CN113952417A - 一种用于自发性高血压的干石斛醇提物制备方法 - Google Patents

一种用于自发性高血压的干石斛醇提物制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于自发性高血压的干石斛醇提物制备方法，涉及制药技术领域；为了解决制备繁琐问题；具体包括如下步骤：将新鲜石斛鲜条洗净，置于烘干箱中烘干至含水率≤8％；将得到的干石斛破碎后过60～100目分离筛得到干石斛粉备用；称取20g干石斛粉，置于55～60℃的350～500ml提取液中重复提取两次，每次浸提15～24小时；合并两次提取物后采用滤膜过滤除菌，得澄清液；将澄清液减压浓缩至原体积的1/6～1/8后，冷冻干燥至恒重后得到；所述新鲜石斛为霍山石斛、铁皮石斛、金钗石斛、水草石斛、流苏石斛和鼓槌石斛中的一种或者两种以上的组合。本发明可以抑制动脉粥样硬化，辅助治疗高血压疾病。

Description

一种用于自发性高血压的干石斛醇提物制备方法
技术领域
本发明涉及制药技术领域，尤其涉及一种用于自发性高血压的干石斛醇提物制备方法。
背景技术
高血压病因受遗传、精神和环境、生活习惯、年龄、药物及其他疾病等的因素影响。高血压患者胆固醇升高使患者动脉粥样硬化，血管弹性减低，动脉血液在动脉血管流动过程中阻力增大，使患者血压升高，血压升高后会促进动脉粥样硬化形成，加重患者病情，这种高血压和胆固醇关系形成恶性循环，更容易使高血压并发症发生，因此，高血压加动脉粥样硬化必须综合及早期治疗。现有的很多治疗高血压的药物为西药，长期服用会存有药物毒性，对患者后期带来隐患。石斛是常用名贵中药材，具有较高的观赏价值和药用功能，目前尚未见有文献和报道提及石斛用于高血压方面的应用。
经检索，中国专利申请号为CN201910500353.0的专利，公开了一种复方铁皮石斛酵素，由以下重量份的原料制成：干品/鲜品的铁皮石斛、干品/鲜品的桑葚、知母15-25份、黄芪10-20份、乌梅10-20份、发酵菌0.4-1.7份和水345-1550份；当所述铁皮石斛为干品时，其重量份为7.5-15份；当所述铁皮石斛为鲜品时，其重量份为15-30份；当所述桑葚为干品时，其重量份为15-30份；当所述桑葚为鲜品时，其重量份为30-60份。上述专利中的复方铁皮石斛酵素存在以下不足：制备繁琐，虽具有代谢能力，但未对石斛在用于高血压等疾病的疗效作出检测。
发明内容
本发明的目的是为了解决现有技术中存在的缺点，而提出的一种用于自发性高血压的干石斛醇提物制备方法。
为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：
一种用于自发性高血压的干石斛醇提物制备方法，包括如下步骤：
S1：将新鲜石斛鲜条洗净，置于烘干箱中烘干至含水率≤8％；
S2：将得到的干石斛破碎后过60～100目分离筛得到干石斛粉备用；
S3：称取20g干石斛粉，置于55～60℃的350～500ml提取液中重复提取两次，每次浸提15～24小时；
S4：合并两次提取物后采用滤膜过滤除菌，得澄清液；
S5：将澄清液减压浓缩至原体积的1/6～1/8后，冷冻干燥至恒重后得到。
优选地：所述新鲜石斛为霍山石斛、铁皮石斛、金钗石斛、水草石斛、流苏石斛和鼓槌石斛中的一种或者两种以上的组合。
优选地：所述烘干的前期温度为45～50℃，烘干10～12小时，中期温度为65～70℃，烘干6～8小时，后期温度为75℃，烘干0.5～1小时。
优选地：所述提取液为石油醚、丙酮、乙醇、甲醇、乙醚、氯仿中的一种或两种以上的混合物。
优选地：所述干石斛醇提物为颗粒剂、丸剂、胶囊剂、片剂、散剂、膏剂或口服液剂中的一种制剂。
优选地：所述干石斛醇提物的配制原始浓度为100mg/ml。
优选地：所述滤膜的孔径为0.22μm。
本发明的有益效果为：
1.本发明制备方法简单，得到的干石斛醇提物能够明显降低CD36、SRA、FABP4及PPARγ基因的mRNA表达水平，因此作为药物可以抑制动脉粥样硬化，辅助治疗高血压疾病。
2.本发明制备的干石斛醇提物能够明显抑制胰岛素诱导基因(INSIG2)的表达水平，由此可知，干石斛醇提物能够抑制胆固醇合成，进一步作为辅助治疗高血压疾病的药物。
3.本发明制备的干石斛醇提物能够明显增加LCAT，LDLR，PCSK9，SRBI的mRNA表达水平，由此可知，干石斛醇提物能够促进胆固醇代谢降解，再进一步的可将之作为辅助治疗高血压疾病的药物。
4.本发明制备的干石斛醇提物应用于药物中，不仅仅治疗胆固醇、动脉粥样硬化及高血压的效果好，而且可以避免长期使用西药带来的药物毒性。
附图说明
图1为本发明提出的一种用于自发性高血压的干石斛醇提物制备方法的流程示意图；
图2为本发明提出的干石斛醇提物对RAW264.7细胞中的胰岛素抵抗相关基因FABP4的mRNA的表达示意图；
图3为本发明提出的干石斛醇提物对RAW264.7细胞中的胰岛素抵抗相关基因CD36的mRNA的表达示意图；
图4为本发明提出的干石斛醇提物对RAW264.7细胞中的胰岛素抵抗相关基因SRA的mRNA的表达示意图；
图5为本发明提出的干石斛醇提物对RAW264.7细胞中的胰岛素抵抗相关基因PPARγ的mRNA的表达示意图；
图6为本发明提出的干石斛醇提物对体外HUH7细胞中胆固醇合成相关基因SREBP1的mRNA的表达示意图；
图7为本发明提出的干石斛醇提物对体外HUH7细胞中胆固醇合成相关基因SCAP的mRNA的表达示意图；
图8为本发明提出的干石斛醇提物对体外HUH7细胞中胆固醇合成相关基因INSIG2的mRNA的表达示意图；
图9为本发明提出的干石斛醇提物对体外HUH7细胞中胆固醇合成相关基因HMGCR的mRNA的表达示意图；
图10为本发明提出的干石斛醇提物对体外HUH7细胞中胆固醇代谢相关基因SRB1的mRNA的表达示意图；
图11为本发明提出的干石斛醇提物对体外HUH7细胞中胆固醇代谢相关基因PCSK9的mRNA的表达示意图；
图12为本发明提出的干石斛醇提物对体外HUH7细胞中胆固醇代谢相关基因LDLR的mRNA的表达示意图；
图13为本发明提出的干石斛醇提物对体外HUH7细胞中胆固醇代谢相关基因LCAT的mRNA的表达示意图。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本专利的技术方案作进一步详细地说明。
下面详细描述本专利的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，仅用于解释本专利，而不能理解为对本专利的限制。
实施例1：
一种用于自发性高血压的干石斛醇提物制备方法，如图1所示，包括如下步骤：
S1：将新鲜石斛鲜条洗净，置于烘干箱中烘干至含水率≤8％；
S2：将得到的干石斛破碎后过70目分离筛得到干石斛粉备用；
S3：称取20g干石斛粉，置于55℃的450ml提取液中重复提取三次，每次浸提24小时；
S4：合并两次提取物后采用滤膜过滤除菌，得澄清液；
S5：将澄清液减压浓缩至原体积的1/6～1/8后，冷冻干燥至恒重后得到。
所述新鲜石斛为霍山石斛、铁皮石斛、金钗石斛、水草石斛、流苏石斛和鼓槌石斛等中的一种或者两种以上的组合。
所述烘干的前期温度为45～50℃，烘干10～12小时，中期温度为65～70℃，烘干6～8小时，后期温度为75℃，烘干0.5～1小时。
所述提取液为石油醚、丙酮、乙醇、甲醇、乙醚、氯仿中的一种或两种以上的混合物，优选的，本实施例中，提取液为浓度75％的乙醇。
实施例2：
一种用于自发性高血压的干石斛醇提物制备方法，如图1所示，包括如下步骤：
S1：将新鲜石斛鲜条洗净，置于烘干箱中烘干至含水率≤8％；
S2：将得到的干石斛破碎后过80目分离筛得到干石斛粉备用；
S3：称取20g干石斛粉，置于55℃的350ml提取液中重复提取两次，每次浸提20小时；
S4：合并两次提取物后采用滤膜过滤除菌，得澄清液；
S5：将澄清液减压浓缩至原体积的1/6～1/8后，冷冻干燥至恒重后得到。
所述干石斛醇提物为颗粒剂、丸剂、胶囊剂、片剂、散剂、膏剂或口服液剂等中的一种制剂，干石斛醇提物可制成所有药学可接受口服和非口服制剂形式。
实施例3：
一种用于自发性高血压的干石斛醇提物制备方法，如图1所示，包括如下步骤：
S1：将新鲜石斛鲜条洗净，置于烘干箱中烘干至含水率≤8％；
S2：将得到的干石斛破碎后过90目分离筛得到干石斛粉备用；
S3：称取20g干石斛粉，置于60℃的400ml提取液中重复提取两次，每次浸提22小时；
S4：合并两次提取物后采用滤膜过滤除菌，得澄清液；
S5：将澄清液减压浓缩至原体积的1/6～1/8后，冷冻干燥至恒重后得到。
所述干石斛醇提物的配制原始浓度为100mg/ml。
所述S4中滤膜的孔径为0.22μm。
实施例4
一种用于自发性高血压的实施例1-3所述干石斛醇提物制备方法，如图1-13所示，将实施例1-3中的任一一种质量浓度为100mg/ml的干石斛醇提物稀释，低温保存，以作为试验药物，备用。
A1：检测干石斛醇提物对RAW264.7细胞中的胰岛素抵抗相关基因FABP4、CD36、SRA、PPARγ的mRNA的表达：RAW264.7(小鼠单核巨噬细胞)采用DMEM完全培养基(之中添加10％胎牛血清、100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素)在37℃、体积分数5％CO2的培养箱中培养，细胞同步化12h，随机分成两大组，即①空白对照组和②给药组，空白对照组为不给药(0μg/ml)；给药组包括FABP4试验区、CD36试验区、SRA试验区和PPARγ试验区，其中给药情况如下：
FABP4试验区：干石斛醇提物低剂量组(10μg/mL)、干石斛醇提物中剂量组(80μg/mL)和干石斛醇提物高剂量组(500μg/mL)；
CD36试验区：干石斛醇提物低剂量组(10μg/mL)、干石斛醇提物中剂量组(100μg/mL)和干石斛醇提物高剂量组(500μg/mL)；
SRA试验区：干石斛醇提物低剂量组(10μg/mL)、干石斛醇提物中剂量组(80μg/mL)和干石斛醇提物高剂量组(500μg/mL)；
PPARγ试验区：干石斛醇提物低剂量组(10μg/mL)、干石斛醇提物中剂量组(80μg/mL)和干石斛醇提物高剂量组(500μg/mL)，给药作用12h，荧光定量PCR：使用RNAiso Plus提取RAW264.7细胞的总RNA，通过Oligo dT18将1μg总RNA逆转录为cDNA，通过定量PCR技术，使用Toyobo公司ThunderBirdSYBR qPCR Mix试剂按照说明书对引物进行PCR扩增，每组样品3个复孔，以保证实验数据的有效性。使用GAPDH为内参，检测目的基因FABP4、CD36、SRA、PPARγ的mRNA相对于内参基因(GAPDH)的表达变化来定量。采用Graphpad7分析数据(即实验组目的基因相对于空白对照组的表达量的变化倍数)。
FABP4所用引物为mFABP4-F：AAATCACCGCAGACGACAGG；mFABP4-R：AACTCTTGTGGAAGTCACGCC；
CD36所用引物为mCD36-f-2：CTATTGGCCAAGCTATTGCG；mCD36-r-2：TCAGATCCGAACACAGCGTA；
SRA所用引物为mSRA-f：TGATCGGGGACAAATTGGCT；mSRA-r：GAGTTATACTGATCTTGATCCGCC；
PPARγ所用引物为m-PPARγ-F：GCCAGTTTCGATCCGTAGAA；m-PPARγ-R：AATCCTTGGCCCTCTGAGAT。
结合附图2-5的实验结果可知，由本发明制备的干石斛醇提物相对空白对照组(给药浓度为0μg/mL)，中剂量和高剂量干石斛醇提物的给药均能够明显降低CD36、SRA、FABP4及PPARγ基因的mRNA表达水平。由此可知，干石斛醇提物可以抑制动脉粥样硬化。
A2：检测干石斛醇提物对体外HUH7细胞中胆固醇合成相关基因的mRNA的表达：HUH7细胞复苏后，用DMEM培养液转入培养皿中，在37℃、体积分数5％CO2条件下培养，细胞同步化12h，随机分成两大组，即①空白对照组：不给药(0μg/ml)；②给药组：干石斛醇提物中剂量组(100μg/mL)、干石斛醇提物低剂量组(10μg/mL)，给药作用12h，荧光定量PCR：使用RNAiso Plus提取HuH7细胞的总RNA，通过Oligo dT18将1μg总RNA逆转录为cDNA，通过定量PCR技术，使用Toyobo公司ThunderBirdSYBR qPCR Mix试剂按照说明书对引物进行PCR扩增。每组样品3个复孔，以保证实验数据的有效性。使用GAPDH为内参，检测目的基因SREBP1、SCAP、INSIG2、HMGCR的mRNA分别相对于内参基因(GAPDH)的表达变化来定量。采用Graphpad7分析数据(即实验组目的基因相对于空白对照组的表达量的变化倍数)。
SREBP1所用引物为：hSREBP1-f：CCCTGGGAGACATCGACGA；hSREBP1-r：CGTTGCACTGAAGGGTCCA；
SCAP所用引物为：h-Scap-f：CGCAAACAAGGAGAGCCTAC；h-Scap-r：TGTCTCTCAGCACGTGGTTC；
INSIG2所用引物为：h-INSIG2-f：GTCCAGTGTAATGCGGTGTG；h-INSIG2-r：TACTCCAAGGCCAAAACCAC；
HMGCR所用引物为：h-HMGCR-f：GTCATTCCAGCCAAGGTTGT；h-HMGCR-r：TCCTGTCCACAGGCAATGTA。
结合附图6-9的实验结果可知，由本发明制备的干石斛醇提物相对空白对照组(给药浓度为0μg/mL)，低剂量和中剂量干石斛醇提物的给药均能够明显抑制胰岛素诱导基因(INSIG2)的表达水平，由此可知，干石斛醇提物能够抑制胆固醇合成。
A3：检测干石斛醇提物对体外HUH7细胞中胆固醇代谢相关基因的mRNA的表达：HUH7细胞复苏后，用DMEM培养液转入培养皿中，在37℃、体积分数5％CO2条件下培养，细胞同步化12h，随机分成两大组，即①空白对照组：不给药(0μg/ml)；②给药组：干石斛醇提物中剂量组(100μg/mL)、干石斛醇提物低剂量组(10μg/mL)，给药作用12h，荧光定量PCR：使用RNAisoPlus提取HuH7细胞的总RNA，通过OligodT18将1μg总RNA逆转录为cDNA，通过定量PCR技术，使用Toyobo公司ThunderBirdSYBR qPCR Mix试剂按照说明书对引物进行PCR扩增。每组样品3个复孔，以保证实验数据的有效性。使用GAPDH为内参，检测目的基因清道夫受体B类I型(SRBI)、前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶kexin9型(PCSK9)、低密度脂蛋白受体(LDLR)、卵磷脂胆固醇脂酰转移酶(LCAT)的mRNA分别相对于内参基因(GAPDH)的表达变化来定量。采用Graphpad7分析数据(即实验组目的基因相对于空白对照组的表达量的变化倍数)。
SRBI所用引物为：hSRBI-f：CTGTGGGTGAGATCATGTGG；hSRBI-r：GCTCAGCTGCAGTTTCACAG；
PCSK9所用引物为：hPCSK9-f：AGTTGCCCCATGTCGACTAC；hPCSK9-r：GAGATACACCTCCACCAGGC；
LDLR所用引物为：hLDLR-f-2：AGGAGACGTGCTTGTCTGTC；hLDLR-r-2：CTGAGCCGTTGTCGCAGT；
LCAT所用引物为：hLCAT-f：ACGGGGCCCTACTGTAATAA；hLCAT-r：AGATGCAGCACTGGAAGGAG。
结合附图10-13的实验结果可知，由本发明制备的干石斛醇提物相对空白对照组(给药浓度为0μg/mL)，低剂量干石斛醇提物的给药能够明显增加LCAT，LDLR，PCSK9，SRBI的mRNA表达水平，中剂量干石斛醇提物的给药能够明显增加卵磷脂胆固醇脂酰转移酶(LCAT)的表达水平。由此可知，干石斛醇提物能够促进胆固醇代谢降解。
综上所述，干石斛醇提物可以作为药物用于治疗自发性高血压疾病。
关于石斛对于自发性高血压的研究，可参见以下文献：(赵文慧，铁皮石斛醇提取物对自发性高血压大鼠降压作用的研究，浙江中医杂志，2018)
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种用于自发性高血压的干石斛醇提物制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1：将新鲜石斛鲜条洗净，置于烘干箱中烘干至含水率≤8％；
S2：将得到的干石斛破碎后过60～100目分离筛得到干石斛粉备用；
S3：称取20g干石斛粉，置于55～60℃的350～500ml提取液中重复提取两次，每次浸提15～24小时；
S4：合并两次提取物后采用滤膜过滤除菌，得澄清液；
S5：将澄清液减压浓缩至原体积的1/6～1/8后，冷冻干燥至恒重后得到。
2.根据权利要求1所述的一种用于自发性高血压的干石斛醇提物制备方法，其特征在于，所述新鲜石斛为霍山石斛、铁皮石斛、金钗石斛、水草石斛、流苏石斛和鼓槌石斛中的一种或者两种以上的组合。
3.根据权利要求2所述的一种用于自发性高血压的干石斛醇提物制备方法，其特征在于，所述烘干的前期温度为45～50℃，烘干10～12小时，中期温度为65～70℃，烘干6～8小时，后期温度为75℃，烘干0.5～1小时。
4.根据权利要求3所述的一种用于自发性高血压的干石斛醇提物制备方法，其特征在于，所述提取液为石油醚、丙酮、乙醇、甲醇、乙醚、氯仿中的一种或两种以上的混合物。
5.根据权利要求1所述的一种用于自发性高血压的干石斛醇提物制备方法，其特征在于，所述干石斛醇提物为颗粒剂、丸剂、胶囊剂、片剂、散剂、膏剂或口服液剂中的一种制剂。
6.根据权利要求5所述的一种用于自发性高血压的干石斛醇提物制备方法，其特征在于，所述干石斛醇提物的配制原始浓度为100mg/ml。
7.根据权利要求4所述的一种用于自发性高血压的干石斛醇提物制备方法，其特征在于，所述滤膜的孔径为0.22μm。
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