JP3148852B2 - 新規抗炎症剤 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は新規ペプチドを有効成分
として含む抗炎症剤に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】炎症反応は非アレルギー性炎症とアレル
ギー性炎症に大別される。カラゲニン浮腫に代表される
ような非アレルギー性炎症には、アスピリン（日経サイ
エンス、３巻、７０頁、１９９１年）やインドメタシン
（Ther. Res., ３巻、１０５７頁、１９８５年）などの
非ステロイド性抗炎症剤およびプレドニゾロンなどのス
テロイド性抗炎症剤が有効である。一方、アレルギー性
炎症はＩ〜IV型に大別され、Ｉ型反応はアトピー性皮膚
炎、喘息、鼻炎の他様々なアレルギー性疾患に関わって
いる。また、II型反応、III 型反応（免疫複合体反応：
アルサス反応）およびIV型反応（細胞性免疫反応：遅延
型過敏反応）は慢性関節リウマチのような自己免疫疾
患、さらには肝炎、腎炎、皮膚炎、感染症、溶血性貧
血、インスリン依存性糖尿病のような様々な炎症反応性
疾患の発症進展に重要な役割を演じていることが明らか
となってきた。これらのアレルギー性炎症には、プレド
ニゾロンなどのステロイド性抗炎症剤が有効である。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】アレルギー性炎症に有
効なステロイド性抗炎症剤は感染防御機能の低下、消化
管障害、下垂体副腎皮質機能の抑制、骨形成の低下など
副作用の点で問題がある。また、ステロイド剤に比べて
安全性が高いと考えられている非ステロイド性抗炎症剤
は、アレルギー性炎症に対する抑制作用が極めて弱いと
いう問題点がある。そこで、より有効でかつ毒性の少な
い抗炎症剤が望まれている。

【０００４】本発明の目的は、上記の点に鑑み、アレル
ギー性炎症および非アレルギー性炎症に有効で、有用性
の高い新規抗炎症物質を提供することにある。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明により、

【化３】 で示される新規ペプチド（以下、本発明ペプチドとい
う）からなる抗炎症物質（以下、本発明抗炎症物質とい
う）を有効成分として含む抗炎症剤が提供される。

【０００６】本発明抗炎症物質は、ストレプトマイセス
属に属する本発明抗炎症物質生産菌株、例えば、放線菌
ストレプトマイセス・ノビリス（Streptomyces nobili
s、以下「Ｓ．ノビリス」と略記する）を培養し、得ら
れた培養液または同液の乾固物もしくは培養菌体から有
機溶剤によって抽出された抽出物を、各種カラムクロマ
トグラフィーに付し、目的物を含むカラムクロマトグラ
フィー画分を再結晶処理することにより得られる。

【０００７】本発明抗炎症物質を生産する放線菌Ｓ．ノ
ビリスは、公的保存機関から入手可能であり、たとえば
理化学研究所の保存菌（ＪＣＭ４２７４）（これは米国
においてＡＴＣＣ１９２５２およびオランダにおいてＣ
ＢＳ１９８．６５としても保存）などの菌が使用でき
る。

【０００８】放線菌Ｓ．ノビリスの培養は、然るべき栄
養物を含んだ培地を用いて行う。液体培養の場合、その
培地の成分としてはブドウ糖などの糖類、ペプトンや麦
芽エキスなどのタンパク質類、ビタミン類、核酸類、ア
ミノ酸類、複合糖質類の一種または数種を含んだ水溶液
が好適に用いられる。代表的な培地例としては、澱粉・
アンモニウム系の液体培地（可溶性澱粉、Ｋ₂ ＨＰ
Ｏ₄ 、ＮＨ₄ Ｃｌを含む）が挙げられる。液体培地のｐ
Ｈは２〜９が好ましく、培養温度は１５〜４２℃が好ま
しい。また液体培養の好ましい培養時間は１〜１４日で
ある。こうして得たＳ．ノビリスの培養液またはその乾
固物もしくは菌体自体から溶剤を用いて本発明ペプチド
を抽出する。

【０００９】Ｓ．ノビリスの培養液またはその乾固物も
しくは菌体自体の抽出液を硫安処理し、得られた沈殿物
を溶媒抽出してもよい。硫安処理に際しては、培養液ま
たはその乾固物もしくは菌体自体の抽出液に添加する硫
安は、固体のままの状態でもよいし、溶液状態のもので
もよい。硫安の添加量は好ましくは飽和濃度の３０〜９
０重量％の範囲である。処理時間は特に限定されない
が、好ましくは３０分〜５時間の範囲である。沈殿物を
得るための遠心分離に際しては、遠心力が３，０００Ｇ
〜２０，０００Ｇであることが好ましく、遠心時間は２
〜６０分であることが好ましい。

【００１０】抽出に用いる溶剤としては有機溶剤が好ま
しく、その代表例としては、酢酸エチルなどのエステル
類、メタノール、エタノール、プロパノールなどのアル
コール類、エチルエーテル、ジオキサンなどのエーテル
類、アセトン、メチルエチルケトンなどのケトン類のほ
かジクロロメタン、クロロホルムなどが挙げられるが、
使用可能な溶剤はこれらに限定されない。また、上記溶
剤の混合物を用いることもできる。特に好適な溶剤は酢
酸エチル、ジクロロメタン、アセトンなどである。抽出
時間は溶剤の種類や抽出温度などによっても異なるが、
好ましくは３〜１２０分の範囲である。また抽出中は液
を静置してもまたは攪拌してもよい。好ましくは、同一
試料に対して抽出操作を複数回繰り返す。抽出温度は特
に制限されない。

【００１１】次に、溶剤抽出物に対するカラムクロマト
グラフィーについて述べる。

【００１２】カラムクロマトグラフィーの充填剤として
は、ＯＤＳ（オクタデシルジメチルクロロシランのよう
なオクタデシルシラン類）が好ましい。充填量は特に限
定されないが、チャージする溶剤抽出物に対する重量比
１０〜５００倍量を充填することが好ましい。溶剤抽出
物をカラムにチャージする際はまずＯＤＳに吸着させる
ことが好ましい。このときＯＤＳの量は特に限定されな
いが、好ましくは吸着させる溶剤抽出物に対する重量比
０．５〜２０倍量のＯＤＳを用いてこれに抽出物を吸着
させた後、この抽出物吸着ＯＤＳを少量の溶剤に懸濁し
てからカラムにチャージする。溶出溶媒は特に限定され
ないが、好ましくは極性がメタノール：アセトニトリル
＝１：１混合溶剤を８０％（ｖ／ｖ）含む水溶液からメ
タノールの間にある溶剤を用いる。

【００１３】次に、本発明ペプチドの再結晶による精製
について述べる。

【００１４】再結晶に用いる溶剤は、本発明ペプチドを
溶かす溶剤であれば特に限定されないが、好ましくはメ
タノール、エタノールなどである。再結晶の方法として
は、当該物質を含有するカラム溶出画分を加熱下で少量
の溶剤に溶かし、得られた溶液を徐々に冷やしてこの物
質を再結晶させてもよいし、当該物質を含有するカラム
溶出画分を当該物質の溶解性の高い溶剤に溶かし、そこ
に当該物質の溶解性の低い液（例えば水）を徐々に加え
てこの物質を再結晶させてもよい。

【００１５】本発明ペプチドは、後述する薬理試験の結
果から分かるように、アレルギー性、非アレルギー性炎
症に有効である抗炎症物質である。

【００１６】本発明抗炎症物質を製剤化するには、通常
はこれを製剤用担体とともに製剤組成物の形態とする。
担体としては剤形に応じた薬剤を調製するのに通常使用
される充填剤、崩壊剤、増量剤、結合剤、着色剤、矯味
矯臭剤、ｐＨ調整剤、可溶化剤、懸濁化剤、緩衝剤、安
定化剤、保存剤、付質剤、表面活性剤、滑沢剤、賦形剤
が例示される。また適当な溶剤を選定することにより、
得られた本発明抗炎症物質をそのままの形態で外用液剤
として使用することもできる。

【００１７】本発明抗炎症物質を用いて製剤化される抗
炎症剤の投与単位形態としては、上記のごとき外用液剤
のほか、錠剤、丸剤、飲用液剤、散剤、懸濁剤、乳剤、
顆粒剤、エキス剤、細粒剤、シロップ剤、浸剤、煎剤、
点眼剤、トローチ剤、パップ剤、リニメント剤、ローシ
ョン剤、眼軟膏剤、硬膏剤、カプセル剤、坐剤、注射剤
（液剤、懸濁剤など）、貼付剤、軟膏剤、吸入剤、クリ
ーム剤、スプレー剤、点鼻剤などが例示される。

【００１８】抗炎症剤中に含有すべき本発明抗炎症物質
の量は、特に限定されず広範囲に適宜選択されるが、好
ましくは抗炎症剤中に１０^-10 〜５０重量％の範囲であ
る。本発明抗炎症物質より得られた抗炎症剤は、その使
用に際し各種形態に応じた方法で投与される。たとえば
上記のごとき外用液剤の場合には、これを皮膚ないしは
粘膜などの所要部位に直接塗布し、錠剤、丸剤、飲用液
剤、懸濁剤、乳剤、顆粒剤およびカプセル剤の場合には
経口投与され、注射剤の場合には静脈内、筋肉内、皮
内、皮下もしくは腹腔内投与され、坐剤の場合には直腸
内投与され、また貼付剤、軟膏剤、クリーム剤の場合に
は貼付または塗布され、吸入剤、点鼻剤の場合は吸入さ
れ、スプレー剤の場合は吸入もしくは塗布される。

【００１９】本発明抗炎症物質より得られた抗炎症剤の
投与量は、使用目的、症状などにより適宜選択される
が、通常は１日当り本発明抗炎症物質として１ｆｇ／ｋ
ｇ〜５０ｍｇ／ｋｇ程度の範囲である。また上記製剤組
成物を１〜４回／日に分けて投与することももちろん差
し支えない。

【００２０】

【実施例】実施例１ 理化学研究所から入手した放線菌Ｓ．ノビリス（ＪＣＭ
４２７４）を、酵母エキス０．２％（ｗ／ｖ）添加澱粉
・アンモニウム培地１００ｍｌ中で４０時間振盪培養
（前々培養）し、続いて同培地３リットルに前々培養菌
液６０ｍｌを接種し、２５時間振盪培養（種培養）し
た。さらに澱粉・アンモニウム培地（蒸留水１００ｍｌ
中に可溶性澱粉を１ｇ、リン酸水素二カリウムを０．０
５ｇ、塩化アンモニウムを０．０５ｇ含む）２８５リッ
トルに種培養した全量を接種し、約３０℃で８日間振盪
培養した。この培養液を遠心分離し、得られた上清液２
５０リットルに硫酸アンモニウムを上清１リットル当た
り６６２ｇ添加し、１時間攪拌した。続いて２０，００
０Ｇ（流速３６０−５００リットル／時間）で連続的に
遠心分離を行い、約１２ｋｇの沈殿物を得た。

【００２１】上記により得られた沈殿物１．２ｋｇに水
３．６リットルを添加し、８０℃で３０分間攪拌した。
次に等量の酢酸エチルを添加し、１０分間振盪後、全体
を５，０００Ｇで１０分間遠心した。酢酸エチル相を分
離後、水相について本操作を数回繰り返し、溶剤抽出物
を得た。

【００２２】次に、上記により得られた溶剤抽出物を、
ＯＤＳ（オクタデシルジメチルクロロシラン）担体２５
ｇに吸着させた。ついで、ＯＤＳ担体２７５ｇを充填し
た径３．２ｃｍのカラム内の上記担体上に上記抽出物吸
着担体をチャージし、ＯＤＳカラムを作成した。このＯ
ＤＳカラムを用いて下記の条件で精製を行なった。溶出
溶剤としてａ）メタノール：アセトニトリル：水＝７：
７：６を１．５リットル、ｂ）メタノール：アセトニト
リル：水＝８：８：４を１．２リットル、ｃ）メタノー
ル：アセトニトリル：水＝９：９：２を１５０ｍｌ、
ｄ）メタノール：アセトニトリル：水＝１９：１９：２
を１リットル、ｅ）メタノールを１リットル、この順に
流速１０．５ｍｌ／分で流した。分画は、溶剤組成を変
更する毎に行い、特にメタノール：アセトニトリル：水
＝１９：１９：２の溶出画分は、適宜フラクションコレ
クターを用いて少量ずつ（２分間ずつ）分画した。各溶
出画分について、ＯＤＳ−８０ＴＭ、内径４．６ｍｍ×
長さ２５．０ｃｍの東ソー社製のカラムを用いたＨＰＬ
Ｃ（日立社製、ポンプＬ−６０００Ｌ−６２００、検出
器Ｌ−３０００、カラムオープン６５５Ａ−５２）にお
いて、検出波長２１０ｎｍ、カラム温度４０℃、流速１
ｍｌ／分の条件で、溶離液として水：アセトニトリル：
メタノール＝６：７：７（０分）〜０：１：１（３０
分）を用いて分析を行った。上記画分のうちリテンショ
ンタイムが１８〜２０分のピークを含むもののみを集
め、同一画分とし（１００ｍｇ）、メタノール−水を用
いて繰り返し再結晶を行い、針状結晶４５ｍｇを得た。

【００２３】この物質の構造は、種々の機器分析データ
より式［Ｉ］であると決定した。

【００２４】実施例２ 実施例１と同様にして培養を行い、得られた菌体２１５
ｇ（湿重量）にジクロロメタン２．１５リットルを加
え、３０分間超音波処理をした後、さらにジクロロメタ
ン８．６リットルを添加し、全体を室温で１時間攪拌し
た。菌体を濾別後、得られた濾液を濃縮乾固した。この
抽出物の乾固物を少量のヘキサンに溶解した後、ヘキサ
ン相をメタノールで３回抽出処理した。ヘキサン不溶物
とメタノール抽出物をメタノールに再溶解した。

【００２５】次に、上記により得られた溶剤抽出物を、
ＯＤＳ担体２８ｇに吸着させた。ついで、ＯＤＳ担体２
７５ｇを充填した径３．２ｃｍのカラム内の上記担体上
に上記抽出物吸着担体約３０ｇをチャージし、ＯＤＳカ
ラムを作成した。このＯＤＳカラムを用いて下記の条件
で精製を行なった。溶出溶剤としてａ）メタノール：ア
セトニトリル：水＝７：７：６を１．５リットル、ｂ）
メタノール：アセトニトリル：水＝８：８：４を１．２
リットル、ｃ）メタノール：アセトニトリル：水＝９：
９：２を２００ｍｌ、ｄ）メタノール：アセトニトリ
ル：水＝１９：１９：２を１リットル、ｅ）メタノール
を５００ｍｌ、この順に流速１０．５ｍｌ／分で流し
た。分画は、溶剤組成を変更する毎に行い、特にメタノ
ール：アセトニトリル：水＝１９：１９：２の溶出画分
は、適宜フラクションコレクターを用いて少量ずつ（２
分間ずつ）分画した。各溶出画分について、ＯＤＳ−８
０ＴＭ、内径４．６ｍｍ×長さ２５．０ｃｍの東ソー社
製のカラムを用いたＨＰＬＣ（日立社製、ポンプＬ−６
０００Ｌ−６２００、検出器Ｌ−３０００、カラムオー
プン６５５Ａ−５２）において、検出波長２１０ｎｍ、
カラム温度４０℃、流速１ｍｌ／分の条件で、溶離液と
して水：アセトニトリル：メタノール＝６：７：７（０
分）〜０：１：１（３０分）を用いて分析を行った。上
記画分のうちリテンションタイムが１８〜２０分のピー
クを含むもののみを集め、同一画分とし（８４０ｍ
ｇ）、メタノール−水を用いて繰り返し再結晶を行い、
針状結晶の本発明ペプチド３３０ｍｇを得た。

【００２６】この物質の構造は、実施例１と同様にして
種々の機器分析データより式［Ｉ］であると決定した。

【００２７】構造分析データ 実施例１および２で得られた物質の機器分析データを以
下に示す。

【００２８】

【表１】１．ＭＳ ・ＥＳＩ−ＭＳ：ｍ／ｚ＝９１３．６（Ｍ＋Ｈ−Ｈ
₂ Ｏ）⁺ ，９３１．６（Ｍ＋Ｈ）⁺ ，９５３．６（Ｍ＋
Ｎａ）⁺

【表２】・ＨＲＦＡＢ−ＭＳ Found ： ｍ／ｚ＝９１３．５０７９（Ｍ＋Ｈ−Ｈ
₂ Ｏ）⁺ ，ｍ／ｚ＝９１３，９５３，９３１（９１３が
メイン，９３１は非常に小さい） Calcd for ： Ｃ₄₅Ｈ₆₉Ｎ₈ Ｏ₁₂ ｍ／ｚ＝９１３．５０５３

【表３】２．ＩＲ ＩＲ： ３，４００ｃｍ^-1：−ＯＨ, −ＮＨ，２，９０
０ｃｍ^-1：アルキル基，１，７５０ｃｍ^-1：−Ｃ（＝
Ｏ）−Ｏ−，１，６５０ｃｍ^-1：−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−

【００２９】３．アミノ酸分析 加水分解物としてＤ−セリン、Ｌ−アラニンおよびＤ−
Ｎ−メチル−フェニルアラニンが認められた。

【００３０】４．組成式 質量分析と後述するＮＭＲのデータから新規ペプチドの
組成式はＣ₄₅Ｈ₇₀Ｎ₈Ｏ₁₃であることが分かった。

【００３１】５．ＮＭＲ ａ）部分構造Ａについて ＨＭＢＣスペクトル測定の結果、アラニン（Ａｌａ）の
カルボニル炭素（１７３．６ｐｐｍ）とＮ−ＣＨ₃ −フ
ェニルアラニン（Ｐｈｅ）のＣＨ₃ （３．０４ｐｐｍ）
とにロングレンジの相関が観測されたことにより、Ａの
部分構造が推定された。

【００３２】ｂ）部分構造Ｂ、Ｃについて¹ Ｈ− ¹Ｈ COSY,HOHAHA から同様のスピン系を持つ２
つの成分が推定された。

【００３３】

【表４】ｉ） ＮＨ(4.38ppm） ＣＨ₂ （46.1 , 2.89 , 3.15ppm ） ＣＨ₂ （21.3 , 1.45 , 1.63ppm ） ＣＨ₂ （24.2 , 1.93 , 2.25ppm ） ＣＨ（51.7 , 4.90ppm） ii） ＮＨ（3.93ppm ） ＣＨ₂ （47.9 , 2.56 , 3.30ppm ） ＣＨ₂ （21.5 , 1.55 , 1.66ppm ） ＣＨ₂ （24.4 , 1.67 , 2.58ppm ） ＣＨ（52.5 , 5.18ppm）

【００３４】両者の¹³Ｃシフトはよく一致しているので
同じ構造のもの（残基）と考えられる。さらに、ＣＨ₂
プロトンが非等価であることから環状構造と推定でき
る。

【００３５】このシフトはモナマイシン（Monamycin ）
に含まれれるPiperazic acid(Pip）のものに合うことか
ら、この成分はＰｉｐ（部分構造Ｂの左の部分と部分構
造Ｃ）と推定された。

【００３６】

【表５】 α β γ δ Ｐｉｐ¹⁾ 49.8 24.1 21.0 47.0 （ＣＤＣｌ₃ 溶液） 実測値 52-53 24-25 21 46-48 （ＣＤＣｌ₃ 溶液）

【００３７】また、セリン（Ｓｅｒ）の６．４０ｐｐｍ
のＮＨとＰｉｐの１６８．９ｐｐｍのカルボニルの間に
ロングレンジが観測されたことにより、部分構造Ｂが推
定された。

【００３８】1) C.H.Hassall, W.A.Thomas, M.C.Mosch
idis，J.Chem.Soc.,Perkin Trans.I, 1977, 2371(1977)

【００３９】ｃ）部分構造Ｄについて¹ Ｈ− ¹Ｈスピン結合から（ＣＨ₃ ）₂ −ＣＨ−ＣＨ−
ＣＨ−ＮＨ−なる部分構造が導かれ、ロングレンジの ¹
Ｈ−¹³Ｃ結合によりこの部分構造が確認され、また、１
７０．６ｐｐｍのカルボニルと４．８８ｐｐｍのＣＨと
のスピン結合から、β−ＯＨ−ロイシン（Ｌｅｕ）の構
造がわかり、５．４６ｐｐｍのＣＨからβ−ＯＨ−Ｌｅ
ｕがそのβ位でエステル結合していることが推定され
た。

【００４０】¹Ｈ− ¹Ｈスピン結合、ロングレンジの ¹
Ｈ−¹³Ｃ結合およびＮＯＥ(NuclearOverhauser Effect)
の測定結果より、部分構造Ｄの側鎖部（左）の部分構
造がわかった。

【００４１】ロングレンジの ¹Ｈ−¹³Ｃ結合から、β−
ＯＨ−Ｌｅｕの４．８８ｐｐｍのＣＨおよび８．３４ｐ
ｐｍのＮＨと側鎖部の１７７ｐｐｍのカルボニルとにロ
ングレンジの相関が観測されたことにより部分構造Ｄが
推定された。

【００４２】ｄ）新規ペプチドの化学構造について ロングレンジの ¹Ｈ−¹³Ｃ結合から、Ｓｅｒの１７０．
２ｐｐｍのカルボニルとβ−ＯＨ−Ｌｅｕの５．４６ｐ
ｐｍのＣＨとにロングレンジ相関が観測されたことによ
り、部分構造Ｂと部分構造ＤがＳｅｒとβ−ＯＨ−Ｌｅ
ｕの間でエステル結合していることがわかった。また、
β−ＯＨ−Ｌｅｕの５．４６ｐｐｍのＣＨとＰｉｐ（部
分構造Ｃ）の４．３８ｐｐｍのＮＨ、β−ＯＨ−Ｌｅｕ
の８．３４ｐｐｍのＮＨとＰｉｐ（部分構造Ｃ）の２．
８９ｐｐｍのＣＨ₂ ，４．９０ｐｐｍのＣＨとにＮＯＥ
が観測されたことから、部分構造Ｃがβ−ＯＨ−Ｌｅｕ
の１７０．６ｐｐｍのカルボニル基に結合していること
がわかった。残る部分構造Ａの結合方法は一通りであ
り、新規ペプチドの化学構造を決定した。

【００４３】また、Ｓｅｒの６．４０ｐｐｍとＮＨとＮ
−ＣＨ₃ −Ｐｈｅの３．０４ｐｐｍのＣＨ₃ の間にもＮ
ＯＥが観測されていることから、上記構造が正しいこと
が示唆されている。

【００４４】ｅ）ＮＭＲの測定結果は下記の通りであ
る。

【００４５】表６と表７は¹³Ｃシフトと炭素タイプ、お
よび直接結合する ¹Ｈを示し、表８〜表１０は ¹Ｈシフ
ト、スピン結合する ¹Ｈ、¹³Ｃ、およびロングレンジ結
合する¹³Ｃを示し、表１１と表１２はＮＯＥ測定結果を
示し、表１３〜表１６は¹³Ｃおよび ¹Ｈの帰属を示す。

【００４６】

【表６】

【表７】

【表８】

【表９】

【表１０】

【表１１】

【表１２】

【表１３】

【表１４】

【表１５】

【表１６】

【化４】

【化５】

【化６】

【化７】

【化８】 薬理試験試験例１ Ｉ型アレルギー性炎症に対する作用 ｉ） ラット抗２，４−ジニトロベンゼンスルホン酸−
ブタ回虫抽出物（ＤＮＰ−Ａｓ）血清の調製 Tada and Okumuraの方法（Journal of Immunology 、１
０６巻、１００２頁、１９７１年）に準じてＤＮＰ−Ａ
ｓを調製した。ブタ回虫（Ascaris suum）の抽出物を、
Strejan and Campbellの方法（Journal of Immunology
、９８巻、８９３頁、１９６７年）に従って調製し、E
isen らの方法（Journal of American Chemical Societ
y、７５巻、４５８３頁、１９５３年）で、２，４−ジ
ニトロベンゼンスルホン酸（ＤＮＰ）と結合させた。こ
のＤＮＰ−Ａｓの１ｍｇを１０¹⁰個の百日咳死菌を浮遊
させた生理食塩水１ｍｌに溶解し、体重２００ｇ前後の
雌性ラットの四肢足蹠皮下に注射した。５日後、ＤＮＰ
−Ａｓの０．５ｍｇを生理食塩水の０．５ｍｌに溶解
し、左右の背部筋肉内に注射した。初回注射の８日後に
腹部大動脈より採血し、血清を分離してラット抗ＤＮＰ
−Ａｓ血清として使用した。なお、この抗血清のラット
４８時間同種ＰＣＡ反応の力価は１：５１２であった。

【００４７】ii）ラット４８時間同種ＰＣＡ反応（Ｉ型
アレルギー性皮膚反応）に対する作用 本発明ペプチドを０．２５ｍｇ／ｍｌになるように、５
重量％アラビアゴム水溶液にジメチルスルホキサイドを
５重量％添加してなる溶液に懸濁した。なお、対照実験
用としてプレドニゾロンを１０ｍｇ／ｍｌとなるように
５重量％アラビアゴム水溶液にジメチルスルホキサイド
を５重量％添加してなる溶液に懸濁した。このようにし
て得られた懸濁液を供試液とした。被験動物としては体
重１２０ｇ〜２００ｇのウイスター雄性ラットを用い
た。

【００４８】まず、上記抗ＤＮＰ−Ａｓ血清を生理食塩
水で２０倍に希釈してなる注射液０．０５ｍｌを、上記
ラットの背部皮内に注射し、ラットを上記抗血清で感作
した。

【００４９】次に、抗血清投与の４８時間後に、対応す
る抗原として２ｍｇ／ｍｌのＤＮＰ−Ａｓを含む０．５
重量％エバンスブルー生理食塩液を２．５ｍｌ／ｋｇ静
脈内投与して、ＰＣＡ反応を誘発した。

【００５０】本発明ペプチド投与群のラットにおいては
本発明ペプチドを含有する上記供試液２ｍｌ／ｋｇ（本
発明ペプチド０．５ｍｇ／ｋｇ）を誘発の２４時間前に
腹腔内投与もしくは皮下投与した。また、プレドニゾロ
ン投与群のラットにおいてはプレドニゾロンを含有する
上記供試液２ｍｌ／ｋｇ（プレドニドロン２０ｍｇ／ｋ
ｇ）を誘発の３時間前に腹腔内投与もしくは皮下投与し
た。

【００５１】こうして皮内反応を惹起した部位の色素漏
出を、Haradaらの方法（J. Pharm.Pharmacol. ２３巻、
２１８頁、１９７１年）に従って抽出定量した。即ち、
抗原注射の１時間後に動物を屠殺し、ＰＣＡ反応部の皮
膚を細切し、これを０．３％（Ｗ／Ｖ）硫酸ナトリウム
水溶液３容とアセトン７容の混合液中に２４時間浸漬
し、漏出色素量を求め、これを抗血清を注射した部位
（site）当たりの漏出色素量（μｇ）として表した。こ
の試験のコントロールとして、薬物を含まない上記ジメ
チルスルホキサイド含有アラビアゴム水溶液を用い、そ
の他の点は上記操作と同様に行って漏出色素量を求め
た。

【００５２】本試験は、それぞれ５匹のラットを用いて
行い、漏出色素量（μｇ／site）はこれらラットについ
て得られた値の平均値を取った。

【００５３】この試験結果を図１に示す。

【００５４】この図から明らかなように、本発明ペプチ
ドを含有する供試液を投与した群は、コントロール群に
比べ、ラット４８時間同種ＰＣＡ反応部の皮膚に漏出す
る色素量が大幅に減少し、顕著なＩ型アレルギー性炎症
抑制活性を示した。

【００５５】また、本発明ペプチドを含有する供試液を
投与した群では、プレドニゾロンを含有する供試液より
も少ない投与量で、コントロール群に比べ、ラット４８
時間同種ＰＣＡ反応部の皮膚に漏出する色素量が大幅に
減少した。すなわち、本発明により得られたペプチド
は、プレドニゾロン以上のＩ型アレルギー性炎症抑制活
性を示す。

【００５６】試験例２ III 型アレルギー性炎症に対す
る作用 i)ウサギ抗オボアルブミン（Ovalumin）血清の調整 江田らの方法（日薬理誌、６６巻、２３７頁、１９７０
年）に準じて、次の手法でウサギ抗オボアルブミン血清
を調整した。すなわち、生理食塩液に溶解したオボアル
ブミン（Sigma 社製）の２ｍｇ／ｍｌ溶液と完全フロイ
ントアジュバント（Difco 社製）との等量混合乳化液よ
りなる抗原液を調製した。この抗原液の０．５ｍｌずつ
を体重３ｋｇのニュージーランドホワイト種の雄性家兎
の左右臀筋内に１週間毎に４回注射した。最終注射の７
日後に頚動脈から採血し、血清のみを分離取得し、ウサ
ギ抗オボアルブミン血清とした。この抗血清のラット４
時間異種受身皮膚アナフィラキシー（４時間heterologo
us PCA）反応の力価は１：３２であった。

【００５７】ii) ラット４時間異種ＰＣＡ反応（III 型
アレルギー性皮膚反応）に対する作用 本発明ペプチドを、最終濃度が０．２５ｍｇ／ｍｌにな
るように、５重量％アラビアゴム水溶液にジメチルスル
ホキサイドを５重量％添加して成る溶液に懸濁した。な
お、対照実験用としてプレドニゾロンを、最終濃度が１
０ｍｇ／ｍｌとなるように、５重量％アラビアゴム水溶
液にジメチルスルホキサイドを５重量％添加して成る溶
液に懸濁した。このようにして得られた懸濁液を供試液
とした。被験動物としては体重１２０ｇ〜２００ｇのウ
イスター雄性ラットを用いた。

【００５８】上記ウサギ抗オボアルブミン血清を生理食
塩水で４倍に希釈してなる注射液０．０５ｍｌを、ラッ
トの背部皮内に注射し、ラットを上記抗血清で感作し
た。次に、抗血清投与の４時間後に、対応する抗原とし
て２ｍｇ／ｍｌのオボアルブミンを含む０．５重量％エ
バンスブルー生理食塩液を２．５ｍｌ／ｋｇ静脈注射し
て、４時間異種ＰＣＡ反応を誘発した。

【００５９】本発明ペプチド投与群のラットにおいては
本発明ペプチドを含有する上記供試液２ｍｌ／ｋｇ（本
発明ペプチド０．５ｍｇ／ｋｇ）を誘発の２４時間前に
腹腔内投与もしくは皮下投与した。また、プレドニゾロ
ン投与群のラットにおいてはプレドニゾロンを含有する
上記供試液２ｍｌ／ｋｇ（プレドニゾロン２０ｍｇ／ｋ
ｇ）を誘発の３時間前に腹腔内投与もしくは皮下投与し
た。

【００６０】こうして皮内反応を惹起した部位の漏出色
素を、Haradaらの方法（J.Pharm. Pharmacol．２３巻、
２１８頁、１９７１年）に従って抽出定量した。すなわ
ち、抗原注射の１時間後に動物を屠殺し、４時間異種Ｐ
ＣＡ反応部の皮膚を細切りし、これを０．３％（ｗ／
ｖ）硫酸ナトリウム水溶液３容とアセトン７容の混合液
中に２４時間浸漬し、漏出色素量を求め、これをウサギ
抗オボアルブミン血清を注射した部位（ｓｉｔｅ）当た
りの漏出色素量（μｇ）として表した。この試験のコン
トロールとして、薬物を含まない上記ジメチルスルホキ
サイド含有アラビアゴム水溶液を用い、その他の点は上
記操作と同様に行なって漏出色素量を求めた。

【００６１】本試験はそれぞれ５匹のラットを用いて行
ない、漏出色素量（μｇ／ｓｉｔｅ）はこれらラットに
ついて得られた値の平均値を取った。

【００６２】この試験結果を図２に示す。

【００６３】この図から明らかなように、本発明ペプチ
ドを含有する供試液を投与した群は、コントロール群に
比べ、ラット４時間異種ＰＣＡ反応部の皮膚に漏出する
色素量が大量に減少し、顕著なアレルギー性炎症抑制活
性を示した。

【００６４】また、本発明ペプチドを含有する供試液を
投与した群では、プレドニゾロンを含有する供試液より
も少ない投与量で、コントロール群に比べ、ラット４時
間異種ＰＣＡ反応部の皮膚に漏出する色素量が大量に減
少した。すなわち、本発明ペプチドは、プレドニゾロン
以上のIII 型アレルギー性炎症抑制活性を示す。

【００６５】試験例３ IV型アレルギー性炎症に対する
作用 次の方法でラットIV型アレルギー性炎症（ツベルクリン
反応）に対する本発明ペプチドの作用を調べた。

【００６６】まず、本発明ペプチドを、最終濃度が０．
２５ｍｇ／ｍｌとなるように、５重量％アラビアゴム水
溶液にジメチルスルホキサイドを５重量％添加して成る
溶液に懸濁した。なお、対照実験用としてプレドニゾロ
ンを２５ｍｇ／ｍｌとなるように、５重量％アラビアゴ
ム水溶液にジメチルスルホキサイドを５重量％添加して
成る溶液に懸濁した。このようにして得られた懸濁液を
供試液とした。被験動物としては体重１７０ｇ〜２５０
ｇのウイスター雄性ラットを用いた。

【００６７】ツベルクリン反応は栗山らの方法（日本薬
理学会誌、９４巻、１１３〜１１８頁、１９８９年）に
従って誘発した。ただし上記供試液２ｍｌ／ｋｇ（本発
明ペプチド０．５ｍｇ／ｋｇ、プレドニゾロン５０ｍｇ
／ｋｇ）は誘発１時間前に腹腔内投与した。誘発２４時
間後、Draizeの判定基準に準じて紅斑強度の測定を行な
い、直径１．８ｃｍのポンチで反応部位を打ち抜き皮膚
重量を測定した。

【００６８】この試験のコントロールとして、上記供試
液含有液の代わりに薬物を含まない上記ジメチルスルホ
キサイド含有アラビアゴム水溶液を用い、その他の点は
上記操作と同様に行なった。

【００６９】それぞれの試験はそれぞれ４匹のラットを
用いて行ない、紅斑強度、皮膚重量はこれらラットにつ
いて得られた値の平均値をとった。

【００７０】この試験結果を図３に示す。

【００７１】この図から明らかなように本発明ペプチド
を含有する供試液を投与した群では、コントロール群に
比べ、紅斑強度、皮膚重量が明らかに抑制され、その効
果はプレドニゾロンを投与した群よりも強かった。すな
わち、本発明組成物は免疫性炎症であるIV型アレルギー
性炎症（ツベルクリン反応）を抑制した。

【００７２】試験例４ 非アレルギー性炎症に対する作
用 次の方法でラットカラゲニン足蹠浮腫反応に対する本発
明ペプチドの作用を調べた。

【００７３】まず、本発明ペプチドを、最終濃度が０．
２５ｍｇ／ｍｌとなるように、５重量％アラビアゴム水
溶液にジメチルスルホキサイドを５重量％添加して成る
溶液に懸濁した。なお、対照実験用としてアスピリン
を、最終濃度が５０ｍｇ／ｍｌとなるように、またプレ
ドニゾロンを、最終濃度が２．５ｍｇ／ｍｌとなるよう
に、５重量％アラビアゴム水溶液にジメチルスルホキサ
イドを５重量％添加して成る溶液に懸濁した。このよう
にして得られた懸濁液を供試液とした。被験動物として
は体重１２０ｇ〜２００ｇのウイスター雄性ラットを用
いた。

【００７４】ラットの右後肢の容積をPlethysmometerを
用いて測定し、その後生理食塩液中のカラゲニンの１％
（ｗ／ｖ）溶液０．１ｍｌをラットの右後肢足蹠皮内に
注射してカラゲニン足蹠浮腫反応を誘発した。ラットの
右後肢足蹠の腫れ度合いを調べるため、足蹠浮腫反応誘
発後１時間毎に５時間後まで、ラットの右後肢の容積を
Plethysmometerを用いて測定し、反応誘発前の容積との
差を求めた。

【００７５】本発明ペプチド投与群のラットにおいては
本発明ペプチドを含有する上記供試液２ｍｌ／ｋｇ（本
発明ペプチド０．５ｍｇ／ｋｇ）を誘発の２４時間前に
腹腔内投与した。アスピリン投与群のラットにおいては
アスピリンを含有する上記供試液（アスピリン１００ｍ
ｇ／ｋｇ）を誘発の１時間前に腹腔内投与した。また、
プレドニゾロン投与群のラットにおいてはプレドニゾロ
ンを含有する上記供試液２ｍｌ／ｋｇ（プレドニゾロン
５ｍｇ／ｋｇ）を誘発の１時間前に腹腔内投与した。

【００７６】この試験のコントロールとして、薬物を含
まない上記ジメチルスルホキサイド含有アラビアゴム水
溶液を用い、その他の点は上記操作と同様に行なってラ
ットの右後肢足蹠の腫れ度合いを調べた。

【００７７】それぞれの試験は、それぞれ５匹のラット
を用いて行ない、足蹠の腫れの度合いはこれらラットに
ついて得られた値の平均値をとった。

【００７８】この試験結果を図４に示す。

【００７９】この図から明らかなように、本発明ペプチ
ドを含有する供試液を投与した群は、コントロール群に
比べ、右後肢足蹠の腫れ度合いが明らかに抑制され、そ
の効果はアスピリンやプレドニゾロンを投与した群より
も非常に強かった。すなわち本発明ペプチドは非アレル
ギー性炎症活性を有した。

【００８０】試験例５ アジュバント関節炎に対する作
用 次の方法でラットアジュバント関節炎に対する本発明ペ
プチドの作用を調べた。

【００８１】まず、本発明ペプチドを、最終濃度が０．
２５ｍｇ／ｍｌとなるように、５重量％アラビアゴム水
溶液にジメチルスルホキサイドを５重量％添加して成る
溶液に懸濁した。なお、対照実験用としてプレドニゾロ
ンを５ｍｇ／ｍｌとなるように、５重量％アラビアゴム
水溶液にジメチルスルホキサイドを５重量％添加して成
る溶液に懸濁した。このようにして得られた懸濁液を供
試液とした。被験動物としては体重１２０ｇ〜２００ｇ
のウイスタールイス雄性ラットを用いた。

【００８２】まず、流動パラフィンに懸濁したMycobact
erium tuberculosisＨ３７ＲＡ（６ｍｇ／ｍｌ）０．１
ｍｌをラット右後肢皮下に注射した。次に上記供試液２
ｍｌ／ｋｇ／日（本発明ペプチド０．５ｍｇ／ｋｇ／
日、プレドニゾロン１０ｍｇ／ｋｇ／日）をMycobacter
ium 注射後２２日間１日１回腹腔内投与した。ラット左
右後肢の容積はPlethysmometerを用いて測定し、Mycoba
cterium 注射前の左右後肢容積との差を求め、腫れの度
合いとした。

【００８３】この試験のコントロールとして、上記供試
液含有液の代わりに薬物を含まない上記ジメチルスルホ
キサイド含有アラビアゴム水溶液を用い、その他の点は
上記操作と同様に行なって、ラット左右後肢の腫れの度
合いを調べた。

【００８４】それぞれの試験はそれぞれ７匹のラットを
用いて行ない、腫れの度合いはこれらラットについて得
られた値の平均値をとった。

【００８５】この試験結果を図５に示す。

【００８６】この図から明らかなように本発明ペプチド
を含有する供試液を投与した群では、コントロール群に
比べ、左右後肢足蹠の腫れの度合いが明らかに抑制さ
れ、その効果はプレドニゾロンを投与した群よりも非常
に強かった。すなわち、本発明ペプチドは免疫性慢性炎
症であるアジュバント関節炎に対して抑制作用を有して
いた。

【００８７】試験例６ 毒性試験 次の方法でラットに対する本発明ペプチドの毒性を調べ
た。まず、本発明ペプチドを、５重量％アラビアゴム水
溶液にジメチルスルホキサイドを５重量％添加して成る
溶液に懸濁し、供試液とした。被験動物としては体重１
２０ｇ〜２００ｇのウイスタールイス雄性ラットを用い
た。

【００８８】上記供試液をラットに皮下投与し、死亡状
況を確認した。その結果、２０ｍｇ／ｋｇ投与でも死亡
しなかった。

【００８９】

【発明の効果】本発明によれば、アレルギー性、非アレ
ルギー性炎症に有効である新規な抗炎症物質を含む抗炎
症剤を提供することができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明ペプチド０．５ｍｇ／ｋｇ、プレドニゾ
ロン２０ｍｇ／ｋｇおよびそのコントロールのラット４
８時間同種ＰＣＡ反応における漏出色素量を示すグラフ
である。

【図２】本発明ペプチド０．５ｍｇ／ｋｇ、プレドニゾ
ロン２０ｍｇ／ｋｇおよびそのコントロールのラット４
時間異種ＰＣＡ反応における漏出色素量を示すグラフで
ある。

【図３】本発明ペプチド０．５ｍｇ／ｋｇ、プレドニゾ
ロン５０ｍｇ／ｋｇおよびそのコントロールのラットツ
ベルクリン反応における紅斑強度、皮膚重量を示すグラ
フである。

【図４】本発明ペプチド０．５ｍｇ／ｋｇ、アスピリン
１００ｍｇ／ｋｇ、プレドニゾロン５ｍｇ／ｋｇおよび
そのコントロールのラットカラゲニン浮腫における右後
肢足蹠浮腫量を示すグラフである。

【図５】本発明ペプチド０．５ｍｇ／ｋｇ、プレドニゾ
ロン１０ｍｇ／ｋｇおよびそのコントロールのラットア
ジュバント関節炎における足蹠浮腫量を示すグラフであ
る。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:465） (72)発明者 藤原 昭彦 大阪府三島郡島本町百山２−１ 積水化 学工業株式会社内 (56)参考文献 特開 平５−25053（ＪＰ，Ａ) 特開 平６−247863（ＪＰ，Ａ) 特開 平６−172194（ＪＰ，Ａ) 特開 平８−119992（ＪＰ，Ａ) 特開 平８−119993（ＪＰ，Ａ) Ｊａｐａｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ （1994）Ｖｏｌ．64，ＳＵＰＰＬ １, ｐ．95Ｐ，０−49 (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) A61K 38/00 A61P 29/00 A61P 37/08 C07K 7/06 C12P 21/00 - 21/02 ＣＡ（ＳＴＮ) ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ) ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (1)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 【化１】 で示されるペプチドを有効成分として含む抗炎症剤。