CN113244267A - 一种红藻多糖纳米银及其制备得到的抑菌凝胶和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种红藻多糖纳米银及其制备得到的抑菌凝胶和应用。所述红藻多糖纳米银是由红藻多糖与硝酸银溶液制得的,并与甘油、三乙醇胺、基质和防腐剂共同制备得到抑菌凝胶。所述的红藻多糖纳米银具有生物相容性好、稳定性高、不易产生耐药性的优点,其与抑菌凝胶均具有抑制多种细菌和病毒的作用。另外,红藻多糖纳米银抗菌凝胶还具有明显促进大鼠伤口愈合的作用。本发明通过系统的科学实验证明,红藻多糖纳米银以及含红藻多糖纳米银的抑菌凝胶在阴道炎、宫颈炎等妇科疾病治疗方面,具有广阔的市场应用前景。

Description

一种红藻多糖纳米银及其制备得到的抑菌凝胶和应用
技术领域
本发明属于医药技术领域,具体涉及一种红藻多糖纳米银及其制备得到的抑菌凝胶和应用。
背景技术
大量研究表明,海洋来源的红藻多糖不仅生物相容性好、使用安全,而且具有广谱的抗病毒活性。可通过阻断病毒的吸附、侵入,抑制病毒的转录和复制,激活机体抗病毒免疫调节活性等机制发挥抗病毒作用。
近年来,纳米银因具有独特的光、热、电性能和安全性,被广泛应用于生物材料和医药健康领域。利用纳米银的表面效应、小尺寸效应和宏观隧道效应,可在很低的浓度下就能破坏病原微生物的细胞膜,产生高效和持久的抗菌作用。
阴道炎、宫颈炎和宫颈癌等妇科疾病,是影响妇女生殖健康的常见疾病。据统计,在美国每年阴道炎妇科疾病就诊人次超过1000万,中国女性中约有40%患有不同程度的生殖道感染等妇科疾病。2018年,中国15岁及以上妇女的妇科病患病率为24.9%,其中育龄妇女的妇科病患病率为36.7%。阴道炎是指阴道或外阴的感染或炎症,通常是由于在阴道中细菌比例失调引起的。最常见的阴道炎感染是细菌性阴道病(Bacterial Vaginosis,BV,20-60%),真菌感染(17-39%)和阴道毛滴虫(4%-30%)感染。在真菌感染病例中,白色念珠菌占80%-92%。如果阴道炎不及时治疗,会增加女性出现其他健康问题的风险。例如,BV阴道生态系统改变,易导致单纯疱疹病毒2(HSV-2)、人类免疫缺陷病毒(HIV)和HPV的感染。其中,HSV-2会破坏阴道粘膜的完整性导致生殖器溃疡,增加感染其他性传播疾病(STDs)的风险;HPV的感染则可能会诱发宫颈癌的发生。2018年,全球估计有5亿人感染了HSV-2病毒,其中约50%是妇女。慢性宫颈炎是已婚女性最常见的妇科疾病,其中宫颈糜烂与HPV的感染密切相关。这些常见的阴道妇科疾病与细菌感染和病毒感染综合相关,针对单一因素治疗难以取得理想效果。目前,妇科疾病主要是使用抗生素和化学药物治疗,如克林霉素、甲硝唑等用于BV治疗,氟康唑用于真菌感染,阿昔洛韦用于病毒感染等,但由于这些药物存在的耐药性、副作用和作用环节单一等问题限制了其在临床上的广泛应用。因此,研究和开发生物相容性和安全性好,同时具有抗病毒和抗菌作用的新型抗妇科疾病药物,将具有重要的临床应用价值。
发明内容
本发明公开了一种红藻多糖纳米银及其制备得到的抑菌凝胶和应用,所述红藻多糖纳米银及含红藻多糖纳米银的抑菌凝胶同时具有抗菌和抗病毒的活性,能够用于抑菌剂以及妇科疾病的防治中。
为了实现上述发明目的,本发明采用下述技术方案予以实现:
本发明提供了红藻多糖纳米银,所述红藻多糖纳米银是通过如下方法制得的:将红藻多糖与硝酸银溶液在30-100℃反应,调整pH至8-10,磁力搅拌0.5-5h后,用纳滤法去除杂质得到红藻多糖纳米银。
进一步的,所述红藻多糖的分子骨架是由1→3连接的-β-D-吡喃半乳糖和1→4连接的3,6-内醚-α-D-吡喃半乳糖重复二糖单元组成的,其硫酸根含量为15%~40%,重均分子量为1kDa~500kDa;其化学结构式如下所示:
Figure BDA0003015143910000021
进一步的,所述红藻多糖纳米银中银离子的含量为50-2000ppm。
进一步的,所述红藻多糖纳米银具有细胞包容性。
进一步的,所述红藻多糖纳米银的浓度为5-200μg/mL时,作用于正常内皮细胞和小鼠单核巨噬细胞后,未显著抑制细胞的增殖和生长。
本发明还提供了含有所述的红藻多糖纳米银的抑菌凝胶,所述抑菌凝胶包括以下组分:红藻多糖纳米银、甘油、三乙醇胺、基质和防腐剂。
进一步的,所述抑菌凝胶中各组分的重量比为:基质∶红藻多糖纳米银∶甘油∶三乙醇胺∶防腐剂=10-40∶150-500∶10-100∶10-60∶1-5。
进一步的,所述基质为水溶性基质或脂溶性基质,所述水溶性基质为卡波姆、甘油明胶、聚乙二醇、聚氧乙烯单硬脂酸酯类、泊洛沙姆中的至少一种;所述脂溶性基质为可可豆酯、半合成或全合成脂肪酸甘油酯中的的至少一种。
本发明还提供了所述的红藻多糖纳米银或所述的含有红藻多糖纳米银的抑菌凝胶在用于制备抑菌剂或/和病毒剂中的应用。
进一步的,所述红藻多糖纳米银或所述抑菌凝胶能够显著抑制大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌、铜绿假单胞菌、HPV病毒、HSV-2病毒。
本发明还提供了所述的含有红藻多糖纳米银的抑菌凝胶在用于制备防治妇科疾病的外用制剂中的应用。
进一步的,所述妇科疾病为病原微生物感染引起的妇科疾病。
进一步的,所述病原微生物包括大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌、铜绿假单胞菌、HPV病毒、HSV-2病毒。
进一步的,所述抑菌凝胶通过抑制病原微生物以及促进伤口愈合来达到防治妇科疾病的目的。
进一步的,所述外用制剂包括阴道凝胶剂、栓剂、泡腾栓剂、阴道泡腾胶囊、阴道软胶囊、阴道泡腾片和海绵栓剂。
与现有技术相比,本发明的优点和技术效果是:
本发明以红藻多糖为原料制备的红藻多糖纳米银,不仅生物相容性好、稳定性高、不易产生耐药性,而且同时具备广谱的抗菌和抗病毒活性。另外,红藻多糖纳米银抗菌凝胶还具有明显促进大鼠伤口愈合的作用。本发明通过系统的科学实验证明,本发明所述红藻多糖纳米银具有明显的抗菌和抗病毒作用,在阴道炎、宫颈炎等妇科疾病治疗方面,具有广阔的市场应用前景。
附图说明
图1是本发明所述红藻多糖的结构表征:图1A是傅里叶红外光谱(FT-IR)图,图1B是核磁共振氢谱(1H-NMR)图。
图2是本发明所述红藻多糖纳米银的表征图:图2A是紫外吸收光谱(UV-Vis)图,图2B是马尔文粒度分析结果,图2C是透射电子显微镜(TEM)图,图2D是X-射线粉末衍生(XRD)图,图2E是不同时间(1年内)下的UV-Vis图,图2F是Zeta电势图。
图3是本发明的红藻多糖纳米银和红藻多糖的细胞相容性结果:图3A是对小鼠单核巨噬细胞的结果,图3B是对人正常内皮细胞的结果。
图4是本发明的红藻多糖纳米银及其凝胶的抗菌结果:图4A是抑菌圈直径结果,图4B是抑菌率结果。
图5是本发明的红藻多糖纳米银凝胶对大鼠伤口愈合的结果:图5A是在19天内不同时间点伤口变化和换药、取样时间轴,图5B是对大鼠伤口愈合作用变化图,图5C是第19天组织的苏木精-伊红(HE)染色结果,图5D是对大鼠伤口愈合作用的面积变化图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式,对本发明的技术方案作进一步详细的说明。
实施例1、红藻多糖的结构与理化性质分析
本发明从海洋红藻中提取制备的多糖红外光谱如图1A所示:在3422.88cm-1的吸收是-OH的伸缩振动峰,2955.39cm-1和2903.29cm-1的吸收是-CH2的伸缩振动峰,1643.35cm-1的吸收是半缩醛基的吸收峰,1259.00cm-1为-O=S=O-的不对称伸缩振动峰信号,1073.99cm-1的吸收是糖骨架(-C-O-)的伸缩振动峰,928.61cm-1的吸收是3,6-内醚半乳糖的吸收峰,844.92cm-1的吸收是(1→3)连接的-β-D半乳糖残基中C-4取代的-SO3-特征吸收峰。本发明红藻多糖的核磁共振氢谱图如图1B所示:在3.4-4.4ppm范围的信号表明存在糖环质子,4.5ppm附近处的信号为β-D-吡喃半乳糖醛酸的H-1信号,5.1ppm附近处的信号为α-D-吡喃半乳糖醛酸(D)的H-1信号。经红外光谱和核磁共振波谱证明,本发明红藻多糖的分子骨架是由(1→3)连接的-β-D-吡喃半乳糖和(1→4)连接的3,6-内醚-α-D-吡喃半乳糖重复二糖单元组成。采用明胶比浊法测定其硫酸根含量为15%~40%;采用高效凝胶色谱法测定其重均分子量为1kDa~500kDa。
实施例2、红藻多糖纳米银及外用制剂的制备
以红藻多糖作为还原剂和稳定剂,与硝酸银溶液,在温度为30-100℃反应,调节pH为8-10,磁力搅拌0.5-5h,用纳滤法去除游离杂质进行制备,即得本发明所述的红藻多糖纳米银。所得的红藻多糖纳米银配合物中,银离子的含量为50-2000ppm。
将所述红藻多糖纳米银与水溶性基质或脂溶性基质复配,形成妇科疾病治疗外用剂型。所述外用剂型包括阴道凝胶剂、栓剂、泡腾栓剂、阴道泡腾胶囊、阴道软胶囊、阴道泡腾片和海绵栓剂。所述水溶性基质为卡波姆、甘油明胶、聚乙二醇、聚氧乙烯单硬脂酸酯类、泊洛沙姆中的一种或几种;所述脂溶性基质为可可豆酯、半合成或全合成脂肪酸甘油酯中的一种或几种,即得本发明所述的红藻多糖纳米银外用制剂。
以水溶性基质为例,称取水溶性基质,加入适量纯化水,完全溶胀,搅拌均匀。然后,将所述红藻多糖纳米银、甘油、三乙醇胺、尼泊金甲酯、尼泊金丙酯、无水乙醇按比例混合,在无菌条件下,室温下搅拌2-24h,混合均匀,即得本发明所述得红藻多糖纳米银外用制剂。其中,水溶性基质、纯化水、红藻多糖纳米银、甘油、三乙醇胺、尼泊金甲酯、尼泊金丙酯、无水乙醇的重量比为(10-40)∶(200-800)∶(150-500)∶(10-100)∶(10-60)∶(0.5-2.5)∶(0.5-2.5)∶(10-50)。
实施例3、岩藻多糖纳米银及外用制剂的制备
岩藻多糖是从海洋褐藻中提取、纯化获得的岩藻多糖硫酸酯。以岩藻多糖硫酸酯作为还原剂和稳定剂,与硝酸银溶液,在温度50-100℃反应,调节pH为8-10,磁力搅拌1-6h,用纳滤法去除游离杂质进行制备,得到岩藻多糖纳米银。所得的岩藻多糖纳米银中,银离子的含量为50-2000ppm.
将所述岩藻多糖纳米银与水溶性基质复配为例,形成妇科疾病治疗外用凝胶剂型。所述凝胶的制备方法和流程与实施例2相同,并如实施例2所述。
实施例4、褐藻胶多糖纳米银及外用制剂的制备
以褐藻胶作为还原剂和稳定剂,与硝酸银溶液,在温度为50-80℃反应,调节pH为8-10,磁力搅拌1-5h即可。所得的褐藻胶多糖纳米银中,银的含量为50-2000ppm。
将所述褐藻胶多糖纳米银与水溶性基质复配为例,形成妇科疾病治疗外用凝胶剂型。所述凝胶的制备方法和流程与实施例2相同,并如实施例2所述。
对比例1
对比例凝胶,包括以下重量比组分,水溶性基质、纯化水、甘油、三乙醇胺、尼泊金甲酯、尼泊金丙酯、无水乙醇的重量比为(10-40)∶(200-800)∶(10-100)∶(10-60)∶(0.5-2.5)∶(0.5-2.5)∶(10-50)。
实施例5、红藻多糖纳米银的表征分析
利用TU-1810紫外可见分光光度计(北京普析通用仪器有限公司,中国),马尔文粒度仪(莫尔文仪器有限公司,英国),JEM-2100EX透射电子显微镜(日本电子株式会社,日本),D-MAX 2500/PC X-射线衍射仪(日本理学株式会社,日本)对红藻多糖纳米银进行了表征,实验结果如图2所示。图2A表示红藻多糖纳米银在400-410nm左右有特征吸收峰,表明纳米银制备成功。图2B表示红藻多糖纳米银的粒径为20-200nm。图2C表明红藻多糖纳米银呈球形或椭球形结构,纳米粒分布均匀,无聚集。图2D显示有4个明显的尖峰,当2θ分别为38°、44°、65°、76°时,分别对应0价银(Ag0)面心立方的(1,1,0),(2,0,0),(2,2,0)和(3,1,1)平面,表明红藻多糖纳米银具有晶型结构。图2E显示纳米银1年内在400-410nm处UV-Vis特征吸收未发生明显变化,表明红藻多糖能够稳定纳米银,防止其聚集。图2F显示红藻多糖纳米银的Zeta电势为-30mV左右,表明红藻多糖纳米银稳定性良好。
实施例6、红藻多糖纳米银的细胞活性评价分析
利用人脐静脉内皮细胞HUVEC和小鼠单核巨噬细胞RAW264.7(中国科学院上海细胞库购买)为细胞模型,采用磺胺多巴酚B(SPR)法检测红藻多糖纳米银和红藻多糖的细胞相容性,计算细胞活力。实验结果如图3所示,图3A和图3B显示红藻多糖和红藻多糖纳米银,在系列浓度范围内对HUVEC和RAW264.7细胞增殖均无抑制活性,表明均具有良好的细胞相容性。
实施例7、红藻多糖纳米银及其凝胶的抗菌活性评价
利用大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌、铜绿假单胞菌(青岛海洋生物医药研究院提供)为病原菌模型,采用琼脂扩散法检测抗菌能力,实验结果如图4所示。图4A显示红藻多糖纳米银及其凝胶对这4种病原菌具有明显的抗菌作用。图4B显示红藻多糖纳米银及其凝胶对革兰氏阴性菌大肠杆菌、革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌和真菌白色念珠菌的抑菌率均高于99.9%,表明具有明显抑制细菌和真菌的作用。对实施例2-4和对比例1制得的凝胶样品进行大肠杆菌、金黄色葡萄糖球菌、白色念珠菌和大肠杆菌的抗菌抑菌性能检测,具体检测结果见表1,相比于其他样品的凝胶,红藻多糖纳米银凝胶具有更高效的抗菌效果。
表1:抗菌抑菌性能测试结果(5min抑菌率)
Figure BDA0003015143910000061
实施例8、红藻多糖纳米银及其凝胶的抗病毒活性评价
采用人胚肾细胞293FT细胞系(中国科学院上海细胞库购买)为细胞模型,将293FT细胞接种于96孔细胞培养板中,于37℃含5%CO2培养箱中培养24h,细胞贴壁后备用。加入稀释100倍的HPV或HSV-2假病毒颗粒混合液10μL于293FT细胞中,同时加入90μL的红藻多糖纳米银凝胶样品,搅拌混匀后室温下孵育1.5h,之后加入900μL培养基稀释,作为第一个浓度,再进行10倍和3倍梯度稀释。设立病毒对照孔,取100μL梯度稀释的病毒液加到细胞中,测定残余病毒滴度。每个浓度梯度设置6个孔检测,在37℃和5%CO2培养箱中分别培养24,48,72,96h。然后弃去培养液,用PBS清洗2次。加入200μL PBS直接于荧光显微镜下,观察并统计荧光细胞数,比较加药组与病毒对照组细胞荧光值的强弱,并计算病毒的FFU(荧光形成单位)。(操作依据:《消毒技术规范》2002版)。
实验结果如表2所示,红藻多糖纳米银凝胶72h时在不同稀释浓度下,均未观察到荧光斑点。与病毒对照组相比,红藻多糖纳米银凝胶在稀释10000倍时,对HPV假病毒颗粒感染还显示出明显的抑制作用。这说明红藻多糖纳米银凝胶具有很强的抑制HPV感染活性,且疗效比较持久。红藻多糖纳米银及其凝胶对HSV-2病毒颗粒的感染也具有明显的抑制作用。
对实施例2-4和对比例1制得的凝胶样品进行抗人乳头瘤状病毒HPV和HSV-2性能检测,具体检测结果见表3。相比于其他样品的凝胶,红藻多糖纳米银凝胶具有更强的抑制病毒效果。
表2:红藻多糖纳米银凝胶对HPV的灭活作用
Figure BDA0003015143910000071
注:“+”表示有荧光斑点,“-”表示没有荧光斑点,数值表示统计的每孔的荧光斑点数
表3:抗HPV和抗HSV-2性能测试结果
Figure BDA0003015143910000072
实施例9、红藻多糖纳米银凝胶的伤口愈合作用评价
采用SD大鼠(250-280g/只)(济南朋悦实验动物繁育有限公司,中国)为动物模型,大鼠腹腔注射10%水合氯醛(0.8mL/只)麻醉。待其完全昏迷后,用消毒电推子刮背部毛发,用75%医用酒精棉球消毒,采用YLS-5Q台式超级控温烫伤仪(济南益延科技发展有限公司,中国)在大鼠背面80℃持续10s构建(1cm×1cm)的圆形烫伤伤口。为预防休克,动物腹腔注射1mL生理盐水复苏。第1个伤口作为空白对照,不进行治疗;第2个伤口用市售磺胺吡啶银作用,作为阳性对照;而其他伤口用红藻多糖纳米银凝胶进行治疗。置于室温下(25±2℃)单独笼中饲养。每天对大鼠检查,以确保敷料正确使用。在第5、13和19天,拍摄伤口表面,并测量伤口大小,以cm为单位,如公式(1),原始创面大小的缩小百分比表示为创面收缩。
伤口收缩(%)=(伤口面积0天-伤口面积n天)/伤口面积0天×100 (1)
术后第19天,对大鼠实施安乐死。组织标本通过去除皮肤(包括整个创面和邻近的正常皮肤)并用10%福尔马林固定,石蜡包埋,切片,苏木精和伊红染色(HE),在1200F显微镜下观察(尼康H600L,德国)。
实验结果如图5所示。图5B表明与空白对照和阳性对照组相比,红藻多糖纳米银凝胶具有显著促进伤口愈合的作用,在19天时候伤口几乎愈合。图5D表明伤口面积随着天数的增加而逐渐变小。图5C是在第19天的苏木精-伊红(HE)染色的结果,相比于空白对照和阳性对照组,红藻多糖纳米银凝胶组出现了更多的毛囊、上表皮、纤维母细胞和皮脂腺,表明红藻多糖纳米银凝胶能显著促进伤口的愈合。
综上所述,红藻多糖纳米银及其凝胶具有良好的细胞相容性;在体外可以显著抑制革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌和白色念珠菌真菌;并具有明显的抗HPV和HSV-2作用。另外,红藻多糖纳米银凝胶可明显促进大鼠皮肤表面的伤口愈合程度。
本发明所述红藻多糖具有资源丰富、成本低廉和安全性高等诸多优点。本发明以红藻多糖制备的纳米银具有稳定性好、细胞相容性好、安全性高等优点,不仅可以显著抑制细菌和真菌的感染,而且可以明显降低HPV和HSV-2病毒载量。将红藻多糖纳米银制成凝胶剂、软膏剂、栓剂等外用剂型,在阴道炎、宫颈炎等妇科疾病的治疗方面,具有广阔的市场应用前景。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案,而非对其进行限制;尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明,对于本领域的普通技术人员来说,依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改,或者对其中部分技术特征进行等同替换;而这些修改或替换,并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。

Claims (10)

1.一种红藻多糖纳米银,其特征在于,所述红藻多糖纳米银是通过如下方法制得的:将红藻多糖与硝酸银溶液反应后,调整pH至碱性后搅拌,去除杂质得到红藻多糖纳米银。
2.根据权利要求1所述的红藻多糖纳米银,其特征在于,所述红藻多糖的分子骨架是由1→3连接的-β-D-吡喃半乳糖和1→4连接的3,6-内醚-α-D-吡喃半乳糖重复二糖单元组成的,其硫酸根含量为15%~40%,其化学结构式如下所示:
Figure FDA0003015143900000011
3.含有权利要求1所述的红藻多糖纳米银的抑菌凝胶,其特征在于,所述抑菌凝胶包括包括以下组分:红藻多糖纳米银、甘油、三乙醇胺、基质和防腐剂。
4.根据权利要求3所述的抑菌凝胶,其特征在于,所述抑菌凝胶中各组分的重量比为:基质∶红藻多糖纳米银∶甘油∶三乙醇胺∶防腐剂=10-40∶150-500∶10-100∶10-60∶1-5。
5.根据权利要求3所述的抑菌凝胶,其特征在于,所述基质为水溶性基质或脂溶性基质;所述水溶性基质为卡波姆、甘油明胶、聚乙二醇、聚氧乙烯单硬脂酸酯类、泊洛沙姆中的至少一种;所述脂溶性基质为可可豆酯、半合成或全合成脂肪酸甘油酯中的的至少一种。
6.权利要求1所述的红藻多糖纳米银或权利要求3所述的含有红藻多糖纳米银的抑菌凝胶在用于制备抑菌剂或/和病毒剂中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用,其特征在于,所述红藻多糖纳米银或所述抑菌凝胶能够显著抑制大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌、铜绿假单胞菌、HPV病毒、HSV-2病毒。
8.权利要求3所述的含有红藻多糖纳米银的抑菌凝胶在用于制备防治妇科疾病的外用制剂中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用,其特征在于,所述妇科疾病为病原微生物感染引起的妇科疾病。
10.根据权利要求9所述的应用,其特征在于,所述抑菌凝胶通过抑制病原微生物以及促进伤口愈合来达到防治妇科疾病的作用。
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