JP3673304B2 - 新規創傷治癒物質 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は新規ペプチドからなる創傷治癒物質、および該ペプチドを有効成分として含む創傷治癒剤に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
創傷は、外科的切開、胃潰瘍、火傷、裂傷、褥瘡または下肢潰瘍等の感染によって起こった表面組織の損傷である。創傷の治療法としては、受傷部を消毒、縫合し、生体の自然の回復力によって受傷部が治癒するのを待つのが常法である。しかしながら、回復までに長期間を要し、痛みを始めとした患者の苦痛は並大抵のものではない。そこで、自然治癒に頼ることなく、積極的かつ直接的に治癒を促進させることが望まれている。創傷の治癒は一般に細胞増殖による新しい結合組織および上皮組織の形成に依存し、創傷の治癒に関与する細胞の分化、増殖過程を刺激あるいは促進する薬剤が有効であると考えられている。
【０００３】
従来、創傷治癒の促進作用を示すものとしては、幼牛血液抽出物（ソルコセリル）（応用薬理、２２巻、５６５〜５７９頁、１９８１年）や塩化リゾチーム等が報告されている。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
しかし、創傷治癒効果を示すとされているソルコセリルや塩化リゾチームは、実際には有意な創傷治癒促進効果を示さない。
【０００５】
本発明の目的は、上記の点に鑑み、有用性の高い新規創傷治癒物質を提供することにある。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明により、
【化２】
で示される新規ペプチド（以下、本発明ペプチドという）からなる創傷治癒物質（以下、本発明創傷治癒物質という）、およびこれを有効成分として含む創傷治癒剤が提供される。
【０００７】
本発明創傷治癒物質は、ストレプトマイセス属に属する本発明創傷治癒物質生産菌株、例えば、放線菌ストレプトマイセス・バリアビリス（Streptomyces variabilis 、以下「Ｓ．バリアビリス」と略記する）を培養し、得られた培養液または同液の乾固物もしくは培養菌体から有機溶剤によって抽出された抽出物を、各種カラムクロマトグラフィーに付し、目的物を含むカラムクロマトグラフィー画分を再結晶処理することにより得られる。
【０００８】
本発明創傷治癒物質を生産する放線菌Ｓ．バリアビリスは、公的保存機関から入手可能であり、例えば、理化学研究所の保存菌（ＪＣＭ４４２２）（これは米国においてＡＴＣＣ１９８１５およびオランダにおいてＣＢＳ５６８．６８としても保存）などの菌が使用できる。
【０００９】
放線菌Ｓ．バリアビリスの培養は、然るべき栄養物を含んだ培地を用いて行う。液体培養の場合、その培地の成分としてはブドウ糖などの糖類、ペプトンや麦芽エキスなどのタンパク質類、ビタミン類、核酸類、アミノ酸類、複合糖質類の一種または数種を含んだ水溶液が好適に用いられる。代表的な培地例としては、ＹＭ系の液体培地（ブドウ糖、麦芽エキス、イーストエキスを含む）が挙げられる。液体培地のｐＨは２〜９が好ましく、培養温度は１５〜４２℃が好ましい。また液体培養の好ましい培養時間は１〜１４日である。こうして得たＳ．バリアビリスの培養液またはその乾固物もしくは菌体自体から溶剤を用いて本発明ペプチドを抽出する。
【００１０】
Ｓ．バリアビリスの培養液またはその乾固物もしくは菌体自体の抽出液を硫安処理し、得られた沈殿物を溶剤抽出してもよい。硫安処理に際しては、培養液またはその乾固物もしくは菌体自体の抽出液に添加する硫安は、固体のままの状態でもよいし、溶液状態のものでもよい。硫安の添加量は好ましくは飽和濃度の３０〜９０重量％の範囲である。処理時間は特に限定されないが、好ましくは３０分〜５時間の範囲である。沈殿物を得るための遠心分離に際しては、遠心力が３，０００Ｇ〜２０，０００Ｇであることが好ましく、遠心時間は２〜６０分であることが好ましい。
【００１１】
抽出に用いる溶剤としては有機溶剤が好ましく、その代表例としては、酢酸エチルなどのエステル類、メタノール、エタノール、プロパノールなどのアルコール類、エチルエーテル、ジオキサンなどのエーテル類、アセトン、メチルエチルケトンなどのケトン類のほかジクロロメタン、クロロホルムなどが挙げられるが、使用可能な溶剤はこれらに限定されない。また、上記溶剤の混合物を用いることもできる。特に好適な溶剤は酢酸エチル、ジクロロメタン、アセトンなどである。抽出時間は溶剤の種類や抽出温度などによっても異なるが、好ましくは３〜１２０分の範囲である。また抽出中は液を静置してもまたは攪拌してもよい。好ましくは、同一試料に対して抽出操作を複数回繰り返す。抽出温度は特に制限されない。
【００１２】
次に、溶剤抽出物に対するカラムクロマトグラフィーについて述べる。
【００１３】
カラムクロマトグラフィーの充填剤としては、特に限定されないが、シリカゲルが好ましい。充填量は特に限定されないが、チャージする溶剤抽出物に対する重量比１０〜５００倍量を充填することが好ましい。溶剤抽出物をカラムにチャージする際はまず充填剤に吸着させることが好ましい。このとき充填剤の量は特に限定されないが、好ましくは吸着させる溶剤抽出物に対する重量比０．５〜２０倍量の充填剤を用いてこれに抽出物を吸着させた後、この抽出物吸着充填剤を少量の溶剤に懸濁してからカラムにチャージする。溶出溶媒は特に限定されないが、例えば、充填剤がシリカゲルの場合、好ましくは極性がクロロホルム：メタノール＝５０：１からメタノールの間にある溶剤を用いる。
【００１４】
次に、本発明ペプチドの再結晶による精製について述べる。
【００１５】
再結晶に用いる溶剤は、本発明ペプチドを溶かす溶剤であれば特に限定されないが、好ましくはメタノール、エタノールなどである。再結晶の方法としては、当該物質を含有するカラム溶出画分を加熱下で少量の溶剤に溶かし、得られた溶液を徐々に冷やしてこの物質を再結晶させてもよいし、当該物質を含有するカラム溶出画分を当該物質の溶解性の高い溶剤に溶かし、そこに当該物質の溶解性の低い液（例えば水）を徐々に加えてこの物質を再結晶させてもよい。
【００１６】
本発明ペプチドを有効成分として含む創傷治癒剤は、通常は、本発明ペプチドを製剤用担体と混合して製剤組成物の形態とする方法により製造される。上記担体としては剤形に応じた薬剤を調製するのに通常使用される充填剤、崩壊剤、増量剤、結合剤、着色剤、矯味矯臭剤、ｐＨ調整剤、可溶化剤、懸濁化剤、緩衝剤、安定化剤、保存剤、付質剤、表面活性剤、滑沢剤、賦形剤が例示される。また本発明ペプチドを適当な溶剤に溶解して外用液剤の形態とする方法によっても製造される。
【００１７】
本発明の創傷治癒剤の投与単位形態としては、上記のような外用液剤のほか、錠剤、丸剤、飲用液剤、リモナーゼ剤、注入剤、散剤、懸濁剤、乳剤、顆粒剤、エキス剤、細粒剤、シロップ剤、浸剤、煎剤、点眼剤、トローチ剤、パップ剤、リニメント剤、ローション剤、エリキシル剤、眼軟膏剤、硬膏剤、カプセル剤、坐剤、浣腸剤、注射剤（液剤、懸濁剤など）、貼付剤、軟膏剤、ゼリー剤、パスタ剤、吸入剤、クリーム剤、スプレー剤、点鼻剤などが例示される。
【００１８】
本発明の創傷治癒剤中に含有される本発明ペプチドの量は、特に限定されず広範囲に適宜選択されるが、好ましくは創傷治癒剤中に１０-10 〜５０重量％の範囲である。
【００１９】
本発明の創傷治癒剤は、その使用に際し各種形態に応じた方法で投与される。例えば、上記のような外用液剤の場合には、皮膚ないしは粘膜などの所要部位に直接塗布され、錠剤、丸剤、飲用液剤、懸濁剤、乳剤、顆粒剤およびカプセル剤の場合には経口投与され、注射剤の場合には静脈内、筋肉内、皮内、皮下もしくは腹腔内投与され、坐剤の場合には直腸内投与され、また貼付剤、軟膏剤、ゼリー剤、クリーム剤の場合には貼付または塗布され、吸入剤、点鼻剤の場合は吸入され、スプレー剤の場合は吸入もしくは塗布される。
【００２０】
本発明の創傷治癒剤の投与量は、使用目的、症状などにより適宜選択されるが、通常は１日当り本発明ペプチドとして１ｆｇ／ｋｇ〜５０ｍｇ／ｋｇ程度の範囲である。また上記製剤組成物を１〜４回／日に分けて投与することも勿論差し支えない。
【００２１】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の実施例を説明する。
実施例１
理化学研究所から入手した放線菌Ｓ．バリアビリス（ＪＣＭ４４２２）を、ＹＭ培地（グルコース０．４重量％、麦芽エキス１．０重量％、酵母エキス０．４重量％含有蒸留水溶液）１００ｍｌを含む５００ｍｌ容エーレンマイヤーフラスコで、２７℃で４日間振盪培養（種培養）した。続いて同培地２５リットルを含む５０リットル容ジャーファーメンターに種培養菌液１．３リットルを接種し、２７℃、通気量１０リットル／ｍｉｎ、攪拌数２００ｒｐｍで４日間培養した。この培養液を遠心分離し、得られた上清液５０リットルのｐＨを２．０に調整し、５０リットルの酢酸エチルを用いて２回抽出した。また、上記の遠心分離で得られた菌体を５リットルのアセトンで２回抽出し、抽出液をエバポレーターで濃縮後、濃縮液のｐＨを２．０に調整し、２リットルの酢酸エチルを用いて２回抽出した。上清液の酢酸エチル抽出液と菌体の酢酸エチル抽出液を合わせて蒸発乾固し粗抽出物２０ｇを得た。
【００２２】
次に、上記により得られた粗抽出物を少量のシリカゲルに吸着させた。次いで、シリカゲルをクロロホルムに懸濁させ内径４ｃｍのカラム内に充填し、長さ４０ｃｍのシリカゲルカラムを作成し、その上に上記抽出物吸着シリカゲルをチャージした。カラムをクロロホルムで洗浄した後、溶出溶剤としてクロロホルム：メタノール＝３０：１を用いて溶出させた画分を蒸発乾固した。
【００２３】
次に、ゲル濾過担体（ファルマシアバイオテク社製、セファデックスＬＨ−２０）をメタノールに懸濁させ、内径４ｃｍのカラム内に充填し、長さ６０ｃｍのゲル濾過用カラムを作成した。このカラムの上に、上記で得られたクロロホルム：メタノール＝３０：１溶出画分の蒸発乾固物を少量のメタノールに溶解させてチャージした。次いで、メタノールで溶出させ溶出液を少量ずつ分画した。各溶出画分について、後述のペーパーディスク埋没法により肉芽増殖作用の有無を調べた。肉芽増殖作用の認められた画分を集め、蒸発乾固させて活性物質１００ｍｇを得た。
【００２４】
この物質の構造は、種々の機器分析データーより、既知物質バリアベプチン(M.Nakagawa.et al,Agric.Biol.Chem.,54,791,1990) と同一であることがわかった。
【００２５】
薬理試験
試験例１ 肉芽増殖作用
本発明ペプチドを、最終濃度がそれぞれ５μｇ／ｍｌ、５０μｇ／ｍｌ、５００μｇ／ｍｌおよび５０００μｇ／ｍｌになるようにメタノールに溶解した。各濃度のメタノール溶液の２０μｌを径８ｍｍのペーパーディスク（アドバンテック社製の抗生物質検定用濾紙）に２回に分けて染み込ませた後、風乾によりメタノールを除去した。
【００２６】
被験動物としては体重１２０〜２００ｇのウイスター雄性ラットを用いた。
【００２７】
ラットをエーテル麻酔下で剃毛し、背部正中線に沿ってメスで約３ｃｍの切創部を作成した。作成した切創部より上記ペーパーディスクを皮下に埋め込んだ後、切創部を縫合した。１週間後、ラットをエーテル麻酔下にて安楽死させ、皮下からペーパーディスクを取り出し、形成された肉芽の湿重量を測定した。
コントロールとしては、本発明ペプチドを含まないメタノール２０μｌをペーパーディスクに染み込ませ次いで風乾したものを用いた。
【００２８】
本試験はそれぞれ５匹のラットを用いて行い、肉芽湿重量はこれらラットについて得られた値の平均値を取った。
【００２９】
この試験結果を図１に示す。
【００３０】
図１から判るように、本発明ペプチド１μｇ／ディスク以上の濃度のディスクを埋め込んだ群では、コントロール群に比べて明らかに肉芽湿重量が増加した。従って、本発明ペプチドは細胞増殖作用を有することが認められる。
【００３１】
試験例２ ラット切創モデルに対する作用
本発明ペプチド１５０μｇを含むメタノール３７．５μｌを軟膏基剤（大正製薬社製のプラスチベース）３ｇと混合し、本発明ペプチドを０．００５％含む軟膏剤を作成した。
【００３２】
被験動物としては体重２５０〜３００ｇのウイスター雄性ラットを用いた。
【００３３】
ラットをエーテル麻酔下で剃毛し、背部正中線に垂直な方向にメスで３ｃｍの切創部を作成した。この切創部を等間隔で３ケ所で縫合し、３時間後に上記軟膏剤２００ｍｇを切創部に塗布した。切創翌日より３日間、用時調製した軟膏剤２００ｍｇを１日１回切創部に塗布した。切創４日後にラットをエーテル麻酔下にて安楽死させ、抜糸後、切創中央部２ｃｍを含む短冊状の皮膚切片を切り取った。皮膚切片の結合組織を除去した後、レオメーターを用いて切創部の耐創張力（ｇ／ｃｍ）を測定した。
コントロールとしては、本発明ペプチドを含まないメタノール３７．５μｌを軟膏基剤（大正製薬社製のプラスチベース）３ｇと混合したものを用いた。
【００３４】
本試験はそれぞれ１５匹のラットを用いて行い、耐創張力（ｇ／ｃｍ）はこれらラットについて得られた値の平均値を取った。
【００３５】
この試験結果を図２に示す。
【００３６】
図２から判るように、本発明ペプチドを塗布した群では、コントロール群に比べ、明らかに耐創張力が増加した。従って、本発明ペプチドは強力な創傷治癒促進効果を示すことが認められる。
【００３７】
【発明の効果】
本発明によれば、顕著な創傷治癒効果を示す新規創傷治癒物質およびこれを含む新規創傷治癒剤を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】コントロールおよび本発明ペプチドの濃度と肉芽湿重量との関係を示すグラフである。
【図２】コントロールおよび本発明ペプチド含有軟膏剤と耐創張力との関係を示すグラフである。
【発明の属する技術分野】
本発明は新規ペプチドからなる創傷治癒物質、および該ペプチドを有効成分として含む創傷治癒剤に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
創傷は、外科的切開、胃潰瘍、火傷、裂傷、褥瘡または下肢潰瘍等の感染によって起こった表面組織の損傷である。創傷の治療法としては、受傷部を消毒、縫合し、生体の自然の回復力によって受傷部が治癒するのを待つのが常法である。しかしながら、回復までに長期間を要し、痛みを始めとした患者の苦痛は並大抵のものではない。そこで、自然治癒に頼ることなく、積極的かつ直接的に治癒を促進させることが望まれている。創傷の治癒は一般に細胞増殖による新しい結合組織および上皮組織の形成に依存し、創傷の治癒に関与する細胞の分化、増殖過程を刺激あるいは促進する薬剤が有効であると考えられている。
【０００３】
従来、創傷治癒の促進作用を示すものとしては、幼牛血液抽出物（ソルコセリル）（応用薬理、２２巻、５６５〜５７９頁、１９８１年）や塩化リゾチーム等が報告されている。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
しかし、創傷治癒効果を示すとされているソルコセリルや塩化リゾチームは、実際には有意な創傷治癒促進効果を示さない。
【０００５】
本発明の目的は、上記の点に鑑み、有用性の高い新規創傷治癒物質を提供することにある。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明により、
【化２】
【０００７】
本発明創傷治癒物質は、ストレプトマイセス属に属する本発明創傷治癒物質生産菌株、例えば、放線菌ストレプトマイセス・バリアビリス（Streptomyces variabilis 、以下「Ｓ．バリアビリス」と略記する）を培養し、得られた培養液または同液の乾固物もしくは培養菌体から有機溶剤によって抽出された抽出物を、各種カラムクロマトグラフィーに付し、目的物を含むカラムクロマトグラフィー画分を再結晶処理することにより得られる。
【０００８】
本発明創傷治癒物質を生産する放線菌Ｓ．バリアビリスは、公的保存機関から入手可能であり、例えば、理化学研究所の保存菌（ＪＣＭ４４２２）（これは米国においてＡＴＣＣ１９８１５およびオランダにおいてＣＢＳ５６８．６８としても保存）などの菌が使用できる。
【０００９】
放線菌Ｓ．バリアビリスの培養は、然るべき栄養物を含んだ培地を用いて行う。液体培養の場合、その培地の成分としてはブドウ糖などの糖類、ペプトンや麦芽エキスなどのタンパク質類、ビタミン類、核酸類、アミノ酸類、複合糖質類の一種または数種を含んだ水溶液が好適に用いられる。代表的な培地例としては、ＹＭ系の液体培地（ブドウ糖、麦芽エキス、イーストエキスを含む）が挙げられる。液体培地のｐＨは２〜９が好ましく、培養温度は１５〜４２℃が好ましい。また液体培養の好ましい培養時間は１〜１４日である。こうして得たＳ．バリアビリスの培養液またはその乾固物もしくは菌体自体から溶剤を用いて本発明ペプチドを抽出する。
【００１０】
Ｓ．バリアビリスの培養液またはその乾固物もしくは菌体自体の抽出液を硫安処理し、得られた沈殿物を溶剤抽出してもよい。硫安処理に際しては、培養液またはその乾固物もしくは菌体自体の抽出液に添加する硫安は、固体のままの状態でもよいし、溶液状態のものでもよい。硫安の添加量は好ましくは飽和濃度の３０〜９０重量％の範囲である。処理時間は特に限定されないが、好ましくは３０分〜５時間の範囲である。沈殿物を得るための遠心分離に際しては、遠心力が３，０００Ｇ〜２０，０００Ｇであることが好ましく、遠心時間は２〜６０分であることが好ましい。
【００１１】
抽出に用いる溶剤としては有機溶剤が好ましく、その代表例としては、酢酸エチルなどのエステル類、メタノール、エタノール、プロパノールなどのアルコール類、エチルエーテル、ジオキサンなどのエーテル類、アセトン、メチルエチルケトンなどのケトン類のほかジクロロメタン、クロロホルムなどが挙げられるが、使用可能な溶剤はこれらに限定されない。また、上記溶剤の混合物を用いることもできる。特に好適な溶剤は酢酸エチル、ジクロロメタン、アセトンなどである。抽出時間は溶剤の種類や抽出温度などによっても異なるが、好ましくは３〜１２０分の範囲である。また抽出中は液を静置してもまたは攪拌してもよい。好ましくは、同一試料に対して抽出操作を複数回繰り返す。抽出温度は特に制限されない。
【００１２】
次に、溶剤抽出物に対するカラムクロマトグラフィーについて述べる。
【００１３】
カラムクロマトグラフィーの充填剤としては、特に限定されないが、シリカゲルが好ましい。充填量は特に限定されないが、チャージする溶剤抽出物に対する重量比１０〜５００倍量を充填することが好ましい。溶剤抽出物をカラムにチャージする際はまず充填剤に吸着させることが好ましい。このとき充填剤の量は特に限定されないが、好ましくは吸着させる溶剤抽出物に対する重量比０．５〜２０倍量の充填剤を用いてこれに抽出物を吸着させた後、この抽出物吸着充填剤を少量の溶剤に懸濁してからカラムにチャージする。溶出溶媒は特に限定されないが、例えば、充填剤がシリカゲルの場合、好ましくは極性がクロロホルム：メタノール＝５０：１からメタノールの間にある溶剤を用いる。
【００１４】
次に、本発明ペプチドの再結晶による精製について述べる。
【００１５】
再結晶に用いる溶剤は、本発明ペプチドを溶かす溶剤であれば特に限定されないが、好ましくはメタノール、エタノールなどである。再結晶の方法としては、当該物質を含有するカラム溶出画分を加熱下で少量の溶剤に溶かし、得られた溶液を徐々に冷やしてこの物質を再結晶させてもよいし、当該物質を含有するカラム溶出画分を当該物質の溶解性の高い溶剤に溶かし、そこに当該物質の溶解性の低い液（例えば水）を徐々に加えてこの物質を再結晶させてもよい。
【００１６】
本発明ペプチドを有効成分として含む創傷治癒剤は、通常は、本発明ペプチドを製剤用担体と混合して製剤組成物の形態とする方法により製造される。上記担体としては剤形に応じた薬剤を調製するのに通常使用される充填剤、崩壊剤、増量剤、結合剤、着色剤、矯味矯臭剤、ｐＨ調整剤、可溶化剤、懸濁化剤、緩衝剤、安定化剤、保存剤、付質剤、表面活性剤、滑沢剤、賦形剤が例示される。また本発明ペプチドを適当な溶剤に溶解して外用液剤の形態とする方法によっても製造される。
【００１７】
本発明の創傷治癒剤の投与単位形態としては、上記のような外用液剤のほか、錠剤、丸剤、飲用液剤、リモナーゼ剤、注入剤、散剤、懸濁剤、乳剤、顆粒剤、エキス剤、細粒剤、シロップ剤、浸剤、煎剤、点眼剤、トローチ剤、パップ剤、リニメント剤、ローション剤、エリキシル剤、眼軟膏剤、硬膏剤、カプセル剤、坐剤、浣腸剤、注射剤（液剤、懸濁剤など）、貼付剤、軟膏剤、ゼリー剤、パスタ剤、吸入剤、クリーム剤、スプレー剤、点鼻剤などが例示される。
【００１８】
本発明の創傷治癒剤中に含有される本発明ペプチドの量は、特に限定されず広範囲に適宜選択されるが、好ましくは創傷治癒剤中に１０-10 〜５０重量％の範囲である。
【００１９】
本発明の創傷治癒剤は、その使用に際し各種形態に応じた方法で投与される。例えば、上記のような外用液剤の場合には、皮膚ないしは粘膜などの所要部位に直接塗布され、錠剤、丸剤、飲用液剤、懸濁剤、乳剤、顆粒剤およびカプセル剤の場合には経口投与され、注射剤の場合には静脈内、筋肉内、皮内、皮下もしくは腹腔内投与され、坐剤の場合には直腸内投与され、また貼付剤、軟膏剤、ゼリー剤、クリーム剤の場合には貼付または塗布され、吸入剤、点鼻剤の場合は吸入され、スプレー剤の場合は吸入もしくは塗布される。
【００２０】
本発明の創傷治癒剤の投与量は、使用目的、症状などにより適宜選択されるが、通常は１日当り本発明ペプチドとして１ｆｇ／ｋｇ〜５０ｍｇ／ｋｇ程度の範囲である。また上記製剤組成物を１〜４回／日に分けて投与することも勿論差し支えない。
【００２１】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の実施例を説明する。
実施例１
理化学研究所から入手した放線菌Ｓ．バリアビリス（ＪＣＭ４４２２）を、ＹＭ培地（グルコース０．４重量％、麦芽エキス１．０重量％、酵母エキス０．４重量％含有蒸留水溶液）１００ｍｌを含む５００ｍｌ容エーレンマイヤーフラスコで、２７℃で４日間振盪培養（種培養）した。続いて同培地２５リットルを含む５０リットル容ジャーファーメンターに種培養菌液１．３リットルを接種し、２７℃、通気量１０リットル／ｍｉｎ、攪拌数２００ｒｐｍで４日間培養した。この培養液を遠心分離し、得られた上清液５０リットルのｐＨを２．０に調整し、５０リットルの酢酸エチルを用いて２回抽出した。また、上記の遠心分離で得られた菌体を５リットルのアセトンで２回抽出し、抽出液をエバポレーターで濃縮後、濃縮液のｐＨを２．０に調整し、２リットルの酢酸エチルを用いて２回抽出した。上清液の酢酸エチル抽出液と菌体の酢酸エチル抽出液を合わせて蒸発乾固し粗抽出物２０ｇを得た。
【００２２】
次に、上記により得られた粗抽出物を少量のシリカゲルに吸着させた。次いで、シリカゲルをクロロホルムに懸濁させ内径４ｃｍのカラム内に充填し、長さ４０ｃｍのシリカゲルカラムを作成し、その上に上記抽出物吸着シリカゲルをチャージした。カラムをクロロホルムで洗浄した後、溶出溶剤としてクロロホルム：メタノール＝３０：１を用いて溶出させた画分を蒸発乾固した。
【００２３】
次に、ゲル濾過担体（ファルマシアバイオテク社製、セファデックスＬＨ−２０）をメタノールに懸濁させ、内径４ｃｍのカラム内に充填し、長さ６０ｃｍのゲル濾過用カラムを作成した。このカラムの上に、上記で得られたクロロホルム：メタノール＝３０：１溶出画分の蒸発乾固物を少量のメタノールに溶解させてチャージした。次いで、メタノールで溶出させ溶出液を少量ずつ分画した。各溶出画分について、後述のペーパーディスク埋没法により肉芽増殖作用の有無を調べた。肉芽増殖作用の認められた画分を集め、蒸発乾固させて活性物質１００ｍｇを得た。
【００２４】
この物質の構造は、種々の機器分析データーより、既知物質バリアベプチン(M.Nakagawa.et al,Agric.Biol.Chem.,54,791,1990) と同一であることがわかった。
【００２５】
薬理試験
試験例１ 肉芽増殖作用
本発明ペプチドを、最終濃度がそれぞれ５μｇ／ｍｌ、５０μｇ／ｍｌ、５００μｇ／ｍｌおよび５０００μｇ／ｍｌになるようにメタノールに溶解した。各濃度のメタノール溶液の２０μｌを径８ｍｍのペーパーディスク（アドバンテック社製の抗生物質検定用濾紙）に２回に分けて染み込ませた後、風乾によりメタノールを除去した。
【００２６】
被験動物としては体重１２０〜２００ｇのウイスター雄性ラットを用いた。
【００２７】
ラットをエーテル麻酔下で剃毛し、背部正中線に沿ってメスで約３ｃｍの切創部を作成した。作成した切創部より上記ペーパーディスクを皮下に埋め込んだ後、切創部を縫合した。１週間後、ラットをエーテル麻酔下にて安楽死させ、皮下からペーパーディスクを取り出し、形成された肉芽の湿重量を測定した。
コントロールとしては、本発明ペプチドを含まないメタノール２０μｌをペーパーディスクに染み込ませ次いで風乾したものを用いた。
【００２８】
本試験はそれぞれ５匹のラットを用いて行い、肉芽湿重量はこれらラットについて得られた値の平均値を取った。
【００２９】
この試験結果を図１に示す。
【００３０】
図１から判るように、本発明ペプチド１μｇ／ディスク以上の濃度のディスクを埋め込んだ群では、コントロール群に比べて明らかに肉芽湿重量が増加した。従って、本発明ペプチドは細胞増殖作用を有することが認められる。
【００３１】
試験例２ ラット切創モデルに対する作用
本発明ペプチド１５０μｇを含むメタノール３７．５μｌを軟膏基剤（大正製薬社製のプラスチベース）３ｇと混合し、本発明ペプチドを０．００５％含む軟膏剤を作成した。
【００３２】
被験動物としては体重２５０〜３００ｇのウイスター雄性ラットを用いた。
【００３３】
ラットをエーテル麻酔下で剃毛し、背部正中線に垂直な方向にメスで３ｃｍの切創部を作成した。この切創部を等間隔で３ケ所で縫合し、３時間後に上記軟膏剤２００ｍｇを切創部に塗布した。切創翌日より３日間、用時調製した軟膏剤２００ｍｇを１日１回切創部に塗布した。切創４日後にラットをエーテル麻酔下にて安楽死させ、抜糸後、切創中央部２ｃｍを含む短冊状の皮膚切片を切り取った。皮膚切片の結合組織を除去した後、レオメーターを用いて切創部の耐創張力（ｇ／ｃｍ）を測定した。
コントロールとしては、本発明ペプチドを含まないメタノール３７．５μｌを軟膏基剤（大正製薬社製のプラスチベース）３ｇと混合したものを用いた。
【００３４】
本試験はそれぞれ１５匹のラットを用いて行い、耐創張力（ｇ／ｃｍ）はこれらラットについて得られた値の平均値を取った。
【００３５】
この試験結果を図２に示す。
【００３６】
図２から判るように、本発明ペプチドを塗布した群では、コントロール群に比べ、明らかに耐創張力が増加した。従って、本発明ペプチドは強力な創傷治癒促進効果を示すことが認められる。
【００３７】
【発明の効果】
本発明によれば、顕著な創傷治癒効果を示す新規創傷治癒物質およびこれを含む新規創傷治癒剤を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】コントロールおよび本発明ペプチドの濃度と肉芽湿重量との関係を示すグラフである。
【図２】コントロールおよび本発明ペプチド含有軟膏剤と耐創張力との関係を示すグラフである。
Claims (2)
-
- 請求項１記載のペプチドを有効成分として含む創傷治癒剤。
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|---|---|---|---|
| JP19463695A JP3673304B2 (ja) | 1995-07-31 | 1995-07-31 | 新規創傷治癒物質 |
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|---|---|---|---|
| JP19463695A JP3673304B2 (ja) | 1995-07-31 | 1995-07-31 | 新規創傷治癒物質 |
Publications (2)
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|---|---|
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|---|---|---|---|
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Country Status (1)
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Cited By (1)
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|---|---|---|---|---|
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-
1995
- 1995-07-31 JP JP19463695A patent/JP3673304B2/ja not_active Expired - Fee Related
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