KR20120053604A - 더덕 추출물을 포함하는 허혈성 뇌혈관 질환 예방 또는 개선용 조성물 - Google Patents
더덕 추출물을 포함하는 허혈성 뇌혈관 질환 예방 또는 개선용 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 더덕 추출물을 유효성분으로 포함하는 허혈성 뇌혈관 질환 예방 또는 개선용 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 상기 더덕 추출물은 뇌 해마조직의 신경세포 보호능 및 신경세포사 억제능이 우수하고, 아교세포의 활성화 억제능이 뛰어나다는 것이 확인되어, 뇌허혈에 민감하다고 알려져 있는 뇌 해마조직 CA1 영역의 신경 손상을 효과적으로 예방할 뿐만 아니라, 인체에 무해하여, 상기 더덕 추출물을 유효성분으로 포함하는 허혈성 뇌혈관 질환 예방 또는 개선용 조성물은 뇌허혈에 의한 질환의 치료, 예방 또는 개선을 위해 다양하게 응용될 수 있을 것으로 기대된다.
Description
본 발명은 더덕 추출물을 유효성분으로 포함하는 허혈성 뇌혈관 질환 예방 또는 개선용 조성물에 관한 것이다.
최근 통계청에서 발표한 자료에 의하면, 우리나라도 지난 2000년 기준으로 65세 이상 인구가 총인구에서 차지하는 비중이 7.2 %에 이르렀고, 지난 2003년 기준으로 국민의 평균수명이 77.5세로 노령인구가 급격하게 증가되고 있는 추세이며, 2005년 기준으로 총인구 중에서 65세 이상 노령인구의 비율은 9.1%를 차지하고 있고, 14세 이하 유년인구의 비중은 점차 줄어들고 있어, 우리나라도 이미 고령화 사회로 진입한 것으로 평가된다. 또한, 앞으로 2019년에는 총인구 중에서 65세 이상 노령인구의 비율이 14%를 넘고, 2020년에는 이 비율이 20%에 육박하여, 일본 다음의 고령화 국가가 될 것으로 전망되고 있다.
또한, 2003년 유엔의 발표에 의하면 오는 2050년 전 세계 인구는 100억 명으로 증가하고, 이 가운데 60세 이상 노령인구는 20억 명에 이를 것으로 전망되었다. 상기한 바와 같이한 급속하게 고령화의 진행됨에 따라, 노인들의 주거, 보건, 문화, 여가 등 노인복지에 대한 관심이 높아지고 있다.
또한, 통계청이 발표한 우리나라 1인당 GNI는 2004년 14,162 달러였으며, 매년 10% 이상 증가하고 있어 삶의 질은 점차 나아지고 있다고 할 수 있다.
이와 같이 최근 삶의 질의 향상에 따른 생활환경과 식생활 패턴의 변화 등으로 현대인들은 생체조직의 노화를 비롯한 퇴행성 신경질환에 관심이 커지고 있다. 또한, 고령화 문제가 사회적인 이슈로 대두 됨에 따라 고령인구의 특성이나 주거, 보건, 문화, 여가 등 노인복지 등에 대한 국민의 관심이 높아지고, 이에 대한 통계 수요도 늘어나고 있다.
이러한 사회적 조건의 변화와 함께, 지난 50여 년간 주요한 사망원인이 되었던 급성 전염성 질병보다는 만성 퇴행성 질병이 더욱더 큰 문제로 대두 되고 있다. 보다 구체적으로, 과거 주요한 사망원인인 전염성 질병에 의한 사망자 수는 급격하게 줄어들고 있는 반면에 암, 뇌혈관질환, 당뇨병 등의 퇴행성 질환에 의한 사망자 수는 꾸준히 증가하고 있다. 특히, 급속한 노령 인구의 증가에 따라, 뇌, 척추 또는 말초신경 등의 손상을 포함한 퇴행성 신경질환이 계속해서 증가하고 있는 추세이며, 퇴행성 질환 중에서 뇌혈관 질환에 의한 사망은 단일질환에 의한 사망률 중에서 2위를 기록하고 있는 매우 중요한 질환이 되었다.
우리나라 사망 원인에 2위를 차지하는 질환인 상기 뇌혈관 질환이란 흔히 뇌졸중이라고도 하며, 크게 2가지 형태로 분류될 수 있다. 하나는 주로 교통사고 등과 같이 외부의 충격에 의해서 뇌에 있는 혈관이 터져서 발생하는 뇌출혈과 같은 출혈성 뇌질환이고, 다른 하나는 주로 노령의 사람들에서 자주 나타나는 질환으로 뇌혈관 폐쇄 등에 의한 뇌경색과 같은 허혈성 뇌질환이다.
상기 뇌경색은 허혈성 뇌혈관 질환이라고도 하며, 뇌혈관이 막혀서 뇌에 혈액과 산소공급을 되지 못하여, 뇌세포가 죽게 되어 발생하는 질환을 의미하고, 상기 뇌출혈은 출혈성 뇌혈관 질환이라고도 하며, 뇌혈관이 터져 피가 흐르고 고여서 뇌 손상이 오는 경우를 의미한다. 상기의 뇌경색이나 뇌출혈로 인해 뇌의 기능을 잃게 되면 외견상 반신마비, 언어장애 및 의식장애 등의 신체증상이 나타나기도 하며, 심한 경우에는 사망을 할 수도 있다.
이 중 허혈성 뇌혈관 질환은 뇌의 혈류가 감소되어 산소와 포도당의 공급이 이루어지지 않아, 해마 CA1 영역에 지연성 신경세포사(delayed neuronal death)가 유발되어 발생되는 질환을 의미한다. 또한, 상기 허혈성 뇌질환은 뇌졸중이나 심장마비와 같은 병리학적 상황에서 뇌에 혈액이 공급되지 않음으로써 유발되는 것으로 알려져 있다.
지금까지 뇌허혈에 의한 신경세포사 기전으로는 2가지가 알려져 있다.
하나는 뇌허혈에 의해서 세포 바깥에 과도한 글루타메이트(glutamate)가 축적되게 되며, 이러한 글루타메이트가 세포 내로 유입되어 결국 과도한 세포 내 칼슘의 축적으로 신경세포사가 유발된다는 흥분성 신경세포사 기전이고, 다른 하나는 일시적인 뇌허혈 및 재관류(reperfusion)시에 갑작스런 산소 공급으로 인해 생체 내 라디칼이 증가되고, 이러한 생체 내 라디칼의 증가로 인해 DNA 및 세포질에 손상을 입어 유발된다는 산화성 신경세포사 기전이다.
상기 뇌허혈 및 재관류에 의해 해마 CA1영역에서의 지연성 신경세포사가 유도되는 것으로 보고되고 있다. 상기 지연성 신경세포사의 원인은 세포 내로 칼슘의 과다유입, 프리 라디칼(free radical) 관련 신경세포 손상 또는 글루타메이트-수용체 매개 신경세포 손상이라고 알려져 있다.
보다 구체적으로, 뇌허혈이 발생되면, 산소와 포도당의 공급이 차단되어 신경세포에서는 ATP(Adenosine Triphosphate)의 감소로 인해 능동수송의 역전이 발생되어, 신경세포의 탈분극이 일어나고, 시냅스의 글루타메이트(glutamate)가 유리되어 세포 외 글루타메이트의 농도가 증가한다. 상기 세포 외 글루타메이트의 축적은 NMDA(N-methyl-D-aspartic Acid), AMPA(α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4 -isoxazole-propionic acid) 및 메타보트로픽 글루타메이트 수용체(metabotropic glutamate receptor)의 연속적인 활성을 유도하여, 칼슘의 세포 내 과다 유입을 초래한다. 칼슘의 세포 내 유입은 특히 칼슘 의존성 프로테아제, 리파제 및 모듈레이터의 활동을 촉발시키고, 결국 프리 라디칼을 포함하는 세포 독성분자가 생성되어 DNA 및 세포막 등의 세포 구조물을 파괴하여 신경세포사가 유발하는 것으로 알려져 있다. 상기 신경세포사는 뇌허혈이 있은 후, 상당한 시간이 경과된 뒤에 나타나므로, 이를 지연성 신경세포사(delayed neuronal death)라고 한다.
상기 지연성 신경 세포사는 몽골리안 저빌(Mongolian gerbil)을 이용한 일과성 전뇌 허혈모델(transient forebrain ischemic model)을 통한 실험을 통해 살펴볼 수 있으며, 상기 몽골리안 저빌 모델에서는 5분간 뇌허혈 유도 4일 후 해마(hippcampus)의 CA1 영역에서 신경세포사가 관찰되는 것으로 보고되고 있다(Kirino T., Sano K., Acta Neuropathol., 62, pp 201-208(1984)).
상기 뇌 허혈에 의해 비가역적인 신경세포 손상이 일어나면, 운동능력 저하, 성적능력 저하, 기억력 감퇴 등이 유발되는 것으로 알려져 있다. 또한, 상기 뇌 허혈에 의해 뇌조직의 손상이 나타나면 발생되는 질병과 관련하여, 상기 뇌 허혈에 의해 손상된 뇌 조직의 부위에 따라 노인성치매, 알츠하이머병, 헌팅턴병 및 파킨슨병을 비롯한 다양한 뇌신경계 질환이 보고되고 있다.
상기 뇌 허혈에 의한 질환, 뇌신경계 질환 또는 퇴행성 신경질환을 치료하기 위해서 세포 이식, 외과적 수술 등 다양한 치료법이 제시되고 있지만 대부분이 위험요소와 부작용을 나타내고 있으며, 손상 기전의 복잡성 등으로 실질적으로 신경세포의 손상을 보호하는 치료제는 개발되지 못하고 있는 실정이다.
보다 구체적으로, 이러한 기전적인 연구를 바탕으로 해서 뇌허혈시에 나타나는 신경 세포사를 효과적으로 억제하는 물질을 탐색하거나, 물질에 대한 기전을 밝히는 연구가 많이 수행되고 있다. 그러나, 아직까지 효과적으로 뇌허혈에 의한 신경 세포사를 억제하는 물질은 거의 없는 실정이다.
지금까지 유일하게 뇌허혈 치료제로 FDA 공인 시판 중인 조직 플라즈미겐활성자(tissue plasminogen activator)는 혈전용해제로 뇌허혈을 유발시키는 혈전을 녹여 빠른 산소 및 포도당의 공급을 유도하는 물질이다. 따라서, 직접적으로 신경세포를 보호하는 것이 아니기 때문에 빠른 사용이 필요하며, 혈전용해제라는 특징 때문에 과량 사용하거나, 자주 사용하는 경우에는 혈관벽이 얇아져 결국 출혈성 뇌혈관질환을 유발할 수 있어 문제가 된다.
또한, 초기의 세포 내 칼슘 유입을 효과적으로 저해함으로써 글루타메이트 유도 세포독성을 억제하기 위한 칼슘채널 억제제(calcium channel blocker)인 MK-801의 경우 임상적 테스트가 실행이 되었으나, 그 부작용으로 인해 약물을 폐기한 바 있다.
한편, 이외에도 많은 물질이 임상테스트를 실시하고 있으나, 뇌졸중에 대한 치료효과보다는 오히려 약물의 투여로 인해 나타나는 부작용이 매우 심각하여, 실제 약물로 사용기 어려운 것으로 보고되고 있다.
뿐만 아니라, 최근 뇌신경세포의 재생이 가능하다는 것이 보고되기는 하였으나, 이러한 뇌신경세포의 재생은 그 조직학적 특성을 고려하건데 용이하지 아니할 것으로 예상된다.
따라서, 뇌혈관 질환의 특성을 고려할 때, 뇌 허혈에 의한 질환 또는 뇌신경계 질환은 치료보다는 그에 대한 예방이 강조되고 있는 경향이며, 뇌신경세포를 보호할 수 있는 물질을 지속적으로 섭취하여 이러한 뇌혈관질환을 예방하는 것의 필요성이 새롭게 인식되고 있다.
이러한 측면에서, 뇌 허혈에 의한 질환, 구체적으로 허혈성 뇌혈관 질환은 병을 치료하는 것보다는 미리 예방하는 것에 대해 더 중점을 두어야 한다는 내용이 주장되고 있다.
상기 질환에 대한 예방을 위한 약물투여의 경우, 일반적인 질환에 대한 약물과 마찬가지로 부작용이 문제될 수 있는 단일 합성물 보다는 천연복합물이 선호되고 있는 실정이다. 이러한 추세에 따라, 최근 건강식품에 대한 관심 및 수요의 증가와 함께 국내에서 다수의 천연 물질이 뇌졸증의 예방에 효과가 있는 건강식품으로서 시판되고 있다.
그러나, 이들 대부분은 과학적인 검증을 거치지 않은 것이 대부분이며, 오히려 건강식품 남용의 원인이 되기도 하여 사회적인 문제가 되고 있다.
따라서, 오랫동안 식품으로 사용되어 그 안전성이 입증된 천연자원들을 객관적으로 검증하여 뇌질환 치료 및 예방효과를 갖는 천연물질을 개발하고자 하는 노력이 시급히 요구된다.
본 발명은 허혈성 뇌혈관 질환을 효과적으로 예방 또는 개선하고, 뇌허혈에 의한 뇌 손상을 억제할 뿐만 아니라 인체에도 무해한 천연식물의 추출물을 유효성분으로 포함하는 허혈성 뇌혈관 질환 예방 또는 개선용 조성물 및 상기 조성물을 유효성분으로 포함하는 허혈성 뇌혈관질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공하는 것을 목적으로 한다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 더덕 추출물을 유효성분으로 포함하는 허혈성 뇌혈관질환 치료 또는 예방용 조성물을 제공한다.
또한, 상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 더덕 추출물 또는 상기 허혈성 뇌혈관질환 예방 또는 개선용 조성물을 유효성분으로 포함하는 허혈성 뇌혈관질환 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.
또한, 상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 더덕 추출물을 유효성분으로 보호하는 신경세포 보호용 조성물을 제공한다. 상기 신경세포 보호용 조성물은 뇌허혈에 의한 신경세포, 구체적으로 뇌 조직의 신경세포, 보다 구체적으로 뇌 해마조직 CA1 영역의 신경세포의 손상을 보호 또는 예방하기 위한 것이다.
이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.
본 발명의 발명자들은 뇌혈관질환 예방 및 개선용 조성물을 인체 안전성이 확보된 천연식물 특히, 오랫동안 식품으로 사용되어온 천연식물 유래의 물질로부터 연구하던 중, 더덕 추출물 또는 찐더덕 추출물이 뇌허혈에 민감하다고 알려져 있는 뇌 해마조직 CA1 영역의 신경세포의 손상 예방효과가 있으며, 특히 상기 더덕 추출물의 에틸아세테이트 분획물 및 찐더덕 추출물의 에틸아세테이트 분획물의 신경세포의 예방 효과가 현저하게 우수하다는 것을 확인하였으며, 이를 토대로 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명에 있어서, 신경세포 보호란 뇌 또는 중추 신경계, 일 예로 뇌 또는 척수의 신경세포의 사망을 억제하거나, 신경세포의 피해로부터 보호하는 것을 의미한다. 보다 구체적으로, 신경세포 보호란 뇌 허혈에 의하여 유발되는 뇌, 일 예로 해마 부위의 신경세포의 사멸을 억제하고 보호하는 것일 수 있다.
본 발명에 있어서, 허혈이란 조직으로의 혈액 공급이 감소되거나 혈액 공급이 폐지되는 것을 의미한다. 허혈에 의해 조직에 산소와 영양소의 연합된 결핍이 일어나면, 허혈이 일어난 조직에서는 세포 사멸(괴사)을 초래할 수 있다. 허혈이 발생하는 경우, 허혈에 의해 유도되는 뇌조직의 손상은 크게 2단계로 구분할 수 있다. 첫 번째 단계는 산소의 결핍에 의해 세포 물질대사가 정지하고 그 결과 일부 세포와 조직이 몇 분 내에 사망하여 발생되는 손상이고, 두 번째 단계는 초기에 유도된 허혈 상태가 개선된 후, 세포자살(apoptosis)과 같은 일련의 캐스캐이드(cascade)가 시작되어 최대 12시간 지속되는 손상이다. 상기 두 번째 단계에 의해 손상된 조직은 치명적이고 상기 첫 번째 단계에 의해 발생되는 손상 보다 개체에 더 위험한 것으로 알려져 있다.
본 발명에 있어서, 환자란 사람 및 동물을 모두 포함하는 의미이다.
본 발명에 있어서, 조성물이란 명시된 성분들을 명시된 양으로 포함하는 생성물뿐만 아니라 명시된 양의 명시된 성분들의 배합물로부터 직접 또는 간접적으로 야기되는 생성물을 포함하는 의미이다.
본 발명에 있어서, 유효량 또는 치료학적 유효량이란 목적하는 치료, 경감, 억제 또는 예방 효과를 발생시키는 데 효과적인 본 발명의 추출물 또는 조성물의 양을 의미한다.
본 발명은 더덕 추출물을 유효성분으로 포함하는 허혈성 뇌혈관질환의 예방 또는 개선용 조성물에 관한 것이다.
상기 더덕(Codonopsis lanceolata)은 초롱꽃과의 여러해살이 덩굴식물로, 사삼 또는 백삼이라고도 부른다. 상기 더덕은 한국, 일본 또는 중국의 산간지방이나 숲속에서 야생하는 다년생 초본으로 일반식용으로 흔히 이용되어 온 식품 소재이다. 우리나라에서는 주로 봄에 산중에서 뿌리를 캐어 식용한다. 모양이 크고 연하며 독특한 향내와 함께 맛은 달면서도 약간 쓰다. 상기 더덕의 어린잎은 삶아서 나물로 만들어 먹거나 쌈으로 먹기도 하고, 뿌리는 생채, 누름적 또는 구이로 먹기도 하고, 고추장장아찌로 먹거나 장 또는 술을 담그어 먹기도 한다.
상기 더덕의 뿌리는 도라지나 인삼과 비슷하며, 덩굴진 줄기는 길이 2m 이상이나 뻗는다. 8월 내지 10월에 자주색의 넓적한 종모양의 꽃이 피는데, 화관이 다섯 쪽으로 갈라져 끝이 밖으로 젖혀져 보이며, 꽃빛깔이 바깥쪽은 녹백색이고 안쪽은 암자색의 아롱진 반점이 있다.
상기 더덕은 그 형태에 특별한 제한이 있지는 않으나, 바람직하게는 더덕 즉, 생더덕 또는 찐 더덕일 수 있다. 상기 생더덕은 채취된 더덕 그대로인 것 또는 상기 채취된 더덕에 수세공정을 추가한 것을 의미한다. 상기 찐더덕은 채취된 더덕에 대해 뜨거운 김으로 익히거나 데우는 찌는 공정을 수행한 것 또는 상기 찌는 과정 전 후에 수세공정 및/또는 건조공정을 추가로 수행한 것을 의미이고, 세포 내 효소를 불활성화시키기 위해 수행하는 고온처리인 블랜칭(blanching)이라고도 한다. 상기 ‘찌다’ 또는 “찌는 과정”은 김으로 익히는 것이란 점에서 물에 넣고 끓이는 삶는 것과 구분되는 개념이다. 상기 찐더덕은 일 예로, 약 80℃ 내지 105℃의 온도 조건에서 뜨거운 김으로 5분 내지 3시간 동안 찌는 과정을 수행한 것일 수 있고, 상기 찌는 과정은 반복하여 수행할 수 있다. 또한, 상기 더덕은 수세공정, 건조공정 및/또는 분쇄공정을 추가로 수행한 것일 수 있다.
본 발명의 추출물은 추출용매로 추출한 용매 추출물, 추출용매로 추출하여 제조한 추출물에 분획용매를 가하여 분획한 분획물 또는 상기 분획물에 크로마토그래피를 수행하여 수득한 정제물일 수 있다.
상기 추출용매는 천연물 추출에 사용될 수 있는 물, 유기용매 또는 이들의 혼합용매, 바람직하게는 물, 탄소수 1 내지 5의 알코올 및 이들의 혼합물로 이루어진 군 중에서 선택된 어느 하나일 수 있다. 상기 유기용매는 메탄올, 에탄올 등의 탄소수 1 내지 5의 직쇄 또는 분지형 알코올, 에틸아세테이트 또는 아세톤 등의 극성용매와 헥산 또는 디클로로메탄의 비극성용매, 탄소수 3 내지 5의 케톤 등의 중성용매 또는 이들의 혼합용매일 수 있으며, 바람직하게는 30 내지 90%의 에탄올 등의 탄소수 1 내지 5의 직쇄 또는 분지형 알코올 수용액 또는 30 내지 90%의 탄소수 3 내지 5의 케톤, 더욱 바람직하게는 40 내지 80% 에탄올 수용액 또는 40 내지 80%의 아세톤 수용액, 더더욱 바람직하게는 50 내지 70% 에탄올 수용액일 수 있다.
상기 분획용매는 물, 탄소수 5 내지 탄수소 7의 알칸, 부탄올을 포함한 탄소수 1 내지 탄수소 5의 직쇄 또는 분지형 알코올, 에틸아세테이트, 메틸렌클로라이드, 클로로포름, 헥산 또는 이들의 혼합물일 수 있고, 바람직하게는 에틸아세테이트, 헥산, 메틸렌클로라이드 및 물로 이루어진 군중에서 선택된 어느 하나일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 에틸아세테이트일 수 있다. 보다 구체적으로 상기 더덕이 생더덕인 경우에는 상기 분획용매는 에틸아세테이트, 헥산, 메틸렌클로라이드 및 물로 이루어진 군중에서 선택된 어느 하나일 수 있고, 바람직하게는 에틸아세테이트 또는 헥산일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 에틸아세테이트일 수 있고, 상기 더덕이 찐더덕인 경우에는 상기 분획용매는 에틸아세테이트, 메틸렌클로라이드, 헥산 및 물로 이루어진 군중에서 선택된 어느 하나일 수 있고, 바람직하게는 에틸아세테이트, 메틸렌클로라이드 또는 물일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 에틸아세테이트 또는 메틸렌클로라이드일 수 있고, 더더욱 바람직하게는 에틸아세테이트일 수 있다.
본 발명의 더덕 추출물은 통상의 식물 추출물의 제조방법에 따라 제조된 것일 수 있다. 보다 구체적으로는 불순물을 제거한 더덕에 추출용매를 가하고 추출과정을 수행하는 방법으로 수행할 수 있다. 상기 추출과정은 냉침추출법, 온침추출법, 가압추출법, 환류추출법 또는 초음파 분쇄 추출법일 수 있다.
또한, 상기 더덕 추출물의 분획물의 제조는 추출법으로 제조한 추출물 즉, 조추출액에 추출용매와 극성이 상이한 분획용매를 가한 후에, 예를 들어 헥산, 클로로포름, 메틸렌클로라이드, 에틸아세테이트, 부탄올 및 물, 바림직하게는 헥산, 메틸렌클로라이드, 에틸아세테이트, 부탄올 및 물 더욱 바람직하게는 헥산, 메틸렌클로라이드, 에틸아세테이트, 부탄올 및 물의 순서로 가한 후에 층분리한 헥산 분획물, 클로로포름 분획물, 에틸아세테이트 분획물, 부탄올 분획물 및 물 분획물을 수득하는 방법으로 수행할 수 있다.
상기 층분리에 의한 분획법은 상기 용매의 비극성 순을 적용하여 각 적용시마다 얻어지는 분획물을 수득하는 방법일 수 있고, 일 예로 에탄올 수용액 추출물에 헥산을 첨가하여 층분리가 된 헥산층을 분획하여 얻은 헥산 분획물; 상기 헥산 분획물을 분리하고 남은 수성층에 메틸렌클로라이드를 첨가하여 층분리가 된 메틸렌클로라이드층을 분획하여 얻은 메틸렌클로라이드 분획물; 상기 메틸렌클로라이드 분획물을 분리하고 남은 수성층에 에틸아세테이트를 첨가하여 층분리가 된 에틸아세테이트층을 분획하여 얻은 에틸아세테이트 분획물 및 상기 에틸아세테이트 분획물을 분리하고 남은 층인 물 분획물을 순차적으로 수득하는 방법일 수 있다.
상기 분획물의 정제를 위한 크로마토그래피는 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(silica gel column chromatography), 박층 크로마토그래피(thin layer chromatography, TLC) 또는 고성능 액체 크로마토그래피(high performance liquid chromatography, HPLC) 등의 다양한 크로마토그래피를 이용하여 수행할 수 있다.
또한, 상기 추출물은 추출, 분획과정 또는 정제과정을 수행한 이후, 감압 여과 과정을 수행하거나 추가로 농축 및/또는 동결건조를 수행하여 농축하거나 용매를 제거할 수 있다. 따라서, 본 발명에서의 더덕 추출물은 통상적 방법으로 건조된 추출물의 건조물과 통상적 방법으로 농축된 추출물의 농축물, 상기 추출물, 건조물 또는 농축물의 희석액을 포함하는 의미로 사용된다. 상기 수득한 더덕 추출물은 사용 시까지 급속 냉동 냉장고(deep freezer)에 보관할 수 있다.
본 발명에서 허혈성 뇌혈관 질환이란 뇌의 혈관이 어떠한 이유로 막혀 뇌에 필요한 혈액이 공급되지 않아 발생하는 질환을 총칭하는 것을 의미하며, 뇌허혈 질환이라고도 한다.
상기 뇌허혈(cerebral ischemia)은 임상적으로 심장정지(cardiac arrest) 또는 뇌졸중에서 가장 보편적으로 나타나고, 난치성 뇌신경세포 손상이 야기되며, 이로 인해 불구가 되거나 혼수상태에 빠질 수 있고, 심한 경우에는 사망에 이르게 된다.
상기 뇌허혈에 의해 뇌의 혈류가 감소되어 산소와 포도당의 공급이 정상적으로 이루어지지 않게 되면, 산화적 인산화반응이 감퇴되고, 결과적적으로 혐기성 해당작용(glycolysis)도 정지되어, 세포 내 에너지원으로 사용되는 아데노신 트리포스페이트(adenosine triphosphate, ATP)가 고갈되게 된다. 상기 에너지원의 고갈에 의해, 생명유지에 필수적인 세포기능이 저해되고, 이로 인해 다방면의 퇴행성 과정들이 유발됨으로써 세포사멸을 초래하게 된다. 상기 세포사멸은 허혈기간 동안은 물론 허혈 부위의 혈류가 회복되어져 재관류(reperfusion)가 일어날 때 공급되는 산소에 의해 발생되는 자유 라디칼에 의해 재관류 시에도 일어난다.
상기 세포사멸은 특히, 뇌세포 중 뇌허혈에 민감하다고 알려져 있는 해마조직 CA1 영역의 신경세포에서 발생되며, 상기 신경세포의 사멸 즉, 신경세포사 특히, 지연성 신경세포사에 의해 유발되어 발생되는 질환을 허혈성 뇌혈관 질환이라고 한다.
상기 허혈성 뇌혈관 질환의 예로는 뇌경색(허혈성 뇌졸중, ischemic stroke), 뇌출혈, 지주막하 출혈, 뇌신경 질환, 뇌허혈, 허혈성 신경질환, 퇴행성 신경질환, 중풍, 치매, 노인성 치매, 알츠하이머병, 파킨슨 병, 헌팅턴병, 크로이츠펠트-야콥병, 간질, 루게릭병, 기억력 감퇴, 혈전증, 혈전색전증, 소경색 또는 백질 이상증 등이 포함될 수 있고, 바람직하게는 뇌경색, 뇌출혈, 노인성 치매, 알츠하이머병, 파킨슨 병, 헌팅턴병 및 혈전색전증으로 이루어진 군중에서 선택된 1종 이상일 수 있다.
본 발명의 더덕 추출물은 일정기간 투여 후 저빌을 마취시켜 온목동맥을 결찰하여 뇌허혈을 유발시킨 후, 뇌 해마조직 및 상기 해조조직의 CA1 영역의 신경세포를 염색하여 효능을 측정하는 실험에서 뇌허혈에 의한 신경세포사 억제 효과가 우수한 것으로 확인되었고, 특히 상기 더덕 추출물의 분획물, 구체적으로 생더덕 추출물의 에틸아세테이트 분획물과 찐더덕 추출물의 에틸아세테이트 분획물의 경우 대조군에 비해 신경세포사 억제 효능이 우수한 것으로 확인된 조추출물 또는 다른 분획물에 비하여 현저하게 우수한 신경세포 보호효능을 가지고 있는 것으로 확인되었다.
본 발명의 더덕 추출물은 상기와 같은 효과를 가지고 있으므로, 허혈성 뇌혈관 질환의 예방 또는 개선을 위한 조성물의 유효성분으로 포함될 수 있다.
이러한 측면에서, 본 발명은 더덕 추출물을 유효성분으로 포함하는 허혈성 뇌혈관질환의 예방 또는 개선용 조성물에 관한 것이다.
상기 허혈성 뇌혈관 질환의 예방 또는 개선용 조성물은, 조성물 총 중량에 대하여 상기 더덕추출물을 0.001 내지 99.99중량%, 바람직하게는 0.1 내지 99 중량%로 포함할 수 있다.
상기 조성물은 더덕 추출물 외에 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 중진제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 추가로 함유할 수 있다. 상기 조성물에는 상기 성분들이 독립적으로 또는 조합하여 추가될 수 있다. 상기 추가성분의 함량은 바람직하게는 상기 더덕 추출물 100 중량부 당 0.1 내지 20 중량부 범위에서 추가할 수 있다.
이러한 측면에서, 상기 허혈성 뇌혈관 질환의 예방 또는 개선용 조성물은 허혈성 뇌혈관 질환을 예방, 개선 또는 치료하기 위한 의약 조성물일 수 있다.
상기 더덕 추출물을 유효성분으로 포함하는 조성물은 그 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더욱 포함할 수 있다.
발명의 더덕 추출물을 유효성분으로 포함하는 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스, 폴리비닐 피롤리돈, 생리식염수, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유, 덱스트린, 칼슘카보네이트, 프로필렌글리콜 및 리퀴드 파라핀으로 이루어진 군에서 선택된 1 이상일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, 통상의 담체, 부형제 또는 희석제 모두 사용가능하다. 상기 성분들은 상기 유효성분인 더덕 추출물에 독립적으로 또는 조합하여 추가될 수 있다.
본 발명의 더덕 추출물을 유효성분으로 포함하는 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 현탁제, 에멀젼, 시럽 등의 경구형 제형물로 사용될 수 있다.
상기 더덕 추출물을 유효성분으로 포함하는 조성물은 조성물 총 중량에 대하여 상기 더덕 추출물을 0.001 중량% 내지 99.9 중량%, 바람직하게는 0.1 중량% 내지 99 중량%, 더욱 바람직하게는 1중량% 내지 50 중량% 포함할 수 있다. 또한, 상기 추가성분의 함량은 바람직하게는 상기 더덕 추출물 100 중량부 당 0.1 내지 20 중량부 범위에서 추가할 수 있다.
또한, 상기 더덕 추출물을 유효성분으로 포함하는 조성물은 약제화하는 경우, 통상의 충진제, 증량제, 결합제, 붕해제, 계면활성제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 또는 방부제 등을 더욱 포함할 수 있으며, 경구 또는 비경구 모두 사용할 수 있다.
구체적으로 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 항균 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데, 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제 예를 들면, 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.
또한, 본 발명의 의약 조성물의 제형은 사용방법에 따라 바람직한 형태일 수 있으며, 특히 포유동물에 투여된 후 활성 성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 공지된 방법을 채택하여 제형화할 수 있다. 구체적인 제형의 예로는 과립제, 산제, 시럽제, 액제, 현탁제, 전제, 침제, 정제, 좌제, 주사제, 주정제, 캅셀제, 환제, 연질 또는 경질 젤라틴 캅셀 등일 수 있다. 더 나아가 본 발명의 치료용 조성물은 당해 기술 분야의 공지된 적절한 방법을 사용하여 또는 레밍턴의 문헌(Remington's Pharmaceutical Science(최근판), Mack Publishing Company, Easton PA. 18th, 1990)에 개시되어 있는 방법을 이용하여 바람직하게 제형화될 수 있다.
본 발명의 의약 조성물의 바람직한 투여량은 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 바람직하게는 본 발명의 의약 조성물은 더덕 추출물의 양을 기준으로 1일 0.0001 내지 1000 mg/kg으로, 보다 효과적이기 위해서는 0.01 내지 100 mg/kg으로 투여하는 것이 바람직하다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량과 투여횟수는 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
또한, 상기 목적을 달성하기 위하여, 다른 측면에서, 본 발명은 더덕 추출물을 유효성분으로 포함하는 허혈성 뇌혈관질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.
본 발명에 있어서, 식품이란 함은 영양소를 한 가지 또는 그 이상 함유하고 있는 천연물 또는 가공품을 의미하며, 바람직하게는 어느 정도의 가공 공정을 거쳐 직접 먹을 수 있는 상태가 된 것을 의미하며, 통상적인 의미로서, 건강기능식품, 음료, 식품 첨가제 및 음료 첨가제를 모두 포함하는 의도이다.
본 발명의 식품은 예를 들어, 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강기능식품 등이 있다. 추가로, 본 발명에서 식품에는 특수영양식품(예, 조제유류, 영아식, 유아식 등), 식육가공품, 어육제품, 두부류, 묵류, 면류(예, 라면류, 국수류 등), 건강보조식품, 조미식품(예, 간장, 된장, 고추장, 혼합장 등), 소스류, 과자류(예, 스넥류), 유가공품(예, 발효유, 치즈 등), 기타 가공식품, 김치, 절임식품(각종 김치류, 장아찌 등), 음료(예, 과실, 채소류 음료, 두유류, 발효음료류 등), 천연조미료(예, 라면스프 등)을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 상기 식품, 건강기능식품, 음료, 식품 첨가제 및 음료 첨가제는 통상의 제조방법으로 제조될 수 있다.
본 발명에서 건강기능식품이란 식품에 물리적, 생화학적, 생물공학적 수법 등을 이용하여 해당 식품의 기능을 특정 목적에 작용, 발현하도록 부가가치를 부여한 식품군이나 식품 조성이 갖는 생체방어리듬조절, 질병방지와 회복 등에 관한 체조절기능을 생체에 대하여 충분히 발현하도록 설계하여 가공한 식품을 의미한다.
상기 건강기능식품에는 식품학적으로 허용 가능한 식품 보조 첨가제를 포함할 수 있으며, 건강기능식품의 제조에 통상적으로 사용되는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더욱 포함할 수 있다.
본 발명에서 음료란 갈증을 해소하거나 맛을 즐기기 위하여 마시는 것의 총칭을 의미하며 건강기능음료를 포함하는 의도이다. 상기 음료는 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 더덕 추출물을 유효성분으로 포함하는 것 외에 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며, 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다.
상기의 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어 포도당, 과당 등 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 수크로스 등 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알코올이다. 상기한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 식품 조성물 100㎖ 당 일반적으로 약 1 내지 20g, 바람직하게는 5 내지 12g일 수 있다. 그밖에 본 발명의 조성물은 천연 과일 주스, 과일 쥬스 음료, 야채 음료의 제조를 위한 과육을 추가로 함유할 수 있다.
상기 외에 본 발명의 식품 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 이러한 성분을 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 그렇게 중요하지 않지만, 본 발명의 더덕 추출물 100 중량부 당 0 내지 20 중량부 범위에서 선택될 수 있다.
본 발명에서 건강기능음료란 음료에 물리적, 생화학적, 생물공학적 수법 등을 이용하여 해당 음료의 기능을 특정 목적에 작용, 발현하도록 부가가치를 부여한 음료 군이나 음료 조성이 갖는 생체방어리듬조절, 질병방지와 회복 등에 관한 체조절기능을 생체에 대하여 충분히 발현하도록 설계하여 가공한 음료를 의미한다.
상기 건강기능음료는 지시된 비율로 필수 성분으로서 본 발명의 더덕 추출물을 함유하는 외에는 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다.
상기 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어 포도당, 과당 등 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 수크로스 등 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알코올이다. 상기한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴), 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100㎖ 당 일반적으로 약 1 내지 20 g, 바람직하게는 5 내지 12 g이다.
또한, 허혈성 뇌혈관 질환의 예방 또는 개선의 효과를 목적으로 하는 식품 조성물에 있어서, 상기 더덕 추출물의 양은 식품 또는 음료의 제조 시에 이용 목적에 따라 적합하게 결정되어 질 수 있고, 일 예로, 상기 더덕 추출물은 전체 식품 중량의 0.01 내지 15 중량%로 포함할 수 있으며, 음료 조성물의 경우에는 전체 식품 중량의 100 ㎖를 기준으로 0.02 내지 5 g, 바람직하게는 0.3 내지 1g의 비율로 포함할 수 있다.
본 발명의 더덕 추출물을 유효성분으로 포함하는 조성물 및 식품은 허혈을 유발시킨 수컷 몽골리안 저빌(Mongolian gerbil, Harlan, USA)의 해마(hippocampus) 영역의 신경세포사를 억제하는 우수한 신경세포 보호효능을 가지고 있으며, 특히, 더덕 추출물의 에틸아세테이트 분획물의 경우에는 대조군뿐만 아니라 신경세포 보호능 및 신경세포사 억제능이 인정된 더덕 추출물이나 다른 용매에 의한 분획물에 비하여 현저하게 우수한 신경세포 보호효과를 확인하였다.
상술한 바와 같이, 본 발명의 더덕 추출물은 신경세포를 보호하여 뇌허혈에 의해 유발되는 신경세포의 손상을 효과적으로 예방하고, 뇌허혈에 의한 신경세포사를 억제할 수 있어서 허혈성 뇌혈관 질환의 예방, 치료 또는 개선에 유용하게 사용될 수 있을 뿐만 아니라 인체에 부작용을 발생시키지 않으므로 의약 조성물 또는 건강기능식품 조성물에 널리 사용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 더덕 추출물의 허혈성 뇌혈관 질환 보호 효과를 알아보기 위하여, 뇌허혈 유발 후 4일이 경과된 실험동물의 해마조직을 크레실 바이올렛(cresyl violet)으로 염색하여 촬영한 사진으로, 상기 A는 뇌허혈을 유발시키지 않은 정상군(Sham)의 해마전체를 촬영한 사진이고, B는 CA1 영역을 촬영한 사진이며, 상기 C는 용매만을 투여한 후 뇌허혈을 유발시킨 대조군(Vehicle)의 해마전체를 촬영한 사진이고, D는 CA1 영역을 촬영한 사진이며, 상기 E는 더덕 추출물(Raw CL Crude)의 해마전체를 촬영한 사진이고, F는 CA1 영역을 촬영한 사진이며, 상기 G는 더덕 추출물의 에틸아세테이트 분획물의 해마전체를 촬영한 사진이고, H는 CA1 영역을 촬영한 사진이며, 상기 I는 더덕 추출물의 헥산 분획물의 해마전체를 촬영한 사진이고, J는 CA1 영역을 촬영한 사진이며, 상기 K는 더덕 추출물의 메틸렌클로라이드 분획물의 해마전체를 촬영한 사진이고, L은 CA1 영역을 촬영한 사진이며, 상기 M은 더덕 추출물의 물 분획물의 해마전체를 촬영한 사진이고, N은 CA1 영역을 촬영한 사진이며, 상기 O는 찐더덕 추출물(Steamed CL Crude)의 해마전체를 촬영한 사진이고, P는 CA1 영역을 촬영한 사진이며, 상기 Q는 찐더덕 추출물의 에틸아세테이트 분획물의 해마전체를 촬영한 사진이고, R은 CA1 영역을 촬영한 사진이며, 상기 S는 찐더덕 추출물의 헥산 분획물의 해마전체를 촬영한 사진이고, T는 CA1 영역을 촬영한 사진이며, 상기 U는 찐더덕 추출물의 메틸렌클로라이드 분획물의 해마전체를 촬영한 사진이고, V는 CA1 영역을 촬영한 사진이며, 상기 W는 더덕 추출물의 물 분획물의 해마전체를 촬영한 사진이고, X는 CA1 영역을 촬영한 사진이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 더덕 추출물의 허혈성 뇌혈관 질환 보호 효과를 알아보기 위하여, 신경세포의 생존율을 뇌허혈 유발 4일 후에 생존해 있는 세포수를 정상군에 대한 상대적 수치로 나타낸 그래프이다. 상기 그래프에서 Sham은 정상군을 의미하고, Vehicle은 대조군을 의미하며, Raw CL은 생더덕을 의미하고, Steamed CL은 찐더덕을 의미하며, Crude은 추출물을 의미하고, EtoAC는 에틸아세테이트 분획물을 의미하며, Hexane은 헥산 분획물을 의미하고, DCM은 메틸렌클로라이드 분획물을 의미하며, Water는 물 분획물을 의미한다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 더덕 추출물, 보다 구체적으로 더덕 추출물의 에틸아세테이트 분획물 및 찐더덕 추출물의 에틸아세테이트 분획물의 허혈성 뇌혈관 질환 보호 효과를 알아보기 위하여, 뇌허혈 유발 후 4일이 경과된 실험동물의 해마조직의 CA1 영역을 신경세포에 대한 항체인 마우스 항-NeuN(NeuN)를 이용하여 면역조직화학(immunohistochemistry) 방법으로 관찰한 사진 및 사멸 신경세포에 대해 Fluoro-Jade B(F-JB)를 이용하여 형광염색한 사진이다. 상기 사진에서 Sham은 정상군(A, a)을 의미하고, Vehicle은 대조군(B, b)을 의미하며, ERC(C, c)는 생더덕 추출물의 에틸아세테이트 분획물을 의미하고, ESC(D, d)는 찐더덕 추출물의 에틸아세테이트 분획물을 의미한다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 더덕 추출물, 보다 구체적으로 더덕 추출물의 에틸아세테이트 분획물 및 찐더덕 추출물의 에틸아세테이트 분획물의 허혈성 뇌혈관 질환 보호 효과를 알아보기 위한 것으로, 도 4a는 뇌허혈 유발 4일 후에 생존해 있는 세포수를 정상군에 대한 상대적 수치로 나타낸 그래프이고, 도 4b는 뇌허혈 유발 4일 후에 사멸한 세포수를 대조군에 대한 상대적 수치로 나타낸 그래프이다. 상기 그래프에서 Sham은 정상군을 의미하고, Vehicle은 대조군을 의미하며, Raw Codonopsis는 생더덕 추출물의 에틸아세테이트 분획물을 의미하고, Steamed Codonopsis는 찐더덕 추출물의 에틸아세테이트 분획물을 의미한다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 더덕 추출물, 보다 구체적으로 더덕 추출물의 에틸아세테이트 분획물 및 찐더덕 추출물의 에틸아세테이트 분획물의 허혈성 뇌혈관 질환 보호 효과를 알아보기 위하여, 미세돌기아교세포의 표지자인 항-IB4 항체(IB4)를 이용하여 면역조직화학(immunohistochemistry) 방법으로 관찰한 사진이다. 상기 사진에서 Sham은 정상군(A)을 의미하고, Vehicle은 대조군(B)을 의미하며, ERC는 생더덕 추출물의 에틸아세테이트 분획물(C)을 의미하고, ESC는 찐더덕 추출물의 에틸아세테이트 분획물(D)을 의미한다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 더덕 추출물, 보다 구체적으로 더덕 추출물의 에틸아세테이트 분획물 및 찐더덕 추출물의 에틸아세테이트 분획물의 허혈성 뇌혈관 질환 보호 효과를 알아보기 위하여 뇌허혈 유발 4일 후에 IB4로 염색된 세포 수를 정상군에 대한 상대적 수치로 나타낸 그래프로, 상기 그래프에서 Sham은 정상군을 의미하고, Vehicle은 대조군을 의미하며, Raw Codonopsis는 생더덕 추출물의 에틸아세테이트 분획물을 의미하고, Steamed Codonopsis는 찐더덕 추출물의 에틸아세테이트 분획물을 의미한다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 더덕 추출물의 허혈성 뇌혈관 질환 보호 효과를 알아보기 위하여, 신경세포의 생존율을 뇌허혈 유발 4일 후에 생존해 있는 세포수를 정상군에 대한 상대적 수치로 나타낸 그래프이다. 상기 그래프에서 Sham은 정상군을 의미하고, Vehicle은 대조군을 의미하며, Raw CL은 생더덕을 의미하고, Steamed CL은 찐더덕을 의미하며, Crude은 추출물을 의미하고, EtoAC는 에틸아세테이트 분획물을 의미하며, Hexane은 헥산 분획물을 의미하고, DCM은 메틸렌클로라이드 분획물을 의미하며, Water는 물 분획물을 의미한다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 더덕 추출물, 보다 구체적으로 더덕 추출물의 에틸아세테이트 분획물 및 찐더덕 추출물의 에틸아세테이트 분획물의 허혈성 뇌혈관 질환 보호 효과를 알아보기 위하여, 뇌허혈 유발 후 4일이 경과된 실험동물의 해마조직의 CA1 영역을 신경세포에 대한 항체인 마우스 항-NeuN(NeuN)를 이용하여 면역조직화학(immunohistochemistry) 방법으로 관찰한 사진 및 사멸 신경세포에 대해 Fluoro-Jade B(F-JB)를 이용하여 형광염색한 사진이다. 상기 사진에서 Sham은 정상군(A, a)을 의미하고, Vehicle은 대조군(B, b)을 의미하며, ERC(C, c)는 생더덕 추출물의 에틸아세테이트 분획물을 의미하고, ESC(D, d)는 찐더덕 추출물의 에틸아세테이트 분획물을 의미한다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 더덕 추출물, 보다 구체적으로 더덕 추출물의 에틸아세테이트 분획물 및 찐더덕 추출물의 에틸아세테이트 분획물의 허혈성 뇌혈관 질환 보호 효과를 알아보기 위한 것으로, 도 4a는 뇌허혈 유발 4일 후에 생존해 있는 세포수를 정상군에 대한 상대적 수치로 나타낸 그래프이고, 도 4b는 뇌허혈 유발 4일 후에 사멸한 세포수를 대조군에 대한 상대적 수치로 나타낸 그래프이다. 상기 그래프에서 Sham은 정상군을 의미하고, Vehicle은 대조군을 의미하며, Raw Codonopsis는 생더덕 추출물의 에틸아세테이트 분획물을 의미하고, Steamed Codonopsis는 찐더덕 추출물의 에틸아세테이트 분획물을 의미한다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 더덕 추출물, 보다 구체적으로 더덕 추출물의 에틸아세테이트 분획물 및 찐더덕 추출물의 에틸아세테이트 분획물의 허혈성 뇌혈관 질환 보호 효과를 알아보기 위하여, 미세돌기아교세포의 표지자인 항-IB4 항체(IB4)를 이용하여 면역조직화학(immunohistochemistry) 방법으로 관찰한 사진이다. 상기 사진에서 Sham은 정상군(A)을 의미하고, Vehicle은 대조군(B)을 의미하며, ERC는 생더덕 추출물의 에틸아세테이트 분획물(C)을 의미하고, ESC는 찐더덕 추출물의 에틸아세테이트 분획물(D)을 의미한다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 더덕 추출물, 보다 구체적으로 더덕 추출물의 에틸아세테이트 분획물 및 찐더덕 추출물의 에틸아세테이트 분획물의 허혈성 뇌혈관 질환 보호 효과를 알아보기 위하여 뇌허혈 유발 4일 후에 IB4로 염색된 세포 수를 정상군에 대한 상대적 수치로 나타낸 그래프로, 상기 그래프에서 Sham은 정상군을 의미하고, Vehicle은 대조군을 의미하며, Raw Codonopsis는 생더덕 추출물의 에틸아세테이트 분획물을 의미하고, Steamed Codonopsis는 찐더덕 추출물의 에틸아세테이트 분획물을 의미한다.
이하, 본 발명의 바람직한 실시예를 기재한다. 하기의 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐 본 발명의 권리범위가 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예
1. 더덕 추출물 및
분획물의
제조
대한민국 춘천시 소재 재래시장에서 신선한 상태로 구입한 더덕을 사용하여 찐더덕을 제조하였고, 상기 더덕과 찐더덕을 이용하여 각각 더덕 추출물을 제조하였다.
보다 구체적으로, 상기 찐더덕은 다음과 같은 방법으로 수행하였다. 상기 구입한 생더덕을 깨끗이 수세하고, 열풍건조기를 이용하여 60℃에서 3시간 동안 건조한 뒤, 가압멸균기(autoclave)를 이용하여 105℃에서 3시간 동안 찌는 과정을 수행하였다. 상기 과정을 2회 더 반복하여 수행한 뒤, 열풍건조기를 이용하여 60℃에서 3시간 동안 더 건조하여 최종적으로 찐더덕을 제조하였다.
상기 더덕과 찐더덕에 대해 용매추출법으로 추출물을 제조하였고, 추가로 분획물을 제조하였다.
보다 구체적으로, 상기 더덕과 상기 찐더덕 각 6 kg에 30 L 70%에탄올을 첨가 후, 70℃에서 2시간 동안 온침추출과정을 수행하였다. 상기 과정을 2회 더 반복하여 얻은 추출물을 Whatman filter No2.(Whatman, 영국)를 이용하여 여과하여 여과액을 수득하였다. 상기 수득된 여과액의 용매를 감압농축기(Buchi Rotavapor R-220, 스위스)를 제거한 후, -20℃에서 동결 건조하여 최종 더덕 70% 에탄올 추출물(1,334.81 g, 22.25%) 및 찐더덕 70% 에탄올 추출물(2,557.75 g, 42.63%)을 수득하였다. 상기 수득한 추출물은 실험에 사용되기 전까지 냉동보관하였다.
상기 수득된 더덕 70% 에탄올 추출물 및 찐더덕 70% 에탄올 추출물을 극성에 따라 분획하기 위해 유기용매를 이용한 계통분획을 실시하였다.
보다 구체적으로, 상기 에탄올 추출물에 일정량의 물을 가하여 현탁시킨 후, 노르말-헥산(n-hexane), 메틸렌클로라이드(methylene chloride), 에틸아세테이트(ethylacetate), 노르말-부탄올(n-butanol) 및 물을 첨가하여 분획물을 수득하였다.
우선 상기 에탄올 추출물에 물을 가하여 현탁시키고, 노르말-헥산을 첨가한 후, 충분히 흔들어 주고 5시간 동안 상온에서 정치한 후 분리하였다. 상기 과정을 3회 반복하여, 헥산 분획층을 얻은 후, 여과하고 감압농축한 뒤, 동결 건조하여 최종 헥산 분획물을 수득하였다. 상기 헥산 분획층 제거한 후, 메틸렌클로라이드를 첨가하고, 상기와 같은 방법으로 메틸렌클로라이드 분획물을 수득하였다. 상기 메틸렌클로라이드 분획물을 제거한 후, 에틸렌아세테이트를 첨가하고, 상기와 같은 방법으로 에틸렌아세테이트 분획물을 수득하였다. 상기 에틸렌아세테이트 분획물을 제거한 후, n-부탄올을 첨가하고, 상기와 같은 방법으로 부탄올 분획물을 수득하였다. 상기 부탄올 분획물을 제거하고 남은 물층은 동결건조하여 물 분획물로 수득하였다.
상기 분획과정에 의해 더덕 헥산 분획물(26.8 g, 수득률: 22.25%), 더덕 메틸렌클로라이드 분획물(15.62 g, 수득률: 1.17%), 더덕 에틸아세테이트 분획물(3.39 g, 수득률: 0.25%), 더덕 부탄올 분획물(107.95 g, 수득률: 8.09%), 더덕 물 분획물(691.09 g, 수득률: 51.77%), 찐더덕 헥산 분획물(21.64 g, 수득률: 0.85%), 찐더덕 메틸렌클로라이드 분획물(60.26 g, 수득률: 2.36%) 및 찐더덕 에틸아세테이트 분획물(24.67 g, 수득률: 0.96%)을 수득하였다.
실시예
2. 실험동물을 통한 더덕 추출물의
뇌허혈
시 신경세포 보호효능
측정1
상기 실시예 1에서 제조된 더덕 추출물, 더덕 분획물, 찐더덕 추출물 및 찐더덕 분획물의 신경세포 보효효능을 체중 65g 내지 75g인 수컷 몽골리안 저빌(Mongolian gerbil, Harlan, USA)을 마취시켜 온목동맥(common carotid artery)을 노출 후 결찰하여 뇌허혈을 유발시킨 후에, 몽골리안 저빌의 해마조직을 염색하여 관찰하는 방법을 통하여 확인하였다.
실시예
2-1. 실험동물의 사육
체중 65 내지 75g의 수컷 몽골리안 저빌(Mongolian gerbil, Meriones unguiculatus, Halan, USA) 40 마리를 오전 7시부터 오후 7시까지 빛을 가하는 일정한 명암주기, 21℃ 내지 25℃의 온도 및 45% 내지 65%의 상대습도의 조건에서 사육하였다. 실험동물의 사료는 일반적인 펠렛건조 사료(대한실험동물, 대한민국)를 사용하였고, 사료와 물은 상시로 섭취할 수 있게 하였다.
실시예
2-2.
뇌허혈시
신경세포 보호효능 측정
상기 실시예 2-1에서 사육한 실험동물에 실시예 1에서 제조된 더덕 추출물, 더덕 분획물, 찐더덕 추출물 및 찐더덕 분획물 각각 350 mg을 증류수 50 ml에 녹인 것을 일주일 전부터 매일 식도용 바늘을 이용하여 실험동물 체중 1kg 당 상기 추출물 또는 분획물이 50 mg이 되도록 경구투여하였다.
상기 일주일간 추출물들을 투입한 후에, 질소와 산소가 7 : 3으로 혼합된 가스에 3% 이소플루란(isoflurane, Baxtor, USA)을 혼합한 가스를 이용하여 실험동물을 전신마취하였다. 상기의 질소와 산소 혼합가스에 2.5% 이소플루란을 혼합한 가스를 이용하여 실험동물의 마취상태를 유지하면서 실험동물에 대한 수술을 수행하였다.
실험동물에 대한 수술은 목 부위의 털을 깎고 소독한 다음 절개를 하여 양쪽 온목동맥을 노출시키고, 동맥류 클립(aneurysm clip, Staelting, USA)을 이용하여 5분 동안 결찰하여 뇌허혈을 일으킨 후, 클립을 제거하여 재관류시키는 방법으로 수행하였다. 이때, 각 실험군은 검안경(ophthalmoscope)을 이용하여 망막중심동맥(central artery of retina)의 혈액 순환 유무를 관찰하여 완전한 온목동맥의 폐쇄여부를 확인하였다.
뇌허혈을 유발시키는 동안 직장 내 체온계를 삽입하여 체온을 측정하였으며, 실험동물의 온도에 따라 자동으로 조절되는 온열 패드를 사용하여 체온을 정상 체온인 36.7℃ 내지 37.3℃로 일정하게 유지시켰다.
실험군은 뇌허혈 유발 4일 후에 티오펜탈 소듐(thiopental sodium, 유한양행, 대한민국)을 체중 1 ㎏ 당 각각 30㎎의 용량으로 복강 내 주사하여 마취시킨 다음, 1,000㎖ 당 헤파린 1,000 IU를 함유한 4 ℃의 생리식염수를 좌심실로 주입하여 관류 세척하였다. 관류 세척이 완료된 상기 동물에 대해 4℃의 4% 파라포름알데하이드(0.1 M 인산완충액(in 0.1 M phosphate buffer; PB), pH 7.4)를 이용하여 관류고정을 수행하였다.
뼈절단기를 이용하여 관류 고정이 끝난 실험동물의 머리뼈 공간을 열어 뇌를 적출하였다. 적출된 실험동물의 뇌를 4℃의 4% 파라포름알데하이드(in 0.1 M phosphate buffer; PB, pH 7.4)를 이용하여 4시간동안 후고정하였다. 후고정이 끝난 뇌는 30% 수크로스 용액(in 0.1 M 인산 완충액(phosphate buffer))에 넣어 바닥에 가라앉을 때까지 침강시킨 후, 슬라이드 마이크로톰(sliding microtome, Reichert-Jung, 독일)으로 상기 뇌의 조직을 30㎛ 두께로 잘라 조직절편을 만들었다. 상기의 조직절편을 보존액(storing solution)이 들어있는 6웰 플레이트에 넣어 염색을 수행할 때까지 4℃에서 보관하였다.
상기 만들어진 조직절편 중에서 해마형성체(hippocampal formation)가 잘 나와 있는 조직을 선택하고, 조직절편에 묻어있는 보존액을 없애기 위해 0.01M PBS로 10분씩 3회 세척하였다. 상기 세척된 조직절편을 젤라틴 입힌 슬라이드에 도말하여 37℃에서 충분히 건조시켰다. 충분히 건조시킨 상기 조직절편을 증류수에 잠시 담가 둔 후, 2% 크레실 바이올렛 아세테이트(cresyl violet acetate, Sigma, USA) 용액에 1분간 담가 조직절편의 염색을 수행하였다.
상기의 염색한 조직절편을 흐르는 물에 충분히 세척하여 슬라이드에 묻어 있는 과량의 염료를 제거하였다. 상기 과량의 염료를 제거한 조직절편을 증류수에 잠시 담근 후에 50%, 70%, 80%, 90%, 95% 및 100% 에탄올 용액으로 순차적으로 처리하여 탈수 및 과량의 크레실 바이올렛 세척을 수행하였다. 상기 조직절편에서 니슬소체(Nissle body)가 보이는 것을 확인한 후, 자일렌(Junsei, 일본)에 담가 투명화한 다음 카나다 발삼(Canada Balsam, Kanto, 일본)으로 봉입하였다.
대조군은 상기 추출물을 녹이는데 이용된 증류수만을 경구투여한 것을 제외하고는 상기와 동일한 방법으로 준비하였으며, 정상군은 더덕 추출물을 포함한 어떠한 물질도 투여하지 않고, 허혈-재관류 수술도 시행하지 아니하였으며, 정상군의 조직절편은 상기와 동일한 방법으로 준비하였다.
디지털 카메라(Axiocam, Cal Zeiss, Germany)가 부착되어 있는 악시오엠1 현미경(AxioM1 microscope, Carl Zeiss, 독일)으로 전체 해마 영역을 25배, CA1 영역을 200배로 각각 확대하여 각 조직절편들을 사진 촬영하였다. 상기 더덕 추출물 및 분획물을 투여한 실험군, 대조군 및 정상군의 조직절편을 촬영한 결과를 도 1에 나타내었다. 유의성의 검증을 위하여, 상기 도 1은 각 군 중에서 가장 일반적인 부분을 골라 촬영한 사진이다.
또한, 상기 촬영한 사진에 대해 이미지 분석기(Optimas 6.5, USA) 프로그램을 이용하여 보라색으로 염색된 상기 조직절편의 신경세포를 계수하였다. 각 군에 대한 유의성의 검증을 위하여 일원분산분석(one-way ANOVA test)을 수행하였다. 상기 측정한 조직절편의 신경세포를 계수한 결과를 정상군(Sham)에 대한 상대적인 수 즉, 정상군의 신경세포 계수결과를 100%로 하여 각 실험군의 계수결과를 도 2에 나타냈다.
상기 도 1에서 알 수 있는 바와 같이, 정상군(Sham)은 해마의 영역 전체에서 신경세포가 보라색으로 진하게 염색되고, 특히 CA1 영역에서는 피라미드층에 신경세포가 밀집하여 있는 것을 관찰할 수 있었다. 그러나, 추출물을 투여하지 아니하고 뇌허혈을 유발시킨 대조군(Vehicle)의 경우, 뇌허혈에 의한 지연성 신경세포사로 인해 해마의 영역 중 CA1 영역에서 신경세포사가 일어남으로써 신경세포의 염색이 거의 관찰되지 않았고, CA1 영역 중 피라미드층에 대부분의 신경세포가 소실되었음이 확인되었다.
또한, 50㎎/㎏의 더덕 추출물 또는 더덕 추출물의 분획물을 투여한 E 내지 N에서, 더덕 추출물, 메틸렌클로라이드 분획물 및 물 분획물의 경우 신경세포사가 발생하였음이 확인되었고, 해마의 영역 중 CA1 영역을 확인한 결과에서 더덕 추출물, 메틸렌클로라이드 분획물 및 물 분획물의 경우 CA1 영역 중 피라미드층에서 신경세포가 다소 소실되었음이 확인되었다. 또한, 에틸아세테이트 분획물 및 헥산 분획물을 처리한 결과, 정상군과 같이 해마의 영역 전체에서 신경세포가 보라색으로 진하게 염색되고, CA1 영역의 피라미드층에서도 신경세포가 밀집하여 있는 것이 관찰되었다. 상기 결과로부터, 더덕 추출물의 경우, 더덕 추출물의 에틸아세테이트 분획물 및 더덕 추출물의 헥산 분획물이 다른 추출물 또는 분획물에 비하여 신경세포 보호효과가 현저히 우수한 것으로 확인되었다.
상기 도 2에서 알 수 있는 바와 같이, 대조군은 정상군에 비하여 해마의 CA1 영역 신경세포의 수가 약 12% 정도 관찰되었으나, 더덕 추출물의 경우 약 25%의 신경세포가 생존한 것으로 확인되어, 더덕 추출물의 경우 신경세포 보호효과가 있음이 확인되었다. 또한, 더덕 추출물의 경우 대조군의 약 2배인 약 25%, 메틸렌클로라이드 분획물의 경우 약 30% 및 물 분획물의 경우 약 35%의 신경세포가 생존한 것으로 확인된 반면, 헥산 분획물의 경우 약 53%의 신경세포가 생존되고, 에틸아세테이트 분획물의 경우 약 75%의 신경세포가 생존한 것으로 확인되어, 다른 추출물에 비하여 에틸아세테이트 분획물 및 헥산 분획물 특히, 에틸아세테이트 분획물의 신경세포 보호효과가 현저하게 우수한 것으로 확인되었다.
또한, 상기 도 1에서 알 수 있는 바와 같이, 50㎎/㎏의 찐더덕 추출물 또는 찐더덕 추출물의 분획물을 투여한 O 내지 X에서, 찐더덕 추출물, 헥산 분획물 및 물 분획물의 경우 신경세포사가 발생하였음이 확인되었고, 해마의 영역 중 CA1 영역을 확인한 결과에서 찐더덕 추출물, 헥산 분획물 및 물 분획물의 경우 CA1 영역 중 피라미드층에서 신경세포가 다소 소실되었음이 확인되었다. 또한, 에틸아세테이트 분획물 및 메틸렌클로라이드 분획물을 처리한 결과, 정상군과 같이 해마의 영역 전체에서 신경세포가 보라색으로 진하게 염색되고, CA1 영역의 피라미드층에서도 신경세포가 밀집하여 있는 것이 관찰되었다. 상기 결과로부터, 찐더덕 추출물의 경우, 찐더덕 추출물의 에틸아세테이트 분획물 및 찐더덕 추출물의 메틸렌클로라이드 분획물이 다른 추출물 또는 분획물에 비하여 신경세포 보호효과가 현저히 우수한 것으로 확인되었다.
또한, 상기 도 2에서 알 수 있는 바와 같이, 찐더덕 추출물의 경우 대조군인 약 12%에 비하여, 약 20%의 신경세포가 생존한 것으로 확인되어, 찐더덕 추출물의 경우에도 신경세포 보호효과가 있음이 확인되었다. 또한, 찐더덕 추출물의 경우 약 20% 및 헥산 분획물의 경우 약 22%의 신경세포가 생존한 것이 확인되었다. 또한, 물 분획물의 경우 약 40%의 신경세포가 생존하여 대조군의 약 300%의 신경세포가 확인되었고, 헥산 분획물의 경우 약 57%의 신경세포가 생존하여 대조군의 약 500%의 신경세포가 확인되었으며, 에틸아세테이트 분획물의 경우 약 85%의 신경세포가 생존하여, 더덕 추출물 및 더덕 추출물의 분획물과 찐더덕 추출물 및 찐더덕 추출물의 분획물 중에서 찐더덕 추출물의 에틸아세테이트 분획물이 신경세포 보호 효과가 가장 우수한 것으로 확인되었다.
상기 더덕 추출물의 에틸아세테이트 분획물 또는 찐더덕 추출물의 에틸아세테이트 분획물의 경우 정상군 대비 각각 75% 및 85%의 신경세포가 계수되어, 뇌허혈 등이 발생하는 경우에도 정상군과 유사한 정도의 신경세포가 유지되는 것으로 확인되었다. 따라서, 에틸아세테이트 분획물의 경우, 뇌 의 일정 부분 또는 전체의 신경세포의 사멸을 억제할 수 있어서, 뇌허혈이 일어난 경우에도 운동, 언어, 시각 또는 후각 등의 관련 부위의 신경세포 손상을 최대한으로 억제하여, 뇌허혈에 의한 허혈성 뇌혈관 질환이나 운동손실, 감각의 마비, 언어장애, 시각 및 후각 장애와 같은 뇌기능 저하를 예방 또는 개선할 수 있으므로, 상기 에틸아세테이트 분획물은 신경세포 보호효과가 매우 탁월한 것으로 평가될 수 있다.
실시예
3. 실험동물을 통한 더덕 추출물의
뇌허혈
시 신경세포 보호효능
측정2
더덕 추출물의 신경세포 보호 효과, 보다 구체적으로 뇌허혈에 의한 신경세포의 사멸 방지 효과를 추가적으로 확인하기 위하여, 상기 실시예 2에서 신경세포 보호효과가 가장 우수한 것으로 확인된 더덕 추출물의 에틸아세테이트 분획물 및 찐더덕 추출물의 에틸아세테이트 분획물을 각각 투여시킨 투여군에 대하여 추가적으로 신경세포의 표지자인 NeuN(a neuronal specific nuclear protein)에 대한 항체를 이용하여 면역조직화학(immunohistochemistry) 염색을 수행하였고, 사멸된 신경세포에 대한 표지자인 Fluoro-Jade B를 이용하여 조직 형광염색을 수행하였다.
보다 구체적으로, 상기 실시예 2에서 준비된 조직절편 중 해마복합체가 잘 나타난 조직절편을 선택하여 실험에 사용하였으며, 상기 선택된 조직절편은 조직에 존재하는 내인성 페록시다아제(peroxidase)를 제거하기 위하여 0.3% H2O2(in 0.001M PBS)와 30분 동안 반응시켰다. 상기 0.3% H2O2(in 0.001M PBS)로 반응시킨 조직 절편의 비특이적인 면역반응을 방지하기 위하여, 상기 조직절편을 3%의 정상 염소 혈청(normal goat serum)으로 30분간 반응시켰다.
신경세포에 대한 염색과 관련해서는 상기 3%의 정상 염소 혈청과 반응한 조직절편과 1:800으로 희석한 1차 항체인 마우스 항-NeuN(mouse anti-NeuN, Chemicon, USA)를 4℃에서 48시간 반응시켰다. 상기 반응이 끝난 조직절편은 각각 1:200으로 희석한 2차 항체인 항 마우스 IgG(anti-mouse IgG, Vector)로 상온에서 2시간 반응시킨 후, 1:200으로 희석한 3차 항체인 ABC용액(Vector)으로 2시간 반응시켰으며, 3,3'-DAB(diaminobezidine)를 기질로 발색하였다. 상기 항체와 반응시키는 과정의 각 단계를 수행함에 있어서, 각 단계 별로 상기 조직절편을 0.01M PBS를 사용하여 10분씩 3회 세척하였다.
상기 3차 항체를 이용한 반응이 끝난 조직절편을 젤라틴 코팅된 슬라이드 글라스(slide glass)에 도말한 후, 실온에서 12시간 동안 건조하였고, 상기 건조된 조직절편은 통상적인 탈수투명화 과정을 거쳐 봉입하였다. 상기 NeuN 항체와 반응을 수행한 후, 봉입한 조직절편을 현미경을 이용하여 관찰하였으며, 그 관찰결과를 촬영한 사진을 촬영하여 도 3에 나타내었다.
또한, 상기 촬영한 사진에 대해 상기 실시예 2-2와 같이 이미지 분석기 프로그램을 이용하여 염색된 신경세포를 계수하였으며, 상기 계수한 결과를 정상군(Sham)에 대한 상대적인 수치로 도 4에 나타내었다.
상기 도 3의 오른쪽 열에 나타낸 바와 같이, 정상군(Sham)은 해마의 CA1 영역 전체에서 상기 1차 항체인 마우스 항-NeuN 항체에 의해 면역염색된 세포들이 다수 관찰되었다. 그러나, 추출물이 아닌 용매만을 투여하고 뇌허혈을 유발시킨 대조군(Vehicle)의 경우, 정상군과 비교하여 CA1 영역에서 상기 1차 항체인 마우스 항-NeuN 항체에 의해 면역염색된 세포 즉, 신경세포가 현저하게 감소되었음이 확인되었다. 또한, 50㎎/㎏의 더덕 에틸아세테이트 분획물 및 찐더덕 에틸아세테이트 분획물을 처리한 결과, 정상군과 같이 해마의 CA1 영역 전체에서 상기 1차 항체인 마우스 항-NeuN 항체에 의해 면역염색된 세포들이 다수 관찰되었다. 상기 결과로부터, 더덕 추출물의 에틸아세테이트 분획물 및 찐더덕 추출물의 에틸아세테이트 분획물이 신경세포 보호효과가 매우 우수하다는 것이 재확인되었다.
또한, 상기 도 4a에서 알 수 있는 바와 같이, 상기 대조군의 1차 항체인 마우스 항-NeuN 항체로 염색된 신경세포의 수는 정상군의 약 14% 정도에 불과한 것으로 측정되었으나, 더덕 에틸아세테이트 분획물의 경우 정상군의 약 72%의 신경세포가 생존한 것으로 확인되었고, 찐더덕 에틸아세테이트 분획물의 경우 정상군의 약 68%의 신경세포가 생존한 것으로 확인되어, 상기 더덕추출물의 에틸아세테이트 분획물의 신경세포 보호효과가 현저하게 우수한 것으로 확인되었다.
또한, 사멸된 신경세포에 대한 염색과 관련해서는 퇴행신경세포의 표지자인 Fluoro-Jade B(F-J B)를 이용하여 조직형광염색을 수행하였다. 상기 조직절편을 증류수를 이용하여 5분간 3회 세척한 후, 0.06% potassium permanganet 용액에 15분간 담그었다. 이후, 증류수로 2분간 세척하고 0.1% 아세트산(acetic acid)이 포함된 0.001% F-J B(Histochem, Jefferson, AR, USA) 용액에 30분간 담그어 염색을 수행하였다. 상기 염색된 조직은 1분씩 3회 증류수로 세척하고, 50℃ slide warmer에서 20분간 건조한 후, 자일렌(xylen)에 담근 다음, DPX(Sigma, USA)로 봉입하였다. 상기 봉입된 조직을 형광현미경(Ex:385nm, Em:425nm)을 이용하여 관찰하였으며,그 결과를 촬영한 사진을 촬영하여 도 3에 나타내었다.
또한, 상기 촬영한 사진에 대해 상기 실시예 2-2와 같이 이미지 분석기 프로그램을 이용하여 염색된 신경세포를 계수하였으며, 상기 계수한 결과를 대조군(Vehicle)에 대한 상대적인 수치로 도 4에 나타내었다.
상기 도 3의 왼쪽 열에 나타낸 바와 같이, 정상군(Sham)은 해마의 CA1 영역 전체가 사멸된 신경세포 또는 사멸중인 신경세포에 대한 표지자인 Fluoro-Jade B에 의해 거의 염색되지 아니한 반면, 대조군(Vehicle)의 경우에는 해마의 CA1 영역 전체에서 진하게 형광염색되어, 다수의 신경세포가 사멸 또는 사멸중인 것으로 확인되었다. 또한, 50㎎/㎏의 더덕 에틸아세테이트 분획물 및 찐더덕 에틸아세테이트 분획물을 처리한 결과, 정상군과 같이 해마의 CA1 영역 전체에서 상기 사멸된 신경세포 또는 사멸중인 신경세포에 대한 표지자인 Fluoro-Jade B에 의해 형광염색된 세포들이 소수 관찰되었다. 상기 결과로부터, 더덕 추출물의 에틸아세테이트 분획물 및 찐더덕 추출물의 에틸아세테이트 분획물을 처리한 경우 허혈 발생에 의해서도 신경세포 사멸 정도가 현저하게 감소되는 것으로 확인되었다.
또한, 상기 도 4b에서 알 수 있는 바와 같이, 더덕 에틸아세테이트 분획물을 처리한 실험군의 경우, 사멸된 신경세포 또는 사멸중인 신경세포에 대한 표지자인 Fluoro-Jade B로 염색된 신경세포의 수는 정상군의 약 16% 정도에 불구하고, 찐더덕 에틸아세테이트 분획물을 처리한 실험군의 경우, 사멸된 신경세포 또는 사멸중인 신경세포에 대한 표지자인 Fluoro-Jade B로 염색된 신경세포의 수는 정상군의 약 23% 정도에 불구하여, 더덕 추출물의 에틸아세테이트 분획물 및 찐더덕 추출물의 에틸아세테이트 분획물을 처리한 경우 허혈 발생에 의한 신경세포의 사멸이 억제될 수 있으므로, 상기 더덕 추출물의 에틸아세테이트 분획물 및 찐더덕 추출물의 에틸아세테이트 분획물은 신경세포 보호효과가 현저하게 우수한 것으로 확인되었다.
실시예
4. 실험동물을 통한 더덕 추출물의
뇌허혈
시 신경세포 보호효능
측정3
(아교세포 활성변화 측정)
더덕 추출물의 신경세포 보호 효과, 보다 구체적으로 뇌허혈에 의한 신경세포의 사멸 방지 효과를 추가적으로 확인하기 위하여, 상기 실시예 2에서 신경세포 보호효과가 가장 우수한 것으로 확인된 더덕 추출물의 에틸아세테이트 분획물 및 찐더덕 추출물의 에틸아세테이트 분획물을 각각 투여시킨 투여군에 대하여 추가적으로 아교세포, 구체적으로 미세돌기아교세포의 활성 변화를 면역조직화학(immunohistochemistry) 염색을 수행하였다.
보다 구체적으로, 상기 실시예 2에서 준비된 조직절편 중 해마복합체가 잘 나타난 조직절편을 선택하여 실험에 사용하였으며, 상기 선택된 조직절편은 상기 실시예 3에 기재된 방법을 응용하여 면역조직화학 염색을 수행하였다.
상기 면역조직화학 염색과정에서, 미세돌기아교세포의 변화를 확인하기 위한 1차 항체로는 1:1000으로 희석한 항-IB4(rabbit anti-IB4, Sigma, USA)를 사용하였다. 상기 1차 항체를 사용하여 상기 실시예 3에 기재된 방법을 응용하여 면역조직화학 염색과정을 수행한 후, 봉입한 조직절편을 전자 현미경을 이용하여 관찰하였으며, 그 관찰결과를 촬영한 사진을 도 5에 나타내었다.
상기 도 5에 나타낸 바와 같이, 정상군(Sham)의 경우, 활성화된 미세돌기아교세포에 대한 항체인 마우스 항-IB4 항체에 의해 면역염색된 세포들은 거의 관찰되지 아니하였다. 한편, 대조군(Vehicle)의 경우, 마우스 항-IB4 항체에 의해 면역염색된 세포가 다수 관찰되어, 상기 미세아교세포의 표식자로 알려진 IB4가 다수 발현된 것으로 확인되었다. 한편, 더덕 추출물의 에틸아세테이트 분획물 및 찐더덕 추출물의 에틸아세테이트 분획물을 각각 50mg/kg으로 투여한 실험군의 경우 활성화된 미세돌기아교세포의 표식자로 알려진 IB4의 발현 정도가 대조군에 비하여 낮아, 상기 미세돌기아교세포의 발현이 상당히 억제되는 것으로 확인되었다.
또한, 상기 도 6에서 알 수 있는 바와 같이, 상기 활성화된 미세돌기아교세포에 대한 1차 항체인 IB4에 의해 면역염색된 세포 즉, IB4에 대한 면역반응성이 확인되어 활성화된 것으로 확인된 미세돌기아교세포는 정상군(Sham)에 대비하여 약 9,000%로 확인되었다. 또한, 더덕 추출물의 에틸아세테이트 분획물 및 찐더덕 추출물의 에틸아세테이트 분획물을 각각 50mg/kg으로 투여한 실험군의 경우 활성화된 미세돌기아교세포의 표식자로 알려진 IB4의 발현 정도가 정상군에 대비하여 각각 600% 및 640%으로 확인도었다. 상기 결과에 의해, 대조군의 경우 허혈에 의해 미세돌기아교세포가 비정상적으로 활성화되었으나, 더덕 추출물의 에틸아세테이트 분획물 및 찐더덕 추출물의 에틸아세테이트 분획물을 투여한 실험군에서는 정상군에 비해서 미세돌기아교세포가 활성화되기는 하였으나, 대조군과 비교하여 비정상적인 활성화를 최대한 억제하여, 상기 더덕추출물의 에틸아세테이트 분획물 및 상기 찐더덕추출물의 에틸아세테이트 분획물의 신경세포 보호효과가 현저하게 우수한 것이 다시 확인되었다.
상기한 바와 같이, 더덕 추출물과 찐더덕 추출물 특히, 더덕 추출물의 에틸아세테이트 분획물과 찐더덕 추출물의 에틸아세테이트 분획물은 허혈을 유발시킨 경우에서도 신경세포 특히, 해마 영역을 염색한 신경절편을 관찰한 결과 해마의 전체 영역, 특히 해마의 CA1 영역에서의 신경세포사를 억제하는 것으로 확인되었고, 신경세포에 대한 항-NeuN 항체 및 사멸된 신경세포에 대한 표시자인 F-J B를 통해 확인한 결과 신경세포사의 사멸이 현저하게 억제됨이 확인되었으며, 항-IB4 항체를 통하여 확인한 결과 미세돌기아교세포의 활성화를 매우 우수하게 억제할 수 있음이 확인되었으므로, 상기 더덕 추출물은 신경세포보호에 탁월한 효과가 있을 뿐만 아니라 아교세포의 활성화를 억제 효과도 우수한 것으로 평가되었다.
따라서, 상기 더덕 추출물은 허혈에 의해 발생되는 지연성 신경세포사를 현저하게 억제할 수 있으므로, 뇌허혈이 일어난 경우에도 운동, 언어, 시각 또는 후각 등의 관련 부위의 신경세포 손상을 최대한으로 억제하여, 뇌허혈에 의한 허혈성 뇌혈관 질환이나 운동손실, 감각의 마비, 언어장애, 시각 및 후각 장애와 같은 뇌기능 저하를 예방 또는 개선할 수 있을 것이다.
제조예
: 더덕추출물을 이용한 제제
하기 제조예는 실시예 1에서 제조된 더덕 추출물을 이용한 본 발명에 따른 허혈성 뇌혈관 질환 예방 또는 개선용 조성물의 제제예를 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 하기 기재에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
제조예
1.
산제의
제조
더덕 추출물 분말 30 mg
유당 100 mg
탈크 10 mg
약전 제제총칙 중 산제의 조제방법에 따라 1포 당 상기의 성분들을 혼합하고, 기밀포에 충진하여 산제를 제조하였다.
제조예
2. 정제의 제조
더덕 추출물 분말 20 mg
무수인산수소칼슘 750 mg
이산화규소 2 mg
전분글리콜산나트륨 20 mg
스테아린산 마그네슘 3 mg
산화티탄 적량
디에칠프탈레이트 적량
알미늄레이크 적량
레시틴 적량
인디고카르민 알미늄레이 적량
약전 제제총칙 중 정제의 조제방법에 따라 1정 당 상기의 성분들을 혼합하고, 타정하여 정제를 제조하였다.
제조예
3. 캡슐제의 제조
더덕 추출물 분말 10 mg
결정성 셀룰로오스 3 mg
락토오스 14.8 mg
마그네슘 스테아레이트 0.2 mg
약전 제제총칙 중 캡슐제의 조제방법에 따라 1캡슐 당 상기의 성분들을 혼합하고, 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조하였다.
제조예
4.
액제의
제조
더덕 추출물 분말 20 mg
이성화당 10 g
만니톨 5 g
미세결정셀룰로오스 적당
인산일수소칼륨 적당
정제수 적량
약전 제제총칙 중 액제의 제조방법에 따라 정제수에 각각의 성분을 가하여 용해시키고 레몬향을 적량 가한 다음 상기의 성분을 혼합한 후, 정제수를 가하여 전체 부피를 100㎖로 조절한 후 갈색병에 충진하여 멸균시켜 액제를 제조하였다.
제조예
5. 건강기능식품의 제조
더덕 추출물 분말 1,000 ㎎
비타민 혼합물 적량
비타민 A 아세테이트 70 ㎍
비타민 E 1.0 ㎎
비타민 B1 0.13 ㎎
비타민 B2 0.15 ㎎
비타민 B6 0.5 ㎎
비타민 B12 0.2 ㎍
비타민 C 10 ㎎
비오틴 10 ㎍
니코틴산아미드 1.7 ㎎
엽산 50 ㎍
판토텐산 칼슘 0.5 ㎎
무기질 혼합물 적량
황산 제1철 1.75 ㎎
산화아연 0.82 ㎎
탄산마그네슘 25.3 ㎎
제1인산칼륨 15 ㎎
제2인산칼슘 55 ㎎
구연산칼륨 90 ㎎
탄산칼슘 100 ㎎
염화마그네슘 24.8 ㎎
상기의 비타민 및 미네랄 혼합물의 조성비는 비교적 건강기능식품에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하며, 통상의 건강기능식품 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 과립을 제조하고, 통상의 방법에 따라 건강기능식품 제조에 사용할 수 있다.
상기 약제 및 기능성 식품의 조성비는 비교적 약제 또는 기능성 식품 제조에 적합한 성분비 중 일 예로, 수요국가, 수요계층이나 사용용도 등 수요자의 기호도에 따라서 그 배합비를 임의로 변형 실시할 수 있다.
Claims (8)
- 더덕(Codonopsis lanceolata) 추출물을 유효성분으로 포함하는 허혈성 뇌혈관 질환 예방 또는 개선용 조성물.
- 제1항에 있어서,
상기 허혈성 뇌혈관 질환은 뇌경색, 뇌출혈, 노인성 치매, 알츠하이머병, 파킨슨 병, 헌팅턴병 및 혈전색전증으로 이루어진 군중에서 선택된 어느 하나인 허혈성 뇌혈관 질환 예방 또는 개선용 조성물. - 제1항에 있어서,
상기 더덕은 더덕 또는 찐 더덕인 허혈성 뇌혈관 질환 예방 또는 개선용 조성물. - 제1항에 있어서,
상기 더덕 추출물은 물, 탄소수 1 내지 5의 알코올 및 이들의 혼합물로 이루어진 군 중에서 선택된 어느 하나를 추출용매로 하여 추출된 용매 추출물인 허혈성 뇌혈관 질환 예방 또는 개선용 조성물. - 제4항에 있어서,
상기 더덕 추출물은 상기 더덕 용매 추출물에 에틸아세테이트, 헥산, 메틸렌클로라이드, 부탄올 및 물로 이루어진 군중에서 선택된 1종 이상의 분획용매로 분획한 것인 허혈성 뇌혈관 질환 예방 또는 개선용 조성물. - 제3항에 있어서,
상기 더덕 추출물은 더덕 에탄올 추출물 또는 더덕 에탄올 수용액 추출물에 에틸아세테이트 또는 헥산을 분획용매로 분획한 분획물인 허혈성 뇌혈관 질환 예방 또는 개선용 조성물. - 제3항에 있어서,
상기 더덕 추출물은 찐 더덕 에탄올 추출물 또는 찐 더덕 에탄올 수용액 추출물에 에틸아세테이트, 메틸렌클로라이드 및 물로 이루어진 군 중에서 선택된 1종 이상의 분획용매로 분획한 분획물인 허혈성 뇌혈관 질환 예방 또는 개선용 조성물. - 더덕(Codonopsis lanceolata) 추출물을 유효성분으로 포함하는 허혈성 뇌혈관 질환 예방 또는 개선용 식품조성물.
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| KR20200056771A (ko) | 2018-11-15 | 2020-05-25 | 강원대학교산학협력단 | 참당귀 및 미나리의 혼합 추출물을 포함하는 허혈성 뇌질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물 |
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| Publication number | Publication date |
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| KR101290749B1 (ko) | 2013-07-29 |
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