WO2023243525A1 - 抗菌剤ならびに抗ウイルス剤およびそれらの用途 - Google Patents
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-
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- A01P3/00—Fungicides
Abstract
フコイダンの硫酸基に銀が結合した銀結合型フコイダンを含有することを特徴とする抗菌剤または抗ウイルス剤により、フコイダンをベースとする抗菌剤や抗ウイルス剤であって、効果の高いものを提供する。
Description
本発明は、銀結合型フコイダンを含有する抗菌剤ならびに抗ウイルス剤およびそれらの用途に関する。
菌やウイルスによる感染症は、人々の生活に大きな影響を及ぼすものである。感染症を予防するためには、ヒトがマスク等の衛生製品を装着する他、ヒトが接触する場所に抗菌剤や抗ウイルス剤等を使用すること等が考えられる。
これまで抗菌や抗ウイルスに使用される薬剤は、アルコール系のものが多く、ヒトによってはかぶれたりすることがあった。
本発明者らは、食用にされているような天然物由来の成分でより安全な抗菌剤や抗ウイルス剤を探索しており、褐藻由来のフコイダンが候補に挙がった。このフコイダンはコロナウイルスの侵入阻害やコロナウイルスとヘパリンの接着を阻害することが知られている（非特許文献１、２）が、その効果は決して高いものではなかった。
Sung-Kun Yim , et. al.," Inhibition of SARS-CoV-2 Virus Entry by the Crude Polysaccharides of Seaweeds and Abalone Viscera In Vitro", Mar. Drugs 2021, 19, 219.
Paul S. Kwon, et. al.," Sulfated polysaccharides effectively inhibit SARS-CoV-2 in vitro", Cell Discovery ( 2020) 6:50.
従って、本発明の課題は、フコイダンをベースとする抗菌剤や抗ウイルス剤であって、効果の高いものを提供することを課題とした。
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究したところ、フコイダンの硫酸基に銀を結合させた銀結合型フコイダンを用いることにより、優れた抗菌剤および抗ウイルス剤となることを見出し、本発明を完成させた。
すなわち、本発明はフコイダンの硫酸基に銀が結合した銀結合型フコイダンを含有することを特徴とする抗菌剤または抗ウイルス剤である。
また、本発明は、上記抗菌剤および抗ウイルス剤を被処理物に処理したことを特徴とする抗菌・抗ウイルス製品である。
更に、本発明は、フコイダンの硫酸基に銀が結合したことを特徴とする銀結合型フコイダンである。
本発明の抗菌剤または抗ウイルス剤は効果が高く、また、安全性も高いものである。
従って、本発明の抗菌剤または抗ウイルス剤は、ヒトが接触する場所に散布等したり、これを衛生製品等の被処理物に処理したり、咽喉や鼻腔に噴霧したり、あるいは飲食品として摂取することにより、感染症の対策に利用できる。
本発明の抗菌剤は、フコイダンの硫酸基に銀が結合した銀結合型フコイダンを含有するものである。
上記銀結合型フコイダンの原料となるフコイダンは、褐藻類に特有の多糖で、硫酸化されたフコースを構成糖に有するものである。褐藻類は特に限定されないが、例えば、オキナワモズク（Cladosiphon okamuranus）ワカメ（Undaria pinnatifida）、アカモク（Sargassum horneri (Turner) C.Agardh）、マコンブ（Laminaria Japonica Areschoug）、ヒバマタ（Fucus distichus）、ホンダワラ（Sargassum fulvellum）等が挙げられる。これらの中でもオキナワモズク由来のオキナワモズクフコイダンが好ましい。このオキナワモズクフコイダンはα１,３結合したフコースを主鎖として、フコース４～６分子にグルクロン酸が１分子結合したものであり、また、フコースの半分は硫酸化されているものである。
これらフコイダンは、文献（M.Nagaoka,et al. : Structural study of fucoidan from Cladosiphon okamuranus TOKIDA.Glycoconjugate Journal 16 : 19-26,1999）や、特許（特許第３９２０９５４号）記載の方法等で抽出したもの等を特に制限なく使用することができる。更に、フコイダンは、塩酸などの酸で加水分解したものでもよいし、例えば、前記特許記載の限外ろ過膜を用いる酸洗浄、電気透析、イオン交換カラム等による精製処理をしてもよい。
フコイダンの分子量は特に限定されないが、例えば、５～２５０ｋＤａ、好ましくは２０～２００ｋＤａである。なお、この分子量はサイズ排除クロマトグラフィーで測定される値である。
このようなフコイダンは、ヤクルトフコイダン等としてヤクルト薬品工業株式会社等から市販されているものを利用してもよい。
上記フコイダンの硫酸基に、銀を結合させる方法は、フコイダンの硫酸基に、銀を結合できる方法であれば特に限定されないが、例えば、イオン交換樹脂、電気透析あるいは限外濾過膜を用いる方法等が挙げられる。
上記、銀を結合させる方法に用いるフコイダンは、特に限定されず、フコイダンを水等に溶解させた溶液等が挙げられる。この溶液におけるフコイダンの含有量は特に限定されないが、例えば、０．０００２～１０質量％（以下、単に「％」という）、好ましくは０．１～８％である。この溶液のｐＨは特に限定されないが２～１２、好ましくは４～１０である。
上記で用いられる銀は、特に限定されず、硝酸銀等を水等に溶解させた溶液等が挙げられる。この溶液における銀の含有量は特に限定されないが、例えば、硝酸銀換算で０．０５μＭ～２０Ｍ、好ましくは０．６μＭ～１５Ｍである。また、この溶液のｐＨは特に限定されないが２～１２、好ましくは４～１０である。
具体的にイオン交換樹脂を用いてフコイダンの硫酸基に、銀を結合させる方法は次のようになる。まず、０．６μＭ～１５Ｍの硝酸銀溶液を、陽イオン交換樹脂を充填したカラムに添加して０．１～２時間室温で反応させた後、脱イオン水をカラムに通液する。一方フコイダンを脱イオン交換水に１～３０ｍｇ／ｍＬになるよう溶解し、前記カラムに添加して０．１～２時間室温で反応させる。反応後、反応液およびカラムの１～５倍量の脱イオン水で通液を回収する。これにより銀結合型フコイダンが得られる。
なお、フコイダンの硫酸基に結合される銀の量を多くするには、銀溶液の濃度を高くする、陽イオン交換樹脂の量を増やす、陽イオン交換樹脂に複数回通過させるなど反応時間を長くする、反応の際に撹拌する等すればよい。
上記のようにしてフコイダンの硫酸基に、銀を結合させた後は、更に、透折等の洗浄、凍結乾燥、スプレードライ等の乾燥、クロマトグラフィー、限外ろ過および二相分配等の精製を行ってもよい。
斯くして得られる銀結合型フコイダンは、フコイダンの硫酸基に銀が結合している。フコイダンと、銀の質量比は特に限定されないが、１：０．０００１以上、好ましくは１：０．００１以上、更に好ましくは１：０．０１～０．２である。なお、フコイダンの硫酸基に結合した銀の量は、例えば、誘導結合プラズマ発光分析等により測定することができる。
銀結合型フコイダンは、抗菌作用を有する。ここで抗菌作用とは、菌の増殖抑制効果、殺菌効果等をいい、特に菌の増殖抑制効果をさす。菌の増殖を抑制するとは、菌が増殖しない、あるいは、増殖速度が抑えられることをいい、具体的には銀結合型フコイダン１００μｇ／ｍＬを菌と接触させた場合、銀結合型フコイダンを入れていなかった場合と比較して、菌数の増殖が５０％以下、好ましくは９０％以下に抑えられることをいう。
具体的には、菌の増殖抑制とは、グラム陰性菌、グラム陽性菌および真菌の増殖を抑制することをいう。上記グラム陰性菌としては、例えば、大腸菌、サルモネラ菌、腸炎ビブリオ菌、肺炎桿菌、および緑膿菌等が挙げられる。また、上記グラム陽性菌としては、例えば、黄色ブドウ球菌、ウェルシュ菌、レジオネラ菌、セレウス菌、および枯草菌等が挙げられる。更に、上記真菌としては、例えば、クロコウジカビ類、アオカビ類、クロカビ類等が挙げられる。これらの菌の中でも、大腸菌、サルモレラ菌、黄色ブドウ球菌、ウェルシュ菌、表皮ブドウ球菌が好ましく、大腸菌、表皮ブドウ球菌、クロカビ類がより好ましい。銀結合型フコイダンはこれら菌の１種以上の増殖を抑制することができる。
また、銀結合型フコイダンは、抗ウイルス作用を有する。ここで抗ウイルス作用とは、ウイルス感染抑制作用および／またはウイルスの増殖抑制効果のことをいう。具体的には、ウイルスと細胞の接着を阻害してウイルスの感染を抑制すること、ウイルスの増殖を抑制することをいう。
ここでウイルスと細胞の接着を阻害するとは、例えば、ウイルスが細胞を認識する際に利用する細胞表面に発現する分子や受容体とウイルスの結合を阻害することをいい、好ましくはウイルスとヘパラン硫酸の接着を阻害することをいう。なお、ヘパラン硫酸は細胞表面に存在するものである。ここで阻害とは接着する確率を減らすことをいう。具体的には、へパラン硫酸の一種であるヘパリンとウイルスのスパイクタンパク質の存在下に、銀結合型フコイダンを１００μｇ／ｍＬ添加した場合、銀結合型フコイダンを入れていなかった場合と比較して、ヘパリンとスパイクタンパク質の結合が９０％以下に抑えられることをいう。前記ウイルスとしては、細胞表面のヘパラン硫酸と接着するウイルスであれば特に限定されないが、例えば、コロナウイルス、ヘルペスウイルス等が挙げられる。
また、ウイルスの増殖を抑制するとは、ウイルスに直接作用してウイルスの増殖を阻害することをいい、好ましくはウイルスが増殖しない、あるいは増殖速度が低下することをいう。前記ウイルスとしては、例えば、コロナウイルス、インフルエンザウイルス、ノロウイルス、ネコカリシウイルス、デングウイルス、ヘルペスウイルス、アデノウイルス、ＲＳウイルス、ライノウイルス、パラインフルエンザウイルス等のウイルスが挙げられ、好ましくはコロナウイルス、インフルエンザウイルス、ノロウイルス、ヘルペスウイルス等が挙げられる。銀結合型フコイダンはこれらウイルスの１種以上の増殖を抑制することができる。
上記した銀結合型フコイダンは、抗菌作用、抗ウイルス作用を有するので、これを抗菌剤、抗ウイルス剤として用いることができる。本発明の抗菌剤および抗ウイルス剤は、従来の抗菌剤や抗ウイルス剤と同様に用いることができる。また、上記した銀結合型フコイダンは、ウイルスを接着し不活化させる効果を有するため、非常に抗ウイルス効果の高いものである。
また、本発明の抗菌剤および抗ウイルス剤には、本発明の効果を損なわない限り、例えば、香料、エタノール等を含有させてもよい。
本発明の抗菌剤および抗ウイルス剤の剤形は特に限定されないが、例えば、液剤、粉末剤、散剤、錠剤、顆粒剤、カプセル剤等が挙げられる。これらの中でも液剤が好ましい。
より具体的に、本発明の抗菌剤および抗ウイルス剤は、例えば、ヒトが接触する場所に散布等することができる。人が接触する場所は特に限定されないが、例えば、ドアノブ、テーブル、椅子、仕切り、玩具、トレーニング器具、エレベーター等のボタン等が挙げられる。この場合の抗菌剤や抗ウイルス剤の使用量は特に限定されないが、例えば、１ｃｍ２あたり、（銀結合型フコイダン換算で）１ｎｇ～２００μｇ、好ましくは２ｎｇ～１００μｇである。散布には、スプレー等を利用すればよい。
また、本発明の抗菌剤および抗ウイルス剤は、例えば、これを衛生製品等の被処理物に処理することができる。本発明の抗菌剤および抗ウイルス剤を、衛生製品等の被処理物に処理する方法は特に限定されず、例えば、塗布、コーティング等の方法が挙げられる。衛生製品としては、マスク、ウェットティッシュ等が挙げられる。この場合の抗菌剤や抗ウイルス剤の処理量は特に限定されないが、例えば、１ｃｍ２あたり、１ｎｇ～２００μｇ、好ましくは２ｎｇ～１００μｇである。これにより被処理物が抗菌および抗ウイルス作用を有することになる。処理にはスプレー、ブラシ等を利用すればよい。
更に、本発明の抗菌剤および抗ウイルス剤は、例えば、咽喉や鼻腔に噴霧して、あるいはマウスウォッシュなどのように咽頭に接触させて使用することができる。この場合の抗菌剤や抗ウイルス剤の使用量は特に限定されないが、例えば、１ｍｌあたり、０．１μｇ～２０ｍｇ、好ましくは０．５μｇ～１５ｍｇ、更に好ましくは１０μｇ～１０ｍｇ、特に好ましくは１００μｇ～５ｍｇである。噴霧には、スプレー等を利用すればよい。
更に、本発明の抗菌剤および抗ウイルス剤は、例えば、トローチ、飴、飲料、ゼリー等の飲食品に使用することも可能である。この場合の抗菌剤や抗ウイルス剤の使用量は特に限定されないが、例えば、１ｍｌまたは１ｇあたり、０．１μｇ～５ｍｇ、好ましくは０．５μｇ～５ｍｇ、更に好ましくは、１０μｇ～５ｍｇ、特に好ましくは１００μｇ～５ｍｇである。
本発明の抗菌剤および抗ウイルス剤を特に茶飲料に使用する場合には、例えば、特許第３５７９５９７号公報等に記載のフコイダンを含有する茶飲料のフコイダンに代えて銀結合型フコイダンを用いればよい。
本発明の抗菌剤および抗ウイルス剤は、上記のようにして感染症の対策に利用することができる。
以下、本発明の実施例を挙げて詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に何ら限定されるものではない。
実 施 例 １
銀結合型フコイダンの調製：
２Ｍ硝酸銀溶液を陽イオン交換樹脂（Ｄｏｗｅｘ５０、富士フイルムワコーケミカル製）を充填したカラムに添加して１時間室温で反応させた後、脱イオン水をカラムに通液した。オキナワモズクフコイダン（ヤクルトフコイダン、ヤクルト薬品工業製、分子量７９ｋＤａ）を脱イオン交換水に１０ｍｇ／ｍＬになるよう溶解し、前記カラムに添加して１時間室温で反応させた。反応後、反応液およびカラムの５倍量の脱イオン水通液を回収し、凍結乾燥して硫酸基に銀が結合した銀結合型フコイダンを得た。なお、銀結合型フコイダンにおける銀の含有量を誘導結合プラズマ発光分析で測定したところ１ｍｇあたり０．０３７ｍｇであった。
銀結合型フコイダンの調製：
２Ｍ硝酸銀溶液を陽イオン交換樹脂（Ｄｏｗｅｘ５０、富士フイルムワコーケミカル製）を充填したカラムに添加して１時間室温で反応させた後、脱イオン水をカラムに通液した。オキナワモズクフコイダン（ヤクルトフコイダン、ヤクルト薬品工業製、分子量７９ｋＤａ）を脱イオン交換水に１０ｍｇ／ｍＬになるよう溶解し、前記カラムに添加して１時間室温で反応させた。反応後、反応液およびカラムの５倍量の脱イオン水通液を回収し、凍結乾燥して硫酸基に銀が結合した銀結合型フコイダンを得た。なお、銀結合型フコイダンにおける銀の含有量を誘導結合プラズマ発光分析で測定したところ１ｍｇあたり０．０３７ｍｇであった。
試 験 例 １
大腸菌増殖抑制活性の測定：
実施例１で調製した銀結合型フコイダン（ＡｇＦ）の終濃度が１０μｇ／ｍＬ、１００μｇ／ｍＬ、１０００μｇ／ｍＬになるようTryptic soy broth（ＴＳＢ）に溶解し、これにそれぞれ大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ１２系統株）をＴＳＢで２４時間培養した培養液を５％添加した。これを３７℃の条件で培養し、各時間におけるＯＤ６００ｎｍを測定して大腸菌の増殖抑制活性を調べた。また、比較として、オキナワモズクフコイダン（Ｆ）（ヤクルトフコイダン、ヤクルト薬品工業製、分子量７９ｋＤａ）を１０μｇ／ｍＬ、１００μｇ／ｍＬ、１，０００μｇ／ｍＬ、１０，０００μｇ／ｍＬ添加したものについても大腸菌の増殖抑制活性を調べた。これらの結果を図１に示した。
大腸菌増殖抑制活性の測定：
実施例１で調製した銀結合型フコイダン（ＡｇＦ）の終濃度が１０μｇ／ｍＬ、１００μｇ／ｍＬ、１０００μｇ／ｍＬになるようTryptic soy broth（ＴＳＢ）に溶解し、これにそれぞれ大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ１２系統株）をＴＳＢで２４時間培養した培養液を５％添加した。これを３７℃の条件で培養し、各時間におけるＯＤ６００ｎｍを測定して大腸菌の増殖抑制活性を調べた。また、比較として、オキナワモズクフコイダン（Ｆ）（ヤクルトフコイダン、ヤクルト薬品工業製、分子量７９ｋＤａ）を１０μｇ／ｍＬ、１００μｇ／ｍＬ、１，０００μｇ／ｍＬ、１０，０００μｇ／ｍＬ添加したものについても大腸菌の増殖抑制活性を調べた。これらの結果を図１に示した。
大腸菌に対し、オキナワモズクフコイダンは１０,０００μｇ／ｍＬで初めて増殖抑制活性を示したのに対して、銀結合型フコイダンは１０μｇ／ｍＬで増殖抑制活性を示した。
試 験 例 ２
大腸菌増殖抑制活性の測定：
実施例１で調製した銀結合型フコイダン（ＡｇＦ）、オキナワモズクフコイダン（Ｆ）（ヤクルトフコイダン、ヤクルト薬品工業製、分子量７９ｋＤａ）、硝酸銀（Ａｇ）、オキナワモズクフコイダンと硝酸銀の混合液（Ａｇ＋Ｆ）を表１に記載の濃度にしたものを用いて、試験例１と同様にして大腸菌の増殖抑制活性を調べた。これらの結果を図２に示した。
大腸菌増殖抑制活性の測定：
実施例１で調製した銀結合型フコイダン（ＡｇＦ）、オキナワモズクフコイダン（Ｆ）（ヤクルトフコイダン、ヤクルト薬品工業製、分子量７９ｋＤａ）、硝酸銀（Ａｇ）、オキナワモズクフコイダンと硝酸銀の混合液（Ａｇ＋Ｆ）を表１に記載の濃度にしたものを用いて、試験例１と同様にして大腸菌の増殖抑制活性を調べた。これらの結果を図２に示した。
大腸菌に対して、銀結合型フコイダンは、同量の銀およびフコイダン単独およびそれらの混合液より顕著に高い増殖抑制効果を示した。
試 験 例 ３
コロナウイルス接着阻害活性の測定：
実施例１で調製した銀結合型フコイダン（ＡｇＦ）を用いて、コロナウイルスのヘパラン硫酸への結合阻害効果を確認した。Ｂｉａｃｏｒｅ（Ｃｙｔｉｖａ社）を用いてＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質とヘパリン（ＨＰ、ヘパラン硫酸の一種）の結合の阻害効果を調べた。チップに固定したＨＰに対し、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質（１００ｎＭ）にＡｇＦを１００または５００ｎｇ／ｍＬ添加し、結合量（Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ Ｕｎｉｔ）を測定した。陽性対照としてＡｇＦに変えて、ＨＰを用いた系を行った。それぞれの系を３回ずつ行い、平均した結果を図３に示す（図中のバーは標準偏差を示す）。
コロナウイルス接着阻害活性の測定：
実施例１で調製した銀結合型フコイダン（ＡｇＦ）を用いて、コロナウイルスのヘパラン硫酸への結合阻害効果を確認した。Ｂｉａｃｏｒｅ（Ｃｙｔｉｖａ社）を用いてＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質とヘパリン（ＨＰ、ヘパラン硫酸の一種）の結合の阻害効果を調べた。チップに固定したＨＰに対し、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質（１００ｎＭ）にＡｇＦを１００または５００ｎｇ／ｍＬ添加し、結合量（Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ Ｕｎｉｔ）を測定した。陽性対照としてＡｇＦに変えて、ＨＰを用いた系を行った。それぞれの系を３回ずつ行い、平均した結果を図３に示す（図中のバーは標準偏差を示す）。
図３より、ＡｇＦがコロナウイルスのスパイクタンパク質とＨＰの結合を阻害することが確認された。
実 施 例 ２
抗菌・抗ウイルス剤の製造：
以下の処方の各成分を混合して抗菌・抗ウイルス剤を製造した。
（成分）
銀結合型フコイダン（実施例１で調製したもの） ０．０１％
水 ９９．９９％
抗菌・抗ウイルス剤の製造：
以下の処方の各成分を混合して抗菌・抗ウイルス剤を製造した。
（成分）
銀結合型フコイダン（実施例１で調製したもの） ０．０１％
水 ９９．９９％
この抗菌・抗ウイルス剤を、スプレーにてドアノブに噴霧し、乾燥させた。
実 施 例 ３
抗菌・抗ウイルス剤の製造：
以下の処方の各成分を混合して抗菌・抗ウイルス剤を製造した。
（成分）
銀結合型フコイダン（実施例１で調製したもの） ０．０１％
水 ９９．９８％
香料 ０．０１％
抗菌・抗ウイルス剤の製造：
以下の処方の各成分を混合して抗菌・抗ウイルス剤を製造した。
（成分）
銀結合型フコイダン（実施例１で調製したもの） ０．０１％
水 ９９．９８％
香料 ０．０１％
この抗菌・抗ウイルス剤を、スプレーにてマスクにまんべんなく噴霧し、乾燥させて抗菌・抗ウイルスマスクを製造した。
実 施 例 ４
抗菌・抗ウイルス剤の製造：
以下の処方の各成分を混合して抗菌・抗ウイルス剤を製造した。
（成分）
銀結合型フコイダン（実施例１で調製したもの） ０．０１％
水 ９５．９８％
マルチトール ４．００％
香料 ０．０１％
抗菌・抗ウイルス剤の製造：
以下の処方の各成分を混合して抗菌・抗ウイルス剤を製造した。
（成分）
銀結合型フコイダン（実施例１で調製したもの） ０．０１％
水 ９５．９８％
マルチトール ４．００％
香料 ０．０１％
この抗菌・抗ウイルス剤を、スプレーにて咽喉や鼻腔に噴霧した。
実 施 例 ５
抗菌・抗ウイルス剤を含む飲料の製造：
以下の処方の各成分を混合して抗菌・抗ウイルス剤を含む飲料を製造した。
（成分）
銀結合型フコイダン（実施例１で調製したもの） ０．０１％
茶抽出液 ９９．９９％
抗菌・抗ウイルス剤を含む飲料の製造：
以下の処方の各成分を混合して抗菌・抗ウイルス剤を含む飲料を製造した。
（成分）
銀結合型フコイダン（実施例１で調製したもの） ０．０１％
茶抽出液 ９９．９９％
実 施 例 ６
銀結合型フコイダンの調製：
（１）陽イオン交換樹脂の洗浄
陽イオン交換樹脂（強酸性陽イオン交換樹脂 Ｎｏ．４、架橋度８％、５０－１００メッシュ、Ｈ形、ＦＵＪＩＦＩＬＭ Ｗａｋｏ ３５５－４５６８）６０ｍＬを入れたカラムに、樹脂容量の５倍量の１Ｍ塩酸、４倍量の超純水、３倍量の１Ｍ水酸化ナトリウム溶液の順で通液した後、３倍量の１Ｍ水酸化ナトリウム溶液を添加し、ガラス棒で時々攪拌しながら６５℃、２時間反応させた。この操作をもう一度繰り返した。
銀結合型フコイダンの調製：
（１）陽イオン交換樹脂の洗浄
陽イオン交換樹脂（強酸性陽イオン交換樹脂 Ｎｏ．４、架橋度８％、５０－１００メッシュ、Ｈ形、ＦＵＪＩＦＩＬＭ Ｗａｋｏ ３５５－４５６８）６０ｍＬを入れたカラムに、樹脂容量の５倍量の１Ｍ塩酸、４倍量の超純水、３倍量の１Ｍ水酸化ナトリウム溶液の順で通液した後、３倍量の１Ｍ水酸化ナトリウム溶液を添加し、ガラス棒で時々攪拌しながら６５℃、２時間反応させた。この操作をもう一度繰り返した。
（２）樹脂の活性化および銀イオン化
洗浄後、４倍量の超純水に樹脂を懸濁した。洗浄した樹脂に３倍量の１Ｍ水酸化ナトリウム溶液、３倍量の超純水、１倍量の４Ｍ塩酸、３倍量の１Ｍ塩酸の順に通液して樹脂を活性化し、５倍量の超純水（ｐＨが超純水と同程度になるまで）を通液して洗浄した。活性化した樹脂に２．５倍量の２Ｍ硝酸銀溶液を添加して２５℃で６０時間、樹脂が動く程度に振盪して通液した。引き続き、カラムに３倍量の１Ｍ硝酸銀溶液を通液した後、５倍量の超純水を通液して洗浄することで銀イオン化した樹脂を調製した。
洗浄後、４倍量の超純水に樹脂を懸濁した。洗浄した樹脂に３倍量の１Ｍ水酸化ナトリウム溶液、３倍量の超純水、１倍量の４Ｍ塩酸、３倍量の１Ｍ塩酸の順に通液して樹脂を活性化し、５倍量の超純水（ｐＨが超純水と同程度になるまで）を通液して洗浄した。活性化した樹脂に２．５倍量の２Ｍ硝酸銀溶液を添加して２５℃で６０時間、樹脂が動く程度に振盪して通液した。引き続き、カラムに３倍量の１Ｍ硝酸銀溶液を通液した後、５倍量の超純水を通液して洗浄することで銀イオン化した樹脂を調製した。
（３）フコイダンへの銀イオン付加
オキナワモズクフコイダン（ヤクルトフコイダン、ヤクルト薬品工業製、分子量７９ｋＤａ）を超純水で１０ｍｇ／ｍＬに溶解し、３μｍフィルター（ＡＤＶＡＮＴＥＣ、Ｃ３００Ａ０４７Ａ）でろ過後、透析膜（ＭＷＣＯ７０００、Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ Ｎｏ．１ １３２６５５）で３日間、超純水を交換しながら透析を行い、このフコイダン溶液を試験に供した。銀イオン化した樹脂およびフコイダン溶液をメデューム瓶に移し、２５℃で６０時間、樹脂が動く程度に振盪しながら反応させた。樹脂およびフコイダン溶液をカラムに移し、３倍量の超純水を通液した後、その通液を凍結乾燥し、銀結合型フコイダンの凍結乾燥品を得た。なお、銀結合型フコイダンにおける銀の含有量を誘導結合プラズマ発光分析で測定したところ１ｍｇあたり０．１３７ｍｇであった。
オキナワモズクフコイダン（ヤクルトフコイダン、ヤクルト薬品工業製、分子量７９ｋＤａ）を超純水で１０ｍｇ／ｍＬに溶解し、３μｍフィルター（ＡＤＶＡＮＴＥＣ、Ｃ３００Ａ０４７Ａ）でろ過後、透析膜（ＭＷＣＯ７０００、Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ Ｎｏ．１ １３２６５５）で３日間、超純水を交換しながら透析を行い、このフコイダン溶液を試験に供した。銀イオン化した樹脂およびフコイダン溶液をメデューム瓶に移し、２５℃で６０時間、樹脂が動く程度に振盪しながら反応させた。樹脂およびフコイダン溶液をカラムに移し、３倍量の超純水を通液した後、その通液を凍結乾燥し、銀結合型フコイダンの凍結乾燥品を得た。なお、銀結合型フコイダンにおける銀の含有量を誘導結合プラズマ発光分析で測定したところ１ｍｇあたり０．１３７ｍｇであった。
試 験 例 ４
表皮ブドウ球菌増殖抑制活性の測定：
表皮ブドウ球菌（Staphylococcus epidermidis ATCC 14990：基準株）をＴＳＢ３ｍＬに植菌して３７℃で前培養した。実施例６で調製した銀結合型フコイダン（ＡｇＦ）、オキナワモズクフコイダン（Ｆ）（ヤクルトフコイダン、ヤクルト薬品工業製、分子量７９ｋＤａ）および硝酸銀（Ａｇ）をそれぞれ１ｍｇ／ｍＬ、１０ｍｇ／ｍＬおよび２ｍｇ／ｍＬの濃度に純水で調製し、４℃で２４時間攪拌しながら溶解した。これらを０．４５μｍフィルターでろ過したのち、ＴＳＢで希釈調製した５０、１００および２００μｇ／ｍＬの銀結合型フコイダン、ならびに各濃度の銀結合型フコイダンに相当するフコイダン溶液、銀（硝酸銀）溶液、硝酸銀とフコイダンの混合液（表２）をそれぞれ１９０μＬと前培養液１０μＬを混ぜた。その後、酸素透過性が高いプレートシール（ＢＥＭ－１、ＤＩＶＥＲＳＩＦＩＥＤ ＢＩＯＴＥＣＨ）をして３７℃で培養しながら濁度（６００ｎｍ）を経時的に測定した（ｎ＝３、Ｉｎｆｉｎｉｔｅ Ｍ２００ ＰＲＯ、Ｔｅｃａｎ）。ＴＳＢのみに前培養液を混ぜた条件を対照とした。
表皮ブドウ球菌増殖抑制活性の測定：
表皮ブドウ球菌（Staphylococcus epidermidis ATCC 14990：基準株）をＴＳＢ３ｍＬに植菌して３７℃で前培養した。実施例６で調製した銀結合型フコイダン（ＡｇＦ）、オキナワモズクフコイダン（Ｆ）（ヤクルトフコイダン、ヤクルト薬品工業製、分子量７９ｋＤａ）および硝酸銀（Ａｇ）をそれぞれ１ｍｇ／ｍＬ、１０ｍｇ／ｍＬおよび２ｍｇ／ｍＬの濃度に純水で調製し、４℃で２４時間攪拌しながら溶解した。これらを０．４５μｍフィルターでろ過したのち、ＴＳＢで希釈調製した５０、１００および２００μｇ／ｍＬの銀結合型フコイダン、ならびに各濃度の銀結合型フコイダンに相当するフコイダン溶液、銀（硝酸銀）溶液、硝酸銀とフコイダンの混合液（表２）をそれぞれ１９０μＬと前培養液１０μＬを混ぜた。その後、酸素透過性が高いプレートシール（ＢＥＭ－１、ＤＩＶＥＲＳＩＦＩＥＤ ＢＩＯＴＥＣＨ）をして３７℃で培養しながら濁度（６００ｎｍ）を経時的に測定した（ｎ＝３、Ｉｎｆｉｎｉｔｅ Ｍ２００ ＰＲＯ、Ｔｅｃａｎ）。ＴＳＢのみに前培養液を混ぜた条件を対照とした。
表皮ブドウ球菌に対する銀結合型フコイダンの増殖抑制作用は、いずれの濃度でも銀フコイダンに相当するフコイダン溶液、銀（硝酸銀）溶液および硝酸銀とフコイダンの混合液より高かった（図４）。銀結合型フコイダンは表皮ブドウ球菌に対しては５０μｇ／ｍＬ以上で増殖抑制作用を示し、銀イオンとフコイダンがイオン結合することで表皮ブドウ球菌に対しては少なくとも５０～２００μｇ／ｍＬで相乗効果を示すと考えられた。
試 験 例 ５
クロカビ増殖抑制活性の測定：
（独）製品評価技術基盤機構から入手したクロカビ（Cladosporium cladosporioides NBRC 6368）をｐｏｔａｔｏ ｄｅｘｔｒｏｓｅ ａｇａｒ（ＰＤＡ、日本製薬（株））に播種して２５℃で２２日間培養し、１回継代した後さらに２６日間培養した。生育したクロカビをＰＤＡごとくり抜き、保護培地（１０％グリセロール、５％トレハロース溶液）に浸漬して凍結ストックを作製した。次に、凍結ストックを融解し、サブロー寒天培地（Ｒｅｍｅｌ）に播種して２５℃で７日間培養した。生育したクロカビの表面をコンラージ棒で擦り取ってサブロー液体培地（Ｏｘｏｉｄ）に懸濁させ、キムワイプを詰めた漏斗でろ過し、得られたろ液を胞子液とした。胞子液中の胞子数を血球計算盤を用いてカウントし、１０７個／ｍＬとなるようにサブロー液体培地で調製した。
クロカビ増殖抑制活性の測定：
（独）製品評価技術基盤機構から入手したクロカビ（Cladosporium cladosporioides NBRC 6368）をｐｏｔａｔｏ ｄｅｘｔｒｏｓｅ ａｇａｒ（ＰＤＡ、日本製薬（株））に播種して２５℃で２２日間培養し、１回継代した後さらに２６日間培養した。生育したクロカビをＰＤＡごとくり抜き、保護培地（１０％グリセロール、５％トレハロース溶液）に浸漬して凍結ストックを作製した。次に、凍結ストックを融解し、サブロー寒天培地（Ｒｅｍｅｌ）に播種して２５℃で７日間培養した。生育したクロカビの表面をコンラージ棒で擦り取ってサブロー液体培地（Ｏｘｏｉｄ）に懸濁させ、キムワイプを詰めた漏斗でろ過し、得られたろ液を胞子液とした。胞子液中の胞子数を血球計算盤を用いてカウントし、１０７個／ｍＬとなるようにサブロー液体培地で調製した。
試験例４と同様にして純水で溶解した後、ＴＢＳの代わりにサブロー液体培地で希釈調製した１０、２０および４０μｇ／ｍＬの銀結合型フコイダン、ならびに各濃度の銀結合型フコイダンに相当するフコイダン溶液、銀（硝酸銀）溶液、銀とフコイダンの混合液（表３）をそれぞれ１９０μＬと胞子液（胞子数１０７個／ｍＬ）１０μＬを混ぜた後、酸素透過性が高いプレートシール（ＢＥＭ－１、ＤＩＶＥＲＳＩＦＩＥＤ ＢＩＯＴＥＣＨ）をして２５℃で培養しながら濁度（６００ｎｍ）を経時的に測定し（ｎ＝３、Ｉｎｆｉｎｉｔｅ Ｍ２００ ＰＲＯ、Ｔｅｃａｎ）、培養開始時からの濁度変化量を算出した。サブロー液体培地に胞子液を混ぜた条件を対照とした。
クロカビに対して、１０μｇ／ｍＬの銀結合型フコイダン、銀結合型フコイダンに相当する硝酸銀溶液および硝酸銀とフコイダンの混合液ではいずれも増殖抑制は認められなかったが、２０μｇ／ｍＬの銀結合型フコイダンは、銀結合型フコイダンに相当する硝酸銀溶液および硝酸銀とフコイダンの混合液より高い増殖抑制作用を示した（図５）。また、４０μｇ／ｍＬの銀結合型フコイダン、銀結合型フコイダンに相当する硝酸銀溶液および硝酸銀とフコイダンの混合液はいずれも培養６０時間の増殖を抑制した。フコイダン溶液はいずれの濃度でも増殖を抑制しなかった。銀結合型フコイダンは、クロカビに対しては２０μｇ／ｍＬ以上で増殖抑制作用を示し、銀イオンとフコイダンがイオン結合することでクロカビに対しては少なくとも２０～４０μｇ／ｍＬで相乗効果を示すと考えられた。
試 験 例 ６
ＳＡＲＳ２－ＣｏＶ－２の細胞感染阻害活性の測定：
（１）試験物質の調製
実施例６で調製した銀結合型フコイダンを、Ｍｉｌｌｉ Ｑ水で１００μｇ／ｍＬに調製した。これを０．４５μｍフィルターでろ過した後、１０倍段階希釈（１００ｎｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌ）して実験に供した。
ＳＡＲＳ２－ＣｏＶ－２の細胞感染阻害活性の測定：
（１）試験物質の調製
実施例６で調製した銀結合型フコイダンを、Ｍｉｌｌｉ Ｑ水で１００μｇ／ｍＬに調製した。これを０．４５μｍフィルターでろ過した後、１０倍段階希釈（１００ｎｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌ）して実験に供した。
（２）ルシフェラーゼ発光を用いたウイルス細胞感染評価
ルシフェラーゼ遺伝子の挿入によりエンベロープタンパク質をコードする遺伝子を欠損した水疱性口内炎ウイルス（Ｖｅｓｉｃｕｌａｒ ｓｔｏｍａｔｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ； ＶＳＶ）に、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質を外套させたシュードタイプウイルス（ＳＡＲＳ２－ｐｖ）を既報（Ｔａｎｉ ｅｔ ａｌ． Ｖｉｒｏｌ Ｊ （２０２１） １８：１６）に従って調製した。アンジオテンシン変換酵素２（ＡＣＥ２）安定発現細胞株を９６ｗｅｌｌ Ｗｈｉｔｅ／Ｃｌｅａｒ Ｂｏｔｔｏｍ Ｐｌａｔｅ（Ｔｈｅｒｍｏ ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に２×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで播種した。翌日、１０μＬ試験物質と１０μＬＳＡＲＳ２－ｐｖを混合し、室温で５分間反応後、細胞の培養上清に添加した。２４時間培養した後、２０μＬ／ｗｅｌｌピッカジーンＢｒｉｌｌｉａｎＳｔａｒ－ＬＴ発光試薬（東洋ビーネット）を添加し、５分間静置後にＳｐｅｃｔｒａｍａｘ Ｍ５ｅ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を用いてルシフェラーゼによる発光を測定した。ＳＡＲＳ２－ｐｖの細胞感染阻害効果は、ＳＡＲＳ２－ｐｖと溶媒（Ｍｉｌｌｉ Ｑ水）を混合して添加したｗｅｌｌの発光強度を１００％としたときの割合で示した。
ルシフェラーゼ遺伝子の挿入によりエンベロープタンパク質をコードする遺伝子を欠損した水疱性口内炎ウイルス（Ｖｅｓｉｃｕｌａｒ ｓｔｏｍａｔｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ； ＶＳＶ）に、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質を外套させたシュードタイプウイルス（ＳＡＲＳ２－ｐｖ）を既報（Ｔａｎｉ ｅｔ ａｌ． Ｖｉｒｏｌ Ｊ （２０２１） １８：１６）に従って調製した。アンジオテンシン変換酵素２（ＡＣＥ２）安定発現細胞株を９６ｗｅｌｌ Ｗｈｉｔｅ／Ｃｌｅａｒ Ｂｏｔｔｏｍ Ｐｌａｔｅ（Ｔｈｅｒｍｏ ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に２×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで播種した。翌日、１０μＬ試験物質と１０μＬＳＡＲＳ２－ｐｖを混合し、室温で５分間反応後、細胞の培養上清に添加した。２４時間培養した後、２０μＬ／ｗｅｌｌピッカジーンＢｒｉｌｌｉａｎＳｔａｒ－ＬＴ発光試薬（東洋ビーネット）を添加し、５分間静置後にＳｐｅｃｔｒａｍａｘ Ｍ５ｅ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を用いてルシフェラーゼによる発光を測定した。ＳＡＲＳ２－ｐｖの細胞感染阻害効果は、ＳＡＲＳ２－ｐｖと溶媒（Ｍｉｌｌｉ Ｑ水）を混合して添加したｗｅｌｌの発光強度を１００％としたときの割合で示した。
（３）細胞生存アッセイ（ＭＴＳ）
９６ｗｅｌｌ Ｐｌａｔｅに１～２×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで細胞を播種した翌日、試験物質を１０μＬ添加した。２４時間培養後、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ ＡＱｕｅｏｕｓ Ｏｎｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ Ａｓｓａｙ （Ｐｒｏｍｅｇａ）のＣｅｌｌＴｉｔｅｒ ９６ ＡＱｕｅｏｕｓ Ｏｎｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔを１０μＬ／ｗｅｌｌで添加し、３７℃のＣＯ２インキュベーター内で１時間反応させた後、４９０ｎｍにおける吸光度を測定した。培地のみに試験物質を添加したｗｅｌｌをバックグラウンドとし、試験物質毎にバックグラウンドを差し引いた。ＭＴＳアッセイの値は、溶媒を添加したｗｅｌｌの値を１００％としたときの割合で示した。
９６ｗｅｌｌ Ｐｌａｔｅに１～２×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで細胞を播種した翌日、試験物質を１０μＬ添加した。２４時間培養後、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ ＡＱｕｅｏｕｓ Ｏｎｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ Ａｓｓａｙ （Ｐｒｏｍｅｇａ）のＣｅｌｌＴｉｔｅｒ ９６ ＡＱｕｅｏｕｓ Ｏｎｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔを１０μＬ／ｗｅｌｌで添加し、３７℃のＣＯ２インキュベーター内で１時間反応させた後、４９０ｎｍにおける吸光度を測定した。培地のみに試験物質を添加したｗｅｌｌをバックグラウンドとし、試験物質毎にバックグラウンドを差し引いた。ＭＴＳアッセイの値は、溶媒を添加したｗｅｌｌの値を１００％としたときの割合で示した。
銀結合型フコイダンは、１００ｎｇ／ｍｌ～１０μｇ／ｍｌで濃度依存的にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２細胞感染阻害効果を示すことが分かった（図６）。また、この範囲内では細胞毒性も認められなかった。
本発明の抗菌剤および抗ウイルス剤は、菌およびウイルスによる感染症の対策に利用することができる。
Claims (13)
- フコイダンの硫酸基に銀が結合した銀結合型フコイダンを含有することを特徴とする抗菌剤。
- フコイダンがオキナワモズクフコイダンである請求項１記載の抗菌剤。
- グラム陰性菌、グラム陽性菌または真菌の増殖を抑制するものである請求項１または２記載の抗菌剤。
- フコイダンと、銀が質量比で１：０．０００１以上である請求項１～３の何れか１項に記載の抗菌剤。
- フコイダンの硫酸基に銀が結合した銀結合型フコイダンを含有することを特徴とする抗ウイルス剤。
- フコイダンがオキナワモズクフコイダンである請求項５記載の抗ウイルス剤。
- ウイルスとヘパラン硫酸の接着を阻害するものである請求項５または６記載の抗ウイルス剤。
- ウイルスの増殖を抑制するものである請求項５または６記載の抗ウイルス剤。
- フコイダンと、銀が質量比で１：０．０００１以上である請求項５～８の何れか１項に記載の抗ウイルス剤。
- 請求項１～４の何れか１項に記載の抗菌剤および請求項５～９の何れか１項に記載の抗ウイルス剤を被処理物に処理したことを特徴とする抗菌・抗ウイルス製品。
- フコイダンの硫酸基に銀が結合したことを特徴とする銀結合型フコイダン。
- フコイダンがオキナワモズクフコイダンである請求項１１記載の銀結合型フコイダン。
- フコイダンと、銀が質量比で１：０．０００１以上である請求項１１または１２記載の銀結合型フコイダン。
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|---|---|---|---|
| JP2022095706 | 2022-06-14 | ||
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|---|---|
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|---|---|---|---|
| PCT/JP2023/021284 WO2023243525A1 (ja) | 2022-06-14 | 2023-06-08 | 抗菌剤ならびに抗ウイルス剤およびそれらの用途 |
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Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2013506712A (ja) * | 2009-10-06 | 2013-02-28 | ザ・ポピュレイション・カウンシル，インコーポレイテッド | カラゲナン含有水性抗菌性組成物 |
| WO2018225847A1 (ja) * | 2017-06-08 | 2018-12-13 | 株式会社サウスプロダクト | レトロウイルス増殖抑制剤およびこれを含有するレトロウイルス感染予防薬、レトロウイルス感染症発症予防薬 |
| CN113244267A (zh) * | 2021-04-12 | 2021-08-13 | 中国海洋大学 | 一种红藻多糖纳米银及其制备得到的抑菌凝胶和应用 |
| WO2022240943A1 (en) * | 2021-05-13 | 2022-11-17 | The Population Council, Inc. | Antiviral agents for treating severe acute respiratory syndrome |
-
2023
- 2023-06-08 WO PCT/JP2023/021284 patent/WO2023243525A1/ja unknown
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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| WO2022240943A1 (en) * | 2021-05-13 | 2022-11-17 | The Population Council, Inc. | Antiviral agents for treating severe acute respiratory syndrome |
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| PAUL S. KWON, HANSEUL OH, SEOK-JOON KWON, WEIHUA JIN, FUMING ZHANG, KEITH FRASER, JUNG JOO HONG, ROBERT J. LINHARDT, JONATHAN S. D: "Sulfated polysaccharides effectively inhibit SARS-CoV-2 in vitro", CELL DISCOVERY, vol. 6, no. 1, 1 December 2020 (2020-12-01), XP055758214, DOI: 10.1038/s41421-020-00192-8 * |
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| RAVICHANDRAN ANJALI; SUBRAMANIAN PALANISAMY; MANOHARAN VINOSHA; MUTHU THENMOZHI; PERIYANNAN RAJASEKAR; THANGAPANDI MARUDHUPANDI; P: "Phyto-mediated synthesis of silver nanoparticles using fucoidan isolated fromSpatoglossum asperumand assessment of antibacterial activities", JOURNAL OF PHOTOCHEMISTRY AND PHOTOBIOLOGY B: BIOLOGY, ELSEVIER SCIENCE S.A., BASEL., CH, vol. 185, 31 May 2018 (2018-05-31), CH , pages 117 - 125, XP085424571, ISSN: 1011-1344, DOI: 10.1016/j.jphotobiol.2018.05.031 * |
| S. RAJESHKUMAR: "Phytochemical constituents of fucoidan (Padina tetrastromatica) and its assisted AgNPs for enhanced antibacterial activity", IET NANOBIOTECHNOLOGY, THE INSTITUTION OF ENGINEERING AND TECHNOLOGY, MICHAEL FARADAY HOUSE, SIX HILLS WAY, STEVENAGE, HERTS. SG1 2AY, UK, vol. 11, no. 3, 16 August 2016 (2016-08-16), Michael Faraday House, Six Hills Way, Stevenage, Herts. SG1 2AY, UK , pages 292 - 299, XP006108670, ISSN: 1751-8741, DOI: 10.1049/iet-nbt.2016.0099 * |
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