KR102273322B1

KR102273322B1 - 복합 한약재 추출물을 유효성분으로 포함하는 알츠하이머병 예방, 치료, 또는 개선용 조성물

Info

Publication number: KR102273322B1
Application number: KR1020210004068A
Authority: KR
Inventors: 김세윤; 유인식; 이진혁
Original assignee: 우보한의연구소(주)
Priority date: 2020-04-29
Filing date: 2021-01-12
Publication date: 2021-07-06

Abstract

본 발명은 복합 한약재 추출물을 유효성분으로 포함하는 알츠하이머병 예방, 치료, 또는 개선용 조성물 및 복합 한약재 추출물의 제조방법에 관한 것으로서, 본 발명에 따른 복합 한약재 추출물은 장미근, 사과락, 및 봉안초를 포함하여, 한약재의 독성을 줄이면서도 기억 및 인지 기능을 증진시키고 우수한 항우울 및 항불안 효과를 나타내며, 뇌의 베타 아밀로이드(Aβ) 축적을 억제하는 효과를 가지는 바, 알츠하이머병의 예방 또는 치료에 유용하게 이용할 수 있을 것으로 기대된다.

Description

복합 한약재 추출물을 유효성분으로 포함하는 알츠하이머병 예방, 치료, 또는 개선용 조성물 {A composition for preventing, treating, or improving Alzheimer's disease comprising complex medicinal herb extract as an effective ingredient}

본 발명은 복합 한약재 추출물을 유효성분으로 포함하는 알츠하이머병 예방, 치료, 또는 개선용 조성물 및 복합 한약재 추출물의 제조방법에 관한 것이다.

전 세계적으로 평균 수명이 늘어나고 노인 인구가 증가하는 고령화 사회로 변화하면서 치매를 일으키는 많은 질환들의 발병률이 크게 증가하고 있다. 치매를 일으키는 많은 질환 중에 가장 흔한 것 중에 하나가 알츠하이머병이다.

이러한 알츠하이머병과 같은 뇌신경 질환들은 특정 뇌세포의 사멸 또는 퇴화가 일시적 또는 오랜 기간에 걸쳐 진행하는 것이 특징인데, 한번 죽은 뇌세포는 재생이 되지 않기 때문에 결국 치명적인 뇌기능의 손실로 이어진다. 특히, 인지기능, 감각기증, 운동기능, 전신기능의 진행성 저하를 수반하는 뇌기능 부전은 결국 성격과 행동의 변화를 가져오고, 결국 알츠하이머병 환자는 자기 자신을 통제하거나 보호할 수 없는 상태에 이르게 된다.

알츠하이머병의 발병 기전은 명확히 알려져 있지 않으나, 신경독성 단백질인 베타 아밀로이드(β-amyloid)의 독성이 중요한 원인으로 제시되고 있다. 이 물질은 아밀로이드 전구단백질(APP: amyloid precursor protein)의 잘못된 대사로 인해 생성되는 것으로 알려져 있고, APP의 정상 대사물은 신경세포 보호작용이 있는 것으로 보고되고 있다. 최근 유전공학적 방법을 이용한 연구 결과에서는 베타 아밀로이드(β-amyloid)등의 독성 단백질이 세포와 혈관에 쌓여 신경세포에 독성을 미침으로써 결과적으로 뇌기능에 장애가 초래된다는 사실이 밝혀졌다.

그러나, 현재까지 근본적인 치료제는 전무할 뿐만 아니라, 병의 진행을 일시적으로 억제하는 치료제조차도 병세 악화에 따라 약효가 감소하여 다양한 부작용이 발생하는 문제점이 있다.

한편, 한의학에서 주로 사용하는 한약재들은 발병 원인 및 증상이 복합적으로 나타나는 만성 및 난치성 질환의 예방 및 치료에 있어서 멀티 타겟 기전에 의해 보다 근본적인 치료제로 주목받고 있다.

이에, 이러한 퇴행성 뇌질환을 치료할 뿐만 아니라 예방할 수 있고, 다양한 부작용을 최소화할 수 있는 한약재를 원료로 하는 복합 한약재 추출물에 대한 연구가 필요한 실정이다.

대한민국 등록특허 제10-1987418호(2019.06.10)

본 발명자들은 한약재의 독성을 줄이면서도 알츠하이머병에 대해 우수한 예방 또는 치료 효과를 나타낼 수 있는 복합 한약재 추출물을 제조하였는 바, 이에 기초하여 본 발명을 완성하였다.

이에, 본 발명의 목적은 장미근, 사과락, 및 봉안초를 포함하는 복합 한약재의 추출물을 유효성분으로 포함하는, 알츠하이머병 예방, 치료, 또는 개선용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 장미근, 사과락, 및 봉안초를 포함하는 복합 한약재의 추출물을 제조하는 방법을 제공하는 것이다.

그러나, 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위해 본 발명은 장미근, 사과락, 및 봉안초를 포함하는 복합 한약재의 추출물을 유효성분으로 포함하는, 알츠하이머병 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 장미근, 사과락, 및 봉안초를 포함하는 복합 한약재의 추출물을 유효성분으로 포함하는, 알츠하이머병 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 구현예로서, 상기 식품 조성물은 건강기능식품 조성물일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 복합 한약재의 추출물은 기억 또는 인지 기능을 증진시킬 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 복합 한약재의 추출물은 우울 또는 불안 증상을 개선할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 복합 한약재의 추출물은 뇌의 베타 아밀로이드(Aβ) 축적을 억제할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 복합 한약재의 추출물은 간 보호 활성을 가질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 복합 한약재의 추출물은 개체의 체중에 대하여 10 mg/kg 내지 250 mg/kg의 용량으로 경구 투여될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 추출물은 물, C₁내지 C₄의 저급알코올, n-헥산, 에틸아세테이트, 아세톤, 아세토니트릴, 부틸아세테이트, 1,3-부틸렌 글리콜, 메틸렌클로라이드, 및 이들의 혼합용매로 구성된 군으로부터 선택된 하나의 용매로 추출될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또한, 본 발명은 (a) 장미근, 사과락, 및 봉안초를 포함하는 복합 한약재를 혼합하는 단계; 및

(b) 상기 혼합된 복합 한약재에 추출용매를 첨가하여 복합 한약재 추출물을 추출하는 단계를 포함하는, 복합 한약재 추출물의 제조방법으로서,

상기 복합 한약재 추출물은 알츠하이머병 예방 또는 치료 활성을 가지는 것을 특징으로 하는, 제조방법을 제공한다.

본 발명의 다른 구현예로서, 상기 (b) 단계에서 추출은 10 ℃ 내지 40 ℃에서 60 시간 내지 84 시간 동안 이루어질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또한, 본 발명은 장미근, 사과락, 및 봉안초를 포함하는 복합 한약재의 추출물을 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 알츠하이머병의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 장미근, 사과락, 및 봉안초를 포함하는 복합 한약재의 추출물을 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물의 알츠하이머병 예방 또는 치료 용도를 제공한다.

또한, 본 발명은 장미근, 사과락, 및 봉안초를 포함하는 복합 한약재의 추출물의, 알츠하이머병 치료용 약제의 제조를 위한 용도를 제공한다.

본 발명에 따른 복합 한약재 추출물은 장미근, 사과락, 및 봉안초를 포함하여, 한약재의 독성을 줄이면서도 기억 및 인지 기능을 증진시키고 우수한 항우울 및 항불안 효과를 나타내며, 뇌의 베타 아밀로이드(Aβ) 축적을 억제하는 효과를 가지는 바, 알츠하이머병의 예방 또는 치료에 유용하게 이용할 수 있을 것으로 기대된다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 복합 한약재 추출물 투여 마우스에 대한 학습(training) 및 기억(Testing) 시험 결과를 나타낸 그래프이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 복합 한약재 추출물 투여 마우스에 대한 Y 미로 실험 결과를 나타낸 그래프이다.
도 3a 내지 3c는 본 발명의 일 실시예에 따른 복합 한약재 추출물 투여 마우스에 대한 인지기능 실험을 위해 모리스(Morris) 물-미로 실험을 수행한 결과를 나타낸 그래프로서, 도 3a는 각 마우스를 대상으로 4일 동안 연속적으로 학습 시험한 그래프이고, 도 3b는 각 마우스를 대상으로 학습 시험 수행 24시간 후에 검사 시험한 결과를 나타낸 그래프이며, 도 3c는 시험을 수행하는 동안 마우스가 zone에 머무는 시간을 나타낸 그래프이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 복합 한약재 추출물 투여 마우스에 대한 항우울 효과 실험으로 강제 수영 검사한 결과 그래프이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 복합 한약재 추출물 투여 마우스에 대한 항우울 효과 실험으로 꼬리 매달기 검사한 결과 그래프이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 복합 한약재 추출물 투여 마우스에 대한 항불안 효과 실험으로 재개방 검사(Open field)한 결과 그래프이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 복합 한약재 추출물 투여 마우스의 혈액을 분석한 그래프이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른 복합 한약재 추출물 투여 마우스의 뇌에서의 베타 아밀로이드의 양을 측정한 그래프이다.
도 9는 본 발명의 일 실시예에 따른 복합 한약재 추출물 투여 마우스의 대뇌피질을 면역염색한 이미지와 대뇌피질에 존재하는 플라그(plaques)의 면적 당 개수를 나타낸 그래프이다.
도 10은 본 발명의 일 실시예에 따른 복합 한약재 추출물 투여 마우스의 뇌 해마부위를 면역염색한 이미지와 뇌 해마부위에 존재하는 플라그(plaques)의 면적 당 개수를 나타낸 그래프이다.
도 11은 본 발명의 일 실시예에 따른 복합 한약재 추출물 투여 마우스의 대뇌피질에서의 단백질 검사를 수행한 이미지 및 그래프이다.

본 발명자들은 장미근, 사과락, 및 봉안초를 포함하는 복합 한약재의 추출물을 제조하고, 알츠하이머병에 대한 상기 복합 한약재 추출물의 효과를 확인하였다.

본 발명의 일 실험예에서는 수동 회피 실험 및 Y 미로 실험을 통해 본 발명에 따른 복합 한약재 추출물을 투여한 마우스의 기억력 증진 효과를 확인하였다(실험예 1 참조).

본 발명의 다른 실험예에서는 모리스 물-미로 실험을 통해 본 발명에 따른 복합 한약재 추출물을 투여한 마우스의 인지기능 증진 효과를 확인하였다(실험예 2 참조).

본 발명의 또 다른 실험예에서는 강제 수영 검사 및 꼬리 매달기 검사를 통해 본 발명에 따른 복합 한약재 추출물을 투여한 마우스의 항우울 효과를 확인하였다(실험예 3 참조).

본 발명의 또 다른 실험예에서는 보행활동 수준 및 정서기능을 확인하기 위해 개방장 검사를 실시하여 본 발명에 따른 복합 한약재 추출물을 투여한 마우스의 항불안 효과를 확인하였다(실험예 4 참조).

본 발명의 또 다른 실험예에서는 본 발명에 따른 복합 한약재 추출물을 투여한 마우스의 혈액 분석 결과 GOT, GPT, 및 트리글리세라이드의 양이 감소되고 HDL 콜레스테롤 양이 증가된 것을 확인하여, 상기 복합 한약재 추출물이 간 보호 활성을 가져 독성이 낮은 한약재를 제공할 수 있음을 확인하였다(실험예 5 참조).

본 발명의 또 다른 실험예에서는 본 발명에 따른 복합 한약재 추출물을 투여한 마우스 뇌에서의 베타 아밀로이드의 축적량이 감소된 것을 확인하였다(실험예 6 참조).

본 발명의 또 다른 실험예에서는 본 발명에 따른 복합 한약재 추출물을 투여한 마우스의 대뇌피질 및 해마 부위에서 베타 아밀로이드의 양이 감소된 것을 확인하였다(실험예 7 참조).

본 발명의 또 다른 실험예에서는 본 발명에 따른 복합 한약재 추출물을 투여한 마우스의 대뇌피질에서 베타 아밀로이드 42 및 인산화된 타우 단백질의 양이 감소된 것을 확인하였다(실험예 8 참조).

이에, 본 발명은 장미근, 사과락, 및 봉안초를 포함하는 복합 한약재의 추출물을 유효성분으로 포함하는, 알츠하이머병 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명에 있어서, “장미근”은 가시나무라고도 하는 찔레나무(Rosa multiflora Thunb.)의 뿌리로, 열(熱)을 내리고 습(濕)을 거두며 풍(風)을 제거하고 혈액 순환을 촉진시키며 해독하는 효능이 있는 약재로 알려져 있다.

본 발명에 있어서, “사과락”은 수세미오이(Luffa cylindrica Roemer)(박과 Cucurbitaceae)의 익은 열매를 씨와 껍질을 버리고 말린 것을 의미하며, 라틴생약명은 Luffae Fructus Retinervu이다. 맛은 달고 성질은 차며, 폐경(肺經), 위경(胃經), 간경(肝經)에 작용한다. 기와 혈액 순환을 촉진하고 풍사(風邪)와 혈열(血熱)을 없애며 소변이 잘 나오게 한다. 옆구리와 팔다리의 통증, 유종(乳腫), 젖의 분비가 부족한 증, 장출혈, 무월경, 소변을 자주 누는 데, 부종, 장염, 옹종(癰腫), 습진 등에 쓴다. 하루 5~10 g을 탕약으로 먹으며, 외용약으로 쓸 때는 까맣게 덖아서 가루 내어 기초(약)제에 개어 바른다.

본 발명에 있어서, “봉안초”는 가죽나무(Ailanthus altissima(=Ailanthus glandulosa))의 과실로서, 이질(痢疾), 장풍변혈(腸風便血), 혈뇨(血尿), 자궁 출혈, 백대하(白帶下)를 치료하는 약재로 알려져 있다.

본 발명에 있어서, “한약재”는 한약으로 사용하기 위해 간단한 선별세척, 절단, 건조, 포장 등 가공 혹은 제조과정을 거친 원료 약재를 의미한다.

본 발명에 있어서, 복합 한약재는 여러 가지 종류의 한약재를 혼합한 것으로서, 장미근, 사과락, 및 봉안초가 각각 일정한 중량비로 포함될 수 있으며, 상기 복합 한약재에 포함되는 장미근 : 사과락 : 봉안초의 중량비는 1 : 0.2 내지 5 : 0.2 내지 5, 1 : 0.2 내지 3 : 0.2 내지 3, 1 : 0.2 내지 1 : 0.2 내지 1, 1 : 0.5 내지 1 : 0.5 내지 1, 1 : 0.5 내지 3 : 0.5 내지 3, 1 : 1 내지 5 : 1 내지 5, 1 : 1 내지 3 : 1 내지 3, 또는 1 : 1 : 1일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 일 제조예에 따르면 상기 복합 한약재 100 중량%를 기준으로 장미근, 사과락, 및 봉안초를 각각 0.1 중량% 내지 33 중량%, 0.1 중량% 내지 30 중량 %, 0.1 중량% 내지 25 중량%, 0.1 중량% 내지 20 중량%, 0.1 중량% 내지 15 중량%, 0.1 중량% 내지 10 중량%, 0.1 중량% 내지 5 중량%, 0.1 중량% 내지 1 중량%, 1 중량% 내지 33 중량%, 1 중량% 내지 25 중량%, 1 중량% 내지 15 중량%, 1 중량% 내지 5 중량%, 5 중량% 내지 33 중량%, 5 중량% 내지 25 중량%, 5 중량% 내지 15 중량%, 10 중량% 내지 33 중량%, 15 중량% 내지 33 중량%, 20 중량% 내지 33 중량%, 25 중량% 내지 33 중량%, 또는 30 중량% 내지 33 중량%로 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 복합 한약재에는 당업계에서 통상적으로 사용되는 한약재 종류가 추가로 더 포함될 수 있으며, 이의 종류 및 중량비에는 제한이 없다.

본 발명에 있어서, “추출물”은 상기 장미근, 사과락, 및 봉안초를 포함하는 복합 한약재의 추출처리에 의하여 얻어지는 추출액, 상기 추출액의 희석액이나 농축액, 상기 추출액을 건조하여 얻어지는 건조물, 상기 추출액의 조정제물이나 정제물, 또는 이들의 혼합물 등, 추출액 자체 및 추출액을 이용하여 형성 가능한 모든 제형의 추출물을 포함한다.

본 발명의 상기 장미근, 사과락, 및 봉안초를 포함하는 복합 한약재의 추출물에 있어서, 상기 복합 한약재를 추출하는 방법은 특별히 제한되지 아니하며, 당해 기술분야에서 통상적으로 사용하는 방법에 따라 추출할 수 있다. 상기 추출 방법의 비제한적인 예로는, 열수 추출법, 초음파 추출법, 여과법, 환류 추출법 등을 들 수 있으며, 이들은 단독으로 수행되거나 2 종 이상의 방법을 병용하여 수행될 수 있다.

본 발명에서 상기 장미근, 사과락, 및 봉안초를 포함하는 복합 한약재를 추출하는 데에 사용되는 추출 용매의 종류는 특별히 제한되지 아니하며, 천연물로부터 추출물을 추출하는 당업계에 공지된 통상적인 방법에 따라, 즉, 통상적인 온도, 압력의 조건 하에서 통상적인 용매를 사용하여 추출할 수 있다. 예컨대, 본 발명에 있어서 상기 복합 한약재 추출물은 물, C₁내지 C₄의 저급알코올, n-헥산, 에틸아세테이트, 아세톤, 아세토니트릴, 부틸아세테이트, 1,3-부틸렌 글리콜, 메틸렌클로라이드, 및 이들의 혼합용매로 구성된 군으로부터 선택된 하나의 용매로 추출될 수 있으며, 본 발명의 일 실시예에 따르면 에탄올을 용매로 사용하여 추출할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에 있어서, 상기 추출용매가 에탄올일 경우, 에탄올의 농도는 10 % 내지 100 %, 10 % 내지 90 %, 10 % 내지 80 %, 10 % 내지 70 %, 10 % 내지 60 %, 10 % 내지 50 %, 10 % 내지 40 %, 20 % 내지 100 %, 20 % 내지 90 %, 20 % 내지 80 %, 20 % 내지 70 %, 20 % 내지 60 %, 20 % 내지 50 %, 20 % 내지 40 %, 또는 30 %일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 제조된 추출물은 이후 여과하거나 농축 또는 건조과정을 수행하여 용매를 제거할 수 있으며, 여과, 농축 및 건조를 모두 수행할 수 있다. 예컨대, 여과는 여과지를 이용하거나 감압여과기를 이용할 수 있으며, 농축은 감압 농축기, 건조는 동결건조법 등을 수행할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서 “예방”이란 알츠하이머병의 발병을 억제하거나 지연시키는 모든 행위를 의미하고, “치료”란 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여에 의해 알츠하이머병과 그에 따른 대사 이상 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미하며, “개선”이란 본 발명에 따른 조성물의 투여에 의해 알츠하이머병과 관련된 파라미터, 예를 들면 증상의 정도를 감소시키는 모든 행위를 의미한다.

본 발명에 따른 약학적 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다. 상기 부형제는 예를 들어, 희석제, 결합제, 붕해제, 활택제, 흡착제, 보습제, 필름-코팅 물질, 및 제어방출첨가제로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있다.

본 발명에 따른 약학적 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 서방형 과립제, 장용과립제, 액제, 점안제, 엘실릭제, 유제, 현탁액제, 주정제, 트로키제, 방향수제, 리모나아데제, 정제, 서방형정제, 장용정제, 설하정, 경질캅셀제, 연질캅셀제, 서방캅셀제, 장용캅셀제, 환제, 틴크제, 연조엑스제, 건조엑스제, 유동엑스제, 주사제, 캡슐제, 관류액, 경고제, 로션제, 파스타제, 분무제, 흡입제, 패취제, 멸균주사용액, 또는에어로졸 등의 외용제 등의 형태로 제형화하여 사용될 수 있으며, 상기 외용제는 크림, 젤, 패치, 분무제, 연고제, 경고제, 로션제, 리니멘트제, 파스타제 또는 카타플라스마제 등의 제형을 가질 수 있다.

본 발명에 따른 약학적 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 올리고당, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.

제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다.

본 발명에 따른 정제, 산제, 과립제, 캡슐제, 환제, 트로키제의 첨가제로 옥수수전분, 감자전분, 밀전분, 유당, 백당, 포도당, 과당, 디-만니톨, 침강탄산칼슘, 합성규산알루미늄, 인산일수소칼슘, 황산칼슘, 염화나트륨, 탄산수소나트륨, 정제 라놀린, 미결정셀룰로오스, 덱스트린, 알긴산나트륨, 메칠셀룰로오스, 카르복시메칠셀룰로오스나트륨, 카올린, 요소, 콜로이드성실리카겔, 히드록시프로필스타치, 히드록시프로필메칠셀룰로오스(HPMC), HPMC 1928, HPMC 2208, HPMC 2906, HPMC 2910, 프로필렌글리콜, 카제인, 젖산칼슘, 프리모젤 등 부형제; 젤라틴, 아라비아고무, 에탄올, 한천가루, 초산프탈산셀룰로오스, 카르복시메칠셀룰로오스, 카르복시메칠셀룰로오스칼슘, 포도당, 정제수, 카제인나트륨, 글리세린, 스테아린산, 카르복시메칠셀룰로오스나트륨, 메칠셀룰로오스나트륨, 메칠셀룰로오스, 미결정셀룰로오스, 덱스트린, 히드록시셀룰로오스, 히드록시프로필스타치, 히드록시메칠셀룰로오스, 정제쉘락, 전분호, 히드록시프로필셀룰로오스, 히드록시프로필메칠셀룰로오스, 폴리비닐알코올, 폴리비닐피롤리돈 등의 결합제가 사용될 수 있으며, 히드록시프로필메칠셀룰로오스, 옥수수전분, 한천가루, 메칠셀룰로오스, 벤토나이트, 히드록시프로필스타치, 카르복시메칠셀룰로오스나트륨, 알긴산나트륨, 카르복시메칠셀룰로오스칼슘, 구연산칼슘, 라우릴황산나트륨, 무수규산, 1-히드록시프로필셀룰로오스, 덱스트란, 이온교환수지, 초산폴리비닐, 포름알데히드처리 카제인 및 젤라틴, 알긴산, 아밀로오스, 구아르고무(Guar gum), 중조, 폴리비닐피롤리돈, 인산칼슘, 겔화전분, 아라비아고무, 아밀로펙틴, 펙틴, 폴리인산나트륨, 에칠셀룰로오스, 백당, 규산마그네슘알루미늄, 디-소르비톨액, 경질무수규산 등 붕해제; 스테아린산칼슘, 스테아린산마그네슘, 스테아린산, 수소화식물유(Hydrogenated vegetable oil), 탈크, 석송자, 카올린, 바셀린, 스테아린산나트륨, 카카오지, 살리실산나트륨, 살리실산마그네슘, 폴리에칠렌글리콜(PEG) 4000, PEG 6000, 유동파라핀, 수소첨가대두유(Lubri wax), 스테아린산알루미늄, 스테아린산아연, 라우릴황산나트륨, 산화마그네슘, 마크로골(Macrogol), 합성규산알루미늄, 무수규산, 고급지방산, 고급알코올, 실리콘유, 파라핀유, 폴리에칠렌글리콜지방산에테르, 전분, 염화나트륨, 초산나트륨, 올레인산나트륨, dl-로이신, 경질무수규산 등의 활택제;가 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 액제의 첨가제로는 물, 묽은 염산, 묽은 황산, 구연산나트륨, 모노스테아린산슈크로스류, 폴리옥시에칠렌소르비톨지방산에스텔류(트윈에스텔), 폴리옥시에칠렌모노알킬에텔류, 라놀린에텔류, 라놀린에스텔류, 초산, 염산, 암모니아수, 탄산암모늄, 수산화칼륨, 수산화나트륨, 프롤아민, 폴리비닐피롤리돈, 에칠셀룰로오스, 카르복시메칠셀룰로오스나트륨 등이 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 시럽제에는 백당의 용액, 다른 당류 혹은 감미제 등이 사용될 수 있으며, 필요에 따라 방향제, 착색제, 보존제, 안정제, 현탁화제, 유화제, 점조제 등이 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 유제에는 정제수가 사용될 수 있으며, 필요에 따라 유화제, 보존제, 안정제, 방향제 등이 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 현탁제에는 아카시아, 트라가칸타, 메칠셀룰로오스, 카르복시메칠셀룰로오스, 카르복시메칠셀룰로오스나트륨, 미결정셀룰로오스, 알긴산나트륨, 히드록시프로필메칠셀룰로오스(HPMC), HPMC 1828, HPMC 2906, HPMC 2910 등 현탁화제가 사용될 수 있으며, 필요에 따라 계면활성제, 보존제, 안정제, 착색제, 방향제가 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 주사제에는 주사용 증류수, 0.9%염화나트륨주사액, 링겔주사액, 덱스트로스주사액, 덱스트로스+염화나트륨주사액, 피이지(PEG), 락테이티드 링겔주사액, 에탄올, 프로필렌글리콜, 비휘발성유-참기름, 면실유, 낙화생유, 콩기름, 옥수수기름, 올레인산에칠, 미리스트산 이소프로필, 안식향산벤젠과 같은 용제; 안식향산나트륨, 살리실산나트륨, 초산나트륨, 요소, 우레탄, 모노에칠아세트아마이드, 부타졸리딘, 프로필렌글리콜, 트윈류, 니정틴산아미드, 헥사민, 디메칠아세트아마이드와 같은 용해보조제; 약산 및 그 염(초산과 초산나트륨), 약염기 및 그 염(암모니아 및 초산암모니움), 유기화합물, 단백질, 알부민, 펩 톤, 검류와 같은 완충제; 염화나트륨과 같은 등장화제; 중아황산나트륨(NaHSO₃) 이산화탄소가스, 메타중아황산나트륨(Na₂S₂O₅), 아황산나트륨(Na₂SO₃), 질소가스(N₂), 에칠렌디아민테트라초산과 같은 안정제; 소디움비설파이드 0.1%, 소디움포름알데히드 설폭실레이트, 치오우레아, 에칠렌디아민테트라초산디나트륨, 아세톤소디움비설파이트와 같은 황산화제; 벤질알코올, 클로로부탄올, 염산프로카인, 포도당, 글루콘산칼슘과 같은 무통화제; 시엠시나트륨, 알긴산나트륨, 트윈 80, 모노스테아린산알루미늄과 같은 현탁화제를 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 좌제에는 카카오지, 라놀린, 위텝솔, 폴리에틸렌글리콜, 글리세로젤라틴, 메칠셀룰로오스, 카르복시메칠셀룰로오스, 스테아린산과 올레인산의 혼합물, 수바날(Subanal), 면실유, 낙화생유, 야자유, 카카오버터+콜레스테롤, 레시틴, 라네트왁스, 모노스테아린산글리세롤, 트윈 또는 스판, 임하우젠(Imhausen), 모놀렌(모노스테아린산프로필렌글리콜), 글리세린, 아뎁스솔리두스(Adeps solidus), 부티룸 태고-G(Buytyrum Tego-G), 세베스파마 16(Cebes Pharma 16), 헥사라이드베이스 95, 코토마(Cotomar), 히드록코테 SP, S-70-XXA, S-70-XX75(S-70-XX95), 히드록코테(Hydrokote) 25, 히드록코테 711, 이드로포스탈(Idropostal), 마사에스트라리움(Massa estrarium, A, AS, B, C, D, E, I, T), 마사-MF, 마수폴, 마수폴-15, 네오수포스탈-엔, 파라마운드-B, 수포시로(OSI, OSIX, A, B, C, D, H, L), 좌제기제 IV 타입(AB, B, A, BC, BBG, E, BGF, C, D, 299), 수포스탈(N, Es), 웨코비(W, R, S, M ,Fs), 테제스터 트리글리세라이드 기제(TG-95, MA, 57)와 같은 기제가 사용될 수 있다.

경구 투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 추출물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다.

경구 투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 약학적 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에 있어서, "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다.

본 발명에 따른 약학적 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 본 발명이 속하는 기술분야에 통상의 기술자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 개체에게 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구 복용, 피하 주사, 복강 투여, 정맥 주사, 근육 주사, 척수 주위 공간(경막내) 주사, 설하 투여, 볼점막 투여, 직장 내 삽입, 질 내 삽입, 안구 투여, 귀 투여, 비강 투여, 흡입, 입 또는 코를 통한 분무, 피부 투여, 경피 투여 등에 따라 투여될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 치료할 질환, 투여 경로, 환자의 연령, 성별, 체중 및 질환의 중등도 등의 여러 관련 인자와 함께 활성성분인 약물의 종류에 따라 결정된다.

본 발명의 약학적 조성물에 있어서, 상기 장미근, 사과락, 및 봉안초를 포함하는 복합 한약재의 추출물은 개체의 체중에 대하여 10 mg/kg 내지 250 mg/kg, 10 mg/kg 내지 230 mg/kg, 10 mg/kg 내지 210 mg/kg, 10 mg/kg 내지 190 mg/kg, 15 mg/kg 내지 250 mg/kg, 15 mg/kg 내지 230 mg/kg, 15 mg/kg 내지 210 mg/kg, 15 mg/kg 내지 190 mg/kg, 20 mg/kg 내지 250 mg/kg, 20 mg/kg 내지 230 mg/kg, 20 mg/kg 내지 210 mg/kg, 또는 20 mg/kg 내지 190 mg/kg의 용량으로 경구 투여될 수 있으며, 상기와 같은 함량으로 이용함으로써, 조성물의 독성을 최대한 줄이면서 알츠하이머병의 예방 또는 치료 효과를 증대시킬 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에 있어서 “개체”란 질병의 치료를 필요로 하는 대상을 의미하고, 보다 구체적으로는 인간 또는 비-인간인 영장류, 생쥐(mouse), 쥐(rat), 개, 고양이, 말, 및 소 등의 포유류를 의미한다.

본 발명에 있어서 “투여”란 임의의 적절한 방법으로 개체에게 소정의 본 발명의 조성물을 제공하는 것을 의미한다.

본 발명의 다른 양태로서, 본 발명은 장미근, 사과락, 및 봉안초를 포함하는 복합 한약재의 추출물을 유효성분으로 포함하는, 알츠하이머병 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 식품 조성물은 건강기능식품 조성물일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 복합 한약재 추출물을 식품 첨가물로 사용할 경우, 상기 복합 한약재 추출물을 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용할 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용할 수 있다. 유효성분의 혼합양은 사용 목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조시 본 발명의 복합 한약재 추출물은 원료에 대하여 15 중량% 이하, 또는 10 중량% 이하의 양으로 첨가될 수 있다. 그러나, 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.

상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 물질을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강기능식품을 모두 포함한다.

본 발명에 따른 건강음료 조성물은 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물은 포도당 및 과당과 같은 모노사카라이드, 말토오스 및 수크로오스와 같은 디사카라이드, 덱스트린 및 시클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드, 및 자일리톨, 소르비톨 및 에리트리톨 등의 당알콜이다. 감미제로서는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제나, 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 mL당 일반적으로 약 0.01-0.20 g, 또는 약 0.04-0.10 g 이다.

상기 외에 본 발명의 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 조성물은 천연 과일쥬스, 과일쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 크게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물 100 중량부 당 0.01-0.20 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명은 (a) 장미근, 사과락, 및 봉안초를 포함하는 복합 한약재를 혼합하는 단계; 및

본 발명에 있어서, 상기 (b) 단계에서 추출은 10 ℃ 내지 40 ℃, 10 ℃ 내지 35 ℃, 10 ℃ 내지 30 ℃, 10 ℃ 내지 27 ℃, 15 ℃ 내지 40 ℃, 15 ℃ 내지 35 ℃, 15 ℃ 내지 30 ℃, 15 ℃ 내지 27 ℃, 20 ℃ 내지 40 ℃, 20 ℃ 내지 35 ℃, 20 ℃ 내지 30 ℃, 20 ℃ 내지 27 ℃, 또는 상온(25 ℃)의 온도에서 60 시간 내지 84 시간, 60 시간 내지 80 시간, 60 시간 내지 76 시간, 64 시간 내지 84 시간, 64 시간 내지 80 시간, 64 시간 내지 76 시간, 70 시간 내지 84 시간, 70 시간 내지 80 시간, 70 시간 내지 76 시간, 또는 72 시간 동안 가열하여 추출할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 추출온도가 10 ℃ 미만일 경우 추출시간이 지연되어 효율이 떨어지거나, 한약재의 추출이 제대로 이루어지지 않을 수 있는 문제점이 있으며, 상기 추출온도가 40 ℃를 초과할 경우에는 고온으로 인하여 약재성분에 변형이 생길 수 있는 문제점이 있다. 또한, 상기 추출시간이 60 시간 미만일 경우 한약재의 추출이 제대로 이루어지지 못하여 추출물의 약학적 기능이 저하될 수 있는 문제점이 발생할 수 있으며, 상기 추출시간이 84 시간을 초과할 경우에는 시간대비 얻을 수 있는 추출액의 양이 떨어져 비효율적인 단점이 있다.

본 발명에 있어서, 상기 복합 한약재 추출물의 제조방법은 상기 (a) 단계 이전에 각각의 한약재를 전처리하는 단계를 더 포함할 수 있다.

상기 전처리하는 단계는 장미근, 사과락, 및 봉안초를 회전식 볶음장치에서 볶아서 수행하는 단계를 포함할 수 있으며, 상기 회전식 볶음장치에 넣기 전에 건조한 후 분쇄하는 단계를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기와 같이 전처리하는 경우, 한약재의 떫은 맛과 진한 향을 완화시켜 복합 한약재 추출물 섭취시의 거부감을 줄일 수 있다.

한편, 본 발명에서 “포함하는” 이라는 용어가 사용될 때, 이는 다른 요소 또는 단계를 배제시키지 않는다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

[제조예]

본 발명의 복합 한약재 추출물은 장미근, 사과락, 및 봉안초를 1:1:1의 중량비로 혼합하고, 30 % 에탄올로 상온(25 ℃)에서 72 시간 동안 추출하여 제조하였다.

[실시예 및 비교예]

실험동물은 중앙동물(주)(한국)에서 수입한 형질전환 마우스(APPswe/PS1dE9 Tg)로 웅성 2개월된(20～26 g) 마우스를 구입하여 일산 실험 동물실에서 사육한 다음 사용하였으며, 온도 22±1 ℃, 습도 55±1 %, 12시간 명암 주기(light-dark cycle)에서 식이와 식수는 자유롭게 섭취하도록 하였고, 태어난 지 4.5개월이 지난 후 실험에 사용하였다.

상기 APPswe/PS1dE9 마우스 모델은 APP와 PS1의 두 가지 돌연변이 유전자를 포함하기에, 베타 아밀로이드(Aβ)의 과발현이 나타나 축적되며, 최소한 6개월령에 대뇌피질과 해마에 아밀로이드 반이 빠르게 형성되고, 해마의 치아 이랑(dentate gyrus) 주위의 신경조직 발생을 감소시킨다. 이에, 알츠하이머병 모델로 상기 APPswe/PS1dE9 마우스를 실험에 사용하였다.

실험은 정상 C57BL/6J 마우스와 알츠하이머병 모델 APPswe/PS1dE9 Tg 마우스 32마리를 4개군으로 나누어 다음과 같이 처리하였다.

실시예 1

4.5개월부터 제조예에서 제조한 복합 한약재 추출물(187 mg/kg)을 사료에 섞어 3개월간 먹인 APPswe/PS1dE9 Tg 마우스 8마리를 사용하였다.

비교예 1

정상군(Normal)으로 아무것도 처리하지 않은 C57BL/6J 마우스 8마리를 사용하였다.

비교예 2

음성 대조군(Control)으로 아무것도 처리하지 않은 APPswe/PS1dE9 Tg 마우스 8마리를 사용하였다.

비교예 3

양성 대조군으로서 알츠하이머병의 치료제인 도네페질(donepezil)을 투여한 군으로 4.5개월부터 0.1 mg/kg의 도네페질 약물을 사료에 섞어 3개월간 먹인 APPswe/PS1dE9 Tg 마우스 8마리를 사용하였다.

[실험예]

실험예 1. 복합 한약재 추출물의 기억력 증진 효과 확인

본 발명의 일 실시예에 따른 복합 한약재 추출물의 기억력 증진 효과를 확인하기 위해 다음과 같은 실험을 수행하였다.

① 수동 회피 실험

실험 기기는 내부가 두 개의 방으로 구성된 상자(shuttle box, 너비(width) 53 ㎝ × 높이(height) 44 ㎝ × 깊이(depth) 33 ㎝)로 중앙에는 두 방 사이의 문 역할을 하는 길로틴 도어(guillotine door)가 있다. 한쪽 방에는 실험동물이 싫어하는 환경을 만들기 위해 매우 밝은 전구가 있고, 다른 방에는 바닥(grid floor) 전체에 전기 쇼크(scrambled foot-shock)를 가할 수 있는 장치가 설치되어 있다.

학습 시험(Training trial)

마우스를 1마리씩 한쪽 방에 넣어 15초의 탐색시간을 주고, 상자의 상부에서 조명과 소음으로 자극하여 마우스가 길로틴 도어를 통과하여 조용하고 어두운 다른 방(전기 쇼크실)으로 이동하도록 하였다. 마우스가 전기 쇼크실로 이동하면 자동적으로 길로틴 도어가 닫히면서 전기 쇼크를 가하였다. 쇼크는 0.3 mA의 전류를 3초간 통하게 하였으며, 마우스가 족부-쇼크(foot-shock)를 받은 후 마우스를 상자에서 꺼내 케이지에 다시 넣어두었다. 동일한 방법으로 각각의 실시예 및 비교예의 마우스에 대하여 전기 쇼크를 가하였다. 120초 동안 쇼크실로 들어가지 않는 마우스는 실험대상에서 제외시켰다.

기억 시험(Test trial)

상기 학습(training)을 받은 마우스는 전기 쇼크를 받으면 전날의 쇼크를 기억하여 쇼크실로 잘 들어가지 않게 되며, 쇼크실에 도달하는 시간이 증가할수록 수동 회피의 학습과 기억효과가 우수함을 나타낸다. 상기 학습 시험을 수행한지 24시간 후, 마우스에 전기 쇼크를 가한 후 쇼크실 도달시간(step-through latency time)을 300초(cut-off time)까지 측정하였다. 약물 투여 후 0일, 30일, 60일, 90일에 각각의 실시예 및 비교예의 마우스를 동일한 방법으로 검사하여 쇼크실 도달시간을 측정하였으며, 그 결과를 도 1에 나타내었다.

도 1을 살펴보면, 비교예 2의 대조군(Control)과 비교하여 실시예 1의 복합 한약재 추출물 투여군의 마우스가 쇼크실 도달시간이 증가하는 것을 확인할 수 있었으며, 투여 기간이 증가할수록 쇼크실 도달시간이 증가하며, 도네페질을 투여한 비교예 3의 마우스와 비교해서도 현저하게 쇼크실 도달시간이 증가하므로 실시예 1에 따른 복합 한약재 추출물 투여에 의하여 기억력이 증가한 것을 알 수 있었다.

② Y 미로 실험(Y maze test)

Y 미로는 길이 50 ㎝, 너비 10 ㎝ 및 높이 5 ㎝인 세 개의 가지로 이루어져 있으며, 각 가지의 각도는 120도이다. 각 가지를 A, B, C로 정하고, 마우스를 한쪽 가지의 끝부분에 조심스럽게 놓은 후 8분 동안 마우스의 이동 위치를 기록하고, 연속적인 움직임을 촬영하였다. A, B, C 또는 B, C, A 또는 C, A, B와 같이 연속적으로 A, B, C에 한 번씩 들어간 경우에만 1점의 점수를 부여하여(A, A, B 나 B, B, A 또는 C, C, C 같은 경우 등은 제외) 하기 수학식 1에 따라 마우스의 변경 행동력을 측정하였으며, 그 결과는 도 2에 나타내었다.

[수학식 1]

변경 행동력(alternation ratio, %) = {실제 변경(actual alternation)/최고 변경(maximum alternation)}*100 (최고 변경=총 입장횟수-2)

도 2를 살펴보면, 비교예 2의 대조군(Control) 마우스와 비교하여 실시예 1의 마우스에서 변경 행동력이 증가한 것을 알 수 있었고, 실시예 1의 복합 한약재 추출물을 투여한 마우스의 변경 행동력이 비교예 1의 정상군과 유사한 수준까지 회복하는 것을 확인할 수 있었다.

실험예 2. 복합 한약재 추출물의 인지기능 증진 효과 확인

본 발명의 일 실시예에 따른 복합 한약재 추출물의 인지기능 증진 효과를 확인하기 위해, 모리스(Morris) 물-미로 실험을 수행하였다.

구체적으로, 원형의 물탱크(지름 180 ㎝, 높이 65 ㎝)에 온도 22±2 ℃의 물을 45 cm 깊이로 채우고, 잉크를 넣어 물을 검게 만들었다. 플랫폼(platform, 지름 4.5 ㎝, 높이 43.5 ㎝)은 전체 물탱크를 4등분하여 어느 하나의 부채꼴 중앙에 놓아두고, 플랫폼 상단이 수면 1.5 ㎝ 밑에 위치하도록 하였다. 학습 시험은 1일 2회씩 4일 동안 연속적으로 실시하고, 마우스가 플랫폼을 찾으면 약 10초 동안 플랫폼에 머무르도록 한 뒤 원래의 케이지로 복귀시키고, 60분 뒤에 다음 학습을 실시하는 방식으로 수행하였다. 마우스가 60초 이내에 플랫폼을 찾지 못하면 마우스를 플랫폼에 10초 동안 두었다가 원래의 케이지로 복귀시키고, 60분 뒤에 다음 학습을 실시하였다. 학습이 종료된 마우스를 대상으로 마지막 학습 시험 수행 24시간 후에 검사 시험(probe trial)을 실시하였다. 검사 시험은 물탱크에서 플랫폼을 제거하고, 60초 동안에 플랫폼이 놓여 있던 4분원에 머무는 시간(latency)을 측정하는 방식으로 모리스 물-미로 실험을 수행하였다. 실험 결과는 물탱크 위의 천장에 설치된 장비(video recorder/tracking device)로 녹화하여 분석하였다.

그 결과, 도 3a 및 3b를 살펴보면, 비교예 2의 대조군(Control) 마우스와 비교하여 실시예 1의 마우스는 플랫폼을 찾는 시간이 현저히 감소하는 것을 확인하였고, 특히 실시예 1의 마우스는 비교예 1의 정상군의 마우스 및 도네페질을 투여한 비교예 3의 마우스와 유사한 수준인 것을 확인하였다. 또한, 도 3b를 살펴보면, 플랫폼을 제거하였을 때 실시예 1의 마우스는 플랫폼이 위치하여 있는 Zone 1에 머무는 시간이 현저히 증가하고 플랫폼 반대편에 위치한 Zone 3에 머무는 시간은 현저히 감소하는 것을 확인하여 인지기능이 향상된 것을 확인할 수 있었다.

실험예 3. 복합 한약재 추출물의 항우울 효과 확인

본 발명의 일 실시예에 따른 복합 한약재 추출물의 항우울 효과를 확인하기 위해 하기와 같은 실험을 수행하였다.

① 강제 수영 검사

약물 투여 90일 후 마우스의 우울 정도를 강제 수영 검사(forced swimming test, FST)를 수행하여 확인하였으며, 그 결과는 도 4에 나타내었다.

구체적으로, 투명한 원통형 아크릴 수조(높이 30 ㎝, 지름 20 ㎝)에 24 ℃ 수돗물을 20 ㎝ 높이로 채우고, 주변의 조명을 어둡게 조절한 후 마우스를 수조에 투하하였다. 총 6분 동안 마우스의 움직임을 관찰하고, 처음 2분을 제외한 4분 동안 수영 시간과 부동 시간(버둥거리는 시간)을 측정하였다. 물에 떠있기 위한 최소한의 움직임만 있는 경우, 즉 버둥거리는 경우 부동성(immobility)을 보이는 것으로 판단하였다.

도 4를 살펴보면, 실시예 1의 마우스는 비교예 2 및 3의 마우스와 비교하여 수영 시간(Swimming time)이 증가한 것을 확인하였고, 특히 비교예 1의 정상군의 마우스와 유사한 수영 시간을 나타내므로, 복합 한약재 추출물이 우울 증상을 현저하게 개선하는 것을 확인할 수 있었다.

② 꼬리 매달기 검사

약물 투여 90일 후 마우스의 우울 정도를 꼬리 매달기 검사(꼬리 현수법, tail suspension test, TST)로 확인하였으며, 그 결과는 도 5에 나타내었다.

구체적으로, 마우스의 꼬리 끝 1 ㎝ 부위에 테이프를 감아서 바닥으로부터 50 ㎝ 이상의 높이에 마우스를 거꾸로 매달고, 총 6분 동안 마우스의 움직임을 관찰하였다. 6분 동안 움직이지 않고 가만히 매달려 있는 시간(부동 시간, immobility time)을 측정하였고, 부동성 시작시점(immobility onset)은 움직임이 멈춘 상태가 2초 이상 지속된 최초의 시간으로 판단하였다. 실험 진행 중 꼬리를 잡고 올라오는 마우스는 실험 결과에서 제외하였다.

그 결과, 도 5에 나타난 것과 같이 실시예 1의 복합 한약재 추출물을 투여한 마우스의 경우 비교예 2의 대조군과 비교하여 부동 시간이 현저히 감소하였고, 비교예 1의 정상군의 마우스와 유사한 수준으로 감소하는 것을 확인하여, 우울 증상이 개선된 것을 확인할 수 있었다.

실험예 4. 복합 한약재 추출물의 항불안 효과 확인

본 발명의 일 실시예에 따른 복합 한약재 추출물의 보행활동 수준 및 정서기능에 대한 효과를 측정하기 위하여 개방장 검사(Open field test, OFT)를 수행하였다.

구체적으로, 사각형 모양의 개방된 상자(50 x 50 x 25 ㎝)를 제작하고, 상자 내부를 총 25개의 정사각형 구획으로 나누어 주변부와 중심부로 구분하였다. 실험 시작 30분 전 마우스를 미리 상자에 넣어 적응시킨 후, 10분 동안 상자에서 보이는 행동을 확인하였다. 마우스의 행동을 중심부에서의 활동과 주변부에서의 활동으로 구분하여 측정하고, 상자 위의 천장에 설치된 장비(video recorder/tracking device)로 녹화하여 분석하였다.

그 결과, 도 6에 나타난 것과 같이 비교예 2의 대조군 마우스와 비교하여 실시예 1의 복합 한약재 추출물 투여군 마우스는 상자의 외부 쪽에 머무르는 시간이 증가하는 것을 확인할 수 있었고, 가운데에 머무르는 시간은 감소한 것을 확인하였다. 이를 통해, 본 발명에 따른 복합 한약재 추출물은 알츠하이머 증상을 갖는 마우스의 불안 정도를 감소시킬 수 있는 것을 알 수 있었다.

실험예 5. 복합 한약재 추출물의 혈액분석

본 발명의 일 실시예에 따른 복합 한약재 추출물의 간 보호 효과를 확인하기 위해, 상기 실험예 1 내지 4의 실험 종료 후 마우스를 희생시켜 혈청을 채취하여 GOT(glutamic oxaloacetic transaminase), GPT(glutamic-pyruvic transaminase), 글루코오스(Glucose), 트리글리세라이드(triglyceride, TG), 총 콜레스테롤(total cholesterol) 및 HDL 콜레스테롤(HDL cholesterol) 양을 측정하였고, 그 결과를 도 7에 나타내었다.

도 7을 살펴보면, 본 발명의 복합 한약재 추출물은 마우스의 혈액 내 GOT, GPT 와 TG 양을 유의성 있게 감소시켰고, HDL 콜레스테롤 양은 유의성 있게 증가시켰다.

이를 통해, 본 발명에 따른 복합 한약재 추출물은 한약재의 독성을 줄여 간에 무리를 주지 않는 것을 알 수 있었다.

실험예 6. 복합 한약재 추출물의 APP/PS1 마우스 모델 뇌에서의 베타 아밀로이드 42(Aβ42)의 축적량 측정

본 발명의 일 실시예에 따른 복합 한약재 추출물의 알츠하이머병 예방 또는 치료 효과를 확인하기 위해, 마우스 뇌 속의 베타 아밀로이드(Aβ)의 양은 Aβ(1-42)을 특이적으로 검출하는 ELISA방법으로 측정하였으며, 그 결과는 도 8에 나타내었다.

ELISA kit는 Invitrogen(CA, USA)로부터 구입하였다. ELISA 방법은 Invitrogen에서 제공된 방법에 따라 수행하였다. 간략히 요약하면 다음과 같다. 표준(standard) 펩타이드로 제공된 Aβ(1-42)을 주어진 표준 재구성 완충액(standard reconstitution buffer)(55 mM 중탄산 나트륨(sodium bicarbonate), pH 9.0)에 녹이고 표준 희석(dilution) 완충액을 이용하여 희석시켜 표준 곡선(standard curve)을 얻는데 사용하였다. Tg-APPswe/PS1dE9 transgenic 마우스(the Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME, 미국) 대뇌피질(cortex) 100 mg을 표준 희석 완충액 100 μl에 섞고 준비된 ELISA strip에 넣었다. 이를 2시간 배양한 후에 4번 세척 완충액으로 씻어주고 1차 항체(항 Aβ항체)를 1시간 붙여준 후에 다시 4번 세척하고 HRP(horseradish peroxidase) 컨쥬게이션된 2차 항체(항-토끼 IgG HRP)를 30분 붙여준 후에 4번 세척하였다. 30분 간 안정화 크로모젠(stabilized chromogen)을 넣어 발색반응을 시키고 정지 용액(stop solution)을 넣어주어 발색반응을 정지시켰다. 발색반응의 정도는 450 nm 파장에서 분광 광도계(spectrophotometer)를 이용하여 측정하였다. 각 샘플의 값을 표준 값과 비교하여 샘플 내에 들어있는 Aβ의 절대량을 환산하였다.

알츠하이머 마우스 모델의 뇌에서 베타 아밀로이드(Aβ)의 축적에 본 발명의 복합 한약재 추출물의 투여가 미치는 영향을 조사한 결과, 도 8을 살펴보면, 실시예 1의 복합 한약재 추출물을 투여한 마우스는 비교예 2의 대조군의 마우스에 비하여 베타 아밀로이드(Aβ)의 양이 유의성 있게 감소하는 것을 관찰하였고, 이는 도네페질을 투여한 비교예 3의 마우스와 유사한 것을 확인하였다.

실험예 7. 면역염색

본 발명의 일 실시예에 따른 복합 한약재 추출물의 알츠하이머병 예방 또는 치료 효과를 확인하기 위해, 상기 실험예 1 내지 4의 실험이 종료된 마우스의 뇌를 면역염색하여 베타 아밀로이드(Aβ42)를 확인하였다.

구체적으로, 실험이 종료된 후 마우스의 뇌를 적출하여 우측 뇌를 4% 파라포름알데히드(paraformaldehyde)가 함유된 0.05 M 인산 완충액(phosphate buffer, PB)으로 고정한 후 후고정을 24시간 수행하고, 30 % 수크로오스(sucrose)에서 24시간을 넣어둔 후 조직을 절편 하였다. 면역염색은 free-floating 방법으로 조직을 동결조직절편기(cryomicrotome)를 이용해 40 mm의 두께로 잘라 해마 부분이 포함된 부위를 사용하였다. 0.05 M PBS 용액에 3 % H₂O₂가 들어간 용액으로 10분간 부유 후 항-Aβ-42(1:100, Biosource, 미국) 항체를 상온에서 16시간 이상 결합시킨 후 Vectastain Elite ABC kit(Vector Laboratories, Burlingame, CA, 미국)를 이용하여 발색하였다.

도 9는 마우스의 대뇌피질에 존재하는 베타 아밀로이드를 확인할 수 있고, 도 10은 마우스의 해마 부위에 존재하는 베타 아밀로이드를 확인할 수 있다. 도 9 및 도 10을 살펴보면, 실시예 1의 복합 한약재 추출물 투여군 마우스의 대뇌 피질과 해마 부위에서 보이는 베타 아밀로이드(Aβ)의 반점이 다른 비교예 2 및 3의 마우스와 비교하여 유의성 있게 감소하는 것을 확인할 수 있었다.

실험예 8. 단백질 분석

상기 실험예 1 내지 4의 실험 종료 후 마우스의 대뇌피질을 분리하여 완충액(50 mM Tris-HCl pH 7.5, 150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 30 mM 피로인산나트륨(sodium pyrophosphate), 10 mM NaF, 2 mM Na₃VO₄, 프로테아제 억제제 칵테일(protease inhibitor cocktail))을 넣고 균질기를 이용하여 균질화하였다. 균질액을 12,000 rpm에서 15분간 4 ℃에서 원심분리 후 상층액만을 얻었다. 단백질 정량은 비신코닌산(bicinchoninic acid, BCA, Pierce)법을 사용하였다. 상층액은 4 × Lammlie의 완충액(62.5 mmol/L Tris-HCl pH 6.8, 2 % SDS, 20 % 글리세롤(glycerol), 10 % 2-머켑토에탄올(2-mercaptoethanol))을 넣고 95 ℃에서 끓였다. 정량된 단백질 시료 50 μg은 4-12 % 도데실 황산 나트륨(sodium dodecylsulfate)-폴리아크릴아마이드 구배 겔(polyacrylamide gradient gel)(Invitrogen) 전기 영동법(SDS-PAGE)으로 분리되었고, 니트로셀룰로오스 페이퍼(nitrocellulose paper)(Amersham)로 옮겨졌다. 단백질이 옮겨진 막을 폰슈-S(Ponceau-S)로 염색하여 단백질이 완전하게 옮겨졌음을 확인하고 0.1 % Tween 20을 포함하는 TBS-T(Tris-buffered saline)로 씻은 후 5 % 탈지 분유액으로 30분 이상 블로킹(blocking)하였다. 타우(Tau), 인산화 타우(p-Tau), 베타 아밀로이드 42(Aβ42), β-액틴(β-actin) 각각에 대한 1차 항체(항 Tau 항체, 항 p-Tau 항체, 항 Aβ42 항체, 및 항 β-actin 항체)를 4 ℃에서 16시간 동안 반응시킨 후 막을 TBS-T에서 10분씩 3회 세척한 후 블랏(blot)을 2차 항체(항-마우스 IgG HRP)와 함께 1시간 동안 반응시켰다. 2차 항체 반응 후 막을 씻고 강화된 화학발광(enhanced chemiluminiscence) 시스템(ECL, Pierce)으로 원하는 단백질을 가시화하였다. 단백질의 가시화 및 정량 분석은 image 장비(LAS-3000, Fuji)를 이용하였으며, 실험은 2번 진행하였다.

도 11을 살펴보면, 복합 한약재 추출물을 투여한 실시예 1의 마우스와 도네페질을 투여한 비교예 3의 마우스에서 다른 비교예 2의 마우스와 비교하여 베타 아밀로이드 42(Aβ42)와 인산화된 타우 단백질(p-Tau)의 양이 감소되는 것을 확인하였다. 이를 통해, 본 발명에 따른 복합 한약재 추출물은 알츠하이머병의 치료 효과가 있음을 알 수 있었다.

전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야 한다.

Claims

장미근, 사과락, 및 봉안초를 포함하는 복합 한약재의 추출물을 유효성분으로 포함하는, 알츠하이머병 예방 또는 치료용 약학적 조성물로서,
상기 복합 한약재는 장미근 : 사과락 : 봉안초를 1 : 0.2 내지 5 : 0.2 내지 5의 중량비로 포함하는 것을 특징으로 하는, 알츠하이머병 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제1항에 있어서,
상기 복합 한약재의 추출물은 기억 또는 인지 기능을 증진시키는 것을 특징으로 하는, 알츠하이머병 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제1항에 있어서,
상기 복합 한약재의 추출물은 우울 또는 불안 증상을 개선하는 것을 특징으로 하는, 알츠하이머병 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제1항에 있어서,
상기 복합 한약재의 추출물은 뇌의 베타 아밀로이드(Aβ) 축적을 억제하는 것을 특징으로 하는, 알츠하이머병 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제1항에 있어서,
상기 복합 한약재의 추출물은 간 보호 활성을 가지는 것을 특징으로 하는, 알츠하이머병 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제1항에 있어서,
상기 복합 한약재의 추출물은 개체의 체중에 대하여 10 mg/kg 내지 250 mg/kg의 용량으로 경구 투여되는 것을 특징으로 하는, 알츠하이머병 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제1항에 있어서,
상기 추출물은 물, C₁내지 C₄의 저급알코올, n-헥산, 에틸아세테이트, 아세톤, 아세토니트릴, 부틸아세테이트, 1,3-부틸렌 글리콜, 메틸렌클로라이드, 및 이들의 혼합용매로 구성된 군으로부터 선택된 하나의 용매로 추출되는 것을 특징으로 하는, 알츠하이머병 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
장미근, 사과락, 및 봉안초를 포함하는 복합 한약재의 추출물을 유효성분으로 포함하는, 알츠하이머병 예방 또는 개선용 식품 조성물로서,
상기 복합 한약재는 장미근 : 사과락 : 봉안초를 1 : 0.2 내지 5 : 0.2 내지 5의 중량비로 포함하는 것을 특징으로 하는, 알츠하이머병 예방 또는 개선용 식품 조성물.
(a) 장미근, 사과락, 및 봉안초를 포함하는 복합 한약재를 혼합하는 단계; 및
(b) 상기 혼합된 복합 한약재에 추출용매를 첨가하여 복합 한약재 추출물을 추출하는 단계를 포함하는, 복합 한약재 추출물의 제조방법으로서,
상기 복합 한약재는 장미근 : 사과락 : 봉안초를 1 : 0.2 내지 5 : 0.2 내지 5의 중량비로 포함하고,
상기 복합 한약재 추출물은 알츠하이머병 예방 또는 치료 활성을 가지는 것을 특징으로 하는, 제조방법.
제9항에 있어서,
상기 (b) 단계에서 추출은 10 ℃ 내지 40 ℃에서 60 시간 내지 84 시간 동안 이루어지는 것을 특징으로 하는, 복합 한약재 추출물의 제조방법.