できるように構成することによって上記課題が解決されることを見出し、発明を完成した。

すなわち、本発明は、以下の発明を包含する。
（１）細胞及び培地を収容可能であり、前記培地に接するように細胞測定電極及び参照電極を備え、内面に前記細胞測定電極及び前記参照電極の少なくとも一方が設けられた細胞培養容器と、
前記細胞測定電極及び前記参照電極の少なくとも一方に接続され、前記細胞培養容器内の細胞量に応じた量を測定可能な測定装置と、
を備える細胞培養システム。
（２）前記細胞培養容器内の細胞を観察するための顕微鏡装置をさらに備える上記（１）に記載の細胞培養システム。
（３）前記細胞培養容器が複数段積層されている上記（１）及び（２）に記載の細胞培養システム。
（４）細胞及び培地を収容可能であり、前記培地に接するように細胞測定電極及び参照電極を備え、内面に前記細胞測定電極及び前記参照電極の少なくとも一方が設けられた細胞培養容器を複数段積層させ、それぞれの前記細胞培養容器内に細胞及び培地を収容し、細胞培養を行う工程と、
前記細胞測定電極及び前記参照電極の少なくとも一方に接続された測定装置によって、それぞれの細胞培養容器における細胞量に応じた量を測定する工程と、
複数段積層した細胞培養容器のうち、最下層の細胞培養容器における細胞を顕微鏡装置により観察する工程と、
顕微鏡装置による観察の結果、最下層の細胞培養容器において所定量を超える細胞が確認されたときに、最下層の細胞培養容器における細胞量に応じた量と、最下層の細胞培養容器以外の細胞培養容器における細胞量に応じた量とを比較する工程と、
を有し、
最下層の細胞培養容器以外の細胞培養容器における細胞量に応じた量が、最下層の細胞培養容器における細胞量に応じた量よりも大きい場合に、細胞培養を完了してそれぞれの細胞培養容器から細胞を回収する細胞培養方法。
（５）前記細胞量に応じた量が、細胞呼吸により生ずる水素イオン量である上記（４）に記載の細胞培養方法。
（６）前記細胞量に応じた量が、細胞量に応じて変化するインピーダンスである上記（４）に記載の細胞培養方法。

本発明によれば、細胞培養容器内の細胞量を、電気信号によって定量的に、且つ効率的に測定することが可能である。

また、複数の細胞培養容器を多段状に積層させて細胞培養を行う場合には、それぞれの細胞培養容器を顕微鏡によって直接観察できない状態であっても、全ての細胞培養容器において所定量の細胞が得られているか否かを容易に確認することができる。

本発明に係る細胞培養システムの一実施形態を示す側面図である。本発明に係る細胞培養システムの一実施形態を示す上面図である。本発明に係る細胞培養システムの別の実施形態を示す側面図である。本発明に係る細胞培養システムのさらに別の実施形態を示す上面図である。各細胞増殖率における細胞電位（水素イオン量）の測定結果を示すグラフである。細胞増殖率０％の顕微鏡写真である。細胞増殖率３５％の細胞の顕微鏡写真である。細胞増殖率５０％の細胞の顕微鏡写真である。細胞増殖率７５％の細胞の顕微鏡写真である。細胞増殖率１００％の細胞の顕微鏡写真である。各細胞増殖率における電圧印加時間に対するインピーダンスの変化を示すグラフである。細胞増殖率に対するインピーダンスの変化を示すグラフである。

以下、本発明を詳細に説明する。
本発明に係る細胞培養システムの一実施形態について、図１及び図２に基づき説明する。本発明の細胞培養システムは、図１に示すように、細胞及び培地を収容可能であり、内面に電極１０が設けられた細胞培養容器１と、電極１０に接続され、細胞培養容器１内の細胞量に応じた量を測定可能な測定装置２とを備えている。

細胞培養容器１は、容器部３０を構成する壁部材が包囲する内部空間内に細胞及び培地を収容可能であり、通常は、容器部を構成する壁部材の一部は、内部空間と外部とを連絡し、細胞及び培地を導入及び排出するため通孔３１が開口されている。通孔３１は、着脱可能な蓋３２により閉栓することが可能であることが好ましい。通孔３１を備える容器部３０は、通孔３１の周縁から、内部空間から離れる方向に延びる首部３３をさらに備えることが好ましく、着脱可能な蓋３２が首部３３に着脱可能に装着されることが好ましい。

この実施形態において、電極１０は、平板状あるいはフィルム状の基材２０上に形成されている。そして、この電極１０及び基材２０の積層体が、容器部３０内に、電極１０が内部空間内に面した状態で設置され、積層体の端部が容器部３０の壁部材を貫通し、外部へ延出されている。外部に延出した電極１０の一部には端子（図示せず）が設けられ、測定装置２と接続されている。

なお、電極１０は、図１の実施形態には限定されず、例えば、基材２０を用いずに、電極を容器部３０の内面上に直接形成し、その電極に設けられた端子と測定装置２とを接続しても良い。

細胞培養容器の容器部３０及び蓋３２を形成する材料は特に限定されず、細胞培養において一般的に用いられる材料を用いることができる。例えば、ポリスチレン樹脂、ポリエステル樹脂、ポリエチレン樹脂、ポリエチレンテレフタレート樹脂、ポリプロピレン樹脂、ＡＢＳ樹脂、ポリアミド樹脂、アクリル樹脂、フッ素系樹脂、ポリカーボネート樹脂、ポリウレタン樹脂、メチルペンテン樹脂、フェノール樹脂、メラミン樹脂、エポキシ樹脂、塩化ビニル樹脂等の樹脂材料、及びガラスや石英等の無機材料であることができるが、好ましくは樹脂材料である。樹脂材料としては、ポリスチレン樹脂又はポリエチレンテレフタレート樹脂であることが好ましい。また、後述する顕微鏡装置により容器部３０内の細胞を観察する場合には、容器部３０の材料は透明であることが好ましい。

この実施形態において、電極１０は、図２の上面図に示すように、細胞測定電極１０ａ及び参照電極１０ｂが、基材２０上に離間して設けられている。ここで、細胞測定電極１０ａ及び参照電極１０ｂの形状は、図２の例に限定されるものではなく、例えば、参照電極１０ｂの領域を細胞測定電極１０ａの領域よりも小さくして基材２０の周縁部に設けたり、細胞測定電極１０ａ及び参照電極１０ｂのそれぞれを複数の領域に分割して設けることができる。具体例として、図４に細胞測定電極１０ａ及び参照電極１０ｂの別の実施形態を示す。この例では、基材２０の中央に細胞測定電極１０ａを形成し、その両端に、帯状に露出した基材２０を介して参照電極１０ｂが設けられている。

なお、図２及び図４では、細胞測定電極１０ａ及び参照電極１０ｂの両方が測定装置２に接続されているが、これに限定されるものではなく、細胞測定電極及び参照電極のいずれか一方を測定装置２に接続する構成もあり得る。例えば、参照電極をＧＮＤ（グラウンド）とし、細胞測定電極のみを測定装置２に接続することができる。

また、図２及び図４の実施形態には限定されず、細胞測定電極及び参照電極のいずれか一方のみを、容器部３０の内面に形成しても良い。すなわち、細胞測定電極及び参照電極は、収容される培地と接するように設けられることを要するが、例えば、細胞測定電極及び参照電極の一方（例えば、参照電極）を、容器部３０あるいは基材２０の上方の空間であって、収容される培地に浸るような位置に固定し、他方の電極（例えば、細胞測定電極）のみを容器部３０の内面上に必要に応じて基材２０を介在させて設けることもできる。

図１及び図２の実施形態において、基材２０としては、表面に細胞測定電極１０ａ及び参照電極１０ｂを形成可能な材料からなるものであれば特に制限されない。具体的には、ガラス、石英ガラス、ホウケイ酸ガラス、アルミナ、サファイア、セラミクス、フォルステライト、感光性ガラス、シリコン、エラストマー、プラスチック（例えば、ポリエステル樹脂、ポリエチレン樹脂、ポリプロピレン樹脂、ポリウレタン樹脂、メチルペンテン樹脂、フェノール樹脂、メラミン樹脂、エポキシ樹脂、塩化ビニル樹脂）で代表される有機材料を挙げることができる。その形状も限定されず、例えば、平板、平膜、フィルム、多孔質膜等の平坦な形状、シリンダ、スタンプ、マルチウェルプレート、マイクロ流路等の立体的な形状、並びに表面に凹凸が形成された形状が挙げられる。フィルムを使用する場合、その厚さは特に制限されないが、通常０．１μｍ〜１ｍｍ、好ましくは１μｍ〜５００μｍである。

基材２０上に細胞測定電極１０ａ及び参照電極１０ｂを形成する場合、公知のパターニング技術を利用できる。公知のパターニング技術としては、例えば、グラビア印刷法、スクリーン印刷法、オフセット印刷法、フレキソ印刷法及びコンタクトプリンティング法等の各種印刷法による方法、各種リソグラフィー法を用いる方法、並びにインクジェット法による方法、他に微細な溝を彫刻等する立体整形の手法等が挙げられる。具体的には、絶縁性材料からなる基材、例えばガラス基材に、導電性材料、例えば金属膜又は金属酸化物膜を成膜し、これをフォトリソグラフィー技術等の公知の技術を用いてパターニングすることにより、細胞測定電極１０ａと参照電極１０ｂを形成することができる。

基材２０上への導電性材料の成膜は、公知の方法で行うことができる。例えば、マイクロ波プラズマＣＶＤ（Chemical Vapor Deposit）法、ＥＣＲＣＶＤ（Electric Cyclotron Resonance Chemical Vapor Deposit）法、ＩＣＰ（Inductive Coupled Plasma）法、直流スパッタリング法、ＥＣＲ（Electric Cyclotron Resonance）、スパッタリング法、イオン化蒸着法、アーク式蒸着法、レーザー蒸着法、ＥＢ（Electron Beam）蒸着法、抵抗加熱蒸着法等が挙げられる。成膜は、塗布により実施しても良い。スピンコートや各種の印刷方式も使用することができる。

細胞測定電極１０ａ及び参照電極１０ｂを構成する導電性材料の膜として、金属膜又は金属酸化物膜、金属微粒子や金属ナノファイバーが絶縁体に分散された膜、導電性の有機材料からなる膜等が挙げられる。金属酸化物としては、ＩＴＯ（酸化インジウム錫）、ＩＺＯ（酸化インジウム亜鉛）等が挙げられ、金属微粒子としては、銀、金、銅等の微粒子、金属ナノファイバーとしてはカーボンナノチューブ、導電性の有機材料としては、ポリエチレンジオキシチオフェン（ＰＥＤＯＴ）等が挙げられる。

導電性の膜としては特に制限されないが、後述する顕微鏡装置により細胞を観察する場合は透明な膜であることが好ましく、具体的には、ＩＴＯ膜、ＩＺＯ膜、導電性高分子であるポリエチレンジオキシチオフェン膜等が挙げられる。例えば、ＩＴＯ膜をスパッタリング法により成膜して、その後パターニングすることにより、細胞測定電極１０ａ及び参照電極１０ｂを形成することが好ましい。

導電性材料の膜の厚さは、通常、単分子膜〜１００μｍ程度であり、好ましくは２ｎｍ〜１μｍ、より好ましくは５ｎｍ〜５００ｎｍである。

そして、この実施形態においては、図１に示すように、さらに顕微鏡装置３を備えている。顕微鏡装置３は、容器部３０の下方から、容器部３０内で培養されている細胞を観察できるように設置されている。顕微鏡装置３の構成は、細胞を観察して必要な細胞数が培養されたか否かを判定できるものであれば良く、特に限定されるものではない。対物レンズ等のレンズ、撮像素子等を適宜備える光学顕微鏡や、各種の電子顕微鏡等を用いることができる。

また、必要に応じて、細胞測定電極１０ａ及び参照電極１０ｂの表面には、培養する細胞の種類（血球系細胞やリンパ系細胞等の浮遊細胞であるか、その他の接着性細胞であるか）等に応じて、細胞が接着するような処理、あるいは細胞の接着を阻害するような処理を施すことができる。通常、このような処理は、細胞測定電極１０ａ及び参照電極１０ｂの表面に、細胞接着性の材料又は細胞接着阻害性の材料を塗布し、層を形成することにより行われる。

細胞接着性の材料として、ポリリシン、ポリエチレンイミン、コラーゲン及びゼラチン等の細胞の接着や増殖が良好に行われる材料や、細胞の接着及び増殖が良好に行われる化学物質、いわゆる細胞接着因子を塗布することができる。また、細胞接着阻害性の材料としては、親水性ポリマーが挙げられる。親水性ポリマーは、炭素成分を含み、ポリマーの主鎖もしくは側鎖に親水性の官能基を含むポリマーのことを指す。親水性ポリマーは、水溶性や水膨潤性を有する、炭素酸素結合を含む水溶性ポリマーであることが好ましい。また、細胞培養に使用する観点から、生体毒性の低いものを採用することが好ましい。親水性ポリマーの具体例として、ポリアルキレングリコール、ポリビニルピロリドン等を挙げることができる。

また、細胞測定電極１０ａ及び参照電極１０ｂの表面には、所定の刺激によって表面の細胞の接着度合いが変化する、すなわち細胞接着性から細胞接着阻害性へと変化することが可能な刺激応答性ポリマーを含む層を形成しても良い。このような刺激応答性ポリマーを含む層は、例えば特開２０１３−２４７９２６号公報に記載されるように、細胞を所定の段階まで接着させて培養し、その後に刺激を加えて細胞を剥離し、浮遊培養を行う技術等において用いることができる。刺激応答性ポリマーとしては、温度応答性ポリマー、ｐＨ応答性ポリマー、イオン応答性ポリマー、光応答性ポリマー等を挙げることができる。特に、刺激の付与が容易であることから温度応答性ポリマーが好ましく用いられる。

温度応答性ポリマーとして、例えば、細胞を培養する温度では細胞接着性を示し、細胞を剥離する時の温度では細胞接着阻害性を示すものを用いると良い。例えば、臨界溶解温度未満の温度では周囲の水に対する親和性が向上し、ポリマーが水を取り込んで膨潤して表面に細胞を接着しにくくする性質（細胞接着阻害性）を示し、同温度以上の温度ではポリマーから水が脱離することでポリマーが収縮して表面に細胞を接着しやすくする性質（細胞接着性）を示すものを用いると良い。このような臨界溶解温度は、下限臨界溶解温度と呼ばれる。下限臨界溶解温度Ｔが０℃〜８０℃、さらに好ましくは０℃〜５０℃である温度応答性ポリマーを用いると良い。そのような温度応答性ポリマーとして、ポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミド（Ｔ＝３２℃）等のアクリル系ポリマーや、ポリ−Ｎ−ｎ−プロピルメタクリルアミド（Ｔ＝３２℃）等のメタクリル系ポリマーを挙げることができる。

次に、図１及び図２に示す細胞培養システムを用いて、細胞培養を行う方法について説明する。

本発明において培養する細胞は特に制限されず、接着培養又は浮遊培養に適した種々の細胞を培養することができる。細胞の具体例としては、例えば、ヒト又はヒト以外の動物（サル、ブタ、イヌ、ラット、マウス等）の任意の臓器又は組織（肝臓、膵臓、心臓、軟骨、骨、脂肪、腎臓、神経、皮膚、骨髄、胚等）に由来する初代細胞、樹立された株化細胞、又はこれらに遺伝子操作等を施した細胞を用いることができる。より具体的には、例えば、ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞、神経幹細胞、間葉系幹細胞、組織幹細胞（体性幹細胞）、造血系幹細胞、癌幹細胞その他の未分化な幹細胞又は前駆細胞を用いることができる。また、例えば、肝臓系細胞や膵臓系細胞等の消化器系臓器由来の細胞、腎臓系細胞、神経系細胞、心筋細胞等の循環器系臓器由来の細胞、脂肪細胞、皮膚真皮等の結合組織由来の線維芽細胞、皮膚表皮等の上皮系組織由来の上皮細胞、骨系細胞、軟骨系細胞、網膜等の眼組織由来の細胞、血管系細胞、血球系細胞、生殖系細胞等の分化した細胞を用いることもできる。また、癌化した細胞を用いることもできる。このような細胞としては、１種類の細胞を単独で用いることができ、又は２種類以上の細胞を任意の比率で混在させて用いることもできる。

目的の細胞を含む培養試料は、予め、生体組織を細かくして液体中に分散させる分散処理や、生体組織中の目的の細胞以外の細胞その他細胞破片等の不純物質を除去する分離処理等を行っておくことが好ましい。

また、細胞の種類によっては、目的とする細胞を含む培養試料を、予め、各種の培養方法で予備培養して、目的とする細胞を増やすことが好ましい。予備培養には、単層培養、コートディシュ培養、ゲル上培養等の通常の培養方法を採用することができる。予備培養において、細胞を支持体表面に接着させて培養する方法の一つに、いわゆる単層培養法として既に知られている手段がある。具体的には、例えば、培養容器に培養試料と培養液を収容して一定の環境条件に維持しておくことにより、特定の生細胞のみが、培養容器等の支持体表面に接着した状態で増殖する。予備培養後に、培養容器中の培養液を除去することで、培養試料中の支持体表面に接着しない塊状や線維状の不純物等の不要成分が除去され、支持体表面に接着した生細胞のみを回収することができる。

上記のように、必要に応じて予備培養した細胞を、培地とともに細胞培養容器１中に収容し、所定の条件下で培養を行う。細胞は、細胞の種類によって、電極１０又はその上に設けられる細胞接着性層上に接着して培養されるか、あるいは浮遊培養される。細胞を培養する時間は、培養時の細胞操作の有無等に左右されるが、通常６〜９６時間、好ましくは１２〜７２時間である。培養する温度は、通常３７℃である。場合により、５％程度のＣＯ_２濃度雰囲気下で培養することが好ましい。

細胞培養に用いる培地としては、当技術分野で通常用いられる細胞培養用培地であれば特に制限なく用いることができる。例えば、用いる細胞の種類に応じて、ＭＥＭ培地、ＢＭＥ培地、ＤＭＥ培地、αＭＥＭ培地、ＩＭＤＭ培地、ＥＳ培地、ＤＭ−１６０培地、Ｆｉｓｈｅｒ培地、Ｆ１２培地、ＷＥ培地及びＲＰＭＩ１６４０培地等、朝倉書店発行「日本組織培養学会編組織培養の技術第三版」５８１頁に記載されているような基礎培地を用いることができる。さらに、基礎培地に血清（ウシ胎児血清等）、各種増殖因子、抗生物質、アミノ酸等を加えても良い。また、Ｇｉｂｃｏ無血清培地（インビトロジェン社）等の市販の無血清培地等も用いることができる。

そして、本発明の細胞培養方法においては、電極１０に接続された測定装置２により、細胞培養容器１内の細胞量に応じた量を、逐次に、あるいはリアルタイムに測定しモニタリングすることができる。細胞量に応じた量とは、増殖する細胞の量に応じて変化する電気生理学的な量であれば良い。細胞量に応じた量の具体例として、細胞が呼吸等に伴って取り込みあるいは放出する水素、ナトリウム、カルシウム、カリウム等のイオン電荷量や、細胞量に応じて変化するインピーダンス等を挙げることができる。

特に、細胞呼吸により生ずる水素イオン量を測定することが好ましい。細胞が呼吸することによりＣＯ_２を吐き出し、そのＣＯ_２とＨ_２Ｏとが反応してＨＣＯ_３ ⁻及びＨ^＋が生成される。この水素イオンに起因して、細胞測定電極１０ａ及び参照電極１０ｂと測定装置２との間に電流が流れる。この電流値を測定することにより、細胞培養容器内の細胞量を、定量的に、且つ効率的に測定することが可能となる。

あるいは、電極１０上に細胞が存在すると、電極と培地の境界面の局所的なイオン環境が変化し、インピーダンスが増加する。より多くの細胞が電極１０上に存在することにより、インピーダンスはさらに増加するため、このインピーダンスを測定装置２によって測定することにより、細胞量をモニタリングすることが可能となる。

上記のような各種の細胞量に応じた量を測定するため、測定装置２は、必要に応じて、バッファ、増幅器、Ａ／Ｄコンバータ、インピーダンス測定部等を適宜備えることができる。

また、測定装置２によって細胞量に応じた量を測定すると同時に、顕微鏡装置３によって、培養した細胞を観察することができる。観察によって得られた像は、その像が得られた時間に測定された細胞量に応じた量と相互に比較することにより、培養によって増殖した細胞の実際の数と電極１０を介して測定された細胞量に応じた量との相関を得ることができる。これにより、細胞数が一定量になるまで培養が行われたか否かを判定することができる。なお、測定装置２には、必要に応じて、顕微鏡装置３により得られた像を画像処理して細胞数を計測する手段と、それによって計測された細胞数と電極１０を介して測定された細胞量に応じた量とを相互に比較して培養が一定量完了したか否かを自動的に判別する手段とを適宜設けることができる。

培養した細胞は、細胞の種類に応じて適宜方法により回収される。具体的には、接着培養の場合にはＥＤＴＡ−トリプシン処理等の手段を用いて電極１０あるいは細胞接着性層上に接着した細胞を剥離し、その後にろ過・遠心分離を行って回収することができる。浮遊培養の場合は培地から細胞をろ過・遠心分離することにより回収することができる。

次に、図３に基づき、本発明の細胞培養システムの別の実施形態について説明する。この細胞培養システムは、図１示すような細胞培養容器、すなわち、細胞及び培地を収容可能であり、その培地に接するように細胞測定電極及び参照電極を備え、内面に細胞測定電極及び参照電極の少なくとも一方（図１の細胞培養容器においては両方）が設けられた細胞培養容器１Ａ〜１Ｄが複数段（図３の例では４段）積層されている。そして、電極１０（細胞測定電極及び参照電極）に接続され、細胞培養容器１Ａ〜１Ｄ内の細胞量に応じた量を測定可能な測定装置２と、細胞培養容器、特に積層されたうちの最下層に位置する細胞培養容器１Ｄ内の細胞を観察するための顕微鏡装置３とを備えている。

図３に示す細胞培養システムにより、次のようにして細胞培養を行うことができる。まず、それぞれの細胞培養容器内に細胞及び培地を収容し、細胞培養を行う。そして、細胞培養の過程において逐次、あるいは連続的に、細胞測定電極及び参照電極に接続された測定装置２によって、それぞれの細胞培養容器における細胞量に応じた量を測定する。細胞培養容器１Ａ〜１Ｄの構成や細胞培養の条件、細胞量に応じた量の具体例等に関しては図１に示す実施形態と同様である。

そして、複数段積層した細胞培養容器１Ａ〜１Ｄのうち、最下層の細胞培養容器１Ｄにおける細胞を顕微鏡装置３により観察し像を得る。顕微鏡装置３による観察の結果、最下層の細胞培養容器１Ｄにおいて所定量を超える細胞が確認されたときに、最下層の細胞培養容器１Ｄにおける細胞量に応じた量と、最下層の細胞培養容器１Ｄ以外の細胞培養容器１Ａ〜１Ｃにおける細胞量に応じた量とを比較する。なお、測定装置２による細胞量に応じた量の測定は、細胞培養の過程において逐次あるいは連続的に測定するのではなく、上記のように顕微鏡装置３によって最下層の細胞培養容器１Ｄにおいて所定量を超える細胞が確認された後に初めて測定を開始しても良い。

最下層の細胞培養容器１Ｄ以外の細胞培養容器１Ａ〜１Ｃにおける細胞量に応じた量が、最下層の細胞培養容器１Ｄにおける細胞量に応じた量よりも大きい場合に、細胞培養を完了して、それぞれの細胞培養容器１Ａ〜１Ｄから上述の方法により細胞を回収する。

上記の細胞培養方法によれば、測定装置２により、細胞培養容器１Ａ〜１Ｃにおける細胞量に応じた量が、最下層の細胞培養容器１Ｄにおける細胞量に応じた量よりも大きいことを確認しているため、培養により得られた細胞培養容器１Ａ〜１Ｃにおける細胞数は、少なくとも細胞培養容器１Ｄよりは多いことが分かる。そのため、細胞培養容器１Ａ〜１Ｃが顕微鏡装置により観察できないことに起因する、必要細胞数に達しない細胞培養容器が発生してしまう事態が回避され、全ての細胞培養容器１Ａ〜１Ｄにおいて所定量の細胞が得られているか否かを容易に判別することができる。

なお、本発明は、上記の各実施形態に限定されるものではない。特許請求の範囲に記載した発明の範囲内で、各構成要素の置換、組み合わせ、省略が可能である。

以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
（実施例１）細胞電位（水素イオン量測定）
シャーレ状の細胞培養容器の底面に、細胞測定電極としてＩＴＯ電極を設置し、細胞培養容器内を培地で満たした上で、細胞測定電極上で細胞を培養した。参照電極として白金電極を用い、細胞測定電極の上方に、培地に浸るように設置した。そして、参照電極をＧＮＤとし、細胞測定電極に電圧測定装置（入力インピーダンス無限大）を接続し、６０秒間、細胞測定電極における電位を測定した。

上記の測定は、細胞測定電極の面全体を細胞が覆っている状態を細胞増殖率１００％として、細胞増殖率０％、３５％、５０％、７５％及び１００％の各状態において行った。なお、これらの各細胞増殖率の状態は、まず細胞増殖率１００％の状態になるまで細胞培養を行い、電位を測定した後、その状態から順次、ポリスチレンフィルムによって細胞測定電極上の細胞を一定量削り取ることによって得た（例えば、細胞増殖率７５％の状態は、２５％の細胞を削り取ることによって得ることができる）。細胞増殖率０％は、細胞培養を行わず、培地のみの状態で測定した。

測定の結果を図５に示す。この実施例においては、培養された細胞が呼吸することによってＣＯ_２を吐き出す。これにより、化学式：ＣＯ_２＋Ｈ_２Ｏ→ＨＣＯ_３ ⁻＋Ｈ^＋に表されるように細胞近傍に水素イオンＨ^＋を生ずる。すると、細胞が絶縁層となり、ＩＴＯ電極にはＨ^＋に引き寄せられてＨ^＋量に応じた量の電子が集まるので、測定される電位はマイナスの値となる。測定の結果、図５に示すように、細胞増殖率に応じて、細胞電位（Ｖ）が変化することが確認された。これにより、細胞呼吸により生ずる水素イオン量を測定することで、培養された細胞量を把握することが可能である。また、図５における細胞増殖率３５％の１回目及び２回目の結果から明らかなように、同じ細胞増殖率であれば測定される電位にほとんど誤差は観測されず、測定結果の高い信頼性が証明された。

（実施例２）インピーダンス測定及び顕微鏡観察
シャーレ状の細胞培養容器の底面に、細胞測定電極として３５ｍｍ×４５ｍｍのＩＴＯ電極（厚さ１５０ｎｍ）、及び参照電極として１５ｍｍ×４５ｍｍのＩＴＯ電極（厚さ１５０ｎｍ）を設け、細胞培養容器内を培地で満たした上で、細胞測定電極上で細胞を培養した。そして、細胞測定電極及び参照電極の間に、２Ｖの直流電圧を６０秒間印加し、電圧印加時の電流値を測定し、Ｒ＝Ｖ／Ｉにより直流インピーダンスの値を算出した。培養した細胞が絶縁層となって電極を覆うため、細胞が多いほどインピーダンスの値は高くなる。

上記の測定は、細胞測定電極の面全体を細胞が覆っている状態を細胞増殖率１００％として、細胞増殖率０％、３５％、５０％、７５％及び１００％の各状態において行った。なお、これらの各細胞増殖率の状態は、細胞測定電極上に予め所定の被覆率になるように細胞接着阻害性の材料であるポリエチレングリコール（ＰＥＧ）膜を縞状に設け、細胞が増殖できる領域をＰＥＧ膜が存在する領域以外の領域に制限することによって達成した。例えば、細胞増殖率７５％の状態は、細胞測定電極の面の２５％に相当する面積にＰＥＧ膜を設けた上で細胞培養を行うことにより得ることができる。細胞増殖率０％は、細胞培養を行わず、培地のみの状態で測定したものである。細胞増殖率１００％は、ＰＥＧ膜を設けずに細胞測定電極上の全面で細胞培養を行うことにより得ることができる。図６〜図１０に、細胞増殖率０％、３５％、５０％、７５％及び１００％における細胞の顕微鏡写真を示す。

インピーダンス測定の結果を図１１に示す。測定の結果、図１１に示すように、細胞増殖率に応じて、インピーダンス（Ω）が変化することが確認された。図１２は、電圧印加時間が５５秒でのインピーダンスを各細胞増殖率で比較したグラフである。図１２に示すように、細胞増殖率の増加に伴ってインピーダンスは高くなっており、このインピーダンスの上昇は、図６〜図１０に示す細胞の増殖状態と良い相関を示す。これにより、インピーダンスを測定することで、培養された細胞量を把握することが可能である。

１細胞培養容器
１Ａ〜１Ｄ細胞培養容器
２測定装置
３顕微鏡装置
１０電極
１０ａ細胞測定電極
１０ｂ参照電極
２０基材
３０容器部
３１通孔
３２蓋
３３首部

Claims

細胞及び培地を収容可能であり、前記培地に接するように細胞測定電極及び参照電極を備え、内面に前記細胞測定電極及び前記参照電極の少なくとも一方が設けられた細胞培養容器が複数段積層され、
前記細胞測定電極及び前記参照電極の少なくとも一方に接続され、前記細胞培養容器内の細胞量に応じた量を測定可能な測定装置と、
複数段積層された前記細胞培養容器のうち、最下層の細胞培養容器内の細胞を観察するための顕微鏡装置と、
を備える細胞培養システム。
前記細胞量に応じた量が、細胞呼吸により生ずる水素イオン量である請求項１に記載の細胞培養システム。
前記細胞量に応じた量が、細胞量に応じて変化するインピーダンスである請求項１に記載の細胞培養システム。
細胞及び培地を収容可能であり、前記培地に接するように細胞測定電極及び参照電極を備え、内面に前記細胞測定電極及び前記参照電極の少なくとも一方が設けられた細胞培養容器を複数段積層させ、それぞれの前記細胞培養容器内に細胞及び培地を収容し、細胞培養を行う工程と、
前記細胞測定電極及び前記参照電極の少なくとも一方に接続された測定装置によって、それぞれの細胞培養容器における細胞量に応じた量を測定する工程と、
複数段積層した細胞培養容器のうち、最下層の細胞培養容器における細胞を顕微鏡装置により観察する工程と、
顕微鏡装置による観察の結果、最下層の細胞培養容器において所定量を超える細胞が確認されたときに、最下層の細胞培養容器における細胞量に応じた量と、最下層の細胞培養容器以外の細胞培養容器における細胞量に応じた量とを比較する工程と、
を有し、
最下層の細胞培養容器以外の細胞培養容器における細胞量に応じた量が、最下層の細胞培養容器における細胞量に応じた量よりも大きい場合に、細胞培養を完了してそれぞれの細胞培養容器から細胞を回収する細胞培養方法。
前記細胞量に応じた量が、細胞呼吸により生ずる水素イオン量である請求項４に記載の細胞培養方法。
前記細胞量に応じた量が、細胞量に応じて変化するインピーダンスである請求項４に記載の細胞培養方法。