JPH06247863A - 炎症抑制剤用組成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 放線菌ストレプトマイセス・ノビリス（Stre
ptomyces nobilis ）の培養液またはその乾固物から有
機溶剤によって抽出された物質を、ＯＤＳカラムクロマ
トグラフィーに供して、水：メタノール＝５０：５０〜
０：１００の間の極性を有する溶出溶剤で溶出し、つい
で、得られたＯＤＳカラム有効画分をシリカゲルカラム
クロマトグラフィーに供して、酢酸エチル：メタノール
＝８５：１５〜５：９５の間の極性を有する溶出溶剤で
溶出して得られた溶出物質からなる炎症抑制剤用組成物
である。 【効果】 少量の投与により、アレルギー性および非ア
レルギー性のいずれの炎症反応にも顕著な抑制作用を示
す活性成分を含む組成物を提供することができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、放線菌ストレプトマイ
セス・ノビリス（以下、「Ｓ．ノビリス」と略記する）
の培養液またはその乾固物から有機溶剤によって抽出さ
れた物質を、ＯＤＳカラムクロマトグラフィーに供して
得られたＯＤＳカラム有効画分を、シリカゲルカラムク
ロマトグラフィーに供し、極性が酢酸エチル：メタノー
ル＝８０：２０〜０：１００の間にある溶剤により溶出
されて得られるアレルギー性および非アレルギー性のい
ずれの炎症反応にも有効な炎症抑制剤用組成物に関す
る。

【０００２】

【従来の技術】炎症反応はアレルギー性炎症と非アレル
ギー性炎症に大別される。アレルギーは、ある抗原との
２度目の接触の際に生じる免疫反応が、個々人によって
過度にあるいは不適当な形で現われる一種の病的症状で
あって、関与する抗体の性質の違いからＩ型、II型、II
I 型およびIV型の反応に分類されている。これら４つの
型のうち、III 型反応（免疫複合体反応：アルサス反
応）およびIV型反応（細胞性免疫反応：遅延型過敏症反
応）に関与するアレルギー性炎症反応は慢性関節リウマ
チのような自己免疫疾患、更には肝炎、腎炎、感染症の
ような種々の炎症性疾患の発症進展に重要な役割を演じ
ていることが明らかになってきた。

【０００３】ところで、従来より放線菌培養濾液中には
種々の抗生物質が見つけられており、該培養濾液は生理
活性物質の宝庫と言われている。しかしながら、アレル
ギー性炎症を抑制する物質は、現在までのところ放線菌
培養濾液から見つけられた例がない。

【０００４】また、従来の抗炎症剤であるアスピリンや
インドメタシンは、アレルギー性炎症に対して抑制作用
が極めて弱いという問題点がある。

【０００５】そこで、本発明者らは先の出願（平成３年
特許願第３３７００９号）に示したように、原材料とし
てＳ．ノビリスを用いてアレルギー性炎症抑制作用を有
する物質の探索を行った結果、顕著なアレルギー性炎症
抑制作用を示し、かつヒトおよび動物に対する安全性に
ついても全く問題がないアレルギー性炎症抑制剤用組成
物を見いだすことに成功した。本発明者らは、さらに研
究を進め、培養液またはその乾固物から有機溶剤によっ
て抽出された物質を、ＯＤＳカラムクロマトグラフィー
に供して得られたＯＤＳカラム有効画分にアレルギー性
および非アレルギー性の炎症反応に対する顕著な抑制作
用と安全性を確認し、抗炎症剤として全く問題がない組
成物を見い出すことに成功した。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】ところが、上記組成物
はアレルギー性および非アレルギー性炎症抑制剤作用を
持たない種々の不純物を含んでいるものと考えられるた
め、投与量を多くせざるを得なかった。

【０００７】そこで、本発明の目的は、このような実情
から、上記アレルギー性および非アレルギー性炎症抑制
剤用組成物を精製して不純物を除き、少量の投与による
アレルギー性および非アレルギー性炎症抑制を可能にす
ることにある。

【０００８】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、III 型ア
レルギーに対するアレルギー性炎症抑制物質を見つけ出
すために、III 型アレルギー反応の動物モデルであるラ
ット４時間異種受身皮膚アナフィラキシー（４時間hete
rologous ＰＣＡ）反応を用いてスクリーニングを行っ
た結果、放線菌Ｓ．ノビリスのＯＤＳカラム有効画分
を、シリカゲルカラムクロマトグラフィーに供し、極性
が酢酸エチル：メタノール＝８０：２０〜０：１００の
間にある溶剤により溶出されて得られた画分に、アレル
ギー性および非アレルギー性炎症抑制物質が含有されて
いることを見出し、この知見に基づき本発明を完成する
に至った。

【０００９】すなわち、本発明によるアレルギー性およ
び非アレルギー性炎症抑制剤用組成物は、放線菌ストレ
プトマイセス・ノビリス（Streptomyces nobilis ）の
培養液またはその乾固物から有機溶剤によって抽出され
た物質を、ＯＤＳカラムクロマトグラフィーに供して、
水：メタノール＝５０：５０〜０：１００の間の極性を
有する溶出溶剤で溶出し、ついで、得られたＯＤＳカラ
ム有効画分をシリカゲルカラムクロマトグラフィーに供
して、酢酸エチル：メタノール＝８５：１５〜５：９５
の間の極性を有する溶出溶剤で溶出して得られた溶出物
質からなるものである。

【００１０】本発明組成物の原料である放線菌Ｓ．ノビ
リスは、公的保存機関から入手可能であり、たとえば理
化学研究所の保存菌(JCM 4274)（これは米国においてAT
CC19252 およびオランダにおいてCBS 198.65としても保
存）などの菌が使用できる。

【００１１】以下に放線菌Ｓ．ノビリスの培養および培
養液からの溶剤抽出について述べる。

【００１２】放線菌Ｓ．ノビリスの培養は、然るべき栄
養物を含んだ培地を用いて行う。すなわち、液体培養の
場合、その成分としては、ブドウ糖などの糖類、ペプト
ンや麦芽エキスなどのタンパク質類、ビタミン類、核酸
類、アミノ酸類、複合糖質類の一種または数種を含んだ
水溶液が好適に用いられる。代表的な培地例としては、
澱粉・アンモニウム系の液体培地（可溶性澱粉、リン酸
水素二カリウム、塩化アンモニウムを含む）が挙げられ
る。液体培地のｐＨは５〜９の範囲が好ましく、培養温
度は２０〜４０℃が好ましい。また液体培養の好ましい
培養時間は３〜１４日である。固体培養の場合、主に上
記の液体培養の培地にさらに寒天を含んだものを用いる
が、固体培養の培養条件も液体培養のそれとほぼ同じで
ある。

【００１３】こうして、Ｓ．ノビリスを培養した後、溶
剤抽出処理を行う。溶剤抽出は、培養液をそのまま溶剤
と接触させる方法、または培養液を蒸発乾固させ乾固物
を溶剤と接触させる方法などによって行い、抽出相から
炎症抑制剤の活性成分を取得する。溶剤抽出処理におい
ては、当該培養液またはその乾固物中にＳ．ノビリス菌
体を存在させてもよいし、させなくてもよい。菌体を存
在させずに抽出を行う場合は、培養液を固液分離して菌
体を除き、その分離液相をそのままもしくはこれを乾固
させたものを溶剤抽出処理に使用する。固液分離手段と
しては、遠心分離、濾過などが適宜用いられる。

【００１４】炎症抑制活性成分の抽出溶剤としては、有
機溶剤が用いられる。その代表例としては、酢酸エチ
ル、プロピオン酸エチルなどのエステル類；メタノー
ル、エタノール、ｎ−プロパノール、イソプロパノー
ル、ｎ−ブタノールなどのアルコール類；エチルエーテ
ル、ジオキサンなどのエーテル類；アセトン、メチルエ
チルケトンなどのケトン類などが挙げられるが、使用可
能な溶剤はこれらに限定されない。また、上記溶剤の混
合液を用いることもできる。特に好適な溶剤は酢酸エチ
ル、メタノールなどである。

【００１５】培養液を乾固させずにそのまま用いた抽出
の場合、培養液と溶剤との比率は特に限定されないが、
抽出効率および操作の容易さの観点から培養液１容あた
り好ましくは溶剤０．５〜２容の範囲である。培養液の
乾固物を用いた抽出の場合、溶剤の使用量は特に限定さ
れない。溶剤抽出は室温で行っても加熱下で行ってもよ
いが、後者の方が効率的である。加熱は常圧下での溶剤
の沸点以下の温度範囲で行う。抽出時間は溶剤の種類や
抽出温度などによっても異なるが、好ましくは３〜１２
０分の範囲である。また抽出中は液を静置するかまたは
時々攪拌しながら放置する。好ましくは、同一の培養液
またはその乾固物に対して抽出操作を複数回繰り返す。

【００１６】つぎに、上記Ｓ．ノビリス培養液溶剤抽出
物に対するＯＤＳカラムクロマトグラフィーについて述
べる。

【００１７】ＯＤＳカラムクロマトグラフィーは充填剤
としてオクタデシルジメチルクロロシランのようなオク
タデシルシラン類を用いた逆相カラムクロマトグラフィ
ーである。ＯＤＳカラムクロマトグラフィーの上記充填
剤の充填量は特に限定されないが、好ましくはチャージ
するＳ．ノビリス培養液抽出物に対する重量比で１０〜
２００倍量を充填する。Ｓ．ノビリス培養液酢酸エチル
抽出物をカラムにチャージする際は、まずこれをＯＤＳ
に吸着させる。このときＯＤＳの量は特に限定されない
が、好ましくは吸着させるＳ．ノビリス培養液抽出物に
対する重量比で０．５〜１０倍量を用いて同抽出物を吸
着させた後、少量の溶剤に懸濁してからカラムにチャー
ジする。溶出溶媒としては、極性が水：メタノール＝５
０：５０〜０：１００の間にある溶剤を用いる。

【００１８】つぎに、上記ＯＤＳカラム有効画分に対す
るシリカゲルカラムクロマトグラフィーについて述べ
る。

【００１９】このカラムクロマトグラフィーの充填剤と
してはシリカゲルを用い、充填量は特に限定されない
が、好ましくはチャージするＯＤＳカラム有効画分に対
する重量比１０〜２００倍量を充填する。ＯＤＳカラム
有効画分をシリカゲルに吸着させカラムにチャージす
る。このときシリカゲルの量は特に限定されないが、好
ましくは吸着させるＯＤＳカラム有効画分に対する重量
比０．５〜１０倍量を用いて吸着させた後、小量の溶剤
に懸濁してからカラムにチャージする。溶出溶剤として
は、極性が酢酸エチル；メタノール＝８５：１５〜５：
９５の間にある溶剤を用い、好ましくは極性が酢酸エチ
ル；メタノール＝約６０：約４０＝約４０：約６０であ
る溶剤を用いる。

【００２０】本発明組成物を炎症抑制剤に製剤化するに
は、通常はこれを製剤用担体と共に製剤組成物の形態と
する。担体としては剤形に応じた薬剤を調製するのに通
常使用される充填剤、崩壊剤、増量剤、結合剤、付湿
剤、表面活性剤、滑沢剤などの稀釈剤あるいは賦形剤が
例示される。また適当な溶剤を選定することにより、得
られた溶剤抽出液ないしはその濃縮物をそのままの形態
で外用液剤として使用することもできる。

【００２１】本発明組成物を用いて製剤化される炎症抑
制剤の投与単位形態としては、上記の如き外用液剤の
外、錠剤、丸剤、飲用液剤、散剤、懸濁剤、乳剤、顆粒
剤、カプセル剤、坐剤、注射剤（液剤、懸濁剤など）、
軟膏剤などが例示される。

【００２２】炎症抑制剤中に含有すべき本発明組成物の
量は、特に限定されず広範囲に適宜選択されるが、好ま
しくは炎症抑制剤中に０．１〜５０重量％の範囲であ
る。

【００２３】本発明組成物より得られた炎症抑制剤は、
その使用に際し各種形態に応じた方法で投与される。た
とえば上記の如き外用液剤の場合には、これを皮膚ない
しは粘膜などの所要部位に直接塗布し、錠剤、丸剤、飲
用液剤、懸濁剤、乳剤、顆粒剤およびカプセル剤の場合
には経口投与され、注射剤の場合には静脈内、筋肉内、
皮内、皮下もしくは腹腔内投与され、坐剤の場合には直
腸内投与され、また軟膏剤の場合には塗布される。

【００２４】本発明組成物より得られた炎症抑制剤の投
与量は、使用目的、症状などにより適宜選択されるが、
通常は１日当り本発明組成物として０．２〜５０ｍｇ／
ｋｇ程度の範囲である。また上記製剤組成物を３〜４回
／日に別けて投与することももちろん差し支えない。

【００２５】

【実施例】つぎに、本発明の実施例を挙げて、本発明を
具体的に実証する。

【００２６】実施例（溶剤抽出物の調製およびＯＤＳカ
ラムクロマトグラフィー、シリカゲルカラムクロマトグ
ラフィーによる溶出） 理化学研究所から購入した放線菌Ｓ．ノビリス (JCM427
4)を、酵母エキス０．２％添加澱粉・アンモニウム培地
１００ｍｌ中、４０〜４５時間振盪培養（前々培養）
し、続いて同培地３リットルに前々培養菌液６０ｍｌを
接種し、２５〜３０時間振盪培養（種培養）した。さら
に澱粉・アンモニウム培地（蒸留水１００ｍｌ中に可溶
性澱粉を１ｇ、リン酸水素二カリウムを０．０５ｇ、塩
化アンモニウムを０．０５ｇ含む）２８５リットルに種
培養した全量を接種し、約３０℃で３０〜１０日間振盪
培養した。

【００２７】この培養液を遠心分離し、分離した上澄液
２５０リットルを得、これを減圧下で２８リットルに濃
縮した。この培養濃縮液３．４リットルを分液ロートに
入れ、これに等量の酢酸エチルを加え、液全体を１０分
間振盪した。５分間静止後、水相と酢酸エチル相を分離
した。分離した水相に等量の酢酸エチルを加え、上述の
操作を繰り返し、再度水相と酢酸エチル相を分離した。
分離した水相に等量の酢酸エチルを加え、上述の操作を
もう一度繰り返し、３回目の抽出を行った。こうして３
回の操作で得られた酢酸エチル相を集めて、集合液をエ
バポレータで濃縮乾固し、抽出物１ｇを得た。

【００２８】つぎに、上記により得られた酢酸エチル抽
出物１ｇを、ＯＤＳ（オクタデシルジメチルクロロシラ
ン）１．５ｇに吸着させ、少量の溶剤（純水）に懸濁し
たものを、ＯＤＳカラム（ＯＤＳ１５０ｇをメタノール
に懸濁し、直径３２ｍｍ、長さ３０５ｍｍのカラムに充
填した後、水：メタノール＝１：９から９：１まで徐々
に溶剤を変えて、カラム中の溶剤を水：メタノール＝
９：１に置換したもの）にチャージした。

【００２９】溶出溶媒は、水：メタノール＝９：１の混
合液を５００ｍｌ、水：メタノール＝６：４を４００ｍ
ｌ、水：メタノール＝３：７を４００ｍｌ、メタノール
を４００ｍｌ、酢酸エチルを４００ｍｌ、この順に流
し、これらの溶出溶媒によって溶出された液を、各々エ
バポレータを用いて乾固させたところ、水：メタノール
＝９：１溶出画分が４６５ｍｇ、水：メタノール＝６：
４溶出画分が８５ｍｇ、水：メタノール＝３：７溶出画
分が１０２ｍｇ、メタノール溶出画分が１３１ｍｇ、お
よび酢酸エチル溶出画分が１１７ｍｇそれぞれ得られ
た。

【００３０】つぎに、上記により得られたメタノール溶
出画分のうち１００ｍｇを、シリカゲル２００ｍｇに吸
着させ、少量のヘキサンに懸濁したものをシリカゲルカ
ラム（シリカゲル１．５ｇを酢酸エチルに懸濁し充填し
た直径１０ｍｍ、長さ４０ｍｍのカラム）にチャージし
た。溶出溶媒として、酢酸エチル、酢酸エチル：メタノ
ール＝９５：５、酢酸エチル：メタノール＝９０：１
０、酢酸エチル：メタノール＝８０：２０、酢酸エチ
ル：メタノール＝６０：４０、酢酸エチル：メタノール
＝４０：６０、メタノールをこの順に６ｍｌずつ流し、
これらの溶出溶媒によって溶出された液を各々エバポレ
ーターを用いて乾固させたところ、酢酸エチル溶出画分
が３６ｍｇ、酢酸エチル：メタノール＝９５：５溶出画
分が６．６ｍｇ、酢酸エチル：メタノール＝９０：１０
溶出画分が９．８ｍｇ、酢酸エチル：メタノール＝８
０：２０溶出画分が１２．２ｍｇ、酢酸エチル：メタノ
ール＝６０：４０溶出画分が１６ｍｇ、酢酸エチル：メ
タノール＝４０：６０溶出画分が８．６ｍｇ、メタノー
ル溶出画分が４．４ｍｇそれぞれ得られた。

【００３１】試験例１ （ III型アレルギー反応に対する作用） ｉ） ウサギ抗オボアルブミン (ovalbumin)血清の調製 江田らの方法（日薬理誌、６６巻、２３７頁、１９７０
年）に準じて、つぎの手法でウサギ抗オボアルブミン血
清を調製した。すなわち、生理的食塩水に溶解したオボ
アルブミン（Sigma 社製）の２ｍｇ／ｍｌ溶液と完全フ
ロイントアジュバント（Difco 社製）との等量混合乳化
液よりなる抗原液を調製した。

【００３２】この抗原液の０．５ｍｌずつを体重約３ｋ
ｇのニュージーランド産ホワイト種の雄性家兎の左右臀
筋内に１週間毎に４回注射した。最終注射の７日後に頸
動脈から採血し、血清のみを分離取得し、ウサギ抗オボ
アルブミン血清とした。この抗血清のラット４時間異種
受身皮膚アナフィラキシー（heterologous ＰＣＡ）反
応の力価は１：３２であった。

【００３３】ii) ラット４時間異種ＰＣＡ反応（ III
型アレルギー性皮膚反応）に対する作用 実施例で得られた乾固状の抽出物をそれぞれ、ＯＤＳカ
ラム有効画分として５ｍｇ／ｍｌ相当、すなわち酢酸エ
チル溶出画分が１．８ｍｇ／ｍｌ、酢酸エチル：メタノ
ール＝９５：５溶出画分が０．３３ｍｇ／ｍｌ、酢酸エ
チル：メタノール＝９０：１０溶出画分が０．４９ｍｇ
／ｍｌ、酢酸エチル：メタノール＝８０：２０溶出画分
が０．６１ｍｇ／ｍｌ、酢酸エチル：メタノール＝６
０：４０溶出画分が０．８０ｍｇ／ｍｌ、酢酸エチル：
メタノール＝４０：６０溶出画分が０．４３ｍｇ／ｍ
ｌ、メタノール溶出画分が０．２２ｍｇ／ｍｌとなるよ
うに、５重量％アラビアゴム水溶液にジメチルスルホキ
サイドを５重量％添加して成る溶液に懸濁した。

【００３４】なお、対照実験用として、上記ＯＤＳカラ
ム有効画分を、最終濃度が２．５ｍｇ／ｍｌとなるよう
に、５重量％アラビアゴム水溶液にジメチルスルホキサ
イドを５重量％添加して成る溶液に懸濁させたものを調
製した。

【００３５】こうして得られた懸濁液を供試液とした。
被検動物としては体重１２０〜２００ｇのウイスター雄
性ラットを用いた。

【００３６】まず、上記供試液をラットに２ｍｌ／ｋｇ
（ＯＤＳカラム有効画分量として１０ｍｇ／ｋｇに相当
するシリカゲルカラム分画とＯＤＳカラム有効画分５ｍ
ｇ／ｋｇ）腹腔内投与しておいた。

【００３７】ついで供試液投与の２０時間後に、上記ウ
サギ抗オボアルブミン血清を生理的食塩水で４倍に希釈
してなる注射液０．０５ｍｌを、上記ラットの背部皮内
に注射し、ラットを上記抗血清で感作した。

【００３８】つぎに、抗血清投与の４時間後に、対応す
る抗原として２ｍｇ／ｍｌのオボアルブミンを含む０．
５重量％エバンスブルー生理的食塩水を２．５ｍｌ／ｋ
ｇ静脈内注射して、４時間異種ＰＣＡ反応を惹起した。

【００３９】こうして皮内反応を惹起した部位の漏出色
素を、Haradaらの方法(J.Pharm.Pharmacol. ２３巻、２
１８頁、１９７１年）に従って抽出定量した。すなわ
ち、抗原注射の１時間後に動物を屠殺し、４時間異種Ｐ
ＣＡ反応部の皮膚を細切し、これを０．３％（ｗ／ｖ）
硫酸ナトリウム水溶液３容とアセトン７容の混合液中に
２４時間浸漬放置し、漏出色素を抽出した。こうして抽
出した色素を６２０ｎｍで比色定量し、漏出色素量を求
め、これをウサギ抗オボアルブミン血清を注射した部位
(site)当たりの漏出色素量（μｇ）として表わした。

【００４０】この試験のコントロールとして、上記シリ
カゲルカラム画分を含まない上記ジメチルスルホキサイ
ド含有アラビアゴム水溶液を用い、その他の点は上記操
作と同様に行って漏出色素量を求めた。

【００４１】本試験は、それぞれ５匹のラットを用いて
行い、漏出色素量（μｇ／site）はこれらラットについ
て得られた値の平均値をとった。

【００４２】この試験結果を図１に示す。

【００４３】この図から明らかなように、実施例の酢酸
エチル：メタノール＝６０：４０溶出画分を含有する供
試液を投与した群では、ＯＤＳカラム有効画分を含有す
る供試液を投与した群とともに、コントロール群に比
べ、ラット４時間異種ＰＣＡ反応部の皮膚に漏出する色
素量が大幅に減少し、顕著なアレルギー性炎症抑制活性
が認められる。すなわち、ＯＤＳカラム有効画分はアレ
ルギー性炎症抑制活性を持ち、その活性は実施例の酢酸
エチル：メタノール＝６０：４０溶出画分（シリカゲル
カラム有効画分）に含まれる物質に由来する。

【００４４】また、実施例のシリカゲルカラム有効画分
を含有する供試液を投与した群では、ＯＤＳカラム有効
画分を含有する供試液の約１／３の投与量で、コントロ
ール群に比べ、ラット４時間異種ＰＣＡ反応部の皮膚に
漏出する色素量が大幅に減少した。すなわち、シリカゲ
ルカラム有効画分の比活性がＯＤＳカラム有効画分の約
３倍になっている。

【００４５】試験例２ （IV型アレルギー反応に対する作用） ｉ） マウス足蹠遅延型浮腫反応（IV型アレルギー性足
蹠浮腫反応）に対する作用 つぎの方法でIV型アレルギー反応での上記シリカゲルカ
ラム有効画分の作用を調べた。

【００４６】まず、試験例１と同様の操作で濃度０．３
２ｍｇ／ｍｌのシリカゲルカラム有効画分含有供試液を
調製した。なお、対照実験用として、上記ＯＤＳカラム
有効画分を、最終濃度が１ｍｇ／ｍｌとなるように、上
記ジメチルスルホキサイド含有アラビアゴム水溶液に懸
濁したものを用意した。また、被検動物としては体重４
０〜５０ｇのＩＣＲ雄性マウスを用いた。

【００４７】羊赤血球を生理的食塩水で最終濃度が４×
１０⁹ 個／ｍｌになるように希釈し、この希釈液０．０
５ｍｌをマウスの左足蹠皮内に注射し、マウスを羊赤血
球で感作した。

【００４８】ついで、感作の４日後に、上記供試液０．
２ｍｌ（シリカゲルカラム有効画分量として１．２８〜
１．６０ｍｇ／ｋｇ、ＯＤＳカラム有効画分量として４
〜５ｍｇ／ｋｇ）を感作マウスに腹腔内投与した。

【００４９】この供試液投与の直後に、羊赤血球４×１
０⁹ 個／ｍｌの０．０５ｍｌを感作マウスの右足蹠皮内
に再度注射してIV型アラルギー反応を誘発した。

【００５０】さらに、上記IV型アラルギー反応誘発の６
時間後に、上記供試液０．２ｍｌを同マウスに再度腹腔
内投与した。

【００５１】最後に２回目の供試液投与の１８時間後
に、マウスの右足蹠の腫れ度合を肉眼的評点で調べた。

【００５２】この試験のコントロールとして、上記シリ
カゲルカラム有効画分を含まない上記ジメチルスルホキ
サイド含有アラビアゴム水溶液を用い、その他の点は上
記操作と同様に行って、マウスの右足蹠の腫れ度合を調
べた。

【００５３】本試験は、それぞれ７匹のマウスを用いて
行い、腫れの度合はこれらマウスについて得られた値の
平均値をとった。

【００５４】この試験結果を図２に示す。

【００５５】この図から明らかなように、実施例のシリ
カゲルカラム有効画分を含有する供試液を投与した群で
は、コントロール群に比べ、右足蹠の腫れが明らかに抑
制され、顕著なアレルギー性炎症抑制活性が認められ
た。また、シリカゲルカラム有効画分は、ＯＤＳカラム
有効画分の約１／３の投与量で、これと同等の活性を示
すことが認められた。

【００５６】ｉｉ） ラット皮膚ツベルクリン反応（IV
型アレルギー性皮膚反応）に対する作用 つぎに、栗山らの方法（日薬理誌９４巻、１１３〜１１
８頁、１９８０年）でラット皮膚ツベルクリン反応に対
する上記シリカゲルカラム有効画分の作用を調べた。

【００５７】まず、試験例１と同様の操作で濃度０．８
０ｍｇ／ｍｌのシリカゲルカラム有効画分含有供試液を
調製した。なお、対照実験用として、上記ＯＤＳカラム
有効画分を、最終濃度が２．５ｍｇ／ｍｌとなるよう
に、上記ジメチルスルホキサイド含有アラビアゴム水溶
液に懸濁したものを用意した。また、BacillusCalmatte
-Guerin （ＢＣＧ）を生理的食塩水に懸濁して最終濃度
２．５ｍｇ／ｍｌとし、１２１℃で５分間オートクレー
ブしたものを用意した。さらに、精製ツベルクリンを生
理的食塩水に溶解して２００μｇ／ｍｌとしたものを用
意した。また、被検動物としては体重１８０〜２２０ｇ
のウィスター系雄性マウスを用いた。

【００５８】まず、上記ＢＣＧ懸濁液の０．２ｍｌ（Ｂ
ＣＧとして、０．５ｍｇ）を被検動物に腹腔内投与し
た。

【００５９】ＢＣＧ投与の７日後に、上記供試液２ｍｌ
／ｋｇ（シリカゲルカラム有効画分量として１．６０ｍ
ｇ／ｋｇ、ＯＤＳカラム有効画分量として５ｍｇ／ｋ
ｇ）を被検動物に腹腔内投与した。

【００６０】この投与直後に、上記ツベルクリン含有生
理的食塩水の０．１ｍｌ（精製ツベルクリンとして２０
μｇ）を被検動物の背部皮内に投与して、皮膚ツベルク
リン反応を誘発した。なお、それと同時に対照として生
理的食塩水のみ０．１ｍｌを背部の別の部位に皮内投与
した。

【００６１】誘発２４時間後にツベルクリン投与部位お
よび生理的食塩水投与部位について、ノギスを用いて紅
斑径（ｍｍ）を、また色彩色差計（ミノルタＣＲ−２０
０）を用いて紅斑強度をそれぞれ測定した。各個体につ
いて、ツベルクリン投与部位の値から生理的食塩水投与
部位の値を減じた値を求め、それぞれの紅斑径と紅斑強
度の値の積を算出して皮膚紅斑インデックスとした。そ
の後、ツベルクリン投与部位および生理的食塩水投与部
位を径１６ｍｍポンチで打ち抜きその重量を測定した。
ツベルクリン投与部位の値から生理的食塩水投与部位の
値を減じ、得られた値を皮膚腫脹重量とした。

【００６２】この試験のコントロールとして、上記シリ
カゲルカラム有効画分を含まない上記ジメチルスルホキ
サイド含有アラビアゴム水溶液を用い、その他の点は上
記操作と同様に行った。

【００６３】本試験は、それぞれ５匹のラットを用いて
行い、これらラットについて得られた値の平均値を試験
結果として図３および図４に示す。

【００６４】これらの図から明らかなように、実施例の
シリカゲルカラム有効画分およびＯＤＳカラム有効画分
を投与した群では、コントロール群に比べ、皮膚ツベル
クリン反応による紅斑および浮腫が明らかに抑制され、
顕著なIV型アレルギー性炎症抑制活性が認められた。ま
た、シリカゲルカラム有効画分は、ＯＤＳカラム有効画
分の約１／３の投与量で、これと同等の活性を示すこと
が認められた。

【００６５】試験例３ （アジュバント関節炎に対する作用） つぎの方法でラットアジュバント関節炎に対する上記シ
リカゲルカラム有効画分の効果を調べた。

【００６６】まず、試験例１と同様の方法で０．８０ｍ
ｇ／ｍｌ濃度のシリカゲルカラム有効画分供試液を調製
した。なお、対照実験用として、上記ＯＤＳカラム有効
画分を、最終濃度が２．５ｍｇ／ｍｌとなるように、上
記ジメチルスルホキサイド含有アラビアゴム水溶液に懸
濁したものを用意した。また、被検動物としては体重２
００〜２５０ｇのウイスタールイス雄性ラットを用い
た。

【００６７】流動パラフィンに０．６重量％の濃度で懸
濁した結核菌体Mycobacteriumtubercurosis H37RA（Dif
co 社製）の菌液アジュバント０．１ｍｌをラットの右
足蹠皮内に投与した。

【００６８】その後、上記供試液をラットに２ｍｌ／ｋ
ｇ（シリカゲルカラム有効画分量として１．６ｍｇ／ｋ
ｇ、ＯＤＳカラム有効画分量として５ｍｇ／ｋｇ）の割
合で当日より１日１回２２日間、毎日腹腔内投与した。
また、アジュバント投与日から２３日間、毎日ラットの
左右後肢の足蹠の容積をPlethysmometer (UgoBasile
社製) を用いて測定し、それらの容積の変化を調べた。

【００６９】この試験のコントロールとして、上記シリ
カゲルカラム有効画分を含まない上記ジメチルスルホキ
サイド含有アラビアゴム水溶液を用い、その他の点は上
記操作と同様に行って左右後肢の足蹠の容積の変化を調
べた。

【００７０】本試験は、それぞれ５匹のラットを用いて
行い、左右後肢の足蹠の容積はこれらラットについて得
られた値の平均値として、図５および図６に示す。

【００７１】これらの図から明らかなように、実施例の
シリカゲルカラム有効画分を含有する供試液を投与した
群では、コントロール群に比べ、左右後肢の足蹠の容積
の増加が明らかに抑制され、アジュバント関節炎に対す
る顕著な有効性が認められた。また、シリカゲルカラム
有効画分は、ＯＤＳカラム有効画分の約１／３の投与量
で、これと同等の活性を示すことが認められた。

【００７２】試験例４ ラットカラゲニン足蹠浮腫反応
（非アレルギー反応）に対する作用 つぎの方法でラットカラゲニン足蹠浮腫反応に対する上
記シリカゲルカラム有効画分の作用を調べた。

【００７３】まず、試験例１と同様の方法で０．８０ｍ
ｇ／ｍｌ濃度のシリカゲルカラム有効画分供試液を調製
した。なお、対照実験用として、上記ＯＤＳカラム有効
画分を、最終濃度が２．５ｍｇ／ｍｌとなるように、上
記ジメチルスルホキサイド含有アラビアゴム水溶液に懸
濁したものを用意した。また、被検動物としては体重１
４０〜１６０ｇのウィスター系雄ラットを用いた。

【００７４】また、カラニゲンを生理的食塩水に溶かし
て１％としたものを用意した。

【００７５】まず、上記供試液をラットに２ｍｌ／ｋｇ
（シリカゲルカラム有効画分量として１．６０ｍｇ／ｋ
ｇ、ＯＤＳカラム有効画分量として５ｍｇ／ｋｇ）を腹
腔内投与した。

【００７６】被検動物の右後肢の容積をPlethysmometer
(Ugo-Basile)を用いて測定したのち、上記１％カラゲニ
ンを被検動物の右後肢足蹠皮内に注射し、浮腫反応を誘
発した。

【００７７】誘発後１、２、３、４、５時間後に同様に
被検動物の右後肢の容積を測定した。

【００７８】なお、この試験のコントロールとして、上
記シリカゲルカラム有効画分を含まない上記ジメチルス
ルホキサイド含有アラビアゴム水溶液を用い、その他の
点は上記操作と同様に行って、ラットの右後肢の容積を
測定した。

【００７９】本試験は、それぞれ５匹のラットを用いて
行い、右後姿態容積は、これらラットについて得られた
値の平均値として図７に示す。

【００８０】この図から明らかなように、シリカゲルカ
ラム有効画分およびＯＤＳカラム有効画分を投与した群
では、コントロール群に比べ、右後肢の脹れは明らかに
抑制され、顕著な炎症抑制活性が認められた。また、シ
リカゲルカラム有効画分は、ＯＤＳカラム有効画分の約
１／３の投与量で、これと同等の活性を示すことが認め
られた。

【００８１】試験例５ 毒性試験 つぎの方法で上記シリカゲルカラム有効画分の毒性を調
べた。

【００８２】まず、実施例で得られたシリカゲルカラム
有効画分を、最終濃度が６４ｍｇ／５ｍｌになるよう
に、上記ジメチルスルホキサイド含有アラビアゴム水溶
液に懸濁した。こうして得られた懸濁液を供試液として
用い、被験動物として体重２５〜３０ｇのＩＣＲ雄性マ
ウスを用いた。

【００８３】上記供試液をマウスに５ｍｌ／ｋｇ（試験
例１〜４の有効量の４０〜１００倍量に相当）腹腔内投
与した。その結果、毒性症状は特に認められず、また供
試液投与２週間後の死亡率は０％であった。生存した被
検動物の剖検においても何ら異常は認められなかった。
この結果からも明らかなように、実施例で得られたシリ
カゲルカラム有効画分は有効量の４０〜１００倍量で毒
性を示さなかった。なお、この試験は５匹のマウスを用
いて行った。

【００８４】

【発明の効果】本発明によれば、少量の投与により、ア
レルギー性および非アレルギー性のいずれの炎症反応に
も顕著な抑制作用を示す活性成分を含む組成物を提供す
ることができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】ＯＤＳカラム有効画分含有液（５ｍｇ／ｋｇ）
とそのシリカゲルカラムの各溶出物含有液（ＯＤＳカラ
ム有効画分１０ｍｇ／ｋｇ相当量）およびそのコントロ
ールのラット４時間異種 PCA反応における漏出色素量を
示すグラフである。

【図２】ＯＤＳカラム有効画分含有液（４〜５ｍｇ／ｋ
ｇ）とシリカゲルカラム有効画分含有液（１．２８〜
１．６０ｍｇ／ｋｇ）およびそのコントロールのマウス
足蹠遅延型浮腫反応における右足蹠の腫れ度合を示すグ
ラフである。

【図３】ＯＤＳカラム有効画分含有液（５ｍｇ／ｋ
ｇ）、シリカゲルカラム有効画分含有液（１．６０ｍｇ
／ｋｇ）およびそのコントロールのラット皮膚ツベルク
リン反応における皮膚紅斑インデックスを示すグラフで
ある。

【図４】ＯＤＳカラム有効画分含有液（５ｍｇ／ｋ
ｇ）、シリカゲルカラム有効画分含有液（１．６０ｍｇ
／ｋｇ）およびそのコントロールのラット皮膚ツベルク
リン反応における皮膚重量を示すグラフである。

【図５】ＯＤＳカラム有効画分含有液（５ｍｇ／ｋ
ｇ）、シリカゲルカラム有効画分含有液（１．６ｍｇ／
ｋｇ）およびそのコントロールのアジュバント関節炎に
おける左足蹠の容積を示すグラフである。

【図６】ＯＤＳカラム有効画分含有液（５ｍｇ／ｋ
ｇ）、シリカゲルカラム有効画分含有液（１．６ｍｇ／
ｋｇ）およびそのコントロールのアジュバント関節炎に
おける右足蹠の容積を示すグラフである。

【図７】ＯＤＳカラム有効画分含有液（５ｍｇ／ｋｇ）
とシリカゲルカラム有効画分含有液（１．６０ｍｇ／ｋ
ｇ）およびそのコントロールのラットカラゲニン足蹠浮
腫反応における右足蹠の容積を示すグラフである。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 放線菌ストレプトマイセス・ノビリス
   （Streptomycesnobilis ）の培養液またはその乾固物か
   ら有機溶剤によって抽出された物質を、ＯＤＳカラムク
   ロマトグラフィーに供して、水：メタノール＝５０：５
   ０〜０：１００の間の極性を有する溶出溶剤で溶出し、
   ついで、得られたＯＤＳカラム有効画分をシリカゲルカ
   ラムクロマトグラフィーに供して、酢酸エチル：メタノ
   ール＝８５：１５〜５：９５の間の極性を有する溶出溶
   剤で溶出して得られた溶出物質からなる炎症抑制剤用組
   成物。