WO2012058935A1

WO2012058935A1 - 板蓝根总多糖及其组分和它们作为疫苗佐剂的用途

Info

Publication number: WO2012058935A1
Application number: PCT/CN2011/076310
Authority: WO
Inventors: 单俊杰; 王玉霞; 姜威; 武军华; 贾培媛; 朱婷; 赵修南; 刁玉林; 王晨宇
Original assignee: 中国人民解放军军事医学科学院毒物药物研究所
Priority date: 2010-11-05
Filing date: 2011-06-24
Publication date: 2012-05-10
Also published as: US20140178427A1; CN102462842A; CN102462842B

Description

板蓝根总多糖及其组分和它们作为疫苗佐剂的用途技术领域

本发明属于医药技术领域，涉及一种板蓝根总多糖及其组分和它们作为疫苗佐剂的用途。具体地，涉及从中药材板蓝根中提取的板蓝根总多糖及其中性多糖组分和酸性多糖组分，以及它们作为疫苗佐剂或用于制备疫苗组合物的用途。本发明还涉及包含上述板蓝根总多糖或多糖组分的疫苗佐剂和疫苗制剂、一种制备抗体的方法、以及一种免疫或接种方法。背景技术

板蓝根为十字花科植物菘蓝 ( Isat is indigot ica ) 的干燥根，具有清热解毒、凉血利咽之功效，常用于温毒发斑，舌绛紫暗，喉痹，烂喉丹痧，丹毒和痈肿。现代药理研究表明板蓝根能提高免疫功能和抗肿瘤作用。板蓝根中主要化学成分有黄酮、木质素、生物碱以及多糖等。近年来有以下文献报道有关板蓝根总多糖制备方法以及对动物免疫功能的影响。

邱妍等（江苏农业科学， 2009, 2： 32 - 35 )采取水煎醇沉法提取板蓝根总多糖（糖含量为 56% ) , 研究对鸡外周血 T淋巴细胞 IL-4、 IFN- γ的 mRNA表达的影响。结果表明该多糖能提高淋巴细胞 IL- 4、 IFN- γ的 mRNA表达水平。邱妍等（南京农业大学学报 2008, 31 (1) : 77- 8 ) 又将该多糖与鸡新城疫-传染性支气管炎二联 (NDV- IBV)弱毒苗一起免疫小鼠，能显著提高新城疫 HI抗体效价，促进外周血 T淋巴细胞增殖，提高 CD4+、 CD8+T淋巴细胞含量和 CD4+/CD8+值。

孔祥峰等 (畜牧兽医学报， 2004， 35 (4)， 468-472 )用新城疫 IV 系疫苗免疫雏鸡，在免疫前、后分别注射高、低剂量的板蓝根总多糖（糖含量为 82. 94 % ) , 结果表明能不同程度地提高抗体效价，且与给药时间、剂量和免疫接种次数有一定关系。

张红英等（河南农业大学学报， 2009 , 43 ( 2 ) : 173 - 176 ) 测定不同浓度的板蓝根总多糖对体外培养的猪脾脏淋巴细胞增殖的影响。结果表明板蓝根总多糖能显著促进猪脾脏淋巴细胞的增殖，同时又能协同 ConA或 LPS诱导的猪脾脏淋巴细胞增殖，能显著促进由 ConA诱导的猪脾脏淋巴细胞分泌 IFN- γ，抑制 IL- 2的分泌，显著促进 NO的分泌。

以板蓝根总多糖作为免疫增强剂联合猪繁殖与呼吸综合征灭活疫苗免疫仔猪，结果显示该多糖能显著提高仔猪的 CD3+、 CD8+ 淋巴细胞的百分数和特异性抗体滴度（张红英等，中国免疫学杂志， 2007, 23: 134 - 137 ) 。

Chen L 等（ Intervi trology, 2005， 48: 207- 212 )将板蓝根水煎液作为佐剂，与手足口病病毒（ FMDV )的 DNA疫苗一起注射小鼠，能明显增加 FMDV的抗体反应，促进 T细胞增殖，增强小鼠对手足口病病毒攻击的保护能力，作用效果优于单独注射 FMDV DNA。

陈亮等（中国专利，专利号 ZL03145034. 2，授权日 2006年 5 月 17 日）将板蓝根水煎液作为佐剂，与口蹄疫病毒 DNA、乙肝病毒核心抗原原核表达产物或口蹄疫灭活疫苗联用，抗体产生量明显增加。该佐剂能直接或间接激活活性细胞，增加抗原表面积，延长抗原在局部组织的存留时间。

李宁（中国专利，公开号 CN101703772A, 公开日 2010年 5月 12 日）制备复方板蓝根口服液，其中板蓝根总多糖 0. 5 - 20kg, 黄芪多糖含量为 50 %的黄芪多糖原料药 0. 5 - 20kg, 淫羊藿多糖含量为 50 %的淫羊 $多糖原料药 0. 5 - 10kg，巴戟天提取物 0. 5 - 10kg, 山梨酸钟 50g，余量的注射用水。该口月良液对于禽类由于疾病或饲养条件造成的免疫力低下具有良好疗效，同时可增强疫苗免疫效果。

也有文献报道了板蓝根总多糖的制备方法。

陈浩然等（中国药房， 2009 , 20 ( 21 ) ： 1642 - 1644 )将板蓝根药材以 8倍、 6倍量水提取 2次，水提取液减压浓缩，加入乙醇至终浓度为 70%, 得到沉淀为板蓝根粗多糖部位。板蓝根总多糖水溶解后，加乙醇分级沉淀，得到 50%和 70%醇沉多糖部分， 70%醇沉多糖经 SephadexGl OO排阻色谱分离，得到板蓝根纯化多糖 A。板蓝根总多糖 A的相对分子质量为 11 700, 多糖 A水解后有 2个斑点，分别为阿拉伯糖和半乳糖。

张体祥等（河南工程学院学报， 2009 , 21 ( 3 ) ： 13 - 17 )采用水煮醇沉方法制备板蓝根粗多糖，再将粗多糖加水溶胀、煮沸和离心，取上层清液滴加一定量的三氯乙酸，剧烈搅拌，离心除去沉淀，经透析、醇沉、洗涤、干燥，即得脱蛋白多糖。利用葡聚糖凝胶（SephadexG-100)柱层析法进行多糖的分离，得到一种分子量均一的 ISP2多糖，其相对分子量为 2. 24 x l0⁵。 ISP2是由鼠李糖、果糖、葡萄糖、半乳糖四种单糖组成的杂多糖，它们的质量比为 1： 4： 58. 2 : 3. 1。

张体祥等（时珍国药， 2009 , 20 ( 8 ) : 1992 - 1994 )采用以下路线制备精制多糖：板蓝根—粉碎—称量—乙醚脱脂―热水浸提 →离心取上清液→残渣重复浸提两次→合并上清液→减压浓缩→ 透析→测含糖量→乙醇沉淀→有机溶剂洗涤→真空干燥→板蓝根粗多糖。粗多糖溶液― SehadexG-100柱层析→洗脱液浓缩→乙醇沉淀→冷冻干燥→精制板蓝根总多糖。该多糖得率 25. 63%, 多糖含量 76. 42%。鲁建江等（广东药学， 2001, 11 ( 4 ) : 16 - 18 )将板蓝根洗净，晾干，精密称取 100g, 置索氏提取器中，依次用石油醚 (60- 90*€)、乙醚和 80%乙醇回流提取 4h。残渣挥干溶剂后，再继续以水回流提取 4h，减压浓缩至一半体积，加入 0.1%活性炭，脱色，滤过，滤液加入 95%乙醇使溶液含醇 80%, 静置过夜，滤过，残渣用乙醚、无水乙醇反复洗涤，得板蓝根总多糖。测得板蓝根中多糖含量 0.8099%。

然而，现有的板蓝根总多糖的制备方法比较烦瑣，成本较高，并且对其中的活性多糖成分可能有所破坏（特别是煎煮和回流步骤）。此外，板蓝根总多糖的收率也往往并不理想。发明内容

本发明人经过创造性的劳动和深入的研究，得到了一种板蓝根总多糖和多糖组分（中性多糖组分和酸性多糖组分）。并且本发明人惊奇地发现，所述板蓝根总多糖和多糖组分能够作为良好的疫苗佐剂。由此提供了下述发明：本发明的一个方面涉及一种具有如下特征的板蓝根多糖组分 (即中性多糖组分）：

(1)其包含葡萄糖、半乳糖、甘露糖、鼠李糖、阿拉伯糖和木糖，并且摩尔比 Rha: Ara: Xyl: Man: Glc: Gal = 1.00: 2.35: 2.38: 9.27: 27.47: 13.03;

(2) 以葡萄糖计算，含糖量为 98.13%;

(3)分子量为 2000— 10000。本发明的另一个方面涉及具有如下特征的板蓝根多糖组分 (即酸性多糖组分）：

( 1 )其包含阿拉伯糖、葡萄糖、半乳糖、鼠李糖和甘露糖，并且摩尔比为 Rha: Ara: Man: Glc: Gal = 1.00: 40.06: 0.61: 22.24： 18.04;

( 2) 以葡萄糖计算，含糖量为 9².11%；

( 3) 以半乳糖醛酸计算，糖醛酸含量为 6.41%;

( 4)分子量为 3000 - 70000。本发明的再一方面涉及一种板蓝根总多糖，其包含：

( 1 )上述的板蓝根中性多糖组分；和

( 2)上述的板蓝根酸性多糖组分。

根据本发明任一项所述的板蓝根总多糖，其特征在于：

( 1 ) 以葡萄糖计算，含糖量为 58.93%;

( 2) 以半乳糖醛酸计算，糖醛酸含量为 13.36%。

根据本发明任一项所述的板蓝根总多糖，其具有 Fig.1或者

Fig.2所示的特征。

根据本发明任一项所述的板蓝根总多糖，其通过如下步骤制得：

1)用水在 O - 60 下浸提板蓝根，得到水提液；

优选地，在 30 - 60 或 25 - 55 下浸提板蓝根；更优选地，为 40 - 55 ; 进一步优选地，为 45 - 55 ;特别优选地，为 50 - 55C 例如 50 、 51*C、 52 、 53*Ό、或 55 。

不拘束于理论的限制，提取温度不同决定着多糖组成不同。低于 60C —般不影响化学稳定性，但得率较低；高于 60 ，得率会升高，但可能影响总多糖的组成和多糖结构。在 55 范围内，制备的多糖和多糖组分的活性保留和产品收率之间得到了良好的平衡。

浸提的时间并不特别限定，优选的是 1-48小时，更优选的是 2- 12小时，进一步优选的是 2- 8小时，例如 2、 3、 4、 5、 6、 7、或 8小时。

2) 将步骤 1)中的水提液经乙醇醇沉、上清液透析和冷冻干燥，得到板蓝根总多糖。

根据本发明任一项所述的板蓝根总多糖，其特征在于如下的 (1) - (12)项中的任意一项或多项：

( 1 )步骤 1 )中，将浸提后得到的残渣按照相同条件进行一次或多次浸提，合并水提液；

(2) 步骤 1) 中所用水为蒸馏水或去离子水；

(3) 步骤 1) 中水的用量为板蓝根的 5- 15倍量（L/Kg) ；

(4) 步骤 1) 中所用板蓝根为粉碎的板蓝根；

(5) 步骤 1) 中所用板蓝根为经过有机溶剂（例如石油醚、乙酸乙酯、氯仿、乙醚、正己烷、环己烷、正丁醇、乙醇或甲醇）浸提过的板蓝根残渣（例如用 75%乙醇浸提，可以是浸提 24小时）；有机溶剂萃取的部分可以用于其它用途（例如分离其它的活性小分子成分），提高了原料板蓝根的利用率，对多糖或多糖组分的提取并不影响。

(6) 步骤 1) 中，浸提期间进行搅拌；

(7)步骤 1) 中，将得到的水提液进行减压浓缩，得到浓缩的水提液；

(8)步骤 2) 中，乙醇醇沉的条件是：醇沉后乙醇的终浓度为 60 - 80%; 优选地，醇沉的时间大于 12小时；

(9)步骤 2) 中，将乙醇醇沉后离心得到的沉淀再进行一次或多次乙醇醇沉，合并上清液； ( 10 )步骤 2 )中 ,透析所用的透析袋的截留分子量大于 1000; 该分子量范围的透析袋能够有效地截留多糖和寡糖；

( 11 ) 步骤 2 ) 中，透析进行一次或多次；

( 12 ) 步骤 2 ) 中，在冷冻干燥之前，将得到的透析液在 50 X： - 55 X：下进行浓缩（例如减压浓缩）。

本发明还涉及根据上述制备方法制得的板蓝根总多糖。在具体的实施方案中，该板蓝根总多糖具有前述任一项的板蓝根总多糖的特征。根据本发明任一项所述的板蓝根中性多糖组分，其通过如下步骤制得：

将本发明任一项的板蓝根总多糖经 DEAE -纤维素柱层析，得到水洗脱部分。

本发明还涉及根据上述制备方法制得的板蓝根中性多糖组分。在具体的实施方案中，该板蓝根中性多糖组分具有前述任一项的板蓝根中性多糖组分的特征。根据本发明任一项所述的板蓝根多糖组分，其通过如下步骤制得：

将本发明任一项的板蓝根总多糖经 DEAE -纤维素柱层析，得到 0. 25 NaHC0₃洗脱部分。

本发明还涉及根据上述制备方法制得的板蓝根酸性多糖组分。在具体的实施方案中，该板蓝根酸性多糖组分具有前述任一项的板蓝根酸性多糖组分的特征。本发明的再一方面涉及一种药物组合物，其包含本发明中任一项所述的板蓝根多糖组分或板蓝根总多糖；可选地，还包含药学上可接受的辅料。本发明的再一方面涉及一种疫苗佐剂，其包含本发明中任一项所述的板蓝根多糖组分或板蓝根总多糖；具体地，所述疫苗佐剂为减毒疫苗、蛋白质疫苗、 DNA疫苗或多肽疫苗的佐剂。本发明的再一方面涉及一种疫苗制剂或疫苗组合物，其包含本发明的板蓝根总多糖或板蓝根多糖组分。

根据本发明任一项所述的疫苗制剂或疫苗组合物，其为减毒疫苗、蛋白质疫苗、 DNA疫苗或多肽疫苗；具体地，为 H1N1流感疫苗。本发明的再一方面涉及本发明中任一项所述的板蓝根多糖组分或者板蓝根总多糖作为疫苗佐剂的用途；或者在制备疫苗制剂、疫苗组合物、或抗体中的用途。

根据本发明任一项的用途，其中，所述疫苗制剂为减毒疫苗、蛋白质疫苗、 DM 疫苗或多肽疫苗；所述疫苗佐剂为减毒疫苗、蛋白质疫苗、 DNA疫苗或多肽疫苗的佐剂。本发明的再一方面涉及一种制备抗体的方法，包括使用有效量的本发明的板蓝根多糖组分和 /或板蓝根总多糖的步骤；具体地，所述抗体为单克隆抗体或多克隆抗体。本发明的再一方面涉及一种免疫方法或者接种方法，包括给予哺乳动物有效量的本发明的疫苗制剂或疫苗组合物的步骤。在本发明的一个实施方案中，所述哺乳动物是人。具体地，所述疫苗制剂或疫苗组合物是减毒疫苗、蛋白质疫苗、 DNA 疫苗或多肽疫苗；更具体地，为 H1N1流感疫苗。用量须由主诊医师在可靠的医学判断范围内作出决定。在本发明中，如果没有特殊说明，术语 "板蓝根多糖组分" 是指板蓝根中性多糖组分和 /或酸性多糖组分。

术语 "有效量" 是指可在哺乳动物中实现免疫效果的疫苗制剂或者疫苗组合物的剂量。发明的有益效果

本发明的板蓝根总多糖及其中性多糖组分和酸性多糖组分均可以用作减毒疫苗、蛋白质疫苗、 DM 疫苗或多肽疫苗的佐剂。本发明的板蓝根总多糖或多糖组分能够作为良好的疫苗佐剂。并且本发明的板蓝根总多糖和多糖组分的制备过程简单，成本较低，并且收率较高，有利于大规模生产。附图说明

Fi g. 1：板蓝根总多糖 A 的 DEAE -纤维素柱层析洗脱曲线 (苯酚 -硫酸法检测多糖组分， 490nm波长）。

Fi g. 2：板蓝根总多糖 A 的 DEAE -纤维素柱层析洗脱曲线 ( 280nm波长下测定吸光度 ) 。

Fi g. 3 : OVA 配伍 BLG- A 第 1 次免疫小鼠血清抗体滴度。 mean+SD; n=5。

Fi g. 4： OVA 配伍 BLG- A 第 2 次免疫小鼠血清抗体滴度。 mean+SD; n=5。 Fig. 5: OVA 配伍 BLG- A 第 3 次免疫小鼠血清抗体滴度。 mean+SD; n=5。

Fig. 6: OVA配伍 BLG- A ( 50 ~ )第 1次免疫小鼠血清抗体滴度。 mean SD; n=5。（BLG- A: lmg/鼠； OVAO. 06mg/鼠）。

Fig. 7: OVA配伍 BLG- A ( 50 ~ 55*C ) 第 2次免疫小鼠血清抗体滴度。 mean SD; n=5。（BLG- A: lmg/鼠； OVAO. 06mg/鼠）。

Fig. 8: OVA配伍 BLG-Al, BLG-A2第 1次免疫小鼠血清抗体滴度。 mean土 SD; n=5。

Fig. 9: OVA配伍 BLG-Al, BLG-A2第 2次免疫小鼠血清抗体滴度。 mean土 SD; n=5。

Fig. 10: OVA配伍 BLG-Al, BLG-A2第 3次免疫后小鼠血清抗体滴度。 mean土 SD; n=5。

Fig. 11： H1N1病毒配伍 BLG- A1初次免疫小鼠血清抗体滴度。

HlNl: 3 g/鼠， BLG-Al: lmg/鼠. mean土 SD; n=5。

Fig. 12： H1N1病毒配伍 BLG- A2初次免疫小鼠血清抗体滴度。

HlNl: 3 g/鼠， BLG-A2: 0. lmg/鼠. mean+SD; n=5。

Fig. 13: BLG-Al 与 H1N1减毒疫苗免疫小鼠抗体滴度（ Al: 10mg/ml, lmg/鼠 ) 。

Fig. 14： BLG-A2 与 H1N1减毒疫苗免疫小鼠抗体滴度（ A2: 10mg/ml, lmg/鼠 ) 。具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。实施例 1: 板蓝根总多糖 BLG - A样品 1的制备

中药材板蓝根 lkg, 粉碎，室温下加入 10L 75%乙醇浸泡 24 小时，过滤，离心 OOOr/minx lOmin) , 残渣同样条件再浸提一次，合并滤液， 40 - 45 减压回收浸膏。经过 75%乙醇浸提后的板蓝根残渣 50 烘干后，加入 15L蒸馏水，在室温下浸提 24 小时，期间不时搅拌；然后过滤，滤液离心 lOmin (转速 3000r/min) , 浸提后的板蓝根残渣在同样条件下进行二次提取。合并二次提取的水提液， 50 - 55 减压浓缩至 1000ml, 然后加入 3倍体积（ 3000ml ) 95 %的乙醇进行 48 - 72小时的醇沉。醇沉溶液离心（ 3000r/minx lOmin) , 沉淀部分加入 1000ml水搅拌溶解，离心，沉淀再同样操作二次。合并溶解的上清液，装入透析袋（截留分子量 >1000 ) , 自来水透析 48小时后换蒸馏水再透析 24小时。该透析液 50 - 55 减压浓缩至 200ml左右，装入小瓶进行冷冻干燥，获得淡黄色粉末，即板蓝根总多糖 BLG- A样品 1 (得率为 0. 417% ) 。实施例 2: 板蓝根总多糖 BLG- A样品 2的制备

中药材板蓝根 lkg, 粉碎后加入 15L蒸馏水，在 50*€ - 55*€ 温度下浸提 4小时，期间不时搅拌；然后过滤，滤液离心 lOmin (转速 3000r/min) ，浸提后的板蓝根残渣在同样条件下进行二次提取。合并二次提取的水提液， 50*€ - 55*€减压浓缩至 1000ml, 然后加入 3倍体积（ 3000ml )95 %的乙醇进行 48 - 72小时的醇沉。醇沉溶液离心（ 3000r/minx lOmin) , 沉淀部分加入 1000ml水搅拌溶解，离心，沉淀再同样操作二次。合并溶解的上清液，装入透析袋（截留分子量 >1000 ) , 自来水透析 48小时后换蒸馏水再透析 24小时。该透析液在 50 - 55 减压浓缩至 200ml左右，装入小瓶进行冷冻干燥，获得淡黄色粉末，即板蓝根总多糖 BLG - A样品 2 (得率为 0. 438 % ) 。

与样品 1的制备相比，样品 2的制备方法与之相同，只是样品 1的制备使用的原料是经过 75 %乙醇浸提后的板蓝根残渣，目的是获得浸膏用于其它用途，而本发明人在后面的实验中发现，这并不影响制得的板蓝根总多糖的产品组成和效果。实施例 3: 板蓝根中性多糖组分（ BLG - A1 )和酸性多糖组分 ( BLG - A2 ) 的制备

取实施例 2制备的板蓝根总多糖 lg，加入蒸馏水 50ml溶解，溶解液上样 DEAE -纤维素柱（ Φ 8cm X 35cm ) , 分别采用水、 0. 25mol /L NaHC0₃、 0. 5mol/L NaHC0₃和 0. 1 mol /LNaOH进行连续洗脱，采用硫酸-苯酚法检测多糖流分（Fig. 1 ) , 相应获得多糖组分 BLG - Al ( H₂0 ) 、 BLG - A2 ( 0. 25mol /L NaHC0₃ ) 、 BLG - A3 ( 0. 5mol /L NaHC0₃ )和 BLG - A4 ( 0. 1 mol/L NaOH ) , 同时测定洗脱液在 280nm处的吸光度，洗脱曲线见 Fig. 2。实施例 4: 板蓝根总多糖、中性多糖组分和酸性多糖组分的理化性质测定

实验样品：

所用板蓝根总多糖为实施例 2制备，中性多糖组分和酸性多糖组分为实施例 3制备。

1. 板蓝根总多糖、中性多糖组分和酸性多糖组分的含糖量 (以葡萄糖计）的测定 1 ) 实验方法

采用硫酸 -苯酚法测定糖含量。

2) 实验结果

板蓝根总多糖 BLG- A为淡黄色粉末，含糖量为 58.93% (以葡萄糖计算）。

中性多糖组分 BLG- A1为白色粉末，含糖量为 98.13% (以葡萄糖计算）。

酸性多糖组分 BLG - A2为浅黄色粉末，含糖量为 92.11 %(以葡萄糖计算）。

2. 板蓝根总多糖、酸性多糖组分的糖醛酸含量（以半乳糖醛酸计）的测定

1 ) 实验方法

采用间羟联苯法测定糖醛酸含量。

2) 实验结果

板蓝根总多糖 BLG- A的糖醛酸含量为 13.36% (以半乳糖醛酸计算）。

酸性多糖组分 BLG - A2的糖醛酸含量为 6.41 % (以半乳糖醛酸计算）。

3. 板蓝根中性多糖组分和酸性多糖组分的单糖比例的测定

1 ) 实验方法

采用衍生化、气相色谱分析获得单糖比例。

2) 实验结果

中性多糖组分 BLG- A1主要由葡萄糖、半乳糖、甘露糖以及少量鼠李糖、阿拉伯糖和木糖组成，摩尔比为 Rha: Ara: Xyl: Man: Glc: Gal = 1.00: 2.35: 2.38: 9.27: 27.47: 13.03。

酸性多糖组分 BLG- A2主要由阿拉伯糖、葡萄糖、半乳糖以及少量鼠李糖和甘露糖组成，摩尔比为 Rha: Ara: Man: Glc: Gal = 1.00: 40.06: 0.61: 22.24： 18.04。

4. 板蓝根中性多糖组分和酸性多糖组分的分子量测定

1 ) 实验方法

仪器： HPLC, Waters公司；色傳柱： TSKsw4000; 流动相： 0.1 M Na₂S04; 流速： 0.6 ml/min; 检测器：示差。

2) 实验结果

中性多糖组分 BLG- A1的分子量为 2000 - 10000。

酸性多糖组分 BLG- A2的分子量为 3000 - 70000。实施例 5: 板蓝根总多糖样品 1的佐剂活性测定

1. 实驗目的：

将实施例 1制备的板蓝根总多糖 BLG- A作为佐剂，以卵清蛋白（OVA)为抗原，二者联用肌肉注射小鼠，测定产生的抗体滴度。

2. 实验方法

实验动物： Balb/C, 6- 8周， 5只 /组，雌性。

药物浓度：由上述实施例 1 制备的板蓝根总多糖 BLG-A: 20mg/ml; OVA: 1.2mg/ml; 铝佐剂： 2mg/ml;

对照溶剂：生理盐水

给药剂量： OVA- 60μ₈/50μ1/鼠；铝佐剂 - 100μ₈/50μ1/鼠； BLG - A: 1η^/50μ1/鼠；

分组：（1) Ρ组： PBS+0VA; (2)铝佐剂组：铝佐剂 +0VA; (3) BLG- Α组： BLG- A+0VA; (4)溶剂对照组：生理盐水。

注射前等体积混合， ΙΟΟμΙ/鼠，右后肢肌肉注射。

免疫方案：动物按照免疫分组首次免疫注射后 3周，尾静脉取血，测定血清中抗体滴度。首次免疫注射后第 3周检测抗体滴度，第 4周加强免疫，二次免疫注射后 2周，尾静脉取血，测定血清中抗体滴度，视滴度情况，测定后 2周进行第 3次免疫。 ELISA 测定血清中抗体滴度。

ELISA法所用试剂配制：

抗原包被液： 50 mmol/L 碳酸盐緩冲液 pH9.6。称取无水 Na₂C0₃ 1.696 g, NaHC0₃ 2.856 g加水溶解到 1000 ml, 调节 pH 至 9.6。

洗涤液（lOxPBST, pH7.4):称取 NaCl 80 g, KC12g, Na₂HP0₄ 29 g, KH₂P0₄ 2 g, Tween-20 10 ml, 双蒸水至 1000 ml, 调节 pH7.4, 10倍稀释使用。

封闭液： 1%BSA, 用 50 mmol/L PBS pH7.4溶解。

底物液（ TMB- H₂0₂ )：使用时将底物液 A和 B等体积混合，加入 30% H₂0₂, 终浓度 0.5%„

底物液 A (TMB) , 称取 TMB 200 mg，无水乙醇 100 ml, 加双蒸水至 1000 ml。

底物液 B (0.1 mol/L柠檬酸 -0.2 mol/L Na₂HP0₄緩冲液） , Na₂HP0₄24.8 g,柠檬酸 19.33 g,加双蒸水至 1000 ml,调节 pH5.0 - 5.4。

2 N H₂S0₄

OVA 溶解于抗原包被液，浓度为 4μ₈ /ml, 包被 96 孔板 (Costa) ΙΟΟμΙ/孔，过夜。 PBST 洗 3遍， 1 % BSA-PBS 37 封闭 1 h。 PBST洗 3遍后加入以 PBST稀释的小鼠血清样品， 100 μ ΐ/孔， 37 孵温 1 h。 PBST洗 3遍，加入 HRP-羊抗小鼠 IgG ( 1: 1000, PBST) 37 X：孵温 1, PBST洗 6遍，加入 ΙΟΟμΙ底物液显色后，加入 50μ1 2 N H₂S0₄终止反应测定 Α₄₅。。

3. 实验结果实验结果表明经过第一、二次免疫所有测试组抗体滴度均比较低 ( Fig.3和 Fig.4 ) , 而经过第三免疫后 BLG - A注射组动物血清具有较高的抗体滴度（Fig.5) , 说明 BLG- A能显著促进抗体产生，佐剂效果优于铝佐剂（Fig.3、 Fig.4和 Fig.5分别为 1， 2， 3次免疫后 ELISA检测小鼠血清抗 OVA 抗体滴度，平均值土 SD; n=5) 。实施例 6: 板蓝根总多糖样品 2的佐剂活性测定

具体步骤与实施例 5相同，除了所用样品为实施例 2制备的板蓝根总多糖样品 2。结果如 Fig.6、 Fig.7所示。

结果显示，板蓝根总多糖样品 2能够有效地促进抗体的生成。实施例 7: 板蓝根中性多糖组分和酸性多糖组分的抗体滴度测定 1

1. 实驗目的：

分别将实施例 3中制备板蓝根中性多糖组分 BLG - A1和酸性多糖 BLG- A2作为佐剂，以卵清蛋白（OVA)为抗原，二者联用肌肉注射小鼠，测定产生的抗体滴度。

2. 实验方法

具体实验步骤参照实施例 5。

药物浓度： BLG- Al: 10mg/ml; BLG- A2: 10mg/ml; OVA: 1.2mg/ml; 铝佐剂： 2mg/ml; 对照溶剂：生理盐水。

给药剂量： OVA- 60μ₈/50μ1/鼠；铝佐剂 - 100μ₈/50μ1/鼠； BLG- A1: 0.5η^/50μ1/鼠； BLG— Α2: 0.5mg/50 l/鼠；分组：（1) P组： PBS+0VA; (2)铝佐剂组：铝佐剂 +0VA; ( 3 ) BLG - A1组： BLG - A1+0VA; ( 4 ) BLG - A2组： BLG - A2+0VA; 注射前等体积混合， ΙΟΟμΙ/鼠，右后肢肌肉注射。

3. 实验结果

板蓝根总多糖 BLG - Α经 DEAE -纤维素柱层析分离，得到中性多糖组分 BLG - A1和酸性多糖组分 BLG - A2，按照免疫方案进行进一步的佐剂活性功能测定，经第一、二次免疫后检测， A1和 A2组分具有较高的免疫佐剂活性（Fig. 8和 Fig. 9 ) 。第三次免疫后抗体的滴度没有明显提高（ Fig. 8、 Fig. 9和 Fig. 10分别为第 1， 2， 3次免疫后 ELISA检测小鼠血清抗 OVA 抗体滴度，平均值土 SD; n=5 ) 。实施例 8: 板蓝根中性多糖组分和酸性多糖组分的抗体滴度测定 2

分别将实施例 3 制备的中性多糖组分 BLG-A1 和酸性多糖 BLG- A2作为佐剂，与 H1N1流感疫苗（H1N1流感病毒裂解液， 30 g/ml ) 混和免疫小鼠， 2周后同样采用 ELASI方法测定抗体滴度。实验分为生理盐水组、 H1N1疫苗组和 H1N1 + BLG- A1组，结果说明 H1N1病毒裂解液为免疫抗原， BLG- A1和 BLG- A2作为佐剂初次免疫即可产生较高滴度的抗体（Fig. 11 , Fig. 12 ) 。实施例 9: 板蓝根中性多糖组分和酸性多糖组分的抗体滴度测定 3

所用样品：将实施例 1制备的板蓝根总多糖样品 1 , 按照实施例 3中的方法，分别制得板蓝根中性多糖组分和酸性多糖组分。

实验步骤参照实施例 8。

结果如 Fig. 13、 Fig. 14所示。

结果显示，由板蓝根总多糖样品 1制得的板蓝根中性多糖组分和酸性多糖组分能够有效地促进抗体的生成。

尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，本领域技术人员将会理解。根据已经公开的所有教导，可以对那些细节进行各种修改和替换，这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。

Claims

权利要求

1. 具有如下特征的板蓝根多糖组分：

(1)其包含葡萄糖、半乳糖、甘露糖、鼠李糖、阿拉伯糖和木糖，并且摩尔比 Rha: Ara: Xyl: Man: Glc: Gal = 1.00: 2.35:

2.38: 9.27: 27.47: 13.03;

(2) 以葡萄糖计算，含糖量为 98.13%;

(3)分子量为 2000 - 10000。

2. 具有如下特征的板蓝根多糖组分：

(1)其包含阿拉伯糖、葡萄糖、半乳糖、鼠李糖和甘露糖，并且摩尔比为 Rha: Ara: Man: Glc: Gal = 1.00: 40.06: 0.61: 22.24： 18.04;

(2) 以葡萄糖计算，含糖量为 9².11%；

(3) 以半乳糖醛酸计算，糖醛酸含量为 6.41%;

(4)分子量为 3000 - 70000。

3. 一种板蓝根总多糖，其包含：

( 1 )权利要求 1所述的板蓝根多糖组分；和

( 2 )权利要求 2所述的板蓝根多糖组分。

4. 根据权利要求 3所述的板蓝根总多糖，其特征在于：

(1) 以葡萄糖计算，含糖量为 58.93%;

( 2 )以半乳糖醛酸计算，糖醛酸含量为 13.36 %。

5. 根据权利要求 4所述的板蓝根总多糖，其具有 Fig.1或者 Fig.2所示的特征。

6. 根据权利要求 3至 5中任一项所述的板蓝根总多糖，其通过如下步骤制得：

1)用水在 50 - 55 下浸提板蓝根，得到水提液； 2) 将步骤 1)中的水提液经乙醇醇沉、上清液透析和冷冻干燥，得到板蓝根总多糖。

7. 根据权利要求 6所述的板蓝根总多糖，其特征在于如下的 (1) - (12)项中的任意一项或多项：

(1) 步骤 1) 中，将浸提后得到的残渣按照相同条件进行一次或多次浸提，合并水提液；

(2) 步骤 1) 中所用水为蒸馏水或去离子水；

(3) 步骤 1) 中水的用量为板蓝根的 5- 15倍量（L/Kg) ；

(4) 步骤 1) 中所用板蓝根为粉碎的板蓝根；

(5) 步骤 1) 中所用板蓝根为经过有机溶剂（例如石油醚、乙酸乙酯、氯仿、乙醚、正己烷、环己烷、正丁醇、乙醇或甲醇）萃取过的板蓝根残渣；

(6) 步骤 1) 中，浸提期间进行搅拌；

(7) 步骤 1) 中，将得到的水提液进行减压浓缩，得到浓缩的水提液；

(8) 步骤 2) 中，乙醇醇沉的条件是：醇沉后乙醇的终浓度为 60 - 80%; 优选地，醇沉的时间大于 12小时；

(9) 步骤 2) 中，将乙醇醇沉后离心得到的沉淀再进行一次或多次乙醇醇沉，合并上清液；

( 10 )步骤 2 )中，透析所用的透析袋的截留分子量大于 1000;

(11) 步骤 2) 中，透析进行一次或多次；

(12) 步骤 2) 中，在冷冻干燥之前，将得到的透析液在 50 -55 下进行浓缩。

8. 根据权利要求 1所述的板蓝根多糖组分，其通过如下步骤制得：

将权利要求 6或 7得到的板蓝根总多糖经 DEAE -纤维素柱层析，得到水洗脱部分。

9. 根据权利要求 2所述的板蓝根多糖组分，其通过如下步骤制得：

将权利要求 6或 7得到的板蓝根总多糖经 DEAE -纤维素柱层析，得到 0. 25 NaHC0₃洗脱部分。

10. 一种药物组合物，其包含权利要求 1至 9 中任一项所述的板蓝根多糖组分或板蓝根总多糖；可选地，还包含药学上可接受的辅料。

11. 一种疫苗佐剂，其包含权利要求 1至 9 中任一项所述的板蓝根多糖组分和 /或板蓝根总多糖；具体地，所述疫苗佐剂为减毒疫苗、蛋白质疫苗、 DNA疫苗或多肽疫苗的佐剂。

12. 一种疫苗制剂或疫苗组合物，其包含权利要求 1至 9 中任一项所述的板蓝根多糖组分和 /或板蓝根总多糖；具体地，所述疫苗制剂或疫苗组合物为减毒疫苗、蛋白质疫苗、 D 疫苗或多肽疫苗；更具体地，为 H1N1流感疫苗。

13. 权利要求 1至 9 中任一项所述的板蓝根多糖组分或者板蓝根总多糖作为疫苗佐剂的用途；或者在制备疫苗制剂、疫苗组合物、或抗体中的用途。

14. 根据权利要求 13所述的用途，其中，所述疫苗制剂为减毒疫苗、蛋白质疫苗、 DNA 疫苗或多肽疫苗；所述疫苗佐剂为减毒疫苗、蛋白质疫苗、 DNA疫苗或多肽疫苗的佐剂。

15. 一种制备抗体的方法，包括使用有效量的权利要求 1至 9 中任一项所述的板蓝根多糖组分和 /或板蓝根总多糖的步驟；具体地，所述抗体为单克隆抗体或多克隆抗体。

16. 一种免疫方法或者接种方法，包括给予哺乳动物有效量的权利要求 12所述的疫苗制剂或疫苗组合物的步骤。