KR100351180B1 - 신규의펩티드및치료제 - Google Patents

Abstract

본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 신규의 펩티드에 관한 것이다. 본 발명의신규의 펩티드는 알레르기성 및 비알레르기성 염증 억제 효과, 항균 효과, 항종양 효과 및 상처-치유 효과를 나타내며, 염증 억제제, 면역억제제, 항균제, 항종양제, 상처 치유제, 항궤양제등으로 유용하다. 따라서, 본 발명은 또한 전술한 약리학적 효과를 가진 치료제를 제공한다.

Description

신규의 펩티드 및 치료제

유기 용매를 사용하여 방선균(Actinomyces)인 스트렙토마이세스 노빌리스(Streptomyces nobilis; 이하, "에스. 노빌리스"로 언급함)의 배양배지 또는 그 건조 생성물로부터 추출하여 얻은 추출 혼합물은 알레르기성 항염증 효과를 가진 물질을 함유한다는 것이 공지되어 있다(일본 공개특허공보 제 25053/1993).

그러나 전술한 약리 효과를 가진 상기 물질의 화학 구조는 아직 명확히 밝혀지지 않았다.

본 발명의 제1 목적은 상기 물질의 구조를 규명하고 신규의 펩티드를 제공하는 것이다.

지금까지 미생물에 의해 생산되는 항생물질은 5,000종 이상이 보고되어 있다. 그들 중에는 스트렙토마이세스속에 속하는 미생물에서 기원한 스트렙토마이신, 액티노마이신 C, 액티노마이신 D 등이 보고되어 있다.

항생물질을 사용할 때에는 내성 박테리아의 출현이 문제를 일으키며, 새로운 유형의 항생물질이 요망된다.

따라서, 본 발명의 제2 목적은 높은 항균 활성을 가진 신규의 항생물질을 제공하는 것이다.

염증은 비알레르기성 염증 및 알레르기성 염증으로 분류된다. 아스피린(Nikkei Science, 3, 70(1991)) 및 인도메타신(Ther. Res., 3, 1057(1985))과 같은 비스테로이드성 항염증제, 및 프레드니솔론과 같은 스테로이드성 항염증제가 카라게닌 부종으로 대표되는 비알레르기성 염증에 대해 효과적이다. 한편, 알레르기성 염증은 I형 내지 IV형으로 분류된다. I형 반응은 아토피성 피부염, 천식, 비염 등과 같은 다양한 알레르기 질병에 관여한다. II형 반응, III형 반응(면역 복합체 반응: 아르투스(Arthus) 반응) 및 IV형 반응(세포 면역 반응: 지연형 과민 반응)은 류머티스성 관절염과 같은 자가면역 질병 및 간염, 신염, 피부염, 감염성 질병, 용혈성 빈혈 및 인슐린-의존 당뇨병과 같은 다양한 염증 질병의 발증 및 진행에 중요한 역할을 하는 것으로 밝혀졌다. 프레드니솔론과 같은 스테로이드성 항염증제가 상기 알레르기성 염증에 효과적이다.

알레르기성 염증에 효과적인 스테로이드성 항염증제는 감염 방어 기능의 저하, 소화관 질환, 하수체 부신피질 기능의 억제 및 골형성의 저하와 같은 부작용을 유발한다. 스테로이드승 제제보다 더 안전한 것으로 생각되는 비스테로이드성 항염증제는 알레르기성 염증에 대해 매우 낮은 억제 효과를 가진다는 문제가 있다. 따라서, 매우 효과적이고 저독성인 항염증제가 요망된다.

전술한 관점에서, 본 발명의 제3 목적은 알레르기성 염증 및 비알레르기성 염증에 효과적이고 유용한 신규의 항염증 물질을 제공하는 것이다.

창상(wound)이란 외과적 절개, 소화관 궤양, 화상, 열상 및 피부 궤양(예; 욕창)과 같은 표면 조직의 손상이다. 창상의 통상적인 치료란 손상 부위에 응급 처치를 한 후 손상 부위가 생체의 자연 회복력에 의해 치유되기를 기다리는 것이다. 그러나, 손상 부위의 회복에는 시간이 오래 걸리며, 동통과 같은 환자의 고통은 결코 무시할 수 없는 문제이다. 따라서, 자연 회복에 의존하지 않고 적극적이고 직접적으로 치유를 촉진하는 것이 요망된다. 창상의 치유는 일반적으로 세포 증식에 의한 새로운 결합 조직 및 상피 조직의 형성에 의해 좌우되며, 창상 치유에 관여하는 세포 분화 과정 및 세포 증식 과정을 촉진하거나 자극하는 약제가 효과적인 것으로 생각된다.

어린 송아지의 혈액 추출물(솔코세릴)(Pharmacometrics, 22, 565-579 (1981)), 염화라이소자임 등이 현재까지 창상 치유에 대한 촉진 효과를 나타내는 물질로서 보고되어 있다.

그러나, 표면 조직의 손상과 같은 창상은 일반적으로 난치성이기 때문에, 현존하는 어떠한 약도 창상에 대한 충분한 임상 효과를 나타내지 못한다.

전술한 관점에서, 본 발명의 제4 목적은 보다 유용한 신규의 창상-치유 물질을 제공하는 것이다.

본 발명은 신규의 펩티드에 관한 것이다. 본 발명의 신규의 펩티드는 알레르기성 및 비알레르기성 염증 억제 효과, 항균 효과 및 창상 치유 효과를 나타내며 염증 억제제, 면역억제제, 항균제, 창상치유제, 항궤양제 등으로서 유용하다. 따라서, 본 발명은 또한 상기의 약리 효과를 가진 치료제에 관한 것이다.

도 1은 본 발명의 펩티드 0.5 mg/kg, 프레드니솔론 20 mg/kg 및 이들의 대조군을 각각 복강내로 투여한 래트의 48 시간 동종 PCA 반응에서의 누출색소량을 나타내는 그래프.

도 2는 본 발명의 펩티드 0.5 mg/kg 프레드니솔론 20 mg/kg 및 이들의 대조군을 각각 피하 투여한 래트의 48 시간 동종 PCA 반응에서의 누출 색소량을 나타내는 그래프.

도 3은 본 발명의 펩티드 0.5 mg/kg, 프레드니솔론 20 mg/kg 및 이들의 대조군을 각각 복강내로 투여한 래트의 4 시간 이종 PCA 반응에서의 누출 색소량을 나타내는 그래프.

도 4는 본 발명의 펩티드 0.5 mg/kg, 프레드니솔론 20 mg/kg 및 이들의 대조군을 각각 피하 투여한 래트의 4 시간 이종 PCA 반응에서의 누출 색소량을 나타내는 그래프.

도 5는 본 발명의 펩티드 0.5 mg/kg, 프레드니솔론 50 mg/kg 및 이들의 대조군을 각각 복강내로 투여한 래트의 투베르쿨린 반응에서 홍반 강도 및 피부 중량을 나타내는 그래프.

도 6은 본 발명의 펩티드 0.5 mg/kg, 아스피린 100 mg/kg, 프레드니솔론 5 mg/kg 및 이들의 대조군을 각각 복강내로 투여한 래트의 카라게닌 부종에서 우측 뒷다리의 부종 부피를 나타내는 그래프.

도 7은 본 발명의 펩티드 0.5 mg/kg, 프레드니솔론 10 mg/kg 및 이들의 대조군을 각각 복강내로 투여한 래트의 보조 관절염에서 각부 부종량을 나타내는 그래프.

도 8은 본 발명의 펩티드, 대조군 및 기준 의약의 농도와 육아의 습윤 중량 사이의 관계를 나타내는 그래프.

도 9는 본 발명의 펩티드, 대조군 및 기준 의약과 창상의 인장강도 사이의 관계를 나타내는 그래프.

도 10은 본 발명의 펩티드를 함유하는 연고제 및 대조군 연고와 관련하여 결함 형성후의 일수와 결함 면적 사이의 관계를 나타내는 그래프.

도 11은 본 발명의 펩티드를 함유하는 연고제 및 기준 연고와 관련하여 결함 형성후의 일수와 결함 면적 사이의 관계를 나타내는 그래프.

본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 신규의 펩티드(이하, "본 발명의 펩티드"로 언급함)를 제공한다:

본 발명의 펩티드는 예를 들면, 방선균 에스, 노빌리스를 배양하여 얻은 배양배지, 배지의 건조 생성물 또는 배양된 박테리아로부터 유기 용매를 사용하여 추출한 추출물을 각종 칼럼 크로마토그래피에 의해 정제하고, 필요에 따라 목적 생성물을 함유하는 칼럼 크로마토그래피 분획을 재결정함으로써 얻어진다.

본 발명의 펩티드를 생산하는 방선균 에스. 노빌리스는 여러 공공 보존 기관으로부터 입수할 수 있다. 예를 들면, 이화학 연구소(the Institute of Physical and Chemical Research)의 보존균(JCM4274)(미국에서는 ATCC19252로, 그리고 네덜란드에서는 CBS198.65로도 보존되어 있음)를 사용할 수 있다.

방선균 에스. 노빌리스는 적절한 영양물을 함유하는 배지를 사용하여 배양한다. 액체 배양의 경우에, 그 배지 성분으로는 바람직하게는 포도당과 같은 당류, 펩톤 및 맥아 추출물과 같은 단백질류, 비타민류, 핵산류, 아미노산류 및 복합 탄수화물류를 1종 또는 수종 함유하는 수성 용액을 사용할 수 있다. 배지의 대표적인 예로는 전분-암모늄 액체 배지형(가용성 전분, K₂HPO₄및 NH₄Cl 함유)이 있다. 액체 배지의 pH는 2 내지 9가 바람직하고, 배양 온도는 15 내지 42℃가 바람직하다. 액체 배양의 배양 기간은 1 내지 14일이 바람직하다. 본 발명의 펩티드는 이런 방법으로 얻은 에스. 노빌리스의 배양 배지, 그 건조 생성물 또는 박테리아 자체로부터 용매를 사용하여 추출한다.

에스. 노빌리스의 배양 배지 그 건조 생성물 또는 박테리아 자체의 추출물은 황산암모늄으로 처리하고, 얻어진 침전물을 용매를 사용하여 추출할 수 있다. 황산암모늄으로 처리할 경우에, 배양 배지, 그 건조 생성물 또는 박테리아 자체의 추출물에 첨가될 황산암모늄은 고체형 및 용액형 둘다 가능하다. 첨가되는 황산암모늄의 양은 포화 농도의 30 내지 90 중량%의 범위가 바람직하다. 처리 시간은 30분 내지 5 시간의 범위가 바람직하지만, 이에 국한되는 것은 아니다. 침전물을 얻기 위해 원심분리할 때, 원심력은 3,000G 내지 20,000G가 바람직하고, 원성분리 시간은 2 내지 60분이 바람직하다.

추출에 사용되는 용매로서는 유기 용매가 바람직하다. 유기 용매의 대표예는 에틸 아세테이트와 같은 에스테르류 메탄올 에탄올 및 프로판올과 같은 알코올류, 에틸 에테르 및 디옥산과 같은 에테르류, 아세톤 및 메틸 에틸 케논과 같은 케톤류, 디클로로메탄, 클로로포름등이다. 그러나, 사용가능한 용매가 그들로 국한되는 것은 아니다. 전술한 용매들의 혼합물을 사용할 수도 있다. 바람직한 용매는 에틸 아세테이트, 디클로로메탄, 아세톤등이다. 추출 시간은 용매의 종류, 추출 온도 등에 따라 달라지나, 3 내지 120분이 바람직하다. 액체는 추출중에 정치 및 교반시킬 수 있다. 추출 작업은 하나의 샘플에 대해 수차례 반복하는 것이 바람직하다. 추출 온도는 특히 한정되지 않는다.

이하에는 용매 추출용 크로마토그래피를 기술한다.

칼럼 크로마토그래피용 충전제로서는 ODS(옥타데실디메틸클로로실란과 같은 옥타세실실란)로 개질시킨 실리카겔(이하, "ODS 실리카겔"로 언급함)이 바람직하다. 충전제 함량은 특히 제한되지 않으나, 충전할 용매 추출물의 10 내지 500배의 중량을 가진 중전제를 중전하는 것이 바람직하다. 용매 추출물을 칼럼내로 충전할 때에는 먼저 용매 추출물을 ODS 실리카겔상에 흡착시키는 것이 바람직하다. ODS 실리카겔의 양은 특히 제한되지 않으나, 추출물의 0.5 내지 20배의 중량을 가진 ODS 실리카겔상에 용매 추출물을 흡착시키고, 추출물을 흡착하는 ODS 실리카겔을 소량의 용매에 현탁시키고, 그 현탁액을 칼럼내로 충전시키는 것이 바람직하다. 용출 용매는 특히 제한되지 않으나, 메탄올-아세토니트릴(1:1)의 혼합 용매를 함유하는 70% 수성 용액의 극성과 메탄올-아세토니트릴-물(19:19:2)의 극성 사이의 극성을 가진 용매를 사용하는 것이 바람직하다.

이하에서는 재결정에 의한 본 발명의 펩티드의 정제에 대해 기술한다.

재결정에 사용된 용매는 본 발명의 펩티드를 용해시키는 한 특히 제한되지않으나, 메탄올, 에탄올등이 바람직하다. 재결정 방법으로서, 목적 물질을 함유하는 칼럼 용출 분획은 가열하면서 소량의 용매에 용해시키고, 얻어진 용액을 서서히 냉각시켜 그 물질을 재결정시킬 수 있다. 한편, 상기 물질을 함유하는 칼럼 용출 분획은 또한 그 물질을 용이하게 용해시키는 용매에 용해시키고, 그 물질을 거의 용해시키지 않는 액체(예; 물)를 용액에 서서히 첨가하여 상기 물질을 재결정시킬 수도 있다.

후술하는 약리학적 시험으로 입증되는 바와 같이, 본 발명의 펩티드는 알레르기성 및 비알레르기성 염증 억제 효과, 항균 효과로서 특히 그람-양성 박테리아의 증식 억제에 효과적인 항균 효과 및 창상-치유 효과를 나타내며, 염증 억제제, 면역 억제제, 항균제, 창상-치유제, 항궤양제 등으로서 유용하다.

전술한 치료제를 제조하기 위하여, 본 발명의 펩티드는 통상 제제용 담체를 사용하여 제제 조성물로 제형화한다. 담체의 예로는 충전제, 분해제, 중량제, 결합체, 착색제, 향미제, pH 조정제, 가용화제, 현탁제, 완충제, 안정화제, 보존제, 습윤제, 계면활성제, 윤활제, 부형제, 산화방지제, 분산제, 분사제, 용매 및 용해보조제가 있으며, 이들은 제형에 따라 약제를 제조하는 데에 통상 사용된다. 얻어진 본 발명의 펩티드는 적합한 용매를 선택하여 액상 제제 형태로 사용할 수 있다.

본 발명의 펩티드를 사용하여 제조되는 치료제의 투여 단위 형태의 예로는 전술한 액상 제제 외에도 정제, 환제, 음용액제, 산제, 현탁제, 유제, 과립제. 추출제, 세립제, 시럽제, 침제, 탕제 점안제 트로케제, 찜질제, 도찰제, 로션제, 안연고제, 고약, 캡슐제, 좌제, 주사제(예; 액제 및 현탁제), 접착 테이프, 연고제,젤리제, 파스타제, 흡입제, 크림제, 스프레이제, 세비제 및 에어로졸이 있다.

치료제에 함유될 본 발명의 펩티드의 양은 특별히 제한되지 않으며, 넓은 범위에 걸쳐 적절히 선택할 수 있다. 펩티드의 바람직한 양은 치료제내에 10^-7내지 10 중량%의 범위로 함유된다.

본 발명의 펩티드로부터 얻어지는 치료제는 사용할 때 다양한 형태에 따른 방법으로 투여한다. 예를 들면, 외용 제제는 피부 및 점막과 같은 필요 부위에 직접 분무, 도포 또는 확포한다. 정제, 환제, 음용액제, 현탁제, 유제, 과립제 및 캡슐제는 경구 투여한다. 주사제는 정맥내로, 근육내로, 피부내로, 피하로, 동맥내로 그리고 복강내로 투여한다. 좌제는 직장내로 투여한다.

본 발명의 펩티드로부터 얻은 치료제의 투여량은 목적, 증상 등에 따라 적절히 조정한다. 통상적인 일일 투여량은 본 발명의 펩티드로 계산할 때 1 kg당 약 10 pg 내지 약 10 mg의 범위이다. 물론, 전술한 제제 조성물은 하루에 1 내지 4회 분할 용량으로 투여할 수 있다.

실시예 1

이화학 연구소에서 입수한 방선균 에스. 노빌리스(JCM4274)는 0.2%의 효모 추출물이 첨가된 전분-암모늄 배지 100 ㎖중에서 40 시간 동안 진탕 배양하였다(전-전배양). 그 후 동일 배지 3 ℓ에 전-전배양된 박테리아액 60㎖를 접종하고, 그 혼합물을 25 시간 동안 진탕 배양하였다(종자 배양). 부가로, 전분-암모늄 배지(증류수 100 ㎖중에 가용성 전분 1g, 인산수소칼륨 0.05g 및 염화암모늄 0.05g을 함유함) 285ℓ를 종자 배양된 배지 전향으로 접종하고, 그 혼합물을 약 30℃에서 8일 동안 진탕 배양하였다. 배양 배지를 원심분리하였다. 얻어진 상청액 250ℓ에 상청액 1 ℓ당 662 g의 속도로 황산암모늄을 첨가하고 그 혼합물을 1 시간 동안 교반하였다. 그 혼합물을 20,000 G(유속: 360 내지 500 ℓ/hr)로 연속 원심분리하여 약 12 kg의 침전물을 얻었다.

전술한 방법으로 얻은 침전물 1.2 kg에 물 3.6 ℓ 첨가하고, 그 혼합물을 80℃에서 30분 동반 교반하였다. 상기 혼합물에 동량의 에틸 아세테이트를 첨가하고, 그 혼합물을 10분 동안 진탕한 다음, 전체를 5,000 G로 10분 동안 원심분리하였다. 아릴 아세테이트층을 분리한 후, 수성층에 대해 상기 조작을 수차례 실시하여 용매추출물을 얻었다.

그 후 전술한 방법으로 얻은 용매를 ODS 실리카겔(실제로, 옥타데실디메틸 클로로실란으로 개질시킨 실리카겔) 흡수제 25g에 흡착시켰다. 추출물을 흡착하는 흡수제를 직경 3.2 cm의 칼럼중의 ODS 실리카겔 흡수제상에 충전하여 ODS 실리카겔 칼럼을 제조하였다. 상기 칼럼은 미리 흡수제 275g을 충전시킨 것이었다. 추출물을 하기 조건하에 ODS 실리카겔 칼럼을 사용하여 정제하였다. 하기 용출 용매는 10.5 ㎖/분의 속도로 순서대로 흐르게 하였다: a) 메탄올-아세토니트릴-물 (7:7:6) 1.5ℓ, b) 메탄올-아세토니트릴-물(8:8:4) 1.2ℓ, c) 메탄올-아세토니트릴-물(9:9:2) 150 ㎖, d) 메탄올-아세토니트릴-물(19:19:2) 1ℓ 및 e) 메탄을 1ℓ 용출 용매의 조성을 변화시킬 때마다 각각의 용출물을 수집하였다. 구체적으로, 메탄올-아세토니트릴-물(19:19:2)의 용출 분획은 분획 수집기로 조금씩(2분 마다) 적절히 분류하였다. 각 용출 분획을 하기 조건하에 칼럼(도소 코오포레이숀에서 제조됨, ODS-80TM, 내경 4.6 mm 및 길이 25.0 cm)을 구비한 고성능 액체 크로마토그래프(히타치 리미티드에서 제조됨, 펌프: L-6000L-6200, 검출기: L-3000, 칼럼 오븐: 655A-52)를 사용하여 분석하였다; 검출 파장= 210 nm, 칼럼 온도= 40℃ 및 유속= 1 ㎖/분, 물-아세토니트릴-메탄올(6:7:7(0분) 내지 0:1:1(30분))의 용출제를 사용함. 체류 시간이 18 내지 20분인 피크를 포함하는 분획만을 전술한 분획중 동일 분획(100 mg)으로 수집하였다. 수집된 분획을 메탄올-물로부터 반복 재결정하여 침상체 45 mg을 얻었다.

상기 물질의 구조는 다양한 기기 분석 데이타에 의해 화학식 1로 표시되는것으로 측정되었다.

실시예 2

실시예 1과 동일한 방법으로 에스. 노빌리스를 배양하였다. 얻어진 박테리아 215 g(습윤 중량)에 디클로로메탄 2.15 ℓ를 첨가하고, 그 혼합물을 30분 동안 초음파 처리하였다. 그 혼합물에 디클로로메탄 8.6 ℓ을 추가로 첨가하고 전체를 실온에서 1 시간 동안 교반하였다. 박테리아를 여과한 후 얻은 여과액을 농축하여 건조 상태로 만들었다. 추출물의 건조된 생성물은 소량의 헥산에 용해시키고, 헥산상을 메탄올로 3회 추출하였다. 헥산에 불용성인 물질 및 메탄올 추출물을 메탄올에 다시 용해시켰다.

다음, 전술한 방법으로 얻은 용매 추출물을 ODS 실리카겔 흡수제 28 g에 흡착시켰다. 추출물을 흡착하는 흡수제 약 30g을 직경 3.2 cm의 칼럼중의 ODS 실리카겔 흡수제상에 충전하여 ODS 실리카겔 칼럼을 제조하였다. 상기 칼럼은 미리 흡수제 275 g 을 충전시킨 것이었다. 추출물을 하기 조건하에 ODS 실리카겔 칼럼을 사용하여 정제하였다. 하기 용출 용매는 10.5 ㎖/분의 속도로 순서대로 흐르게 하였다: a) 메탄올-아세토니트릴-물(7:7:6) 1.5 ℓ, b) 메탄올-아세토니트릴-물(8:8:4) 1.2 ℓ, c) 메탄올-아세토니트릴-물(9:9:2) 200 ㎖, d) 메탄올-아세토니트릴-물(19:19:2) 1 ℓ 및 e) 메탄올 500㎖. 용출 용매의 조성을 변화시킬 때마다 각각의 용출물을 수집하였다. 구체적으로, 메탄올-아세토니트릴-물(19:19:2)의 용출 분측은 분획 수집기로 조금씩(2분 마다) 적절히 분류하였다. 각 용출 분획을 하기 조건하에 칼럼(도쇼 코오포레이숀에서 제조됨, ODS-80TM, 내경 4.6 mm 및 길이 25.0 cm)을 구비한 고성능 액체 크로마토그래프(히타치 리미티드에서 제조됨, 펌프: L-6000L-6200, 검출기: L-3000, 칼럼 오븐: 655A-52)를 사용하여 분석하였다; 검출 파장= 210 nm, 칼럼 온도= 40℃ 및 유속= 1 ㎖/분, 물-아세토니트릴-메탄올(6:7:7(0분) 내지 0:1:1(30분))의 용출제를 사용함. 체류 시간이 18 내지 20분인 피크를 포함하는 분획만을 전술한 분획중에서 동일한 분획(840 mg)으로 수집하였다. 수집된 분획은 메탄올-물로부터 반복적으로 재결정하여 본 발명의 펩티드 330 mg을 침상제로 얻었다.

상기 물질의 구조는 실시예 1과 동일한 방법으로 다양한 기기 분석 데이터에 의해 화학식 1로 표시되는 물질인 것으로 측정되었다.

구조 분석 데이터

실시예 1 및 2에서 얻은 물질의 기기 분석 데이터는 하기에 제시한다.

1. MS

가 주된 피크이고, 931의 피크는 매우 작다.)

C₄₅H₆₉N₈O₁₂에 대한 계산치: m/z=913.5053

2.IR

3. 아미노산 분석

D-세린, L-알라닌 및 D-N-메틸페닐알라닌을 가수분해 생성물로서 검출하였다.

4. 조성식

신규 펩티드의 조성식은 질량 분광분석 및 하기의 NMR의 데이터에 의해 C₄₅H₇₀N₈O₁₃으로 확인되었다.

5. NMR

a) 부분 구조 A

HMBC 스펙트럼의 측정 결과로서, 알라및(Ala)의 카르보닐 탄소(173.6ppm)와 N-CH₃-페닐알라닌(Phe)의 CH₃(3.04 ppm) 사이에 광범위한 상관관계가 관찰되었다. 따라서, 부분 구조 A가 추정되었다.

b) 부분 구조 B 및 C

유사한 스핀 시스템을 가진 두 성분이¹H-¹H COSY, HOHAHA에 의해 추정되었다.

1) NH(4.38 ppm) CH₂(46.1, 2.89, 3.15 ppm) CH₂(21.3, 1.45, 1.63 ppm)CH₂(24.2, 1.93, 2.25 ppm) CH(51.7 4.90 ppm)

2) NH(3.93 ppm) CH₂(47.9, 2.56, 3.30 ppm) CH₂(21.5, 1.55, 1.66 ppm) CH₂(24.4, 1.67, 2.58 ppm) CH(52.5, 5.18 ppm)

성분들의¹³C 이동이 매우 유사하기 때문에, 그들은 동일한 구조(관기)에 기초하는 것으로 생각된다 또한, CH₂양성자는 대등하지 않기 때문에, 성분들은 고리형 구조를 가지는 것으로 추정될 수 있다.

이동이 모나마이신에 함유된 피페라진산(Pip)의 것과 일치하기 때문에, 성분들은 Pip(부분 구조 B 의 좌측 부분 및 부분 구조 C)로 추정되었다.

또한, 세린(Ser)의 6.40 ppm의 NH와 Pip의 168.9 ppm의 카르보닐 사이에 광범위한 상관관계가 관찰되었기 때문에, 부분 구조 B가 추정되었다.

1) C.H. Hassall, W.A. Thomas, M.C. Moschidis, J. Chem. Soc., Perkin Trans. I, 1977, 2371(1977)

c) 부분 구조 D

식 (CH₃)₂-CH-CH-CH-NH-로 표시되는 부분 구조는¹H-¹H 스핀 커플링으로부터추정되었다. 부분 구조는 광범위한¹H-¹³C 커플링에 의해 확인되었다. β-OH-로이신(Leu)의 구조는 170.6 ppm의 카르보닐과 4.88 ppm의 CH 사이의 스핀 커플링에 의해 확인되었다. β-OH-Leu는 5.46 ppm의 CH로부터 그 β 위치에 에스테르 결합을 형성하는 것으로 추정되었다.

부분 구조 D의 측쇄부(좌측)의 구조는¹H-¹H 스핀 커플링, 광범위¹H-¹³C 커플링 및 NOE(Nuclear Overhauser Effect)의 측정 결과에 의해 확인되었다.

부분 구조 D는 광범위¹H-¹³C 커플링으로부터 β-OH-Leu의 4.88 ppm의 CH와 8.34 ppm의 NH 및 측쇄부의 177 ppm의 카르보닐 사이에서 광범위 상관 관계가 관찰된다는 사실에 의해 추정되었다.

d) 신규 펩티드의 화학 구조

부분 구조 B 및 D는 광범위¹H-¹³C 커플링으로부터 Ser의 170.2 ppm의 카르보닐과 β-OH-Leu의 5.46 ppm의 CH 사이에서 광범위 상관관계가 관찰된다는 사실에 의해 Ser과 β-OH-Leu 사이에 에스테르 결합을 형성하는 것으로 확인되었다. 부분 구조 C는 β-OH-Leu의 5.46 ppm의 CH와 Pip(부분 구조 C)의 4 38 ppm의 NH 사이에서, β-OH-Leu의 8.34 ppm의 NH와 Pip(부분 구조 C)의 2.89 ppm의 CH₂사이에서, 그리고 Pip(부분 구조 C)의 8.34 ppm의 NH와 4.90 ppm의 CH 사이에서 NOE가 관찰된다는 사실에 의해 β-OH-Leu의 170.6 ppm의 카르보닐기에 결합하는 것으로 확인되었다. 나머지 부분 구조 A를 결합시키는 방법은 하나의 방법이기 때문에, 신규 펩티드의 화학 구조가 결정되었다.

전술한 구조는 NOE가 Ser의 6.40 ppm의 NH와 N-CH₃-Phe의 3.04 ppm의 CH₃사이에서도 관찰된다는 사실에 의해 정확한 것으로 지지되었다.

e) NMR의 측정 결과를 하기에 제시한다.

표 1 및 2는¹³C 이동, 탄소형 및 직접 커플링¹H를 나타낸다. 표 3-5는¹H 이동, 스핀-커플링¹H 및¹³C, 광범위 커플링¹³C를 나타낸다 표 6 및 7은 NOE의 측정 결과를 나타낸다. 표 8∼11은¹³C 및¹H의 귀속을 나타낸다.

동일한 번호의 A 및 B는 비등가의 CH₂를 나타낸다.

1) DQF-COSY의 측정 결과

동일한 번호의 A 및 B는 비등가의 CH₂를 나타낸다.

부분 구조 A

부분 구조 B

부분 구조 C

부분 구조 D

β -OH-Leu-측쇄

제제의 제조예

본 발명의 펩티드 1 mg을 막자사발을 사용하여 미세하게 분쇄한 후, 플라스 티베이스 1g을 펩티드에 첨가하였다. 이들을 막자사발에서 충분히 혼합하여 연고제를 제조하였다.

본 발명의 펩티드 0.8 mg을 메탄을 50 ㎕에 용해시킨 후, 본 발명의 펩티드를 함유하는 얻어진 메탄올 12.5 ㎕를 플라스티베이스 1g과 막자사발에서 충분히 혼합하여 연고제를 제조하였다.

DMSO 0.1 ㎖를 본 발명의 펩티드 0.5 mg에 첨가하여 펩티드를 용해시킨 후, 본 발명의 펩티드를 함유하는 얻어진 DMSO 용액 0.1 ㎖을, 교반하면서 조금씩 5 중량%의 아라비아 고무 수용액 1.9 ㎖에 첨가하여 균일하게 현탁된 액제를 제조하였다.

소량의 생리 식염수를 본 발명의 펩티드 0.5 mg에 첨가하고 얻어진 혼합물을 초음파 처리하여 균질의 현탁액을 제조하였다. 생리 식염수를 그 현탁액에 첨가하여 2 ㎖의 액제를 제조하였다.

제제예 5(액제)

본 발명의 펩티드 25 mg을 에탄올 2.5 ㎖에 용해시킨 후, 거기에 폴리옥시에틸렌 경화된 카스터유 60을 1g 첨가하였다. 얻어진 용액을 교반하면서 생리 식염수 96.5㎖에 첨가하여 액제를 제조하였다.

제제예 6(액제)

본 발명의 펩티드 10 mg을 마크로골 50 ㎖에 용해시킨 후, 거기에 생리 식염수를 첨가하여 100 ㎖의 액제를 제조하였다.

약리 학적 시험

시험예 1은 본 발명의 펩티드의 항균 활성을 나타내는 시험으로서 제시한다. 시험 예 2 내지 6은 항염증 활성을 나타내는 시험으로서 제시한다. 시험예 7 내지9는 창상 치유 활성을 나타내는 시험으로서 제시한다. 시험에 10은 본 발명의 펩티드의 급성 독성 시험으로서 제시한다.

시험예 1

항균 활성

본 발명의 펩티드의 메탄올 용액(10,000 ㎍/㎖)을 최종 농도를 각각 2,000㎍/㎖, 500 ㎍/㎖, 100 ㎍/㎖, 5 ㎍/㎖ 및 1 ㎍/㎖를 만드는 양으로 멸균수로 희석하여 5 단계의 희석 용액을 조제하였다. 각각의 희석된 용액의 1/9량을 약 50℃로 유지되는 감수성 측정용 배지[박테리아: 뮤엘러 한턴 브로스(디프코 컴퍼니 리미티드에서 제조), 모울드: 1.5% 아가-첨가된 포도당 펩톤 배지(니스이 파마슈티컬 컴퍼니 리미티드에서 제조)]에 첨가하고, 충분히 혼합하였다. 각각의 혼합물을 페트리 디시내로 피펫팅하고, 고형화하여 감수성 측정용 평판 배지(본 발명의 펩티드: 각각 200 ㎍/㎖, 50 ㎍/㎖, 10 ㎍/㎖, 0.5 ㎍/㎖ 및 0.1 ㎍/㎖)를 제조하였다.

시험 박테리아로서는 (1) 스타필로코커스 아우레우스(Staphyococcus aureus) IFO 12732, (2) 스타필로코커스 아우레우스 IID 1677(메티실린-내성 에스. 아우레우스; MRSA), (3) 엔테로코커스 피칼리스(Enterococcus faecalis) IFO 12964, (4) 스타필로코커스 에퍼더미디스(Staphylococcus epidermidis) IFO 13889((1)∼(4)는 모두 그람-양성 박테리아임), (5) 슈도모나스 에어루지노사(Pseudomonas auruginosa) IFO 13275(그람-음성 박테리아) 및 (6) 트리코파이턴 멘타그로파이트(Trichophyton mentagrophytes) IFO 6202(모울드)를 사용하였다.

각각의 시험 박테리아를 표 12에 제시한 조건의 배지에서 배양하였다. 박테리아 (1)-(5)와 관련하여 접종용 박테리아액은 박테리아의 수가 약 10⁶/㎖가 되도록 배지로서 뮤엘러 한턴 브로스를 사용하여 조제하였다. 모울드(6)는 0.05% 멸균 디옥틸 나트륨 설포숙시네이트 용액상에 부유시켜 박테리아의 수가 약 10⁶/㎖가 되도록 접종용 박테리아액을 조제하였다.

이런 방법으로 얻은 접종용 박테리아액을 내경이 약 1 mm인 플라스틱 루프를 사용하여 감수성 측정용 평판상에 줄을 그어 길이 약 2 cm로 도말하였다. 박테리아 (1)-(5)를 35℃에서 18 내지 20 시간 동안 배양하고, 모울드(6)는 25℃에서 7일 동안 배양하였다.

지정된 시간 동안 박테리아를 배양한 후, 각 박테리아의 성장이 억제되는 최소 농도를 측정하였다. 그것은 최소 억제 농도(MIC, ㎍/㎖)로 정의한다. 얻은 결과는 표 13에 제시한다.

상기 결과로부터, 본 발명의 펩티드는 병원 감염과 같은 문제를 일으키는MRSA를 포함하여 그람-양성 박테리아에 대해 매우 높은 항균 활성을 나타내는 것으로 확인되었다.

시험예 2

I형 알레르기성 염증에 미치는 효과

i) 래트의 항-2,4-디니트로벤젠설폰산-돼지 회충(Ascaris suum) 추출물(DNP∼As) 혈청의 조제

Tada 및 Okumura(Journal of Immunology, 106, 1002 (1971))의 방법에 따라 DNP-As를 조제하였다. Strejan 및 Campbell(Journal of Immunology, 98, 893 (1967))의 방법에 따라 돼지 회충 추출물을 조제하고, Eisen등(Journal of American Chemical Society 75 4583 (1953))의 방법에 따라 2,4-디니트로벤젠설폰산(DNP)에 결합시켰다. 10¹⁰개의 죽은 보데텔라 피터시스(Bordetella pertussis)가 부유된 생리 식염수 1 ㎖에 DNP-As 1 mg을 용해시키고, 그 용액을 체중 약 200 g의 암컷 래트의 각부(footpad)로 피하 주사하였다. 5일후, DNP-As 0.5 mg을 생리 식염수 0.5 ㎖에 용해시키고, 그 용액을 우측 및 좌측 등에 근육내 주사하였다. 최초 주사후 8일째에 복대동맥으로부터 채혈하였다. 혈청을 분리하여 래트의 항-DNP-As 혈청으로 사용하였다. 래트의 48-시간 동종 PCA 반응에서 항혈청의 역가(力價)는 1:512였다.

(ii) 래트의 48-시간 동종 PCA 반응(I형 알레르기성 피부 반응)에 미치는 영향

펩티드의 농도가 0.25 mg/㎖가 되도록 5 중량%의 아라비아 고무 수용액에 디메틸 설폭사이드를 5 중량% 첨가하여 얻은 용액내에 본 발명의 펩티드를 현탁시켰다. 대조 실험용으로 프레드니솔론의 농도가 10 mg/㎖가 되도록 5 중량%의 아라비아 고무 수용액에 디메틸 설폭사이드 5 중량%를 첨가하여 얻은 용액내에 프레드 니솔론을 현탁시켰다. 이러한 방법으로 얻은 현탁액을 시험액으로서 사용하였다. 체중 120 내지 200 g의 수컷 위스타 래트를 시험 동물로서 사용하였다.

먼저, 전술한 항-DNP-As 혈청을 생리 식염수로 20배 희석하여 얻은 주사액 0.05 ㎖를 래트의 등의 피부내로 주사하여 래트를 항혈청으로 감작시켰다.

항혈청의 투여 48 시간후에, 상응하는 항원으로서 2 mg/㎖의 DNP-As를 함유하는 0.5 중량%의 에반스 블루 생리 식염수 2.5 ㎖/kg을 정맥내 투여하여 PCA 반응을 유도하였다.

본 발명의 펩티드를 투여한 군의 래트들에 대해서는, 본 발명의 펩티드를 함유하는 시험액 2 ㎖/kg(본 발명의 펩티드: 0.5 mg/kg)을 유도 24시간전에 복강내로 또는 피하로 24 시간 동안 투여하였다. 프레드니솔론을 투여한 군의 래트들에 대해서는, 프레드니솔론을 함유하는 시험액 2 ㎖/kg(프레드니솔론, 20 mg/kg)을 유도 3시간전에 복강내로 또는 피하로 투여하였다.

피하 반응이 일어난 부위에서 누출하는 색소를 추출하고, Harada등(J. Pharm. Pharmacol, 23, 218(1971))의 방법에 따라 다음과 같이 그 양을 측정하였다. 항원 주사 1 시간후에 래트를 에테르로 마취하여 안락사시켰다. 래트의 PCA 반응 부위의 피부를 절개하고, 잘게 썰고, 0.3%(w/v)의 황산나트륨 수용액 3 부피,및 아세톤 7 부피의 혼합 용액에 24 시간 동안 침적시켰다. 색소 누출량을 측정하였다. 얻어진 값은 항혈청이 주사된 부위당 색소 누출량(㎍)을 나타낸다.

색소 누출량을 측정하기 위한 시험의 대조예로서 디메틸 설록사이드를 함유하고 약제를 함유하지 않는 전술한 아라비아 고무 수용액을 사용한 것을 제외하고는, 상기한 바와 동일한 절차를 반복하였다.

각각의 시험은 5마리의 래트를 사용하여 수행하였다 누출 색소량(㎍/부위)은 래트에 대해 수득된 값의 평균으로 표시하였다.

복강내 투여의 시험 결과는 도 1에 제시한다. 피하 투여의 시험 결과는 도 2에 제시한다.

상기 도면으로부터 명백히 알 수 있는 바와 같이 본 발명의 펩티드를 함유하는 시험액을 투여한 군은 대조군과 비교하여 래트의 48-시간 동종 PCA 반응 부위에서 피부에 누출하는 색소량의 현저한 감소를 나타내며, 따라서 I형 알레르기성 염증 억제 활성을 고레벨로 나타냈다.

본 발명의 펩티드를 함유하는 시험액을 투여한 군은 대조군과 비교하여 래트의 48-시간 동종 PCA 반응 부위에서 프레드니솔론을 함유하는 시험액보다 작은 용량으로 피부에 누출하는 색소량의 현저한 감소를 나타냈다. 즉, 본 발명에 의해 얻어진 펩티드는 프레드니솔론보다 높은 I형 알레르기성 염증 억제 활성을 가진다.

시험예 3

III형 알레르기성 염증에 미치는 효과

i) 토끼 항난알부민 혈청의 조정

토끼 항난알부민 혈청은 Eda등(Folia Pharmacologica Japonica, 66, 237 (1970))의 방법에 따라 하기 방법으로 조정하였다. 유탁액을 포함하는 항원 용액은 생리 식염수에 용해된 난알부민(시그마 케미컬 컴퍼니에서 제조) 2 mg/㎖ 용액 및 프로인트의 완전 보조제(디프코 컴퍼니 리미티드에서 제조)를 등량으로 혼합하여 조제하였다. 체중 3 kg의 뉴질랜드 화이트 집토끼 수컷의 우측 및 좌측 둔근내로 1주마다 4번씩 항원 용액 0.5 ㎖씩을 근육내 주사하였다. 마지막 주사 7일 후에 토끼의 경동맥으로부터 채혈하고, 혈청만이 토끼 항난알부민 혈청으로서 분리되었다. 래트의 4-시간 이종 수동 피부 과민증(4-시간 이종 PCA) 반응에서 항혈청의 역가는 1:32였다.

ii) 래트의 4-시간 이종 PCA 반응(III형 알레르기성 피부반응)에 미치는 효과

펩티드의 최종 농도가 0.25 mg/㎖가 되도록 5 중량%의 아라비아 고무 수용액애 디메틸 설폭사이드 5 중량%를 첨가하여 얻은 용액내에 본 발명의 펩티드를 현탁시켰다. 대조 실험용으로 프레드니솔론의 최종 농도가 10 mg/㎖가 되도록 5 중량%의 아라비아 고무 수용액에 디메틸 설폭사이드 5 중량%를 첨가하여 얻은 용액내에 프레드니솔론을 현탁시켰다. 이러한 방법으로 얻은 현탁액을 시험액으로서 사용하였다. 체중 120 내지 200 g의 수컷 위스타 래트를 시험 동물로서 사용하였다.

전술한 토끼 난알부민 혈청을 생리 식염수로 4배 희석하여 얻은 주사액 0.05 ㎖를 래트의 등내부로 피하 주사하여 래트를 항혈청으로 감작시켰다.

항혈청의 투여 4 시간후에, 상응하는 항원으로서 2 mg/㎖의 난알부민을 함유하는 0.5 중량%의 에반스 블루 생리 식염수 2.5 ㎖/kg을 정맥내 주사하여 4 시간 동안 이종 PCA 반응을 유도하였다.

본 발명의 펩티드를 투여한 군의 래트들에 대해서는, 본 발명의 펩티드를 함유하는 시험액 2 ㎖/kg(본 발명의 펩티드: 0.5 mg/kg)을 유도 24시간 전에 복강내로 또는 피하로 투여하였다. 프레드니솔론을 투여한 군의 래트들에 대해서는, 프레드니솔른을 함유하는 시험액 2 ㎖/kg(프레드니솔론: 20 mg/kg)을 유도 3시간 전에 복강내로 또는 피하로 투여하였다.

피하 반응이 일어난 부위에서 누출하는 색소를 추출하고 Harada등(J. Pharm. Pharmacol, 23, 218(1971))의 방법에 따라 다음과 같이 그 양을 측정하였다. 항원 주사 1 시간 후에 래트를 에테르로 마취하여 안락사시켰다. 래트의 4-시간 이종 PCA 반응 부위의 피부를 종은 범위로 절단하여, 0.3%(w/v)의 황산나트륨 수용액 3 부피 및 아세톤 7 부피의 혼합 용액에 24 시간 동안 침지시켰다. 색소 누출량을 측정하였다. 얻어진 값은 토끼 항난알부민이 주사된 부위당 색소 누출량(㎍)을 나타낸다.

누출 색소량을 측정하기 위한 시험의 대조예로서 디메틸 설폭사이드를 함유하고 약제를 함유하지 않는 전술한 아라비아 고무 수용액을 사용한 것을 제외하고는, 상기한 바와 동일한 절차를 반복하였다.

각각의 시험은 5마리의 래트를 사용하여 수행하였다 누출 색소량(㎍/부위)은 래트에 대해 얻어진 값의 평균으로 표시하였다.

복강내 투여의 시험 결과는 도 3에 제시한다. 피하 투여의 시험 결과는 도 4에 제시한다.

상기 도면으로부터 명백히 알 수 있는 바와 같이 본 발명의 펩티드를 함유하는 시험액을 투여한 군은 대조군과 비교하여 래트의 4-시간 이종 PCA 반응 부위에서 피부에 누출하는 색소량의 현저한 감소를 나타내며, 따라서 알레르기성 염증 억제 활성을 고레벨로 나타냈다.

본 발명의 펩티드를 함유하는 시험액을 투여한 군은 대조군과 비교하여 래트의 4-시간 이종 PCA 반응 부위에서 프레드니솔론을 함유하는 시험액보다 작은 용량으로 피부에 누출하는 색소량의 현저한 감소를 나타냈다. 즉, 본 발명의 펩티드는 프레드니솔론보다 높은 III형 알레르기성 염증 억제 활성을 가진다.

시험예 4

IV형 알레르기성 염증에 미치는 효과

본 발명의 펩티드가 래트의 IV형 알레르기성 염증(투베르쿨린 반응)에 미치는 효과는 하기 방법으로 검사하였다.

먼저, 펩티드의 최종 농도가 0.25 mg/㎖가 되도록 5 중량%의 아라비아 고무 수용액에 디메틸 설폭사이드 5 중량%를 첨가하여 얻은 용액내에 본 발명의 펩티드를 현탁시켰다. 대조 실험용으로 프레드니솔론의 농도가 25 mg/㎖가 되도록 5 중량%의 아라비아 고무 수용액에 디메틸 설폭사이드 5 중량%를 첨가하여 얻은 용액내에 프레드니솔론을 현탁시켰다. 이러한 방법으로 얻은 현탁액을 시험액으로서 사용하였다. 체중 170 내지 250 g의 수컷 위스타 래트를 시험 동물로서 사용하였다.

투베르쿨린 반응은 2 ㎖/kg의 시험액(본 발명의 펩티드: 0.5 mg/kg, 프레드니솔론: 50 mg/kg)을 유도 1 시간전에 복강내로 투여하는 것을 조건으로 Kuriyama등(Folia pharmacologica Japonica, 94, 113-118 (1989))의 방법에 따라 유도하였다. 유도 24 시간후에 홍반의 정도를 드레이즈(Draize)의 기준에 따라 측정하였다. 반응 부위는 직경 1.8 cm의 펀치로 표시하고, 피부 중량을 측정하였다.

시험의 대조예로서 전술한 시험액을 사용하는 대신에 디메틸 설폭사이드를 함유하고 약제를 함유하지 않는 전술한 아라비아 고무 수용액을 사용한 것을 제외하고는, 상기한 바와 동일한 절차를 반복하였다.

각각의 시험은 4마리의 래트를 사용하여 수행하였다. 홍반 강도와 피부 중량은 래트에 대해 얻은 값의 평균으로 표시하였다.

시험 결과는 도 5에 제시한다.

상기 도면으로부터 명백히 알 수 있는 바와 같이, 본 발명의 펩티드를 함유하는 시험액을 투여한 군은 대조군과 비교하여 홍반의 현저한 억제 및 피부 중량의 현저한 감소를 나타내며, 그 효과는 프레드니솔론을 투여한 군보다 높았다. 즉, 본 발명의 펩티드는 면역 염증인 IV형 알레르기성 염증(투베르쿨린 반응)에 대해 프레드니슬론보다 높은 억제 활성을 가진다.

시험예 5

비알레르기성 염증에 미치는 효과

본 발명의 펩티드가 래트의 카라게닌 각부 부종 반응에 미치는 효과는 다음 방법으로 검사하였다.

먼저, 펩티드의 최종 농도가 0.25 mg/㎖가 되도록 5 중량%의 아라비아 고무수용액에 디메틸 설폭사이드 5 중량%를 첨가하여 얻은 용액내에 본 발명의 펩티드를 현탁시켰다. 대조 실험용으로 아스피린 및 프레드니솔론의 농도가 각각 50 mg/㎖ 및 2.5 mg/㎖가 되도록 5 중량%의 아라비아 고무 수용액에 디메틸 설록사이드 5 중량%를 첨가하여 얻은 용액내에 아스피린 및 프레드니솔론을 개별적으로 현탁시켰다. 이러한 방법으로 얻은 현탁액을 시험액으로서 사용하였다. 체중 120 내지 200 g의 수컷 위스타 래트를 시험 동물로서 사용하였다.

래트의 우측 뒷다리의 부피는 체적변동 측정기로 측정하였다. 그 후 생리 식영수중의 0.1 ㎖의 1%(w/v) 카라게닌 용액을 래트의 우측 뒷다리 내부로 주사하여 카라게닌 각부 부종 반응을 유도하였다. 래트의 우측 뒷다리의 팽창도를 검사하기 위해, 래트의 우측 뒷다리의 부피를 각부 부종 반응의 유도후 1 내지 5 시간까지 1 시간마다 체적변동 측정기로 측정하고, 반응의 유도전의 부피와 반응의 유도 후의 부피 사이의 차이를 측정하였다.

본 발명의 펩티드를 투여한 군의 래트들에 대해서는, 본 발명의 펩티드를 함유하는 시험액 2 ㎖/kg(본 발명의 펩티드: 0.5 mg/kg)을 유도 24시간 전에 복강내로 투여하였다. 아스피린을 투여한 군의 래트들에 대해서는, 아스피린을 함유하는 시험액(아스피린: 100 mg/kg)을 유도 1시간 전에 복강내로 투여하였다. 프레드니솔론을 투여한 군의 래트들에 대해서는, 프레드니솔론을 함유하는 전술한 시험액 2㎖/kg(프레드니솔론: 5 mg/kg)을 유도 1시간 전에 복강내로 투여하였다.

래트의 우측 뒷다리각부의 팽창도를 검사하기 위한 시험의 대조예로서 디메틸 설폭사이드를 함유하고 약제를 함유하지 않는 전술한 아라비아 고무 수용액을사용한 것을 제외하고는, 상기한 바와 동일한 절차를 반복하였다.

각각의 시험은 5마리의 래트를 사용하여 수행하였다. 각부의 팽창도는 래트에 대해 얻은 값의 평균으로 표시하였다.

시험 결과는 도 6에 제시한다.

상기 도면으로부터 명백히 알 수 있는 바와 같이, 본 발명의 펩티드를 함유하는 시험액을 투여한 군은 대조군과 비교하여 우측 뒷다리각부의 팽창의 현저한 억제를 나타내며, 그 효과는 아스피린 또는 프레드니솔론을 투여한 군보다 높았다. 즉, 본 발명의 펩티드는 아스피린 및 프레드니솔론보다 높은 비알레르기성 염증 억제 활성을 가진다.

시험예 6

보조 관절염에 미치는 효과

본 발명의 펩티드가 래트의 보조 관절염에 미치는 효과를 하기 방법으로 검사하였다.

먼저, 펩티드의 최종 농도가 0.25 mg/㎖가 되도록 5 중량%의 아라비아 고무 수용액에 디메틸 설폭사이드 5 중량%를 첨가하여 얻은 용액내에 본 발명의 펩티드를 현탁시켰다. 대조 실험용으로 프레드니솔론의 농도가 각각 5 mg/㎖가 되도록 5 중량%의 아라비아 고무 수용액에 디메틸 설폭사이드 5 중량%를 첨가하여 얻은 용액내에 프레드니솔론을 현탁시켰다. 이러한 방법으로 얻은 현탁액을 시험액으로서 사용하였다. 체중 120 내지 200 g의 수컷 위스타 루이스 래트를 시험 동물로서 사용하였다.

먼저, 액체 파라핀중에 현탁된 마이코박테리움 튜버큘로시스(Mycobacterium tuberculosis) H37RA(6 mg/㎖) 0.1 ㎖를 래트의 우측 뒷다리 내로 피하 주사하였다. 그 후 전술한 시험액 2 ㎖/kg/일(본 발명의 펩티드: 0.5 mg/kg/일, 프레드니솔론: 10 mg/kg/일)을 마이코박테리움 주사후 22일 동안 일일 1회 복강내 투여하였다. 래트의 우측 및 좌측 뒷다리의 부피는 체적변동 측정기로 측정하였다. 그 후 마이코박테리움 주사전의 부피와 주사후의 부피차를 측정하였다. 그 차이가 팽창도로 정의된다.

래트의 좌우측 뒷다리의 팽창도를 검사하기 위한 시험의 대조예로서 시험액을 함유하는 전술한 액체 대신에 디메틸 설폭사이드를 함유하고 약제를 함유하지 않는 전술한 아라비아 고무 수용액을 사용한 것을 제외하고는, 상기한 바와 동일한 절차를 반복하였다.

각각의 시험은 7마리의 래트를 사용하여 수행하였다. 팽창도는 래트에 대해 얻은 값의 평균으로 표시하였다.

시험 결과는 도 7에 제시한다.

상기 도면으로부터 명백히 알 수 있는 바와 같이, 본 발명의 펩티드를 함유하는 시험액을 투여한 군은 대조군과 비교하여 좌우측 뒷다리각부의 팽창의 현저한 액체를 나타내며, 그 효과는 프레드니솔론을 투여한 군보다 훨씬 높았다. 즉, 본 발명의 펩티드는 면역성 만성 염증인 보조 관절염에 대해서 프레드니솔론보다 높은 효과를 가진다.

시험예 7

육아 증식 작용

펩티드의 최종 농도가 각각 5 ㎍/㎖ 50 ㎍/㎖ 500 ㎍/㎖ 및 5000 ㎍/㎖이 되도록 본 발명의 펩티드를 메탄올에 용해시켰다. 직경 8 mm의 페이퍼 디스크(어드밴텍 컴퍼니 리미티드에서 제조된 항생물질 분석용 여과지)내로 2회로 나누어서 진술한 농도의 각각의 메탄올 용액 20 ㎖를 함침시키고, 공기 건조시켜 메탄올을 제거하였다(본 발명의 펩티드: 0.1 ㎍/디스크 내지 100 ㎍/디스크).

체중 120 내지 200 g의 수컷 위스타 래트를 시험 동물로서 사용하였다.

에테르로 마취시켜 래트의 털을 깎고 외과용 칼로 래트의 등의 중앙선을 따라 약 3 cm 길이의 절개부를 형성하였다. 전술한 페이퍼 디스크를 절개부를 통해 피하에 매립하고, 절개부를 봉합하였다. 1주후에, 래트를 에테르로 마취하여 안락사 시켰다. 페이퍼 디스크를 피하 부위로부터 꺼내서 형성된 육아의 습윤 중량을 측정하였다.

페이퍼 디스크를 본 발명의 펩티드를 함유하지 않는 메탄올 20 ㎕로 함침시키고, 공기 건조시켰다. 그것을 대조예로서 사용하였다.

대조 약으로서 솔코세릴 주사액(다이호 파마슈티컬 컴퍼니 리미티드에서 제조) 25 ㎕(솔코세릴: 1mg/디스크)로 함침시킨 페이퍼 디스크를 사용하는 것을 제외하고는, 전술한 바와 동일한 절차를 반복하였다. 생리 식염수 25 ㎕ 함침시킨 페이퍼 디스크를 대조예로 사용하였다.

각각의 시험은 5마리의 래트를 사용하여 수행하였다. 육아의 습윤 중량은 래트에 대해 얻은 값의 평균으로 표시하였다.

시험 결과는 도 8에 제시한다.

상기 도면으로부터 명백히 알 수 있는 바와 같이, 본 발명의 펩티드 1 ㎍/디스크 이상을 함유하는 디스크가 매립된 군은 대조군 및 솔코세릴을 투여하는 기준군과 비교하여 육아의 습윤 중량의 현저한 증가를 나타냈다. 따라서, 본 발명의 펩티드는 세포 증식 효과를 가지는 것으로 이해된다. 본 발명의 펩티드 1 ㎍/디스크의 효과는 솔코세릴 1 mg/디스크의 효과를 능가하는 것으로 확인되었다.

시험예 8

래트에서 절개된 상처 모델에 미치는 효과

펩티드의 최종 농도가 각각 5 ㎍/㎖, 20 ㎍/㎖ 및 50 ㎍/㎖가 되도록 본 발명의 펩티드를 생리 식염수에 용해시켜 본 발명의 시험액을 조제하였다.

체중 250 내지 300 g의 수컷 위스타 래트를 시험 동물로서 사용하였다.

에테르로 마취시켜 래트의 털을 깎고 외과용 칼로 래트의 등의 중앙선을 수직으로 횡단하는 약 3 cm 길이의 절개부를 형성하였다. 절개부를 일정한 간격으로 3개 지점에서 봉합하였다. 3 시간후에, 각각의 시험액 0.5 ㎖(본 발명의 펩티드: 2.5 ㎍/절개부, 10 ㎍/절개부 및 25 ㎍/절개부)를 절개부 주위에 피하 투여하였다. 절개한 날 이후 3일 동안, 사용직전에 조제된 각각의 시험액 0.5 ㎖(본 발명의 펩티드: 2.5 ㎍/절개부, 10 ㎍/절개부 및 25 ㎍/절개부)를 일일 1회 절개부에 피하 투여하였다. 절개후 4일후에 래트를 에테르로 마취하여 안락사시켰다. 실밥을 뽑은 후, 절개부의 중앙부 2 cm를 포함하는 스트립내 피부 절편을 절단해냈다. 피부 절편의 연결 조직을 제거한 후, 절개부의 창상의 인장강도(g/cm)를 혈류계로 측정하였다.

대조예로서는 생리 식염수를 사용하였다.

대조약으로는 솔코세릴 주사액 0.5㎖ (솔코세릴: 20 mg/절개부, 다이호 파마슈티컬 컴퍼니 리미티드에서 제조)를 사용하였다.

각각의 시험은 15마리의 래트를 사용하여 수행하였다. 창상 인장 강도(g/cm)는 래트에 대해 얻은 값의 평균으로 표시하였다.

시험 결과는 도 9에 제시한다.

상기 도면으로부터 명백히 알 수 있는 바와 같이, 본 발명의 펩티드를 투여한 군은 대조군 및 솔코세릴을 투여하는 기준군과 비교하여 창상의 인장강도의 현저한 증가를 나타냈다. 즉, 본 발명의 펩티드는 솔코세릴 주사액보다 높은 창상-치유 촉진 효과를 나타내는 것으로 확인되었다.

시험예 9

래트의 피부 결함 모델에 미치는 효과

본 발명의 펩티드를 연고 베이스(다이호 파마슈티컬 컴퍼니 리미티드에서 제조제는 플라스티베이스)와 혼합하여 본 발명의 펩티드를 0.02대% 함유하는 연고를 제조하였다.

체중 250 내지 300 g의 수컷 위스타 래트를 시험 동물로서 사용하였다.

덱사메타손(1 mg/kg)을 결함 형성 이틀전부히 3일 동안 해즈에게 복강내 투여하였다. 래트를 에테르로 마취하여 눕혀 놓고 털을 깎았다. 등의 피부는 확장되었고, 두 개의 피부 결함을 래트의 등의 중앙선에 대해 대칭 부위에 펀치(내경 16mm)를 사용하여 형성하였다. 사용 직전에 제조된 연고 50 mg(본 발명의 펩티드 10 ㎍ 함유)으로 코팅한 멸균 여과지(25×25 mm) 한 장을 피부 결함마다 덮었다. 여과지는 테가덤(3엠 컴퍼니 리미티드에서 제조된 드레싱)으로, 그리고 여과지를 고정시키기 위한 접착제 탄성 붕대로 추가로 덮었다. 치유될 때까지 일일 1회 연고를 투여하였다. 각각의 결함의 소축 및 주축을 결함 형성일로부터 치유일까지 슬라이드 게이지로 측정하고, 타원을 형성하는 결함 영역을 측정하였다.

대조예로서 연고 베이스(다이쇼 파마슈티컬 컴퍼니 리미티드에서 제조되는 플라스티베이스)만을 사용하는 것을 제외하고는, 전술한 바와 동일한 절차를 반복하였다.

대조약으로서, 을세논 연고 50 mg(토코레티네이트: 125 ㎍/결함, 레덜 저팬 리미티드에서 제조)를 사용하였다.

각각의 시험은 7마리의 래트를 사용하여 수행하였다. 결함 영역은 래트에 대해 얻은 14개의 결함 영역의 평균으로 나타냈다. 시험에서 시간에 따른 결함 영역의 변화는 도 10 및 11에 제시한다. 시험에서 완전 치유일은 표 15에 제시한다.

^**p<0.01 대조군에 대해 유의 수준의 차이

도 10 및 11과 표 15로부터 명백히 알 수 있는 바와 같이, 본 발명의 펩티드를 투여한 군은 대조군과 비교하여 결함 영역의 감소 및 평균 완전 치유일의 단축에 있어 상당한 효과를 나타냈다. 본 발명의 펩티드를 투여한 군은 또한 기준군(올세논 연고)과 비교하여 결함 영역의 현저한 감소 효과 및 평균 완전 치유일의 단축을 나타냈다. 따라서, 본 발명의 펩티드는 현저한 상처 치유 촉진 효과를 나타내는 것으로 이해되었다.

시험예 10 독성 시험

래트에 대한 본 발명의 독성은 하기 방법으로 검사하였다. 먼저, 5 중량%의 아라비아 고무 수용액에 디메틸 설폭사이드 5 중량%를 첨가하여 얻은 용액에 본 발명의 펩티드를 현탁시켜 시험액을 제조하였다. 체중 120 내지 200 g의 수컷 위스타 래트를 시험 동물로 사용하였다.

그 후 시험액을 래트에게 피하 투여하여 래트의 상태를 관찰하였다. 결국, 래트는 20 mg/kg의 본 발명의 펩티드를 각각의 래트에게 투여하는 경우에도 죽지않았다.

본 발명은 화학식 1로 표시되는 신규의 펩티드를 제공한다. 본 발명의 신규의 펩티드는 알레르기성 및 비알레르기성 염증 억제 효과, 항균 효과, 항종양 효과 및 창상 치유 효과를 나타내며 염증 억제제, 면역억제제 항균제, 항종양제, 창상 치유제, 항궤양제등으로 유용하다. 따라서, 본 발명은 또한 전술한 약리학적 효과를 가진 치료제를 제공한다.

Claims (17)

1. 하기 화학식 1로 표시되는 신규 펩티드:

   화학식 1

   
2. 제1항에 따른 화학식 1로 표시되는 펩티드를 함유하는 항생물질.
3. 제1항에 따른 화학식 1로 표시되는 펩티드를 함유하는 항균제.
4. 제1항에 따른 화학식 1로 표시되는 펩티드를 함유하는 항염증성 물질.
5. 제1항에 따른 화학식 1로 표시되는 펩티드를 함유하는 항염증제.
6. 제1항에 따른 화학식 1로 표시되는 펩티드를 함유하는 창상 치유 물질.
7. 제1항에 따른 화학식 1로 표시되는 펩티드를 함유하는 항궤양제.
8. 제1항에 있어서, 방선균 에스. 노빌리스(Actinomyces S. nobilis)를 배양하여 얻은 배양배지, 배지의 건조 생성물 또는 배양된 박테리아로부터 유기 용매를 사용하여 추출한 추출물을 다양한 칼럼 크로마토그래피에 의해 정제함으로써 얻어지는 화학식 1의 펩티드.
9. 제8항에 있어서, 칼럼 크로마토그래피용 충전제가 옥타데실실란으로 개질시킨 실리카겔을 포함하는 것인 화학식 1의 펩티드.
10. 제9항에 있어서, 칼럼 크로마토그래피의 용출 용매의 극성도가 메탄올-아세토니트릴(1:1)의 혼합 용매를 함유하는 70% 수용액의 극성과 메탄올-아세토니트릴-물(19:19:2)의 극성 사이인 것인 화학식 1의 펩티드.
11. 제10항에 있어서, 메탄올-아세토니트릴(1:1)의 혼합 용매를 함유하는 70% 수용액의 극성과 메탄올-아세토니트릴-물(19:19:2)의 극성 사이값을 갖는 극성도를 가진 2종 이상의 용출 용매가 칼럼을 통해 순서대로 흐르도록 하여 제조된 것이 특징인 화학식 1의 펩티드.
12. 제1항에 따른 화학식 1로 표시되는 펩티드를 함유하는 창상 치유제.
13. 방선균 에스. 노빌리스를 배양하는 단계, 얻어진 배양배지, 배지의 건조 생성물 또는 배양된 박테리아를 유기 용매를 사용하여 추출하는 단계 및 얻어진 추출물을 옥타데실실란으로 개질시킨 실리카겔을 포함하는 충전제를 사용하여 칼럼 크로마토그래피에 의해 정제하는 단계를 포함하는 제1항에 따른 펩티드의 제조 방법.
14. 제13항에 있어서, 칼럼 크로마토그래피의 용출 용매의 극성도가 메탄올-아세토니트릴(1:1)의 혼합 용매를 함유하는 70% 수용액의 극성과 메탄올-아세토니트릴-물(19:19:2)의 극성 사이인 것인 제1항에 따른 펩티드의 제조 방법.
15. 제14항에 있어서, 메탄올-아세토니트릴(1:1)의 혼합 용매를 함유하는 70% 수용액의 극성과 메탄올-아세토니트릴-물(19:19:2)의 극성 사이값을 갖는 극성도를 가진 2종 이상의 용출 용매가 칼럼을 통해 순서대로 흐르도록 하여 제조된 것이 특징인 제1항에 따른 펩티드의 제조 방법.
16. 제13항에 있어서, 방선균 에스. 노빌리스가 이화학 연구소(Institute of Physical and Chemical Research)의 보존균(JCM4274) 미국에서의 보존균 ATCC19252 또는 네덜란드에서의 보존균 CBS198.65인 제조 방법.
17. 제13항 또는 제16항에 있어서, 에스. 노빌리스의 배양 배지의 추출액, 건조된 생성물의 추출액 또는 그 박테리아 자체의 추출액을 황산암모늄으로 처리하고, 얻어진 침전물을 용매로 추출하는 것인 제1항의 펩티드의 제조 방법.

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