WO2023243602A1 - 細胞パターニング方法および細胞パターニング装置 - Google Patents

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WO2023243602A1
WO2023243602A1 PCT/JP2023/021738 JP2023021738W WO2023243602A1 WO 2023243602 A1 WO2023243602 A1 WO 2023243602A1 JP 2023021738 W JP2023021738 W JP 2023021738W WO 2023243602 A1 WO2023243602 A1 WO 2023243602A1
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WO
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region
cells
cell
cell culture
culture substrate
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Application number
PCT/JP2023/021738
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English (en)
French (fr)
Inventor
昌平 山村
秀貴 上野
元 重藤
Original Assignee
国立研究開発法人産業技術総合研究所
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Publication date
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M1/00—Apparatus for enzymology or microbiology
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor

Definitions

  • the present invention relates to a cell patterning method and a cell patterning device.
  • cell tissue consisting of a cell population containing a certain number of cells, and to precisely control the size of the cell tissue.
  • a method for controlling cell organization a method called cell patterning is known in which the cell adhesion area is controlled by dividing the surface of a base material to which cells adhere into areas to which cells adhere and areas to which cells do not adhere.
  • a technique in which a microstructured MPC polymer film is molded by pouring an ethanol solution of 2-methacryloyloxyethyl phosphorylcholine (MPC) polymer into a polydimethylsiloxane (PDMS) micromold formed on a silicon wafer to form a desired pattern. is known (for example, see Non-Patent Document 1).
  • the part covered with MPC polymer is a part where cells do not adhere, and the part not covered with MPC polymer is a part where cells adhere, so cell patterning is done in which the parts to which cells adhere and the parts to which cells do not adhere are separated.
  • a microdevice for this purpose is fabricated.
  • the surface of the cell culture substrate may be coated with cell adsorption/growth factors such as Extracellular Matrix (ECM) (eg, collagen or fibronectin).
  • ECM Extracellular Matrix
  • the MPC polymer is used to form a pattern that separates areas where cells adhere and areas where they do not, coating agents such as ECM for cell adsorption and proliferation are used. It is difficult to use them together.
  • the present invention has been made in view of the above-mentioned circumstances, and its purpose is to provide a cell patterning method and a cell patterning device that can perform good cell patterning according to various types of cells. be.
  • the present invention is a method for patterning cells, comprising: A step of attaching cells to one side of a cell culture substrate having a first region that blocks ultraviolet rays and a second region that transmits ultraviolet rays; irradiating ultraviolet rays from a surface of the cell culture substrate opposite to the surface to which the cells are attached,
  • the present invention relates to a cell patterning method, in which cells on the second region among cells attached to the cell culture substrate are removed by the step of irradiating the ultraviolet rays.
  • the present invention is a cell patterning device, comprising: a cell culture substrate having a first region that blocks ultraviolet rays and a second region that transmits ultraviolet rays; and an ultraviolet irradiation device capable of irradiating the cell culture substrate with ultraviolet rays,
  • the present invention relates to a cell patterning device that removes cells on the second region among cells attached to the cell culture substrate by irradiating the ultraviolet rays with the ultraviolet irradiation device.
  • the present invention is a method for producing a patterned cell population, comprising: A step of attaching cells to one side of a cell culture substrate having a first region that blocks ultraviolet rays and a second region that transmits ultraviolet rays; and culturing the attached cells,
  • the present invention relates to a method comprising, in the culturing step, irradiating the cells with ultraviolet rays from a surface of the cell culture substrate opposite to the surface to which the cells are attached.
  • a cell patterning method and a cell patterning device which can control the proliferation of cells and easily pattern the shape and size of a cell tissue consisting of a cell population obtained by the proliferation, and a patterned cell patterning method and a cell patterning device.
  • a method for producing a cell population can be provided.
  • FIGS. 1A and 1B are a top view and a cross-sectional view schematically showing the structure of a cell culture substrate used in a cell patterning method according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 2 is a diagram showing a schematic configuration of a cell patterning device according to an embodiment.
  • FIGS. 3(a) to 3(d) are diagrams illustrating the flow of a cell patterning method according to one embodiment.
  • FIG. 4 is a graph showing the relationship between the wavelength of irradiation light and the transmittance for various materials.
  • Figure 5 shows the cell culture substrate immediately after seeding cells on the cell culture substrate without a second layer (a) and 4 days after culturing with the cumulative exposure amount of ultraviolet rays at 0 mJ/cm 2 (b).
  • FIG. 6 shows the results immediately after seeding cells on the cell culture substrate provided with the second layer containing Poly-D-Lysine (a), and 4 days after culturing with the cumulative exposure amount of ultraviolet rays at 0 mJ/ cm2 (a). It is a fluorescence image of the base material of b).
  • Figure 7 shows the cell culture substrate immediately after seeding cells on the cell culture substrate without a second layer (a), and 4 days after culturing at an integrated exposure dose of ultraviolet rays of 1038 mJ/ cm2 (b). This is a fluorescence image.
  • Figure 8 shows cells immediately after seeding on a cell culture substrate provided with a second layer containing collagen (a) and 4 days after culturing at an integrated exposure dose of ultraviolet rays of 1038 mJ/ cm2 (b). This is a fluorescent image of the culture substrate.
  • FIG. 9 is a fluorescence image of the substrate on the fourth day after culture when the cell patterning method was performed by changing the diameter X of the first region, which is the cell proliferation area.
  • FIG. 10 shows the results of evaluating the cell proliferation rate in the first region and the number of cells bonded to the second region when no ultraviolet rays were irradiated.
  • FIG. 11 shows the results of evaluating the cell proliferation rate in the first region and the number of cells bonded to the second region when the cumulative exposure amount of ultraviolet rays was 519 mJ/cm 2 .
  • FIG. 12 shows the results of evaluating the cell proliferation rate in the first region and the number of cells bonded to the second region when the cumulative exposure amount of ultraviolet rays was 1038 mJ/cm 2 .
  • FIG. 13 is a diagram illustrating the design of a cell culture substrate having a honeycomb-shaped cell growth area in which a first region is a regular hexagon and a plurality of regular hexagons are connected with the second region as a boundary.
  • FIG. 14 is an image of a cell culture substrate actually manufactured based on the design drawing of FIG.
  • FIG. 13 showing a honeycomb-shaped cell proliferation area (a) and an enlarged image of region Z in (a) (b) shows.
  • Figure 15 shows the image immediately after seeding cells on the cell culture substrate having the honeycomb-shaped cell growth area shown in Figure 14 (a), and the second day after culturing with the cumulative exposure amount of ultraviolet rays at 0 mJ/ cm2 (b). This is a fluorescence image of the base material.
  • Figure 16 shows fluorescence images of the substrate immediately after seeding cells on the same cell culture substrate as in Figure 15 (a), and on the second day after culturing (b) with an integrated exposure dose of ultraviolet rays of 2076 mJ/ cm2 . be.
  • FIG. 17 shows that cells are seeded on a cell culture substrate having a single hexagonal cell growth area, in which only one regular hexagonal first region is provided and a third region is provided around the second region.
  • These are fluorescence images of the substrate immediately after culturing (a) and on the second day after culturing (b) with an integrated exposure amount of ultraviolet rays of 0 mJ/cm 2 .
  • Figure 18 shows fluorescence images of the substrate immediately after seeding cells on the same cell culture substrate as in Figure 17 (a) and on the second day after culturing at an integrated ultraviolet exposure dose of 2076 mJ/ cm2 (b). be.
  • FIG. 19 shows the cell proliferation rate in the first region and the cell growth rate in the second region when the design value A of the circumscribed circle diameter of the first region is 750 ⁇ m in the same cell culture substrate as in FIG. 14. These are the results of evaluating the number of bonds, and are fluorescence images of the base materials at cumulative exposure amounts of ultraviolet rays of 0 mJ/cm 2 (a), 1038 mJ/cm 2 (b), and 2076 mJ/cm 2 (c).
  • FIG. 20 shows the cell proliferation rate in the first region and the cell growth rate in the second region when the design value A of the circumscribed circle diameter of the first region is 750 ⁇ m in the same cell culture substrate as in FIG. 17.
  • FIG. 21 shows the cell proliferation rate in the first region and the cell growth rate in the second region when the design value A of the circumscribed circle diameter of the first region is 450 ⁇ m in the same cell culture substrate as in FIG. 14.
  • FIG. 22 shows the cell proliferation rate in the first region and the cell growth rate in the second region when the design value A of the circumscribed circle diameter of the first region is 450 ⁇ m in the same cell culture substrate as in FIG. 17.
  • a cell patterning method and a cell patterning device use a cell culture substrate in which the surface of the substrate to which cells adhere is divided into a portion to which cells adhere and a portion to which cells do not adhere. It performs cell patterning to control area. Control of the cell adhesion area is achieved by forming an ultraviolet-shielding thin film on the base material and locally irradiating it with ultraviolet rays.
  • cells are attached to a cell culture substrate that has an ultraviolet shielding area that blocks ultraviolet rays and an ultraviolet transmitting area that transmits ultraviolet rays, and the cell culture substrate is irradiated with ultraviolet rays. It is configured to perform cell patterning by removing cells in the ultraviolet ray transmitting region from among the cells attached to the base material.
  • FIG. 1(a) is a top view schematically showing the structure of a cell culture substrate according to one embodiment
  • FIG. 1(b) is a sectional view taken along line AA in FIG. 1(a).
  • the cell culture substrate 1 has a first region 11 that is an ultraviolet shielding region that blocks ultraviolet rays, and a second region 11 that is an ultraviolet transmitting region that transmits ultraviolet rays. 12, and is configured to enable local irradiation of ultraviolet rays to cells attached to the cell culture substrate 1 without precise positioning.
  • the cell culture substrate 1 may further include a third region 13 that is an ultraviolet shielding region.
  • a shape formed by a combination of one first region 11 (and optionally third region 13) and second region 12 is also referred to as a pattern.
  • the first region 11 is a cell proliferation area for forming a cell colony, and is formed, for example, in a circular shape with a diameter of X.
  • the shape of the first region 11 is not limited to this, and may be a polygon including a regular polygon such as a regular hexagon.
  • the shape and size of the first region 11 can be appropriately determined by those skilled in the art so as to correspond to the desired shape and size of the cell colony after formation.
  • the lower limit of the diameter X is not particularly limited, and can be determined as appropriate depending on the number of cells to be proliferated. For example, one cell may be placed in the first region 11, and the diameter X in this case may be approximately 10 ⁇ m.
  • the thickness may be, for example, about 50 ⁇ m or more, 100 ⁇ m or more, and preferably about 150 ⁇ m or more.
  • the upper limit of the diameter X is not particularly limited, but may be approximately 1000 ⁇ m, for example.
  • the size of the first region 11 can be determined so that the first region 11 has an area about the same as these.
  • the shape of the first region is a regular polygon
  • the diameter of the circumscribed circle of the regular polygon can be set to the above value.
  • the second region 12 is an area that touches the outer periphery of the first region 11 and defines the boundary of the first region 11.
  • the second region 12 is formed, for example, in an annular shape with a width Y in accordance with the shape of the first region 11.
  • the third region 13 is optionally provided in an area outside the second region 12, and can be a region that can be replaced with the first region 11.
  • the width Y is not limited to a specific width as long as the cells cultured in the first region 11 and the cells cultured in the area outside the second region 12 do not come into contact with each other.
  • the width Y is preferably a width that allows ultraviolet rays to pass through, and can be larger than the wavelength of the ultraviolet rays to be irradiated.
  • the lower limit of the width Y may be about 300 nm.
  • the upper limit of the width Y is not particularly limited in theory.
  • first region 11 that is, one cell proliferation area is shown in FIG. 1(a)
  • the number of cell proliferation areas provided in the cell culture substrate 1 is not limited to one.
  • a plurality of first regions 11 and a plurality of second regions 12 defining the boundaries thereof may be formed in the cell culture substrate 1 to provide a plurality of cell proliferation areas.
  • the shapes and sizes of the plurality of first regions 11 and second regions 12 may be the same or different.
  • An example of a pattern including a plurality of first regions and second regions having the same shape and size is a pattern in which the first region is a regular hexagon, and a plurality of regular hexagons are connected with the second region as a boundary.
  • One example is one with a honeycomb shape.
  • a plurality of different patterns may be provided on one cell culture substrate 1.
  • the space between one second region 12 and another second region 12 may be occupied by a third region 13.
  • the cell culture substrate 1 includes a substrate 10 that transmits visible light and ultraviolet rays, a first layer 20 that is formed on the substrate 10 and includes a portion that has ultraviolet shielding performance.
  • a second layer 30 is formed on the first layer 20 to assist cell proliferation.
  • the substrate 10 is not particularly limited as long as it is a material that transmits visible light and ultraviolet light, but it is selected from materials suitable for patterning the first layer 20.
  • quartz glass is preferable.
  • the substrate 10 is preferably a flat member with a substantially uniform thickness, and the thickness is not particularly limited. Considering that the transmittance of ultraviolet rays decreases as the thickness of the substrate 10 increases, the thickness of the substrate 10 can be set to, for example, about 1 mm.
  • the length and width dimensions of the substrate 10 are not particularly limited, but considering that cells will be observed using a microscope, the dimensions of the substrate 10 are, for example, about the same size as a normal slide glass (length about 76 mm, width about 26 mm). It can be done.
  • the first layer 20 includes a first portion 21 in which a material having ultraviolet shielding performance is arranged corresponding to the first region 11 and a material having ultraviolet shielding performance in correspondence to the second region 12. It has a second portion 22 that is not
  • the first portion 21 is a portion having ultraviolet shielding performance, and can also be referred to as an ultraviolet shielding layer.
  • the second portion 22 is provided around the first portion 21 so as to define the boundary of the first region 11 .
  • the first layer 20 may have a third portion 23 in which a material having ultraviolet shielding performance is disposed corresponding to the third region 13.
  • the third portion 23 is also a portion having ultraviolet shielding performance and can be called an ultraviolet shielding layer.
  • Ultraviolet rays generally have a wavelength of about 10 nm to 400 nm, and among them, light with a wavelength of about 315 nm or less is classified as UVB (wavelength of about 280 to about 315 nm) and UVC (wavelength of about 200 to about 280 nm). It generally has a sterilizing effect.
  • the material having ultraviolet shielding performance is one of materials having an absorption peak at the wavelength of ultraviolet rays irradiated from an ultraviolet irradiation device (for example, a wavelength of about 315 nm or less corresponding to UVB or UVC), which will be described later. Among them, it is preferable to select a material suitable for patterning the first layer 20.
  • the material having ultraviolet shielding performance is preferably transparent so as not to affect observation of cells.
  • Transparency here means that the transmittance of light necessary for observing cells, such as visible light with a wavelength of about 360 nm to 830 nm, and excitation light/fluorescence with a wavelength of about 340 to 740 nm, is 70% or more. It is preferably 80% or more, more preferably 90% or more.
  • An example of a material having such ultraviolet shielding performance is indium tin oxide (ITO).
  • the thickness of ITO can also be selected from the viewpoints of ultraviolet shielding performance and observation light transmittance.
  • the thickness of ITO is preferably about 4000 ⁇ (400 nm) or more and about 30000 ⁇ (3000 nm) or less, but it is not limited to a specific thickness as long as it can absorb and block ultraviolet rays.
  • other materials having UV shielding performance of about 254 nm include silicon dioxide (SiO 2 ) and polystyrene. An example in which ITO is used as a material having ultraviolet shielding performance will be described below.
  • the ultraviolet shielding layer constituting the first portion 21 or the third portion 23 on the substrate 10 a method depending on the material having ultraviolet shielding performance is used.
  • an ITO film as the first part 21 or optionally the third part 23, it is possible to use, for example, sputtering or photolithography used in semiconductor manufacturing technology.
  • an ITO film is formed by sputtering on a region of the substrate 10 where a pattern is to be formed, a resist is applied on the ITO film, and then exposure and development are performed to form a second pattern of the pattern. The resist in the portion corresponding to the region 12 is removed.
  • the ITO in the areas where the resist has been removed is removed using hydrochloric acid, and finally, the resist remaining in the first region 11 and optionally the third region 13 is removed using a remover.
  • an ultraviolet shielding layer having a desired shape is formed on the substrate 10, including the first portion 21 and optionally the third portion 23.
  • ITO which is cited as an example of a material having ultraviolet shielding performance in the present invention, is not made to function as an electrode. That is, the first portion 21 and the third portion 23 where ITO is arranged are not connected to a power source by wiring or the like, and are not configured to be able to apply voltage.
  • the second layer 30 is an optional layer provided to assist the adhesion of cells to the first region 11 and proliferation of the attached cells, and can also be referred to as a layer made of a coating material.
  • the second layer 30 is formed, for example, by placing the substrate 10 on which the ultraviolet shielding layer described above is formed in a container such as a Petri dish with the ultraviolet shielding layer facing downward, and between the surface of the Petri dish and the substrate 10. For example, it can be formed by introducing a coating agent dissolved in ultrapure water and attaching the coating agent to the surface of the substrate. As shown in FIG. 1(b), the second layer 30 is disposed on and in contact with the first portion 21 and the third portion 23 of the first layer 20. As shown in FIG.
  • the coating material constituting the second layer 30 can be selected from an appropriate material depending on the cell type to be cultured, such as extracellular matrix (ECM) such as collagen and fibronectin, EHS mouse sarcoma, etc. (mouse Engelbreth-Holm-Swarm sarcoma) Matrigel, which is reconstituted basement membrane isolated from cells, is an example.
  • ECM extracellular matrix
  • Matrigel which is reconstituted basement membrane isolated from cells
  • the second layer 30 may not be formed, and the first layer 20 may be subjected to surface modification such as plasma treatment without forming the second layer 30.
  • the thickness of the second layer 30 on the first portion 21 and the third portion 23 is not particularly limited as long as it can support adhesion of cells and proliferation of attached cells. For example, it can be about 0.1 to 3 ⁇ m, more preferably about 0.1 to 1 ⁇ m.
  • the second layer 30 constitutes a surface of the cell culture substrate 1 that comes into contact with cells, and functions as a surface on which cells are seeded. When the second layer 30 is provided, the surface on which cells are seeded is preferably a flat surface, but is not particularly limited.
  • the second layer 30 may not be provided.
  • a first region is formed between the substrate and the first portion (ultraviolet shielding layer) in a direction perpendicular to the main surface of the cell culture substrate.
  • the third region which may be optionally provided, may be a region in which the substrate and the third portion (ultraviolet shielding layer) are laminated in this order.
  • the surface on which cells are seeded may have unevenness due to the first portion and the third portion.
  • the second layer can also be formed on the opposite surface of the substrate to the surface on which the first layer is formed.
  • the second layer can be formed directly on the substrate and the cells can be seeded in contact with the second layer.
  • the substrate on which the ultraviolet shielding layer is formed is placed so that the ultraviolet shielding layer faces upward.
  • the second layer can be formed in the same manner as in the case of forming the second layer on the first layer, except that the second layer is placed in a container such as a petri dish.
  • the cell patterning device 100 includes a cell culture substrate 1 and an ultraviolet irradiation device 110 capable of irradiating the cell culture substrate 1 with ultraviolet rays.
  • the ultraviolet rays emitted from the ultraviolet irradiation device 110 are not particularly limited as long as they have a wavelength that can kill cells by irradiating them, but for example, a wavelength of about 254 nm is used. It is configured to be able to irradiate with ultraviolet rays.
  • the cell culture substrate 1 is placed vertically below the ultraviolet irradiation device 110. Therefore, the cell culture substrate 1 is placed in a container 120 such as a cell culture dish, with the substrate 10 facing upward and the second layer 30 to which the cells 50 are attached downward.
  • the container 120 is configured to be able to hold a culture medium 121, and is provided with a support member 122 made of silicone rubber, for example.
  • the cell culture substrate 1 placed in the container 120 is supported by the support member 122, and at this time, the second layer 30 to which the cells 50 are attached comes into contact with the medium 121.
  • the ultraviolet light UV emitted from the ultraviolet irradiation device 110 enters the cell culture substrate 1 placed in the container 120 from the substrate 10 side. That is, the ultraviolet rays UV are incident on the surface of the cell culture substrate 1 opposite to the surface to which the cells 50 are attached.
  • the ultraviolet light UV incident on the cell culture substrate 1 is configured to be transmitted through the second region 12, which is an ultraviolet transmitting region, and blocked by the first region 11, which is an ultraviolet shielding region, so that the cells are not irradiated.
  • the cell culture substrate 1 is placed vertically below the ultraviolet irradiation device 110, but the cell culture substrate 1 is placed vertically above the ultraviolet irradiation device 110. It may be configured such that the material 1 is arranged. In this case, the cell culture substrate 1 is arranged with the substrate 10 on the lower side and the second layer 30 to which the cells 50 are attached on the upper side so that the ultraviolet rays UV are incident from the substrate 10 side.
  • a cell culture substrate 1 having a first region 11 that blocks ultraviolet rays UV and a second region 12 that transmits ultraviolet rays UV is prepared.
  • the cell culture substrate 1 may have a third region 13 that blocks ultraviolet rays.
  • the cell culture substrate 1 includes the first layer 20 and the second layer 30 formed on the substrate 10.
  • cells 50 are seeded onto the cell culture substrate 1 and attached onto the second layer 30.
  • the cells 50 are preferably seeded substantially uniformly in the first region 11, the second region 12, and optionally the third region 13.
  • the number and concentration of cells seeded may vary depending on the purpose and are not particularly limited. As an example, seeding may be performed such that only one cell is placed in the first region 11. As another example, when seeding a cell population using a pipette or the like, for example, 10 or more cells, or 100 or more cells can be seeded in the first region 11. Assuming that 1 mL of cell suspension is used, the concentration can be converted to approximately 1.0 ⁇ 10 3 cells/mL or more.
  • it may be about 1.0 ⁇ 10 10 cells/mL or less, preferably about 1.0 ⁇ 10 6 cells/mL or less, or about 1.0 ⁇ 10 5 cells/mL or less.
  • a medium may be included as a type of solution used for seeding.
  • the same cells can be simultaneously seeded in the plurality of first regions depending on the purpose.
  • different cells can be seeded in each of the plurality of first regions 11.
  • the number of cells arranged in the first region and the concentration of cells seeded may be the same or different among the plurality of first regions 11 depending on the purpose.
  • the cell culture substrate 1 is irradiated with ultraviolet rays UV for a predetermined period of time using the ultraviolet irradiation device 110 described above.
  • the ultraviolet light UV enters the cell culture substrate 1 from the substrate 10 side.
  • the incident ultraviolet rays UV are blocked by the first portion 21 and the third portion 23 in which ITO is arranged in the first layer 20, and transmitted through the second portion 22 in which ITO is not arranged.
  • the cells 50 attached on the second region 12 corresponding to the second portion 22 of the first layer 20 are killed by the incident ultraviolet rays and removed from the cell culture substrate 1.
  • cells attached on the first region 11 corresponding to the first portion 21 of the first layer 20 and the third region 13 corresponding to the third portion 23 which may be optionally provided. Since the cells 50 are not irradiated with UV rays, the cells 50 are cultured on the cell culture substrate 1 and proliferate while remaining attached to the cells 50 without dying.
  • Irradiation of ultraviolet light to the cell culture substrate 1 is performed periodically during the culture period.
  • the irradiation time and frequency can be determined as appropriate depending on the cell type, chip design, etc.
  • the irradiation time and frequency can be determined as appropriate depending on the cell type, chip design, etc.
  • the cell patterning device 100 includes a cell culture substrate 1 having a first region 11 that blocks ultraviolet rays UV and a second region 12 that transmits the ultraviolet rays, and an ultraviolet ray that can irradiate the cell culture substrate 1 with ultraviolet rays.
  • the irradiation device 110 is configured to remove cells 50 on the second region 12 from among the cells 50 attached to the cell culture substrate 1 by irradiating ultraviolet rays with the ultraviolet irradiation device 110. .
  • the cell culture substrate 1 includes a substrate 10 that transmits visible light and ultraviolet light (UV), and a first layer 20 formed on the substrate 10 and including a portion made of a material having ultraviolet shielding performance.
  • the material having ultraviolet shielding performance may be ITO
  • the first layer 20 of the cell culture substrate 1 includes a first part 21 in which ITO is arranged corresponding to the first region 11, and a second part 21 in which ITO is arranged corresponding to the first region 11.
  • a second portion 22 in which indium tin oxide is not disposed corresponds to the region 12 .
  • the second portion 22 is arranged around the first portion 21 so as to define the boundary of the first region 11 .
  • the first region 11 that blocks ultraviolet rays does not affect the observation of cells. Since a second portion 22 in which ITO is not arranged is formed around the first portion 21, the boundary of the first region 11 is defined by the second portion 22, and the first region 11 is divided into one cell. Can form as colonies.
  • the cell culture substrate 1 is formed on the first layer 20 and further includes a second layer 30 for assisting cell proliferation.
  • a second layer 30 for assisting cell proliferation In the case of conventional cell culture substrates in which adhesive substances are coated on the substrate for cell patterning, it is sometimes difficult to use cell adsorption and growth factors to support cell proliferation. This is because the adhesive substance for cell patterning and the cell adsorption/growth factor for assisting cell growth have a relationship that cancels out the effects of both.
  • the adhesive substance may include, for example, a biocompatible synthetic polymer such as the MPC polymer described in Non-Patent Document 1.
  • the cell culture substrate 1 does not include an adhesive substance for cell patterning. Therefore, even if the second layer 30 made of, for example, a cell adsorption/proliferation factor is formed, a culture environment suitable for the cell type can be constructed without affecting cell patterning.
  • the cell patterning method having the above effects can also be considered as a method for producing a patterned cell population.
  • the method for producing a patterned cell population includes the following steps. a step of attaching cells to one side of a cell culture substrate having a first region that blocks ultraviolet rays and a second region that transmits ultraviolet rays; and a step of culturing the attached cells, the step of culturing the attached cells, the method comprising: In the step of culturing, the step includes a step of irradiating the cells with ultraviolet rays from the surface of the cell culture substrate opposite to the surface to which the cells are attached.
  • the step of attaching cells to one side of the cell culture substrate can be performed in the same manner as the cell patterning method described above.
  • the number of cells to be attached may be one or more, and can be determined as appropriate depending on the purpose.
  • the adhered cells are cultured and proliferated under conditions suitable for the cells until a predetermined cell population is generated.
  • ultraviolet rays are irradiated over a predetermined period of time and over a predetermined number of times from the side opposite to the side to which the cells are attached.
  • the method for producing a patterned cell population it is possible to obtain a cell population adhered to a cell culture substrate, prepared in a desired shape and size, and optionally with the same or different cells or cells. It is possible to obtain a plurality of cell populations, ie, a plurality of cell colonies, which are derived from the population and proliferated to have a desired shape and size.
  • the obtained plurality of cell colonies can be used for various purposes such as screening while remaining attached to the cell culture substrate. Alternatively, it can be separated from the cell culture substrate 1 and used for analysis or other purposes.
  • cells derived from a malignant tumor may be collected from peripheral blood of a human suffering from a malignant tumor.
  • circulating cancer cells CTCs
  • cells derived from a malignant tumor can be collected from a tissue section of malignant glioma tumor tissue.
  • a step of seeding the cells and a step of culturing the cells are performed.
  • an anticancer drug is applied to the first region.
  • anticancer drug-resistant strains By observing and evaluating the state of the cell population after culturing for a predetermined period of time, anticancer drug-resistant strains can be identified, for example. Similarly, a step of confirming the sensitivity of cells to multiple types of anticancer drugs can also be carried out. This makes it possible to culture and evaluate a cell population derived from a specific patient, which can greatly contribute to cancer prognosis and treatment policy decisions.
  • Example I Cell culture substrate in which the first region has a circular pattern
  • a cell culture substrate shown in FIG. 1 and a cell culture substrate on which no second layer is formed were manufactured, and cells were patterned.
  • Candidate materials include ITO with a thickness of 854.7 ⁇ (85.47 nm) deposited on synthetic silica glass with a thickness of 1 mm, ITO with a thickness of 4204 ⁇ (420.4 nm), and ITO with a thickness of 8334 ⁇ (833 nm). .4 nm), polystyrene (PS) with a thickness of 1000 ⁇ m, borosilicate glass (Glass) with a thickness of 1000 ⁇ m, and synthetic silica glass (Synthetic silica) with a thickness of 1 mm were prepared. Regarding these materials, the relationship between the wavelength of irradiation light and the transmittance was investigated using a spectrophotometer (UV2700, Shimadzu Corporation).
  • FIG. 4 is a graph showing the relationship between the wavelength of irradiation light and the transmittance for these materials. From FIG. 4, it was confirmed that ITO, PS, and borosilicate glass (silica glass) can be used as materials that block ultraviolet rays with a wavelength of 254 nm and transmit visible light. In subsequent experiments, ITO with a thickness of 8334 ⁇ was selected as the material constituting the first portion and the third portion.
  • the first region, second region, and third region shown in Fig. 1 are provided, and the substrate is made of synthetic quartz glass with a thickness of 1 mm.
  • the diameter X of the first region was designed to be 1000 ⁇ m
  • the width Y of the second region was designed to be 100 ⁇ m
  • ITO was formed by sputtering.
  • the synthetic quartz substrate was washed with sulfuric acid and hydrogen peroxide for 10 minutes.
  • a sputtering device iMiller, Shibaura Mechatronics
  • ITO was deposited on a region of the substrate where a pattern was to be formed.
  • a positive photoresist S1818, Rohm and Haas Electronic Materials LLC
  • the method for manufacturing the second layer is to mix Type I collagen or Poly-D-lysine with ultrapure water, with Type I collagen having a concentration of 100 ⁇ g/ml and Poly-D-lysine having a concentration of 50 ⁇ g/ml. I adjusted it so that The previously obtained base material was placed in a Petri dish with the first layer facing the Petri dish, and a Type I collagen solution or Poly-D-lysine solution was introduced into the gap between the Petri dish surface and the first layer. It was placed in a refrigerator at 4°C and left overnight.
  • a cell suspension containing human glioblastoma cell line U-87 modified to express fluorescent protein (GFP) at 5.0 ⁇ 10 5 cells/mL was added to these three types of cell culture substrates. were seeded and cultured for 4 days. From the start of culture, ultraviolet rays with a peak wavelength of 254 nm were irradiated once a day for a predetermined period of time. Cells on the substrate were observed immediately after seeding and 4 days later. The observation results are shown in Figures 5-8.
  • Figure 5 shows the cell culture substrate immediately after seeding cells on the cell culture substrate without a second layer (a) and 4 days after culturing with the cumulative exposure amount of ultraviolet rays at 0 mJ/cm 2 (b).
  • This is a fluorescence image.
  • the cumulative exposure amount was calculated based on the amount of energy of light having a wavelength of 254 nm. No ultraviolet rays were irradiated during culturing, and it was confirmed from FIG. 5 that cells proliferated in all the first, second, and third regions.
  • Figure 6 shows images immediately after seeding cells on a cell culture substrate provided with a second layer made of Poly-D-Lysine (a), and 4 days after culturing at an integrated exposure dose of ultraviolet rays of 0 mJ/ cm2 (a). This is a fluorescence image of the cell culture substrate in b).
  • ultraviolet rays were not irradiated during culturing, and as in FIG. 5, it was confirmed that cells proliferated in all the first, second, and third regions.
  • Figure 7 shows immediately after seeding cells on a cell culture substrate without a second layer (a), and 4 days after culturing with an integrated exposure amount of ultraviolet rays of 1038 mJ/cm 2 and an exposure time of 600 seconds once a day. It is a fluorescence image of the cell culture substrate on day (b). From FIG. 7, it was confirmed that the cells in the second region were killed by ultraviolet irradiation, and a cell colony isolated from the surroundings was generated in the first region.
  • Figure 8 shows (a) immediately after seeding cells on a cell culture substrate provided with a second layer made of collagen, and the cumulative exposure amount of ultraviolet rays is 1038 mJ/cm 2 and the exposure time is once a day for 600 sec. It is a fluorescence image of the cell culture substrate 4th day after culture (b). From FIG. 8, it was confirmed that the cells in the second region were killed by ultraviolet irradiation as in the case of FIG. 7. Furthermore, it was confirmed that in the first region, a cell colony isolated from the surrounding area was generated, and a higher proliferation effect than in FIG. 7 was obtained.
  • FIG. 9 is a fluorescence image of the substrate 4 days after culture.
  • the diameter X of the first region of the four patterns at the top of the image was 965 ⁇ m.
  • the diameter X of the first region was 713 ⁇ m.
  • the diameter X of the first region was 455 ⁇ m.
  • the diameter X of the first region was 198 ⁇ m.
  • the square pattern in the image is a pattern for measuring actual values of a plurality of different patterns in FIG. From FIG. 9, cell patterning was possible in all cases where the first region was circular, the diameter X was approximately 200 to 1000 ⁇ m, and the width Y was 100 ⁇ m. More specifically, we succeeded in growing cells in the first region and the third region, killing and removing the cells in the second region, and generating a colony of cells in the first region.
  • the cell proliferation rate in the first region and the number of cells attached to the second region By changing the type of coating material and the diameter X of the first region, the cell proliferation rate in the first region and the number of cells connected to the second region The number of cells attached to the area was investigated.
  • the type of coating material and application method were the same as in (2).
  • the first region was manufactured with the aim of having a diameter X of 500 ⁇ m, 750 ⁇ m, and 1000 ⁇ m.
  • the occupied area ratio of the cells to the area of the first region was used, and the occupied areas at the time of cell seeding, the second day of culture, and the fourth day of culture were obtained.
  • the exclusive area was obtained by measuring the area emitting fluorescence through image analysis.
  • the number of cells connected to the second area is calculated on the image when the boundary line between the first area and the second area is defined as the inner circle, and the boundary line between the second area and the third area is defined as the outer circle.
  • the evaluation was based on the number of points where the inner and outer circles were connected by cells.
  • the existence of a point where the inner circle and the outer circle are connected by cells means that the cell colony in the first region is not isolated from other cells, etc. in the third region.
  • the evaluation results are shown in FIGS. 10, 11 and 12.
  • the legend of each figure indicates the diameter ( ⁇ m) of the culture area.
  • the upper row (a) is a pattern with a layer made of collagen (Collagen)
  • the middle row (b) is a pattern with a layer made of Poly-D-Lysine (Poly-D-Lysine)
  • the lower part (c) shows the evaluation results for a pattern (NON) in which the second layer is not provided.
  • the cumulative exposure amount of ultraviolet rays is 0 mJ/cm 2 in FIG. 10, 519 mJ/cm 2 (exposure time is 300 sec) in FIG. 11, and 1038 mJ/cm 2 (exposure time is 600 sec) in FIG. Exposure was done once.
  • the white plot indicates the cell proliferation rate in the first region, which is expressed as the ratio of the area occupied by cells to the area of the first region on the left axis.
  • the black plot represents the number of cell attachments to the second region on the right axis. Those with more than 10 cells attached to the second region were expressed as 10.
  • Example II Cell culture substrate in which the first area has a regular hexagonal pattern
  • the first area is a regular hexagon
  • the second area provided around the regular hexagon is A cell culture substrate was designed in which 16 regular hexagons were arranged vertically and horizontally as boundaries, and a third region was provided around the outer periphery of the hexagons.
  • a cell culture substrate having such a shaped cell growth area is referred to as a honeycomb type cell culture substrate.
  • FIG. 13 is a diagram illustrating the design of a honeycomb type cell culture substrate. In FIG.
  • A is the design value of the circumscribed circle diameter of the first region consisting of a regular hexagon
  • B is the design value of the gap length in the diametrical direction of the circumscribed circle
  • C is the design value of the width of the second region
  • D was defined as the design value of the distance between two parallel sides of a regular hexagon.
  • FIG. 14 is an image of a cell culture substrate actually manufactured based on the design drawing of FIG. 13, showing a honeycomb-shaped cell proliferation area (a) and an enlarged photograph (b) of area Z in (a). It is.
  • ITO which is the first layer
  • the measured value of the diameter of the circumscribed circle of the first region of a regular hexagon is E
  • the measured value of the gap length in the diametrical direction of the circumscribed circle is F
  • the measured value of the width of the second region is G
  • the measured value of the circumscribed circle of the first region of the regular hexagon is G.
  • the measured value of the distance between two parallel sides was defined as H
  • the measured value of the width of the ITO layer partially etched due to undercut was defined as I.
  • Table 1 shows the designed values and actual measured values for the six types of samples.
  • the designed value is abbreviated as Des, and the measured value is abbreviated as Mea.
  • the actual measurement value Mea in the table indicates the average value of the results measured at three different locations.
  • FIG. 15 is a fluorescence image immediately after seeding cells on a honeycomb-type cell culture substrate (a) and on the second day after culturing at an integrated exposure amount of ultraviolet rays of 0 mJ/cm 2 (b). No ultraviolet rays were irradiated during culturing, and it was confirmed from FIG. 15 that cells proliferated in both the first and second regions.
  • the ITO layer does not absorb the fluorescence of the human glioblastoma cell line U-87, so the U-87 cells in the second region are relatively more sensitive than the U-87 cells in region 1. It is thought that it is being observed brightly.
  • Figure 16 shows the results immediately after seeding cells on a honeycomb-type cell culture substrate (a), and on the second day after culturing (b) with an integrated exposure amount of ultraviolet rays of 2076 mJ/cm 2 and an exposure time of 1200 sec once a day. ) is a fluorescence image. From FIG. 16, it was confirmed that ultraviolet irradiation was able to kill the cells in the second region and generate cell colonies isolated from other first regions in the plurality of hexagonal first regions. .
  • FIG. 17 is a fluorescence image immediately after seeding cells on a single hexagonal cell culture substrate (a) and on the second day after culturing at an integrated ultraviolet exposure dose of 0 mJ/cm 2 (b). No ultraviolet rays were irradiated during culturing, and it was confirmed from FIG. 17 that cells proliferated in both the first and second regions.
  • Figure 18 shows immediately after seeding cells on a single hexagonal type cell culture substrate (a), and 2nd day after culturing with a cumulative UV exposure of 2076 mJ/cm 2 and an exposure time of 1200 sec once a day.
  • (b) is a fluorescence image. From FIG. 18, it was confirmed that the cells in the second region were killed by ultraviolet irradiation, and a cell colony isolated from the surroundings was generated in a single first region.
  • Evaluations were made with an ultraviolet exposure amount of 0 mJ/cm 2 , 1038 mJ/cm 2 (exposure time: 600 sec), or 2076 mJ/cm 2 (exposure time: 1200 sec).
  • an index of the cell proliferation rate in the first region the occupied area ratio of cells to the area of the first region was used, and the occupied area on the second day of culture at the time of cell seeding was obtained.
  • the method for acquiring the exclusive area was the same as in (4) of Example I.
  • the exclusive area was evaluated using three randomly selected regular hexagons other than the outermost regular hexagon, and the average value was taken as the average value.
  • the number of cells connected to the second region was evaluated by the number of points where the outer periphery of a certain first region and the outer periphery of another adjacent first region or the third region were connected by cells.
  • the number of bound cells was evaluated using three randomly selected regular hexagons other than the outermost regular hexagon, and the average value was taken as the average value.
  • the evaluation results are shown in Figures 19 to 22.
  • the legend on the upper right shows the gap length design value B ( ⁇ m).
  • the ultraviolet exposure amount is 0 mJ/cm 2 in the upper row (a), 1038 mJ/cm 2 in the middle row (b), and 2076 mJ/cm 2 in the lower row (c).
  • the white plot indicates the cell proliferation rate in the first region, which is expressed as the ratio of the area occupied by cells to the area of the first region on the left axis.
  • the black plot represents the number of cell attachments to the second region on the right axis. Those with more than 10 cells attached to the second region were expressed as 10.
  • Figure 19 shows the evaluation results using a honeycomb type cell culture substrate with a design value A of the circumscribed circle diameter of 750 ⁇ m
  • Figure 20 shows the evaluation results using a single hexagonal type cell culture substrate with a design value A of the circumscribed circle diameter of 750 ⁇ m. These are evaluation results using cell culture substrates.
  • Figure 21 shows the evaluation results using a honeycomb type cell culture substrate with a design value A of the diameter of the circumscribed circle of 450 ⁇ m
  • Figure 22 shows the evaluation results using a single hexagon type cell culture substrate with a design value A of the diameter of the circumscribed circle of 450 ⁇ m. These are evaluation results using cell culture substrates.
  • the first region is a regular hexagon, as in the case where the first region is circular, by increasing the amount of ultraviolet light exposure, the number of cells bonded to the second region is significantly reduced, and It was confirmed that cell proliferation was possible in the area of 1.
  • the gap length is 25 ⁇ m, the cumulative exposure amount in this experiment may not be sufficient to inhibit cell binding. Therefore, when the gap length is set to 25 ⁇ m or less, it is considered that cell bonding can be suppressed more reliably by increasing the cumulative exposure amount.

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Abstract

細胞の増殖を制御し、細胞集団の形状を簡易にパターニングすることができる細胞パターニング方法および細胞パターニング装置を提供する。 紫外線を遮蔽する第１の領域１１と紫外線を透過させる第２の領域１２とを有する細胞培養基材１の一方の面に細胞を付着させる工程と、前記細胞培養基材１の、前記細胞を付着させた面と逆側の面から紫外線を照射する工程とを含み、前記紫外線を照射する工程によって、前記細胞培養基材に付着した細胞のうち前記第２の領域１２上の細胞を除去する、細胞パターニング方法。

Description

細胞パターニング方法および細胞パターニング装置
　本発明は、細胞パターニング方法および細胞パターニング装置に関する。
　細胞を用いた薬剤評価等の定量的な実験には、ある程度の数の細胞を含む細胞集団からなる細胞組織を形成し、その細胞組織の大きさを正確に制御する必要がある。細胞組織の制御方法として、細胞が接着する基材表面において、細胞が接着する部分と接着しない部分とに区分けすることによって細胞の接着エリアを制御する細胞パターニングという手法が知られている。
　例えば、シリコンウェハー上に形成されたpolydimethylsiloxane（ＰＤＭＳ）のマイクロモールドに、2-methacryloyloxyethyl phosphorylcholine（ＭＰＣ）ポリマーのエタノール溶液を流し込むことによって微細構造のＭＰＣポリマーフィルムを成型し、所望のパターンを形成する技術が知られている（例えば、非特許文献１を参照）。ＭＰＣポリマーで覆われた部分は細胞が接着しない部分となり、ＭＰＣポリマーで覆われていない部分は細胞が接着する部分となるため、細胞が接着する部分と接着しない部分とが区分けされた、細胞パターニング用の微小デバイスが作製される。
N. Tanaka, et al., Vacuum microcasting of 2-methacryloyloxyethylphosphorylcholine polymer for stable cell patterning, BioTechniques, Vol. 69, No. 3, 2020
　接着性の細胞を培養するときに、Extracellular Matrix（ＥＣＭ）（例えば、コラーゲンやフィブロネクチン）などの細胞吸着・増殖因子を細胞培養基材表面にコーティングする場合がある。しかし、上述した非特許文献１においては、ＭＰＣポリマーを用いて細胞が接着する部分と接着しない部分とを区分けするパターン形成を行っているため、ＥＣＭなどの細胞吸着・増殖のためのコーティング剤を併用することは困難である。
　本発明は、上記のような実状に鑑みてなされたものであって、その目的は、種々の細胞に応じた良好な細胞パターニングを行うことができる細胞パターニング方法および細胞パターニング装置を提供することにある。
　本発明は、一実施形態によれば、細胞のパターニング方法であって、
　紫外線を遮蔽する第１の領域と紫外線を透過させる第２の領域とを有する細胞培養基材の一方の面に細胞を付着させる工程と、
　前記細胞培養基材の、前記細胞を付着させた面と逆側の面から紫外線を照射する工程とを含み、
　前記紫外線を照射する工程によって、前記細胞培養基材に付着した細胞のうち前記第２の領域上の細胞を除去する、細胞パターニング方法に関する。
　本発明は、別の実施形態によれば、細胞パターニング装置であって、
　紫外線を遮蔽する第１の領域と紫外線を透過させる第２の領域とを有する細胞培養基材と、
　前記細胞培養基材に紫外線を照射可能な紫外線照射装置と
　を備え、
　前記紫外線照射装置によって前記紫外線を照射することにより、前記細胞培養基材に付着した細胞のうち前記第２の領域上の細胞を除去する、細胞パターニング装置に関する。
　本発明は、さらに別の実施形態によれば、パターニングされた細胞集団の製造方法であって、
　紫外線を遮蔽する第１の領域と紫外線を透過させる第２の領域とを有する細胞培養基材の一方の面に細胞を付着させる工程と、
　付着させた前記細胞を培養する工程と
を含み、
　前記培養する工程において、細胞を前記細胞培養基材の、前記細胞を付着させた面と逆側の面から紫外線を照射する工程を含む、方法に関する。
　本発明によれば、細胞の増殖を制御し、増殖して得られる細胞集団からなる細胞組織の形状及び大きさを簡易にパターニングすることができる、細胞パターニング方法および細胞パターニング装置、並びにパターニングされた細胞集団の製造方法を提供することができる。
図１（ａ）、（ｂ）は、本発明の一実施の形態に係る細胞パターニング方法に用いられる細胞培養基材の構成を模式的に示す上面図および断面図である。 図２は、一実施の形態に係る細胞パターニング装置の概略構成を示す図である。 図３（ａ）～（ｄ）は、一実施の形態に係る細胞パターニング方法の流れを説明する図である。 図４は、各種材料に対する、照射光の波長と透過率の関係を示すグラフである。 図５は、第２の層を設けない細胞培養基材に細胞を播種した直後（ａ）、及び紫外線の積算露光量を０ｍＪ／ｃｍ２として培養後４日目（ｂ）の細胞培養基材の蛍光イメージである。積算露光量は全て２５４ｎｍの波長の光のエネルギー量で計算した。 図６は、Ｐｏｌｙ－Ｄ－Ｌｙｓｉｎｅを含む第２の層を設けた細胞培養基材に細胞を播種した直後（ａ）、及び紫外線の積算露光量を０ｍＪ／ｃｍ２として培養後４日目（ｂ）の基材の蛍光イメージである。 図７は、第２の層を設けない細胞培養基材に細胞を播種した直後（ａ）、及び紫外線の積算露光量を１０３８ｍＪ／ｃｍ２として培養後４日目（ｂ）の細胞培養基材の蛍光イメージである。 図８は、コラーゲンを含む第２の層を設けた細胞培養基材に細胞を播種した直後（ａ）、及び紫外線の積算露光量を１０３８ｍＪ／ｃｍ２として培養後４日目（ｂ）の細胞培養基材の蛍光イメージである。 図９は、細胞増殖エリアである第１の領域の直径Ｘを変更して細胞パターニング方法を実施した際の、培養後４日目の基材の蛍光イメージである。 図１０は、紫外線を照射しなかった場合の、第１の領域における細胞増殖率と第２の領域への細胞結合数を評価した結果である。 図１１は、紫外線の積算露光量を５１９ｍＪ／ｃｍ２とした場合の、第１の領域における細胞増殖率と第２の領域への細胞結合数を評価した結果である。 図１２は、紫外線の積算露光量を１０３８ｍＪ／ｃｍ２とした場合の、第１の領域における細胞増殖率と第２の領域への細胞結合数を評価した結果である。 図１３は、第１の領域が正六角形であり、第２の領域を境界として、正六角形が複数連なったハニカム形状の細胞増殖エリアを有する細胞培養基材の設計を説明する図である。 図１４は、図１３の設計図に基づいて実際に製造された細胞培養基材のイメージであって、ハニカム形状の細胞増殖エリア（ａ）、及び（ａ）の領域Ｚにおける拡大イメージ（ｂ）を示す。 図１５は、図１４に示すハニカム形状の細胞増殖エリアを有する細胞培養基材に細胞を播種した直後（ａ）、及び紫外線の積算露光量を０ｍＪ／ｃｍ２として培養後２日目（ｂ）の基材の蛍光イメージである。 図１６は、図１５と同様の細胞培養基材に細胞を播種した直後（ａ）、及び紫外線の積算露光量を２０７６ｍＪ／ｃｍ２として培養後２日目（ｂ）の基材の蛍光イメージである。 図１７は、正六角形の第１の領域が１つだけ設けられ、第２の領域の外周第３の領域が設けられた、シングル六角形の細胞増殖エリアを有する細胞培養基材に細胞を播種した直後（ａ）、及び紫外線の積算露光量を０ｍＪ／ｃｍ２として培養後２日目（ｂ）の基材の蛍光イメージである。 図１８は、図１７と同様の細胞培養基材に細胞を播種した直後（ａ）、及び紫外線の積算露光量を２０７６ｍＪ／ｃｍ２として培養後２日目（ｂ）の基材の蛍光イメージである。 図１９は、図１４と同様の細胞培養基材において、第１の領域の外接円直径の設計値Ａを７５０μｍとした場合の、第１の領域における細胞増殖率と第２の領域への細胞結合数を評価した結果であって、紫外線の積算露光量０ｍＪ／ｃｍ２（ａ）、１０３８ｍＪ／ｃｍ２（ｂ）、及び２０７６ｍＪ／ｃｍ２（ｃ）の基材の蛍光イメージである。 図２０は、図１７と同様の細胞培養基材において、第１の領域の外接円直径の設計値Ａを７５０μｍとした場合の、第１の領域における細胞増殖率と第２の領域への細胞結合数を評価した結果であって、紫外線の積算露光量０ｍＪ／ｃｍ２（ａ）、１０３８ｍＪ／ｃｍ２（ｂ）、及び２０７６ｍＪ／ｃｍ２（ｃ）の基材の蛍光イメージである。 図２１は、図１４と同様の細胞培養基材において、第１の領域の外接円直径の設計値Ａを４５０μｍとした場合の、第１の領域における細胞増殖率と第２の領域への細胞結合数を評価した結果であって、紫外線の積算露光量０ｍＪ／ｃｍ２（ａ）、１０３８ｍＪ／ｃｍ２（ｂ）、及び２０７６ｍＪ／ｃｍ２（ｃ）の基材の蛍光イメージである。 図２２は、図１７と同様の細胞培養基材において、第１の領域の外接円直径の設計値Ａを４５０μｍとした場合の、第１の領域における細胞増殖率と第２の領域への細胞結合数を評価した結果であって、紫外線の積算露光量０ｍＪ／ｃｍ２（ａ）、１０３８ｍＪ／ｃｍ２（ｂ）、及び２０７６ｍＪ／ｃｍ２（ｃ）の基材の蛍光イメージである。
　本発明の一実施の形態による細胞パターニング方法および細胞パターニング装置は、細胞が接着する基材表面を、細胞が接着する部分と接着しない部分とに区分けした細胞培養基材を用いて、細胞の接着エリアを制御する細胞パターニングを行うものである。細胞の接着エリアの制御は、紫外線遮蔽性の薄膜を基材上に形成し、局所的な紫外線の照射を行うことによって実現する。
　具体的には、紫外線を遮蔽する紫外線遮蔽領域と紫外線を透過させる紫外線透過領域とを有する細胞培養基材に細胞を付着させ、細胞培養基材に紫外線を照射し、紫外線の照射によって、細胞培養基材に付着した細胞のうち、紫外線透過領域上の細胞を除去することにより、細胞パターニングを行うように構成されている。
　以下に、一実施の形態による細胞パターニング方法および細胞パターニング装置について、図面を参照して詳細に説明する。図１（ａ）は、一実施の形態に係る細胞培養基材の構成を模式的に示す上面図であり、図１（ｂ）は図１（ａ）のＡ－Ａ断面図である。
　図１（ａ）、（ｂ）に示すように、細胞培養基材１は、紫外線を遮蔽する紫外線遮蔽領域である第１の領域１１と、紫外線を透過させる紫外線透過領域である第２の領域１２とを有しており、細胞培養基材１に付着した細胞に対する局所的な紫外線の照射が精密な位置合わせなしで可能となるように構成されている。細胞培養基材１は、紫外線遮蔽領域である第３の領域１３をさらに有していてもよい。本明細書において、１つの第１の領域１１(及び、任意選択的に第３の領域１３)と第２の領域１２の組み合わせで形成される形状を、パターンともいう。
　第１の領域１１は、細胞コロニーを形成するための細胞増殖エリアであり、例えば直径Ｘの円形に形成されている。ただし、これには限定されず、第１の領域１１の形状を、例えば正六角形などの正多角形を含む多角形とすることもできる。第１の領域１１の形状、大きさは、形成後の細胞コロニーの所望の形状、大きさに対応するように、当業者が適宜決定することができる。第１の領域１１が円形状である場合、直径Ｘの下限はとくには限定されず、増殖させる細胞の数等によって適宜決定することができる。例えば、第１の領域１１に１個の細胞を配置する場合もあり、この場合の直径Ｘは約１０μｍであってよい。第１の領域１１に複数の細胞を配置する場合には、例えば約５０μｍ以上であってよく、１００μｍ以上であってもよく、約１５０μｍ以上であることが好ましい。直径Ｘの上限はとくには限定されないが、例えば、約１０００μｍとすることができる。第１の領域１１の形状が円形以外の場合にも、第１の領域１１が、これらと同じ程度の面積を有するように、第１の領域１１の大きさを決定することができる。例えば、第１の領域の形状が正多角形の場合、正多角形の外接円の直径を、上記の値とすることができる。
　第２の領域１２は、第１の領域１１の外周に接し、第１の領域１１の境界を画定するエリアである。第２の領域１２は、第１の領域１１の形状に合わせて、例えば幅Ｙの環状に形成されている。第３の領域１３は、第２の領域１２の外側のエリアに任意選択的に設けられ、第１の領域１１と代替可能な領域でありうる。幅Ｙは、第１の領域１１で培養される細胞と、第２の領域１２の外側のエリアで培養される細胞が接触しない程度の幅であればよく、特定の幅には限定されない。ある実施形態においては、幅Ｙは、紫外線を透過させることが可能な幅であることが好ましく、照射する紫外線波長よりも大きい幅とすることができる。例えば、照射に２５４ｎｍの紫外線を用いる場合には、幅Ｙの下限値は約３００ｎｍであってよい。幅Ｙの上限は、理論上はとくには限定されない。
　図１（ａ）には、１つの第１の領域１１、すなわち１つの細胞増殖エリアのみが示されているが、細胞培養基材１が備える細胞増殖エリアの数は１つには限定されない。細胞培養基材１に複数の第１の領域１１と、その境界をそれぞれ画定する複数の第２の領域１２とを形成し、複数の細胞増殖エリアを備えるように構成してもよい。複数の細胞増殖エリアを備える場合、複数の第１の領域１１、及び第２の領域１２の間で、形状及び大きさは同一であってもよく、異なっていてもよい。形状及び大きさが同一の複数の第１の領域及び第２の領域を備えるパターンの例としては、第１の領域が正六角形であり、第２の領域を境界として、正六角形が複数連なったハニカム形状をもつものが挙げられる。また、１つの細胞培養基材１上に、異なる複数のパターンを備えていてもよい。ある第２の領域１２と、別の第２の領域１２との間は、第３の領域１３によって占められていてもよい。
　図１（ｂ）に示すように、細胞培養基材１は、可視光および紫外線を透過する基板１０と、基板１０上に形成され、紫外線遮蔽性能を有する部分を備える第１の層２０と、第１の層２０上に形成され、細胞増殖を補助するための第２の層３０とを備えている。
　基板１０は、可視光および紫外線を透過する材料であればとくには限定されないが、第１の層２０をパターニングするのに適した材料の中から選択される。例えば、石英ガラスなどが好ましい。基板１０は、厚さが略均一な平板状の部材であることが好ましく、その厚さは、とくには限定されない。基板１０の厚さが大きいほど紫外線の透過率が低下することを考慮して、基板１０の厚さは、例えば約１ｍｍとすることができる。基板１０の長さおよび幅の寸法は、とくには限定されないが、顕微鏡により細胞観察を行うことを考慮して、例えば通常形のスライドグラス（長さ約７６ｍｍ、幅約２６ｍｍ）と同程度の寸法とすることができる。
　第１の層２０は、第１の領域１１に対応して紫外線遮蔽性能を有する材料が配置された第１の部分２１と、第２の領域１２に対応して紫外線遮蔽性能を有する材料が配置されていない第２の部分２２とを有する。第１の部分２１は、紫外線遮蔽性能を有する部分であり、紫外線遮蔽層とも指称することができる。第２の部分２２は、第１の領域１１の境界を画定するように、第１の部分２１の周囲に設けられている。さらに、第１の層２０は、第３の領域１３に対応して紫外線遮蔽性能を有する材料が配置された第３の部分２３を有してもよい。第３の部分２３もまた、紫外線遮蔽性能を有する部分であり、紫外線遮蔽層ということができる。
　紫外線は、一般に、約１０ｎｍ～４００ｎｍの波長を有する光であり、そのうち、波長が約３１５ｎｍ以下の光はＵＶＢ（波長約２８０～約３１５ｎｍ）、ＵＶＣ（波長約２００～約２８０ｎｍ）と分類され、一般的に殺菌滅菌作用を有する。一実施の形態における紫外線遮蔽性能を有する材料は、後述する紫外線照射装置から照射される紫外線の波長（例えば、ＵＶＢまたはＵＶＣに対応する波長約３１５ｎｍ以下）に対して吸収ピークを有する材料の中のうち、第１の層２０をパターニングするのに適した材料が選択されることが好ましい。また、紫外線遮蔽性能を有する材料は、細胞の観察に影響しないように透明であることが好ましい。ここでいう透明とは、細胞の観察に必要な光、例えば波長が約３６０ｎｍ～８３０ｎｍの可視光や、波長が約３４０～７４０ｎｍの励起光・蛍光の透過性が、７０％以上であることが好ましく、８０％以上であることがさらに好ましく、９０％以上であることが好ましい。このような紫外線遮蔽性能を有する材料としては、例えば、酸化インジウムスズ（ＩＴＯ）が挙げられる。ＩＴＯの厚さも、紫外線遮蔽性能及び観察光の透過性の観点から選択することができる。とくには、ＩＴＯの厚さが約４０００Å（４００ｎｍ）以上であって、約３００００Å（３０００ｎｍ）以下程度とすることが好ましいが、紫外線を吸収し、遮蔽できれば、特定の厚さには限定されない。一例として、約２５４ｎｍの紫外線遮蔽性能を有する材料としては、他には二酸化ケイ素（ＳｉＯ２）やポリスチレンも含まれる。以下では、紫外線遮蔽性能を有する材料としてＩＴＯを採用した一例を説明する。
　基板１０上への、第１の部分２１または第３の部分２３を構成する紫外線遮蔽層の形成は、紫外線遮蔽性能を有する材料に応じた手法が利用される。第１の部分２１または任意選択的に第３の部分２３としてＩＴＯ膜を形成する場合、例えば半導体製造技術に用いられるスパッタリングやフォトリソグラフィを利用することができる。具体的な製造方法の一例としては、基板１０のパターンを形成する領域に対し、スパッタリングによってＩＴＯ膜を成膜し、ＩＴＯ膜上にレジストを塗布した後、露光および現像を行ってパターンの第２の領域１２に対応する部分のレジストを除去する。レジストが除去された部分のＩＴＯを塩酸により除去し、最後に、第１の領域１１及び任意選択的に第３の領域１３に残ったレジストをリムーバによって除去する。これにより、基板１０上に、第１の部分２１、および任意選択的に第３の部分２３を含む所望の形状の紫外線遮蔽層が形成される。なお、本発明において紫外線遮蔽性能を有する材料の一例として挙げられるＩＴＯは、電極として機能させることはない。すなわち、ＩＴＯが配置される第１の部分２１及び第３の部分２３は、配線などにより電源に接続されることはなく、電圧を印加可能に構成されることはない。
　第２の層３０は、第１の領域１１への細胞の接着および付着した細胞の増殖を補助するために設けられる任意選択的な層であり、コーティング材からなる層ともいうことができる。第２の層３０は、例えば、上述した紫外線遮蔽層が形成された基板１０を、紫外線遮蔽層が下側に向くようにシャーレ等の容器に設置し、シャーレ表面と基板１０との間に、例えば超純水に溶解させたコーティング剤を導入し、コーティング剤を基板の表面に付着させることによって形成することができる。図１（ｂ）に示すように、第２の層３０は、第１の層２０の第１の部分２１および第３の部分２３に接触してこれらの上に配置される。また、第２の部分２２上にも配置され、第２の領域１２では、コーティング材が、第２の部分２２にも充填されて、基板１０に接触する。第２の層３０を構成するコーティング材は、培養対象の細胞種に合わせて適切な材料を選択することができ、例えば、コラーゲン、フィブロネクチン等の細胞外マトリックス（ＥＣＭ：Extracellular Matrix）、ＥＨＳマウス肉腫（mouse Engelbreth-Holm-Swarm sarcoma）細胞から単離した再構成基底膜のマトリゲルなどが挙げられる。あるいは、第２の層３０を成膜しなくてもよく、第２の層３０を成膜せずに、第１の層２０にプラズマ処理などの表面改質を行うこともできる。第１の層２０に対するプラズマ処理による表面改質と、コラーゲンなどの第２の層３０の成膜を組み合わせることもできる。第１の部分２１及び第３の部分２３上の第２の層３０の厚さは、細胞の接着および付着した細胞の増殖を補助することができればとくには限定されない。例えば、約０．１～３μｍとすることができ、約０．１～１μｍとすることがさらに好ましい。第２の層３０は、細胞培養基材１において、細胞と接触する面を構成し、細胞が播種される面として機能する。第２の層３０が設けられる場合、細胞が播種される面は、平坦面であることが好ましいが、とくには限定されない。
　培養対象の細胞種や培養環境等によっては、第２の層３０を設けないようにしてもよい。第２の層が設けられない細胞培養基材（図示せず）においては、第１の領域は、細胞培養基材の主面に垂直な方向に、基板、第１の部分（紫外線遮蔽層）が順に積層された領域であってよく、第２の領域は、基板のみから構成されてよい。任意選択的に設けられてもよい第３の領域は、基板、第３の部分（紫外線遮蔽層）が順に積層された領域であってよい。この場合は、細胞が播種される面は、第１の部分及び第３の部分に起因する凹凸が存在しうる。また、図示はしないが、第２の層は、基板の第１の層が形成された面とは逆側の面に形成することも可能である。この場合、第２の層は、基板に直接形成することができ、細胞は、第２の層に接するように播種することができる。第２の層を、基板の第１の層が形成された面とは逆側の面に形成する場合の形成方法は、紫外線遮蔽層が形成された基板を、紫外線遮蔽層が上側に向くようにシャーレ等の容器に設置する以外は、第１の層上に第２の層を形成する場合と同様にして行うことができる。
　次に、図２を参照して、細胞培養基材１を用いて細胞パターニングを行うための細胞パターニング装置の構成について説明する。図２に示すように、細胞パターニング装置１００は、細胞培養基材１と、細胞培養基材１に紫外線ＵＶを照射可能な紫外線照射装置１１０とから構成される。紫外線照射装置１１０から射出される紫外線ＵＶは、先に詳述した通り、細胞に照射することにより、細胞を死滅させることができる波長をもつものであればとくに限定されないが、例えば約２５４ｎｍの波長の紫外線を照射可能に構成されている。
　図２に示す一例においては、細胞培養基材１は、紫外線照射装置１１０の鉛直方向下方に配置されている。そのため、細胞培養基材１は、細胞培養ディッシュなどの容器１２０内に、基板１０を上側に、細胞５０が付着した第２の層３０を下側にして配置される。容器１２０は、培地１２１を保持可能に構成され、および例えばシリコンゴム製の支持部材１２２が設けられている。容器１２０内に配置された細胞培養基材１は、支持部材１２２によって支持され、このとき、細胞５０が付着した第２の層３０は培地１２１に接することになる。
　紫外線照射装置１１０から射出される紫外線ＵＶは、容器１２０内に配置された細胞培養基材１の基板１０側から入射する。すなわち、細胞培養基材１の細胞５０が付着した面とは、逆側の面から紫外線ＵＶを入射する。細胞培養基材１に入射した紫外線ＵＶは、紫外線透過領域である第２の領域１２は透過し、紫外線遮蔽領域である第１の領域１１では遮蔽され、細胞には照射されない構成となる。
　なお、図２に示す例においては、紫外線照射装置１１０の鉛直方向下方に細胞培養基材１が配置されているが、これには限定されず、紫外線照射装置１１０の鉛直方向上方に細胞培養基材１を配置するように構成してもよい。この場合、基板１０側から紫外線ＵＶが入射するように、細胞培養基材１は、基板１０を下側に、細胞５０が付着した第２の層３０を上側にして配置される。
　次に、図３（ａ）～（ｄ）を参照して、細胞パターニング装置１００を用いた細胞パターニング方法の流れを説明する。
　まず、図３（ａ）に示すように、紫外線ＵＶを遮蔽する第１の領域１１と、紫外線ＵＶを透過させる第２の領域１２とを有する細胞培養基材１を準備する。細胞培養基材１は、紫外線ＵＶを遮蔽する第３の領域１３を有していてもよい。上述したように、細胞培養基材１は、基板１０上に形成された第１の層２０と、第２の層３０とを含んでいる。
　次に、図３（ｂ）に示すように、細胞培養基材１上に細胞５０を播種し、第２の層３０上に付着させる。このとき、細胞５０は、第１の領域１１、第２の領域１２、および任意選択的に第３の領域１３に略均一に播種することが好ましい。細胞の播種の個数や濃度は、目的により異なってよく、とくには限定されない。一例として、第１の領域１１に１個の細胞のみを配置するように播種する場合がある。別の例として、ピペット等を用いて細胞集団を播種する場合には、第１の領域１１に例えば１０個以上、または１００個以上の細胞を播種することができる。１ｍＬの細胞懸濁液を利用すると仮定し、濃度を換算すると、約１．０×１０３ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以上とすることができる。また、例えば、約１．０×１０１０ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以下程度、好ましくは約１．０×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以下程度、あるいは、約１．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以下程度とすることができる。播種に用いる溶液の一種として培地を含んでいてもよい。
　一つの細胞培養基材１上に、複数の第１の領域１１が設けられる場合、目的により、同一の細胞を複数の第１の領域に同時に播種することができる。あるいは、複数の第１の領域１１のそれぞれに、異なる細胞を播種することもできる。その際、第１の領域に配置する細胞数や播種する細胞濃度は、目的により、複数の第１の領域１１の間で、同一であってもよく、異なっていてもよい。
　その後の培養期間中、図３（ｃ）に示すように、上述した紫外線照射装置１１０によって細胞培養基材１に紫外線ＵＶを、所定の時間にわたって照射する。紫外線ＵＶは細胞培養基材１の基板１０側から入射する。入射した紫外線ＵＶは、第１の層２０においてＩＴＯが配置された第１の部分２１と第３の部分２３では遮蔽され、ＩＴＯが配置されていない第２の部分２２は透過する。第１の層２０の第２の部分２２に対応する第２の領域１２上に付着していた細胞５０は、入射した紫外線ＵＶによって死滅し、細胞培養基材１から除去される。一方、第１の層２０の第１の部分２１に対応する第１の領域１１および、任意選択的に設けられてもよい第３の部分２３に対応する第３の領域１３上に付着した細胞５０には、紫外線ＵＶは照射されないため、細胞５０は死滅せずに付着したまま細胞培養基材１上で培養され、増殖する。
　細胞培養基材１への紫外線ＵＶの照射を、培養期間中、定期的に行う。紫外線ＵＶの定期的な照射条件は、細胞種やチップのデザインなどに応じて、照射時間や頻度を適宜決めることができる。これにより、図３（ｄ）に示すように、第２の領域１２を境界とするため、領域１２上の細胞５０を除去し、細胞増殖エリアである第１の領域１１内に細胞コロニーを形成することができる。
　以上説明した一実施の形態による細胞パターニング方法および細胞パターニング装置１００によると、以下のような作用効果を奏することができる。
　細胞パターニング装置１００は、紫外線ＵＶを遮蔽する第１の領域１１と紫外線ＵＶを透過させる第２の領域１２とを有する細胞培養基材１と、細胞培養基材１に紫外線ＵＶを照射可能な紫外線照射装置１１０とを備え、紫外線照射装置１１０によって紫外線ＵＶを照射することにより、細胞培養基材１に付着した細胞５０のうち第２の領域１２上の細胞５０を除去するように構成されている。
　細胞５０が付着した細胞培養基材１に紫外線ＵＶを照射することにより、紫外線ＵＶを透過させる第２の領域１２上の細胞５０のみを除去し、紫外線ＵＶを遮蔽する第１の領域１１上の細胞５０は除去せずに残すことができる。このように、細胞培養基材１において局所的に紫外線ＵＶを照射し、紫外線ＵＶの照射範囲の制御を行うことで、細胞の増殖範囲を制限し、良好な細胞パターニングを行うことができる。
　細胞培養基材１は、可視光および紫外線ＵＶを透過する基板１０と、基板１０上に形成された、紫外線遮蔽性能を有する材料からなる部分を備える第１の層２０とを備える。紫外線遮蔽性能を有する材料は、ＩＴＯであってよく、細胞培養基材１の第１の層２０は、第１の領域１１に対応してＩＴＯが配置された第１の部分２１と、第２の領域１２に対応して酸化インジウムスズが配置されていない第２の部分２２とを有する。第２の部分２２は、第１の領域１１の境界を画定するように、第１の部分２１の周囲に配置されている。
　紫外線遮蔽性能を有する材料として、透明なＩＴＯ薄膜を基板１０上に形成するので、紫外線ＵＶを遮蔽する第１の領域１１によって細胞の観察に影響を与えることがない。第１の部分２１の周囲にはＩＴＯが配置されない第２の部分２２が形成されるので、第２の部分２２によって第１の領域１１の境界を画定し、第１の領域１１を１つの細胞コロニーとして形成することができる。
　細胞培養基材１は、第１の層２０上に形成され、細胞増殖を補助するための第２の層３０をさらに備える。細胞パターニングのために基板上に接着性物質をコーティングした従来の細胞培養基材の場合、細胞増殖を補助するために細胞吸着・増殖因子を用いることが難しい場合があった。これは、細胞パターニングのための接着性物質と細胞増殖補助のための細胞吸着・増殖因子とが双方の効果を打ち消すような関係となってしまうためである。なお、接着性物質とは、例えば、非特許文献１に記載のＭＰＣポリマーのような生体適合性の合成ポリマーを含みうる。これに対し、本発明の一実施の形態においては、細胞培養基材１は細胞パターニングのための接着性物質を備えていない。したがって、例えば細胞吸着・増殖因子からなる第２の層３０を形成しても、細胞パターニングに対して影響を与えることなく、細胞種に適した培養環境を構築することができる。
　上記の作用効果を備える細胞パターニング方法は、別の局面からは、パターニングされた細胞集団の製造方法とも捉えることができる。パターニングされた細胞集団の製造方法は、以下の工程を含む。
　紫外線を遮蔽する第１の領域と紫外線を透過させる第２の領域とを有する細胞培養基材の一方の面に細胞を付着させる工程、及び
　付着させた前記細胞を培養する工程であって、当該培養する工程において、細胞を前記細胞培養基材の、前記細胞を付着させた面と逆側の面から紫外線を照射する工程を含む工程
　細胞培養基材の一方の面に細胞を付着させる工程は、先に説明した細胞パターニング方法と同様に実施することができる。付着させる細胞の数は１個であってもよく、複数であってもよく、目的に応じて適宜決定することができる。細胞を培養する工程は、付着させた細胞を、所定の細胞集団が生成するまで、当該細胞に適する条件で培養し、増殖させる。そして、培養する工程において、所定の時間にわたって、また所定の回数にわたって、細胞を付着させた面と逆側の面から紫外線を照射する。
　パターニングされた細胞集団の製造方法によれば、細胞培養基材上に付着した、所望の形状及び大きさに調製された細胞集団を得ることができ、任意選択的に、同一又は異なる細胞または細胞集団に由来して増殖した、所望の形状及び大きさに調製された複数の細胞集団、すなわち複数の細胞コロニーを得ることができる。得られた複数の細胞コロニーは、細胞培養基材上に付着したままの状態で、スクリーニングなど種々の用途に使用することができる。あるいは、細胞培養基材１から分離して、分析や他の用途に用いることもできる。
　より具体的な応用例として、播種する細胞が、悪性腫瘍由来の細胞である場合のパターニングされた複数の細胞集団の用途について説明する。悪性腫瘍由来の細胞は、悪性腫瘍に罹患したヒト末梢血から採取されたものであってよい。例えば、ヒト末梢血から、循環がん細胞（ＣＴＣ）を採取することができる。あるいは、悪性グリオーマ腫瘍組織の組織切片から、悪性腫瘍由来の細胞を採取することができる。これらの細胞を用いて、細胞を播種する工程及び細胞を培養する工程を実施する。細胞を培養する工程において、第１の領域に、例えば、抗がん剤を適用する。所定の期間の培養後、細胞集団の状態を観察し、評価することで、例えば、抗がん剤耐性株を同定することができる。同様にして、複数種の抗がん剤に対して細胞の感受性を確認する工程を実施することもできる。これにより、特定の患者由来の細胞集団の培養及び評価が可能となり、がんの予後診断や、治療方針の決定に大きく寄与することができる。
　実施例Ｉ．第１の領域が円形のパターンを有する細胞培養基材
　図１に示す細胞培養基材及び、第２の層が形成されていない細胞培養基材を製造し、細胞のパターニングを行った。
　（１）紫外線遮蔽性能を有する材料の選定
　紫外線を吸収し、可視光を透過させることが可能な、第１の部分及び第３の部分を構成する材料の選定を行った。候補材料として、厚さが1ｍｍの合成石英ガラス上に成膜された厚さが８５４．７Å（８５．４７ｎｍ）のＩＴＯ、厚さが４２０４Å（４２０．４ｎｍ）のＩＴＯ、厚さが８３３４Å（８３３．４ｎｍ）のＩＴＯ、そして、厚さが１０００μｍのポリスチレン（ＰＳ）、厚さが１０００μｍのホウケイ酸ガラス（Ｇｌａｓｓ）、厚さが１ｍｍの合成石英ガラス（Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ　ｓｉｌｉｃａ）を準備した。これらの材料について、分光光度計（ＵＶ２７００、島津製作所）を用いて、照射光の波長と透過率の関係を調べた。
　図４は、これらの材料についての、照射光の波長と透過率の関係を示すグラフである。２５４ｎｍの波長の紫外線を遮蔽し、可視光を透過させる材料として、図４より、ＩＴＯ、ＰＳ、ホウケイ酸ガラス（シリカガラス）を使用可能であることが確認された。以降の実験では、第１の部分及び第３の部分を構成する材料として、厚さが８３３４ÅのＩＴＯを選定した。
　（２）細胞培養基材を用いた細胞のパターニング
　図１に示す第１領域、第２領域及び第３領域を備え、基板には、厚さ１ｍｍの合成石英ガラスを用い、第１部分及び第３部分が厚さ８３３４ÅのＩＴＯで構成された細胞培養基材を製造した。第２の層は設けないパターンと、ＴｙｐｅＩ　ｃｏｌｌａｇｅｎ（メルク製、品番Ｃ９７９１－１０ＭＧ）を含む層を設けたパターンと、Ｐｏｌｙ－Ｄ－Ｌｙｓｉｎｅ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ製、品番Ｐ７２８０）を含む層を設けたパターンを製造した。いずれも、第１領域の直径Ｘは１０００μｍ、第２領域の幅Ｙは１００μｍとなるように設計し、ＩＴＯは、スパッタリングにより成膜した。具体的には、合成石英基板を、１０分間、硫酸過水洗浄した。スパッタリング装置（ｉＭｉｌｌｅｒ，芝浦メカトロニクス）、ＩＴＯスパッタリングターゲットを用いて、ＩＴＯを基板のパターンを形成する領域に成膜した。次いで、成膜したＩＴＯ上に、ポジティブ型フォトレジスト（Ｓ１８１８，　Ｒｏｈｍ　ａｎｄ　Ｈａａｓ　Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ　Ｍａｔｅｒｉａｌｓ　ＬＬＣ）を回転数４０００ｒｐｍのスピンコート法により成膜し、１１５℃で３分間加熱した。フォトレジストへの露光と現像により、パターンの第２の領域に対応するＩＴＯ部分のフォトレジストを除去し、ＩＴＯエッチング液（塩酸，０８３－０３４３５，富士フィルム和光純薬）に浸し、フォトレジストが除去された部分のＩＴＯをエッチングした。最後に、第１の領域及び第３の領域に残存するフォトレジストを、フォトレジストのリムーバ（Ｍｉｃｒｏｐｏｓｉｔ　Ｒｅｍｏｖｅｒ　１１６５，Ｒｏｈｍ　ａｎｄ　Ｈａａｓ　Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ　Ｍａｔｅｒｉａｌｓ　ＬＬＣ）を用いて除去し、合成石英基板とその上にパターニングされた第１の層であるＩＴＯから構成された細胞培養基材を得た。第２の層の製造方法は、ＴｙｐｅＩ　ｃｏｌｌａｇｅｎ、またはＰｏｌｙ－Ｄ－ｌｙｓｉｎｅを、それぞれを超純水と混合し、ＴｙｐｅＩ　ｃｏｌｌａｇｅｎは濃度が１００μｇ／ｍｌ、Ｐｏｌｙ－Ｄ－ｌｙｓｉｎｅは濃度が５０μｇ／ｍｌとなるように調整した。先に得られた基材を、第１の層がシャーレに対向する向きにシャーレに配置し、シャーレ表面と第１の層の間隙に、ＴｙｐｅＩ　ｃｏｌｌａｇｅｎ溶液、またはＰｏｌｙ－Ｄ－ｌｙｓｉｎｅ溶液を導入して、４℃の冷蔵庫内に設置し、一晩静置した。
　これらの３種の細胞培養基材に、５．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬの、蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を発現するように改変されたヒト膠芽腫細胞株Ｕ－８７を含む細胞懸濁液を播種し、４日間培養を行った。培養開始から、毎日１回、所定の時間にわたって、ピーク波長が２５４ｎｍの紫外線を照射した。播種直後及び４日後の基材上の細胞を観察した。観察結果を図５～８に示す。
　図５は、第２の層を設けない細胞培養基材に細胞を播種した直後（ａ）、及び紫外線の積算露光量を０ｍＪ／ｃｍ２として培養後４日目（ｂ）の細胞培養基材の蛍光イメージである。本実施例において、積算露光量は全て２５４ｎｍの波長の光のエネルギー量で計算した。培養にあたって紫外線を照射しておらず、図５から、第１、第２、第３の全領域において、細胞が増殖したことが確認された。
　図６は、Ｐｏｌｙ－Ｄ－Ｌｙｓｉｎｅからなる第２の層を設けた細胞培養基材に細胞を播種した直後（ａ）、及び紫外線の積算露光量を０ｍＪ／ｃｍ２として培養後４日目（ｂ）の細胞培養基材の蛍光イメージである。図６でも、培養にあたって紫外線を照射しておらず、図５と同様に、第１、第２、第３の全領域において、細胞が増殖したことが確認された。
　図７は、第２の層を設けない細胞培養基材に細胞を播種した直後（ａ）、及び紫外線の積算露光量を１０３８ｍＪ／ｃｍ２、露光時間を１日１回、６００ｓｅｃとして培養後４日目（ｂ）の細胞培養基材の蛍光イメージである。図７から、紫外線照射により、第２の領域の細胞を死滅させ、第１の領域に、周囲から隔離された細胞コロニーを生成できたことが確認された。
　図８は、コラーゲンからなる第２の層を設けた細胞培養基材に細胞を播種した直後（ａ）、及び紫外線の積算露光量を１０３８ｍＪ／ｃｍ２、露光時間を１日１回、６００ｓｅｃとして培養後４日目（ｂ）の細胞培養基材の蛍光イメージである。図８から、紫外線照射により、図７の場合と同様に第２の領域の細胞を死滅させたことが確認できた。また、第１の領域においては、周囲から隔離された細胞コロニーを生成し、図７よりもより高い増殖効果が得られたことが確認された。
　（３）第１の領域の寸法の検討
　細胞増殖エリアである第１の領域の直径Ｘを変更し、第２の層を設けずに、上記（２）と同様の条件で細胞を播種し、培養した。紫外線の積算露光量は１０３８ｍＪ／ｃｍ２（露光時間を１日６００ｓｅｃ）とした。図９は、培養後４日目の基材の蛍光イメージである。図９中、イメージ上段の４つのパターンは、第１の領域の直径Ｘを、９６５μｍとした。イメージ中段の右側から３つのパターンは、第１の領域の直径Ｘを、７１３μｍとした。イメージ中段の左側及びイメージ下段の右側から２つのパターンは、第１の領域の直径Ｘを、４５５μｍとした。イメージ下段の左側から２つのパターンは、第１の領域の直径Ｘを、１９８μｍとした。イメージ中の四角いパターンは、図９の異なる複数のパターンの実測値の測定用のパターンである。図９より、第１の領域を円形とし、直径Ｘを約２００～１０００μｍとし、幅Ｙを１００μｍとした場合には、いずれも細胞のパターニングが可能であった。より詳細には、第１の領域と第３の領域で細胞を増殖し、第２の領域では細胞を死滅させ、除去して、第１の領域において細胞のコロニーを生成させることに成功した。
　（４）第１の領域における細胞増殖率と第２の領域への細胞結合数の検討
　コーティング材の種類及び第１の領域の直径Ｘを変更し、第１の領域における細胞増殖率と第２の領域への細胞結合数を調べた。コーティング材の種類及び塗布方法は、（２）と同様にした。第１の領域の直径Ｘは、５００μｍ、７５０μｍ、１０００μｍを狙って作製した。第１の領域における細胞増殖率の指標としては、第１の領域の面積に対する細胞の専有面積率を用い、細胞の播種時、培養２日目、培養４日目の専有面積を取得した。専有面積の取得方法は、画像解析による蛍光を発する範囲の測定により行った。第２の領域への細胞結合数は、第１の領域と第２の領域との境界線を内円、第２の領域と第３の領域の境界線を外円と定義したとき、イメージ上で、内円と外円が細胞により接続される箇所の数により評価した。内円と外円が細胞により接続される箇所が存在することは、第１の領域にある細胞コロニーが、第３の領域にある他の細胞等から、隔離されていないことを意味する。
　評価結果を、図１０、１１及び１２に示す。各図の凡例は、培養領域の直径（μｍ）を示す。各図において、上段（ａ）は、コラーゲンからなる層を設けたパターン（Ｃｏｌｌａｇｅｎ）、中段（ｂ）は、Ｐｏｌｙ－Ｄ－Ｌｙｓｉｎｅからなる層を設けたパターンであり（Ｐｏｌｙ－Ｄ－Ｌｙｓｉｎｅ）、下段（ｃ）は、第２の層は設けないパターン（ＮＯＮ）における評価結果である。紫外線の積算露光量は、図１０は０ｍＪ／ｃｍ２、図１１は５１９ｍＪ／ｃｍ２（露光時間は３００ｓｅｃ）、図１２は１０３８ｍＪ／ｃｍ２（露光時間は６００ｓｅｃ）とした場合であり、１日１回露光した。各グラフにおいて、白色のプロットは第１の領域内の細胞増殖率を示し、左軸の第１の領域の面積に対する細胞の専有面積率で表す。黒色のプロットは、右軸の第２の領域への細胞結合数を表す。第２の領域への細胞結合数が１０より多いものは、１０と表した。
　図１０から１２により、紫外線の露光量を増加させることにより、第２の領域への細胞結合数を有意に減少させ、第１の領域において細胞増殖を可能にすることが確認された。とくに、コーティング材を設けた細胞培養基材を用いることで、第１の領域における細胞増殖率を低減させることなく、第２の領域の細胞を死滅除去させ、細胞コロニーを生成可能であることが確認された。
　実施例ＩＩ．第１の領域が正六角形のパターンを有する細胞培養基材
（１）ハニカムタイプの細胞培養基材の設計と製造
　第１の領域を正六角形とし、正六角形の周囲に設けた第２の領域を境界として、１６個の正六角形を縦横に連ね、それらの外周に第３の領域を設けた細胞培養基材を設計した。このような形状の細胞増殖エリアを有する細胞培養基材を、本実施例では、ハニカムタイプの細胞培養基材と指称する。図１３は、ハニカムタイプの細胞培養基材の設計を説明する図である。図１３において、Ａは、正六角形からなる第１の領域の外接円直径の設計値、Ｂは外接円の直径方向のギャップ長さ設計値、Ｃは、第２の領域の幅の設計値、Ｄは、正六角形の平行な２辺の距離の設計値と定義した。
　Ａ～Ｄを変更した６種類のサンプルを設計し、設計に基づき、実施例Ｉの（２）と同様にして、第１の層であるＩＴＯのパターニングを行った。第２の層は、ＴｙｐｅＩ　ｃｏｌｌａｇｅｎ（メルク製、品番Ｃ９７９１－１０ＭＧ）を含む層を設けた。図１４は、図１３の設計図に基づいて実際に製造された細胞培養基材のイメージであって、ハニカム形状の細胞増殖エリア（ａ）、及び（ａ）の領域Ｚにおける拡大写真（ｂ）である。図１４において、正六角形の第１の領域の外接円の直径の実測値をＥ、外接円の直径方向のギャップ長さの実測値をＦ、第２の領域幅の実測値をＧ、正六角形の平行な２辺の距離の実測値をＨ、アンダーカットにより一部がエッチングされたＩＴＯ層の幅の実測値をＩと定義した。
　６種類のサンプルの設計値と実測値を表１に示す。表中、設計値はＤｅｓ、実測値はＭｅａと略した。表中の実測値Ｍｅａは、異なる３箇所で測定した結果の平均値を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　表１から、作製工程上避けられないアンダーカットが生じているが、ほぼ設計値通りに作製できた。
（２）シングル六角形タイプの細胞培養基材の設計と製造
　図１または図３の円形の第１の領域１１を正六角形に変更し、正六角形の周囲に沿って幅が均一の第２の領域を設けた以外は図１または図３と同様のパターンをもつ細胞培養基材を設計した。第１の領域は１つだけ設け、第２の領域の外周は第３の領域とした。このような形状の細胞増殖エリアを有する細胞培養基材を、本実施例では、シングル六角形タイプの細胞培養基材と指称する。設計に基づき、実施例Ｉの（２）と同様にして、第１の層であるＩＴＯのパターニングを行った。第２の層は、ＴｙｐｅＩ　ｃｏｌｌａｇｅｎ（メルク製、品番Ｃ９７９１－１０ＭＧ）を含む層を設けた。
（３）細胞培養基材を用いた細胞のパターニング
　Ｓａｍｐｌｅ　Ｎｏ．１のハニカムタイプの細胞培養基材、及び第１の領域の外接円直径の設計値Ａを４５０μｍ、ギャップ長さの設計値Ｂを５０μｍとしたシングル六角形タイプの細胞培養基材に、５．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬの、蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を発現するように改変されたヒト膠芽腫細胞株Ｕ－８７を含む細胞懸濁液を播種し、２日間培養を行った。培養開始から、毎日１回、所定の時間にわたって、ピーク波長が２５４ｎｍの紫外線に露光した。播種直後及び２日後の基材上の細胞を観察した。観察結果を図１５～１８に示す。
　図１５は、ハニカムタイプの細胞培養基材に細胞を播種した直後（ａ）、及び紫外線の積算露光量を０ｍＪ／ｃｍ２として培養後２日目（ｂ）の蛍光イメージである。培養にあたって紫外線を照射しておらず、図１５から、第１、第２の領域の両方において、細胞が増殖したことが確認された。ここで、第２の領域においては、ＩＴＯ層によるヒト膠芽腫細胞株Ｕ-８７の蛍光の吸収がないので、第２の領域のＵ-８７細胞は領域１のＵ-８７より相対的に明るく観察されていると考えられる。図１６は、ハニカムタイプの細胞培養基材に細胞を播種した直後（ａ）、及び紫外線の積算露光量を２０７６ｍＪ／ｃｍ２、露光時間を１日１回、１２００ｓｅｃとして培養後２日目（ｂ）の蛍光イメージである。図１６から、紫外線照射により、第２の領域の細胞を死滅させ、複数の六角形の第１の領域に、他の第１の領域から隔離された細胞コロニーを生成できたことが確認された。
　図１７は、シングル六角形タイプの細胞培養基材に細胞を播種した直後（ａ）、及び紫外線の積算露光量を０ｍＪ／ｃｍ２として培養後２日目（ｂ）の蛍光イメージである。培養にあたって紫外線を照射しておらず、図１７から、第１、第２の領域の両方において、細胞が増殖したことが確認された。図１８は、シングル六角形タイプの細胞培養基材に細胞を播種した直後（ａ）、及び紫外線の積算露光量を２０７６ｍＪ／ｃｍ２、露光時間を１日１回、１２００ｓｅｃとして培養後２日目（ｂ）の蛍光イメージである。図１８から、紫外線照射により、第２の領域の細胞を死滅させ、単一の第１の領域に、周囲から隔離された細胞コロニーを生成できたことが確認された。
図１５から図１８に示した結果より、円形パターンと同様に正六角形のＩＴＯ層を用いても、細胞のパターニングができることが確認された。また、正六角形のＩＴＯ層をハニカム状に密に配置しても、同様の結果が得られることが確認された。
　（４）第１の領域における細胞増殖率と第２の領域への細胞結合数の検討
　ハニカムタイプ、及びシングル六角形タイプの細胞培養基材について、第１の領域の外接円直径の設計値Ａ及びギャップ長さ設計値Ｂを変更し、所定量の紫外線露光後に、第１の領域における細胞増殖率と第２の領域への細胞結合数を調べた。コーティング材の種類及び塗布は、実施例ＩＩの（１）、（２）と同様に、細胞培養条件は実施例ＩＩの（３）と同様とした。紫外線へは１日１回露光した。紫外線露光量０ｍＪ／ｃｍ２、１０３８ｍＪ／ｃｍ２（露光時間は６００ｓｅｃ）、または２０７６ｍＪ／ｃｍ２（露光時間は１２００ｓｅｃ）とした場合について評価した。第１の領域における細胞増殖率の指標としては、第１の領域の面積に対する細胞の専有面積率を用い、細胞の播種時、培養２日目の専有面積を取得した。専有面積の取得方法は、実施例Ｉの（４）と同様とした。ハニカムタイプの細胞培養基材については、専有面積は、最外周の正六角形以外でランダムに選択した３つの正六角形を用いて評価し、その平均値とした。第２の領域への細胞結合数は、ある第１の領域の外周と、隣接する別の第１の領域の外周もしくは第３の領域が細胞により接続される箇所の数により評価した。ハニカムタイプの細胞培養基材については、結合細胞数は、最外周の正六角形以外でランダムに選択した３つの正六角形を用いて評価し、その平均値とした。
　評価結果を、図１９～２２に示す。右上の凡例は、ギャップ長さ設計値Ｂ（μｍ）を示す。また、紫外線露光量は、各図ともに、上段（ａ）が０ｍＪ／ｃｍ２、中段（ｂ）が１０３８ｍＪ／ｃｍ２、下段（ｃ）が２０７６ｍＪ／ｃｍ２の結果を示す。各グラフにおいて、白色のプロットは第１の領域内の細胞増殖率を示し、左軸の第１の領域の面積に対する細胞の専有面積率で表す。黒色のプロットは、右軸の第２の領域への細胞結合数を表す。第２の領域への細胞結合数が１０より多いものは、１０と表した。
　図１９は、外接円の直径の設計値Ａが７５０μｍのハニカムタイプの細胞培養基材を用いた評価結果であり、図２０は、外接円の直径の設計値Ａが７５０μｍのシングル六角形タイプの細胞培養基材を用いた評価結果である。図２１は、外接円の直径の設計値Ａが４５０μｍのハニカムタイプの細胞培養基材を用いた評価結果であり、図２２は、外接円の直径の設計値Ａが４５０μｍのシングル六角形タイプの細胞培養基材を用いた評価結果である。
　図１９から図２２により、第１の領域が正六角形の場合も、円形の場合と同じく、紫外線の露光量を増加させることにより、第２の領域への細胞結合数を有意に減少させ、第１の領域において細胞増殖を可能にすることが確認された。ただし、本実験における積算露光量ではギャップ長さが２５μｍにおいては、細胞の結合抑止が十分ではない場合がある。そのため、ギャップ長さを２５μｍ以下とする場合は、積算露光量を増すことで、細胞の結合をより確実に抑止できると考えられる。
　１　細胞培養基材
　１０　基板
　１１　第１の領域
　１２　第２の領域
　２０　第１の層
　２１　第１の部分
　２２　第２の部分
　３０　第２の層
　１００　細胞パターニング装置
　１１０　紫外線照射装置
 

Claims (6)

  1. 　紫外線を遮蔽する第１の領域と紫外線を透過させる第２の領域とを有する細胞培養基材の一方の面に細胞を付着させる工程と、
    　前記細胞培養基材の、前記細胞を付着させた面と逆側の面から紫外線を照射する工程とを含み、
    　前記紫外線を照射する工程によって、前記細胞培養基材に付着した細胞のうち前記第２の領域上の細胞を除去する、細胞パターニング方法。
  2. 　前記細胞培養基材は、
    　　可視光および紫外線を透過する基板と、
    　　前記基板上に形成された、紫外線遮蔽性能を有する部分を備える第１の層と
    を備える、請求項１に記載の細胞パターニング方法。
  3. 　前記紫外線遮蔽性能を有する部分は、酸化インジウムスズであり、
    　前記細胞培養基板の前記第１の層は、前記第１の領域に対応して前記酸化インジウムスズが配置された第１の部分と、前記第２の領域に対応して前記酸化インジウムスズが配置されていない第２の部分とを有し、
    　前記第２の部分は、前記第１の領域の境界を画定するように、前記第１の部分の周囲に設けられている、請求項２に記載の細胞パターニング方法。
  4. 　前記細胞培養基材は、前記第１の層上、または前記基板の前記第１の層とは逆側の面に形成され、細胞増殖を補助するための第２の層をさらに備える、請求項２に記載の細胞パターニング方法。
  5. 　紫外線を遮蔽する第１の領域と紫外線を透過させる第２の領域とを有する細胞培養基材と、
    　前記細胞培養基材に紫外線を照射可能な紫外線照射装置と
    　を備え、
    　前記紫外線照射装置によって前記紫外線を照射することにより、前記細胞培養基材に付着した細胞のうち前記第２の領域上の細胞を除去する、細胞パターニング装置。
  6. 　パターニングされた細胞集団の製造方法であって、
    　紫外線を遮蔽する第１の領域と紫外線を透過させる第２の領域とを有する細胞培養基材の一方の面に細胞を付着させる工程と、
    　付着させた前記細胞を培養する工程と
    を含み、
    　前記培養する工程において、細胞を前記細胞培養基材の、前記細胞を付着させた面と逆側の面から紫外線を照射する工程を含む、方法。
     
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